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Autora: Profa. Maristela Tsujita Colaboradores: Prof. Flávio Buratti Gonçalves Profa. Eliane Maria de Almeida Orsine Hematologia Clínica Professora conteudista: Maristela Tsujita Graduada em Farmácia pela Universidade de São Paulo (1999), mestre (2004) e doutora (2016) em Análises Clínicas pela mesma instituição. Trabalhou no laboratório de imunopatologia da Fundação Pró-Sangue, onde atuou no diagnóstico de neoplasias hematológicas por citometria de fluxo, e foi supervisora do laboratório de criopreservação de células-tronco para transplante de medula óssea no banco de sangue do Hospital Sírio-Libanês. Professora de disciplinas dos cursos de Biomedicina, Enfermagem, Farmácia e Nutrição na Universidade Paulista. Docente da disciplina Hematologia Clínica no curso de especialização em Análises Clínicas da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto. Na área de pesquisa, tem experiência em bioquímica, com ênfase em sinalização celular, óxido nítrico e câncer; e em hematologia clínica, no estudo do nicho hematopoiético e células-tronco hematopoiéticas. © Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma e/ou quaisquer meios (eletrônico, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem permissão escrita da Universidade Paulista. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) T882b Tsujita, Maristela. Hematologia Clínica / Maristela Tsujita. – São Paulo: Editora Sol, 2021. 152 p., il. Nota: este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e Pesquisas da UNIP, Série Didática, ISSN 1517-9230. 1. Hemograma. 2. Anemia. 3. Leucemia. I. Título. CDU 616-074 U512.47 – 21 Prof. Dr. João Carlos Di Genio Reitor Prof. Fábio Romeu de Carvalho Vice-Reitor de Planejamento, Administração e Finanças Profa. Melânia Dalla Torre Vice-Reitora de Unidades Universitárias Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez Vice-Reitora de Pós-Graduação e Pesquisa Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez Vice-Reitora de Graduação Unip Interativa – EaD Profa. Elisabete Brihy Prof. Marcello Vannini Prof. Dr. Luiz Felipe Scabar Prof. Ivan Daliberto Frugoli Material Didático – EaD Comissão editorial: Dra. Angélica L. Carlini (UNIP) Dr. Ivan Dias da Motta (CESUMAR) Dra. Kátia Mosorov Alonso (UFMT) Apoio: Profa. Cláudia Regina Baptista – EaD Profa. Deise Alcantara Carreiro – Comissão de Qualificação e Avaliação de Cursos Projeto gráfico: Prof. Alexandre Ponzetto Revisão: Irana Magalhães Aline Ricciardi Sumário Hematologia Clínica APRESENTAÇÃO ......................................................................................................................................................7 INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................................................8 Unidade I 1 TECIDO SANGUÍNEO..........................................................................................................................................9 1.1 Células sanguíneas: morfologia e funções ................................................................................ 10 1.2 Hematopoese fetal e adulta............................................................................................................. 17 1.2.1 Eritropoese ................................................................................................................................................. 21 1.2.2 Granulopoese............................................................................................................................................ 24 1.2.3 Linfopoese .................................................................................................................................................. 26 1.2.4 Monopoese ................................................................................................................................................ 26 1.2.5 Plaquetopoese .......................................................................................................................................... 27 2 HEMOGRAMA ................................................................................................................................................... 28 2.1 Série eritrocitária .................................................................................................................................. 31 2.2 Na série leucocitária ............................................................................................................................ 38 2.3 Série plaquetária ................................................................................................................................... 39 3 ERITRÓCITOS ..................................................................................................................................................... 41 3.1 Membrana dos eritrócitos................................................................................................................. 41 3.2 Hemoglobina .......................................................................................................................................... 42 3.3 Metabolismo do ferro eritrocitário ............................................................................................... 43 3.4 Destruição do eritrócito senescente ............................................................................................. 44 4 ANEMIAS ............................................................................................................................................................ 45 4.1 Epidemiologia das anemias .............................................................................................................. 45 4.2 Quadro clínico das anemias ............................................................................................................. 46 4.3 Classificação das anemias ................................................................................................................. 46 4.3.1 Anemia microcítica ................................................................................................................................ 49 4.3.2 Anemia normocítica-normocrômica .............................................................................................. 55 4.3.3 Anemia macrocítica ............................................................................................................................... 57 Unidade II 5 ALTERAÇÕES BENIGNAS DOS LEUCÓCITOS .......................................................................................... 65 5.1 Leucocitoses: neutroflilias, linfocitoses (reacionais e atipias) e eosinofilias ................ 65 5.2 Leucopenias: neutropenias e linfopenias ................................................................................... 68 5.3 Alterações morfológicas dos leucócitos ...................................................................................... 72 6 NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS ................................................................................................................. 74 6.1 Leucemias agudas: LLA e LMA ........................................................................................................ 83 6.2 Leucemia mieloide crônica (LMC) .................................................................................................. 89 6.3 Policitemia vera ..................................................................................................................................... 92 6.4 Leucemia linfocítica crônica (LLC) ................................................................................................. 92 6.5 Linfomas: do tipo Hodgkin e não Hodgkin ................................................................................ 93 6.6 Transplante de medula óssea ..........................................................................................................95 Unidade III 7 MECANISMOS DA HEMOSTASIA E COAGULAÇÃO DO SANGUE .................................................103 7.1 Testes laboratoriais para diagnóstico das alterações da hemostasia e coagulação ................................................................................................................................................109 7.2 Distúrbios da hemostasia e da coagulação .............................................................................114 7.2.1 Coagulopatias.........................................................................................................................................115 7.2.2 Púrpuras .................................................................................................................................................. 120 7.2.3 Tromboses ............................................................................................................................................... 123 8 IMUNO-HEMATOLOGIA...............................................................................................................................125 8.1 Ciclo do sangue ...................................................................................................................................126 8.2 Transfusão de sangue .......................................................................................................................134 8.3 O setor de terapia celular ................................................................................................................139 7 APRESENTAÇÃO A hematologia é o ramo da biologia que estuda o sangue e os órgãos hematopoéticos, como a medula óssea, que produz hemácias, leucócitos e plaquetas. O sangue é essencial para nossa vida, visto que tem várias funções, tais como transportar oxigênio, nutrientes, hormônios e realizar o papel de defesa contra vírus, bactérias, parasitas e células tumorais, entre outros. Além disso, a hematologia aborda as doenças relacionadas ao sangue: as anemias, leucemias, linfomas e doenças da coagulação. A presente disciplina tem como objetivo geral capacitar o profissional de saúde a interpretar os resultados dos exames realizados dentro do laboratório de hematologia, à luz dos conhecimentos fisiológicos e patológicos adquiridos. Além de fornecer conhecimentos e habilidades para execução das técnicas laboratoriais utilizadas em hematologia e hemoterapia, com a finalidade de preparar o futuro profissional a executar e analisar os exames laboratoriais da área hematológica. O aluno também vai compreender como funcionam os ensaios laboratoriais e a automação em hematologia, para que, assim, esteja apto a trabalhar na rotina de hospitais, laboratórios e bancos de sangue. Dessa forma, o presente material está dividido em três unidades que vão abordar os temas descritos a seguir. A unidade I apresentará as células do sangue periférico (hemácias, leucócitos e plaquetas), suas características morfológicas e funções; a medula óssea, onde ocorre a hematopoiese, processo de produção, proliferação e diferenciação das células sanguíneas; o hemograma: como fazer e interpretar o eritrograma, leucograma e plaquetograma; o metabolismo das hemácias, os tipos de hemoglobina, o metabolismo do ferro eritrocitário e a formação da bilirrubina a partir da destruição das hemácias; os sinais e sintomas do paciente com anemia. Interpretação dos índices hematimétricos e classificação laboratorial das anemias em microcítica-hipocrômica, macrocíticas e normocíticas e normocrômicas; e as hemoglobinopatias hereditárias: anemia falciforme e talassemias. Na unidade II, estudaremos os leucócitos: alterações quantitativas (leucocitoses e leucopenas), as alterações qualitativas em leucócitos (presença de vacúolos, granulações tóxicas e atipias) que evidenciam diversas patologias hematológicas e devem ser descritas no laudo do hemograma; as neoplasias hematológicas, com ênfase nas leucemias agudas e crônicas e nos linfomas do tipo Hodgkin, e não Hodking; as características morfológicas das células nas leucemias e linfomas; os sistemas classificatórios, os exames para diagnóstico das neoplasias: citometria de fluxo, citogenética e biologia molecular; e o transplante de medula óssea como modalidade terapêutica para o tratamento das neoplasidas hematológicas. Abordaremos também, na unidade III, a fisiologia das plaquetas; os mecanismos da hemostasia; os testes laboratoriais para diagnóstico das alterações da hemostasia e coagulação; os distúrbios da hemostasisa: coagulopatias, púrpuras e tromboses; a imuno-hematologia, que é uma especialidade hemoterapia, responsável por realizar os exames imuno-hematológicos de doadores e receptores de sangue. E, por fim, o ciclo do sangue, com as etapas de produção dos hemocomponentes e a criopreservação de células-tronco para o transplante de medula óssea e glóbulos raros. 8 INTRODUÇÃO A cronologia da importância do sangue na vida do homem foi, primeiramente, documentada na Era Paleolítica e, desde então, foram muitos séculos de práticas, hoje consideradas bizarras e envolvidas em misticismo, até chegarmos a diagnósticos e tratamentos bem-sucedidos de diversas patologias hematológicas. A história da hematologia passou pelas sangrias como forma de expurgação dos males do corpo, na época Luís XIV, na França, também pela descrição da circulação feita por Harvey e o estudo dos grupos sanguíneos de Karl Landerstein. A evolução foi possível a partir do desenvolvimento dos corantes hematológicos, da microscopia, de equipamentos como contadores hematológicos, citômetro de fluxo, o desenvolvimento da biologia molecular, isolamento das células-tronco, transplante de medula óssea e terapias celulares. A investigação laboratorial em hematologia permite o diagnóstico das infecções, anemias, leucemias, linfomas, doenças da coagulação, entre outros. Os resultados dos exames são cada vez mais precisos e fornecem informações indicativas sobre o estado imunológico do paciente, riscos de hemorragia e indicações do estado nutricional, por exemplo, na detecção de anemia por carência de ferro. A evolução da tecnologia laboratorial também permitiu o desenvolvimento das técnicas de hemoterapia e, consequentemente, melhorou a vida do paciente. A hemoterapia é o ramo da hematologia que possibilita as transfusões de hemocomponentes obtidos a partir da doação de sangue. O sangue corrige rapidamente estados emergenciais e ainda representa uma alternativa quando hemoderivados (medicamentos obtidos industrialmente a partir do plasma) não estão à disposição. A obtenção dos hemocomponentes emprega uma equipe multidisciplinar no banco de sangue que trabalha na coleta, processamento da bolsa de sangue, realização de exames sorológicos, imuno-hematológicos e exames de biologia molecular. O banco de sangue conta, ainda, com profissionais que realizam o congelamento de células-tronco para transplante de medula óssea e de glóbulos considerados raros. À medida que novos exames são incorporados à rotina laboratorial, maior é a possibilidade de tratamento do paciente, que, por sua vez, requer medicamentos. E, assim, o profissional que atua na indústria farmacêutica utilizará os conhecimentos hematológicos no desenvolvimento e fabricação de fármacos para tratamento das anemias, leucemias e doenças da coagulação. Diante do que foi exposto até aqui, percebe-se a importância da hematologia e de seu vasto campo de atuação, que emprega uma grande equipe multidisciplinar. 9 HEMATOLOGIA CLÍNICA Unidade I 1 TECIDO SANGUÍNEO Quantos litros de sangue tem o corpo humano adulto? Considerando-se as diferentes dimensões de cada indivíduo, de modo geral, o volume de sangue do nosso corpo corresponde a cerca de 7% do nosso peso. Uma pessoa com 70 a 80 quilos, por exemplo, tem entre 4,5 e 5,5 litros de sangue (BRASIL, [s.d.]). O sangue é classificado como tecido conjuntivo especializado constituído por células e plasma (parte líquida).A porção celular compreende hemácias, plaquetas e vários tipos de leucócitos. As funções do sangue são o transporte de gases (oxigênio), nutrientes, hormônios, remoção de gás carbônico e eliminação dos produtos de excreção dos tecidos. As funções de defesa também são intermediadas pelo sangue através dos leucócitos. Ainda distribui calor pelo corpo e participa do equilíbrio osmótico e ácido-básico. Leucócitos Sangue Os leucócitos (glóbulos brancos) são responsáveis pela defesa do organismo. As hemácias (eritrócitos ou glóbulos vermelhos) transportam oxigênio. As plaquetas agem na coagulação. Hemácias 93% de água Plasma parte líquida 55% do volume total 45% Parte sólida Plaquetas Figura 1 – Composição do sangue Disponível em: https://bit.ly/2Sl8JlJ. Acesso em: 22 jun. 2021. O plasma é uma solução aquosa que contém proteínas plasmáticas, sais inorgânicos e compostos orgânicos, tais como aminoácidos, vitaminas, hormônios e glicose. Entre as proteínas plasmáticas, a albumina é fundamental na manutenção da pressão osmótica. As imunoglobulinas são os anticorpos 10 Unidade I que participam da defesa humoral e o fibrinogênio é a proteína solúvel que se converte em fibrina, importante na etapa final da coagulação sanguínea. Observação Soro e plasma não são iguais, apesar de ambos corresponderem à parte líquida do sangue. O soro não contém o fibrinogênio e os fatores da cascata da coagulação. Ele é obtido após a coleta de sangue em tubo sem adição de anticoagulante ou em tubo com gel ativador do coágulo. O objetivo é a formação do coágulo e posterior centrifugação do tubo para a separação do soro, a fim de que seja usado em exames bioquímicos e sorológicos. 1.1 Células sanguíneas: morfologia e funções Vejamos as características morfológicas e funcionais das células do sangue. Os leucócitos presentes no sague periférico de um indivíduo saudável são neutrófilos bastonetes, neutrófilos segmentados, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. A morfologia das células sanguíneas pode ser avaliada por microscopia a partir de um esfregaço ou extensão sanguínea de uma gota de sangue sobre uma lâmina histológica, que é seca ao ar e corada com corantes. Os corantes mais utilizados pelos laboratórios são Leishman e May Grunwald Giemsa. As hemácias são células anucleadas em formato de disco bicôncavo com halo central mais claro. A quantidade de hemácias no sangue é de 3 a 4 milhões/mm3. Você pode estar se perguntando: como ocorre a multiplicação das hemácias, se estas não têm núcleo? A maturação da série eritroide que origina as hemácias ocorre na medula óssea e é em uma das etapas nas quais o precursor eritroide perde o núcleo e outras organelas, portanto, a mitose ocorre em etapas anteriores à formação das hemácias. Uma vez na circulação, o tempo de vida da hemácia é em média de 120 dias (BAIN, 2007). Figura 2 – Hemácia humana cortada ao meio Disponível em: https://bit.ly/3j4hPOM. Acesso em: 22 jun. 2021. 11 HEMATOLOGIA CLÍNICA Os leucócitos são células que participam das defesas celulares. Podem ser classificados em mononucleados e polimorfonucleados. Os polimorfonucleares, ou também denominados granulócitos, apresentam granulações específicas no citoplasma e núcleo multilobulados. São classificados como granulócitos: neutrófilos, basófilos e eosinófilos. Os mononucleares apresentam citoplasma sem granulações e núcleo sem lóbulos, ou seja, são agranulócitos. Há dois tipos de agranulócitos: os linfócitos e os monócitos (LORENZI, 2006). Linfócito Leucócitos mononucleados Leucócitos polimorfonucleados Monócito Neutrófilo Eosinófilo ou acidófilo Basófilo Figura 3 – Leucócitos Disponível em: https://bit.ly/3vO4qNw. Acesso em: 22 jun. 2021. Os neutrófilos bastonetes existem em pequena porcentagem no sangue periférico, cerca de 1 a 5%, e a característica morfológica principal é o núcleo sem lóbulos, formando um segmento único. Já os neutrófilos segmentados representam cerca de 60 a 65% dos leucócitos do sangue periférico. Quanto ao número de lóbulos, devem apresentar de 2 a 5 lóbulos, ligados entre si por uma fina cromatina. Quando o número de lóbulos é superior a cinco, este é denominado hipersegmentado. Os neutrófilos, sejam bastonetes ou segmentados, apresentam granulações primárias (azurófilas ou inespecíficas) e secundárias (específicas). As granulações primárias se coram em vermelho-escuro e estão presentes nas linhagens neutrofílica, eosinófila e basófila. Essas granulações estão presentes em pequena quantidade nas células maduras e quando se manifestam, são denominadas granulações tóxicas. Os grânulos primários se fundem às vesículas fagocíticas que se formam na morte dos microrganismos. As granulações primárias contêm mieloperoxidase (MPO), fosfatase ácida, proteínas antibacterianas, lisozima, fagocitina, defensinas proteinases e catepsinas (BAIN, 2007). As granulações secundárias, de coloração rosa-avermelhada, contêm lactoferrina, lisozima e outras enzimas (colagenase, histaminase, gelatinase, fosfatase alcalina), ativador do plasminogênio, β2-microglobulina e proteína ligadora da vitamina B12. 12 Unidade I Em condições basais, os granulócitos apresentam maior quantidade de grânulos secundários, sendo a razão de 3:1 de grânulos secundários para primários. Entretanto, em condições patológicas, como veremos adiante, essa relação estará alterada. A vida média dos neutrófilos é de cerca de 7 horas na circulação. Os neutrófilos ficam distribuídos igualmente em dois compartimentos no sangue: central e marginais; mas certas condições como estresse, adrenalina e exercício físico rapidamente induzem a migração dos neutrófilos do pool marginal para o central. A principal função dos neutrófilos é a defesa contra bactérias e certos fungos por meio da fagocitose, a partir da formação de vesículas fagocíticas, liberação de enzimas líticas e produção de espécies reativas de oxigênio. Figura 4 – Neutrófilo segmentado Os eosinófilos representam 2 a 4% dos leucócitos, o núcleo é bilobulado e as granulações são semelhantes às dos neutrófilos, entretanto, são acidófilas ao serem coradas pela eosina. Os grânulos inespecíficos contêm enzimas hidrolíticas que participam da destruição de parasitas. Os grânulos específicos contêm a proteína catiônica do eosinófilo e a neurotoxina, que também participam da defesa contra parasitas. Dessa forma, os eosinófilos são a linha de frente no combate a agentes parasitários, pois aderem ao parasita e liberam o conteúdo de seus grânulos, o que causa a destruição destes. Essas células também apresentam receptores para citocinas, entre estas a IL-5, uma interleucina produzida por linfócitos Th2 e relacionada com a produção de IgE, por isso, a eosinofilia é observada também nos processos alérgicos (SANTOS, 2013). 13 HEMATOLOGIA CLÍNICA Figura 5 – Eosinófilo Os basófilos raramente são encontrados no sangue e correspondem a menos de 1% dos leucócitos. O núcleo apresenta um formato sinuoso, lembrando o aspecto de letra “S”. As granulações ricas em heparina e histamina são volumosas que cobrem todo o citoplasma e o núcleo que tem cor violeta-escuro. Apresentam receptores para IgE, que participam da ativação celular em casos de alergia, por exemplo, como ocorre na asma e na ração alérgica cutânea. Essas células também realizam defesa contra infecções parasitárias (SANTOS, 2013). Figura 6 – Basófilo Os monócitos representam cerca de 4 a 8% dos leucócitos circulantes e permanecem no sangue periférico por até 70 horas. São células de tamanho grande, o núcleo apresenta cromatina fina, rendilhada e é pleomórfico (pode adquirir diferentes formatos, mas, em geral, é ovoide, irregular e ocupa grande área do citoplasma). Por vezes, alguns vacúolos podem ser observados no citoplasma basofílico, que também pode conter finas granulações inespecíficas (lisossomos). Nas infecções ou inflamações, os monócitos são recrutados para o tecido lesionado e se diferenciam em macrófagos,podendo aí permanecer por semanas ou até meses. No local da inflamação, os 14 Unidade I macrófagos modulam o processo inflamatório combatendo o patógeno a partir do processo de fagocitose, secreção de espécies reativas de oxigênio e de fatores pró-inflamatórios (IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-6, TNF-alfa, IFN-beta) e secretam diversos fatores de crescimento de fibroblasto e enzimas que são importantes para a regeneração tecidual (SANTOS, 2013). Figura 7 – Monócito Os linfócitos correspondem entre 20 e 30% dos leucócitos na circulação e podem ser de três tipos: linfócitos B, T e NK (natural killer), mas são morfologicamente indistinguíveis. Apresentam tamanhos variados, mas, de forma geral, são células esféricas de contorno regular e o núcleo ocupa quase toda a área do citoplasma. A cromatina é extremamente condensada, com ausência de nucléolos e basofilia acentuada (roxo intenso). Os linfócitos B diferenciam-se em plasmócitos, que são células produtoras de anticorpos, portanto, participam da defesa humoral do organismo. Os linfócitos T estão presentes em maior número e reconhecem fragmentos de antígenos apresentados pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC), ou seja, não dependem dos anticorpos circulantes. Os patógenos intracelulares são apresentados aos linfócitos T CD8 pela molécula MHC I, o que induz a diferenciação dos linfócitos T citotóxicos, que matam as células infectadas. Já os antígenos oriundos de bactérias extracelulares, que foram fagocitadas, são processados e apresentados pela molécula MHCII e, então, são apresentados aos linfócitos T CD4, os quais, posteriormente, se diferenciam em linfócitos Th1 e Th2. Os linfócitos Th1 ativam as propriedades microbicidas de macrófagos e induzem os linfócitos B a produzirem IgG. As células Th2 estimulam os plasmócitos a produzirem IgM, iniciando a resposta humoral. Já os linfócitos NK são células citotóxicas da imunidade inata, não requerem sensibilização prévia e formam uma primeira linha de frente contra vírus e células tumorais (SANTOS, 2013). 15 HEMATOLOGIA CLÍNICA Figura 8 – Linfócito As plaquetas inicialmente não foram descritas como células, mas como fragmentos de origem desconhecida. Foi em 1865 que Max Schultze descreveu as plaquetas como células sanguíneas e Giulio Bizzozero descreveu a função das plaquetas na trombose e na hemorragia. Estas células apresentam formato discoide e circulam durante 7 a 10 dias na corrente sanguínea, sendo então removidas pelos macrófagos. Em condições basais, o número de plaquetas circulantes é de 150.000 a 400.000/mm3. Ao microscópio óptico, verifica-se um corpúsculo cor púrpura que deve estar homogeneamente distribuídos pelo esfregaço. A membrana plaquetária é formada por dupla camada de fosfolipídios, onde estão incorporados colesterol, glicolipídios e glicoproteínas. No citoplasma, há, entre outras organelas, inúmeras mitocôndrias e grânulos alfa contendo β-tromboglobulina, fator plaquetário 4, vários fatores de coagulação (fibrinogênio, fator V, fator XIII, fator de Von Willebrand), fator de crescimento de plaquetas, vitronectin e trombospondina. Os grânulos densos contêm cálcio, ADP e ATP. As plaquetas participam da formação do coágulo no processo de hemostasia, estando também envolvida na vasoconstricção e no reparo tecidual, entre outros. Quando ocorre uma lesão vascular, há exposição do colágeno, o que provoca adesão das plaquetas ao subendotélio exposto, em um evento no qual ocorre a interação do fator de Von Willebrand e glicoproteínas Ib/IX/V. Em seguida, mais plaquetas são recrutadas em um processo de agregação que envolve o fibrinogênio, os receptores de superfície e o complexo GPIIb-IIIa. As plaquetas ativas liberam o conteúdo granular, o que provoca a agregação de mais plaquetas. A plaqueta ativada sofre mudança conformacional, deixa de ser discoide e passa a ser arredondada com pseudópodes. A partir da exposição de cargas negativas na superfície da plaqueta, ocorre a aceleração das reações de ativação dos fatores de coagulação que resultam na formação da rede de fibrina (LORENZI, 2006). 16 Unidade I Figura 9 – Plaquetas Disponível em: https://bit.ly/3gXn6EW. Acesso em: 22 jun. 2021. Figura 10 – Rede de fibrina Disponível em: https://bit.ly/3vPt1RO. Acesso em: 22 jun. 2021. Saiba mais A imunofenotipagem por citometria de fluxo é uma metodologia que permite a determinação do fenótipo celular, ou seja, a sua linhagem e seu estágio de diferenciação. Essa metodologia emprega anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos que reconhecem antígenos presentes na membrana, no citoplasma ou no núcleo da célula. Vale a pena ler o artigo intitulado “Citometria de fluxo: histórico, princípios básicos e aplicações em pesquisa”. BRAGA, K. M. S. et al. Citometria de fluxo: histórico, princípios básicos e aplicações em pesquisa. Enciclopédia Biosfera, Centro Científico Conhecer, Goiânia, v. 13, n. 23, p. 304-319, 2016. Disponível em: https://bit.ly/3xJkrpb. Acesso em: 2 ago. 2021. 17 HEMATOLOGIA CLÍNICA 1.2 Hematopoese fetal e adulta A medula óssea é constituída por estroma, que é composto por tecido conjuntivo e vários tipos celulares, incluindo fibroblastos, macrófagos, adipócitos-like, células endoteliais, células reticulares e musculares lisas. É na medula óssea que as células que encontramos no sangue são formadas, em um processo denominado hematopoese (BIRBRAIR; FRENETTE, 2016). Observação Nos livros e artigos científicos, encontramos os termos hemopoese, hemopoiese, hematopoese, hematopoiese ou, ainda, hemocitopoiese. Todos se referem ao mesmo processo. A hematopoese é um processo dinâmico e hierárquico, no qual as células-tronco (CTH) se autorrenovam e/ou diferenciam-se em células do sistema sanguíneo (BIRBRAIR; FRENETTE, 2016). Linfoblasto B Linfoblasto T Célula-tronco hematopoética Monoblasto Mieloblasto Megacarioblasto Proeritoblasto Eritoblasto HemáciaNeutrófilo Megacariócito PlaquetaBasófiloEosinófiloMonócito Macrófago Linfócito TLinfócito B Plasmócito Figura 11 – Hematopoese Adaptada de: https://bit.ly/3zLVFGJ. Acesso em: 22 jun. 2021. 18 Unidade I Lembrete O linfócito B, quando estimulado por interleucinas, por exemplo, IL-4 e IL-1, se diferencia em plasmócitos, que são células produtoras de anticorpos. E os monócitos, quando migram para o tecido, se transformam em macrófagos. A hematopoese compreende os processos de proliferação, diferenciação e maturação das células sanguíneas. Nas primeiras semanas de vida intrauterina até o segundo mês, ocorre o período pré-hepático. Nessa fase, o saco vitelino é o principal local de hematopoese. Os agrupamentos de angioblastos originam as ilhotas de Wolff, onde as células periféricas originam o endotélio dos primeiros vasos sanguíneos enquanto as células centrais produzem os primeiros glóbulos vermelhos ou megaloblastos. Em seguida, do segundo ao sexto mês de vida intrauterina, ocorre a fase hepatoesplênica, na qual fígado e baço produzem as células sanguíneas. No fígado, a hematopoese também é do tipo eritroide, com células que sintetizam as cadeias globinicas alfa e gama. Os granulócitos e megacariócitos (células que originam as plaquetas) são produzidos mais tardiamente (ZAGO, 2015). A medula óssea se torna o principal local de hematopoese a partir de seis a sete meses de vida fetal até a vida adulta. De modo que, ao nascimento, todos os ossos longos, esterno e vértebras, são produtores e apresentam atividade hematopoética. Entretanto, a partir da puberdade, a medula óssea ativa (denominada vermelha) é gradativamente substituída por adipócitos e, assim, a hematopoese fica restrita ao esterno, costelas, vértebras e fêmur. Em algumas patologias, o fígado e o baço podem retomar a função hematopoética, o que é denominado hematopoese extramedular. Este é um mecanismo compensatório fisiológico que consiste em áreas microscópicas difusas de tecido hematopoético nas regiões supracitadas ou, ainda, em outras regiões (linfonodos,rins, pleura e mediastino), que podem estar presentes, por exemplo, em pacientes com talassemia, anemia falciforme, leucemias, linfomas, entre outros (ANJOS; ALVARES-SILVA; BORELLI, 2000). Nos adultos, esse processo ocorre na medula óssea dos ossos chatos e garante a produção de cerca de 1012 células sanguíneas/Kg de peso corporal. Esse processo é mediado por hormônios, citocinas, fatores de crescimento e pelas células estromais, constituindo um microambiente indutor. O microambinete indutor é composto pelas células hematopoéticas e mesenquimais. As células mesenquimais originam osteoblastos, adipócitos e fibroblastos. E as células hematopoéticas originam os eritrócitos, leucócitos e plaquetas. No microambiente, também há osteoclastos e macrófagos, que são originados da linhagem monocítica. Os macrófagos são importantes, pois realizam a fagocitose das células senescentes da medula óssea. E o papel dos osteoclastos (células que realizam a remodelação óssea, ou seja, removem a matriz mineral óssea) no controle da hematopoese só foi descrito mais recentemente e ainda é alvo de elucidação. 19 HEMATOLOGIA CLÍNICA Alguns estudos mostram que o cálcio liberado do osso, pela ação dos osteoclastos, sinaliza a quiescência das células-tronco no nicho hematopoético (WILSON; TRUMPP, 2006). Vasos sinusoidais Nicho vascular Nicho endosteal Matriz extracelular Adipócito Osteoblasto em repoudo Osteoblasto ativo Osteoclasto Fibroblasto Mesenquimal Célula-tronco hematopoética Fêmur Medula óssea Di áfi se Ep ífi se Figura 12 – Nicho hematopoético Adaptada de: Grassel (2007, p. 4946). Na hematopoese, as células-tronco hematopoéticas pluripotentes (CTPH), ou stem cell, sofrem sucessivas mitoses e originam mais CTPH, se diferenciando para originar células-tronco hematopoéticas multipotentes (CTHM), ou seja, células comprometidas com as linhagens: mieloide (CFU-GEMM) (unidade formadora de colônicas granulocítica, eritroide, megacariocítica, monocítica) ou linfoide (CFU-Li) (unidade formadora de colônica linfocítica). A partir dessas células, são formadas as células progenitoras, que já são diferenciadas em linfoide ou mieloide, podem ser bipotentes e compreendem as unidades formadoras de explosão (burst) de eritrócitos e de megacarióticos (BFU E-Meg) e as unidades formadoras de colônias de granulócitos e monócitos (CFU-GM), ou onipotentes, que compreendem as CFU-E (unidades formadoras de eritrócitos), CFU-Meg (unidade formadora de megacariócitos), CFU-M (unidade formadora de colônias monocíticas) e CFU-G (unidade formadora de colônias granulocíticas). Quando as células progenitoras se dividem, originam células-filhas com potencialidade menor, que são denominadas células precursoras (blastos). Essas células já estão comprometidas com uma linhagem específica e são as primeiras a serem reconhecidas morfologicamente na medula óssea, compreendem proeritroblasto, mieloblasto, monoblasto e linfoblasto. Os blastos, por sua vez, originam células que passam por estágios intermediários, que diminuem de tamanho conforme maturam, perdem os nucléolos, a cromatina fica cada vez mais densa até se 20 Unidade I tornarem maduras, quando são liberadas, então, para a corrente sanguínea. A exceção são os linfócitos T, que migram para o timo para se diferenciarem e, depois, são liberados para o sangue. Quadro 1 – Características das células da hematopoiese Estágio Células-tronco pluripotentes hematopoéticas (CTPH) Células comprometidas (multipotentes) Células progenitoras Células precursoras Células maduras Morfologia Não é possível distinguir morfologicamente Primeiras células a serem reconhecidas Diferenciação morfológica completa Atividade mitótica Apresentam potencial de autorrenovação Grande atividade mitótica. São autorrenováveis Grande atividade mitótica. Não são autorrenováveis Não se multiplicam. Presentes na medula óssea e no sangue periférico Célula CTPH CTM linfoide (CFU-Li) CTM mieloide (CFU-GEMM) BFU-E-Meg CFU-GM CFU-E CFU-Meg CFU-G CFU-M Linfoblasto Proeritroblasto Megacarioblasto Mieloblasto Linfócitos B, T e NK Hemácias Megacariócito Monócito Neutrófilo Linfócito Eosinófilo Basófilo Observe que a partir de poucas células-tronco hematopoéticas, todas as células do sangue são produzidas. Isso justifica a hierarquia do processo citada, que lembra uma pirâmide. Células em maturação Células maduras Células progenitoras Células comprometidas CTPH Figura 13 – Hierarquia da hematopoiese com a célula-tronco pluripotente hematopoética (CPTH) no topo As células-tronco estão em locais denominados nichos, na medula óssea. O termo nicho de célula-tronco é definido como um local anatomicamente delimitado que controla a autorrenovação 21 HEMATOLOGIA CLÍNICA na ausência de diferenciação celular. Schofield foi quem primeiro o descreveu em 1978 e, desde então, novas descobertas influenciam o tratamento e pesquisa de novos fármacos (SCHOFIELD, 1978). Esse processo organizado é capaz de manter a quantidade e os tipos celulares de acordo com a demanda do organismo. Então, vamos exemplificar: quando há infecção em um tecido, neutrófilos são recrutados no local de invasão e a medula óssea passa a produzir mais células da linhagem neutrofílica. Outro exemplo: em um estado fisiológico, quando há produção de eritropoietina pelos rins, haverá estímulo para a medula óssea produzir mais células da linhagem eritroide e aumentar, consequentemente, a quantidade de hemácias no sangue periférico. O que garante a permanência das células na medula óssea ou a migração para o sangue periférico? A presença de moléculas de adesão faz com que as células permaneçam na medula. Nesse local, amadurecem e se diferenciam, quando então ocorre a mudança do fenótipo, ou seja, perdem algumas moléculas de adesão e passam a expressar novas moléculas. Muitos desses marcadores de superfície são conhecidos pela sigla CD, que, em inglês, significa cluster of differentiation. Um marcador importante é o CD34, que é expresso em células-tronco comprometidas. À medida que a célula se diferencia, ela perde esse marcador. Caso a célula esteja comprometida com linhagem mieloide, esta vai expressar marcadores, tais como, MPO, CD33, CD13, entre outros. Já os linfócitos B expressam CD22, CD79a. Ou, ainda, se a célula se comprometer com a linhagem linfocítica T, vai expressar CD1a, CD2, CD3, CD4 ou CD8, CD5, CD7 (SANTOS, 2013). 1.2.1 Eritropoese Um adulto, em condições fisiológicas, produz 200 bilhões de hemácias por dia, o que garante a reposição das células destruídas. O principal hormônio regulador desse processo é a eritropoietina (EPO), que, normalmente, está presente no plasma e se liga aos receptores presentes em precursores eritroides. Alterações nos níveis plasmáticos de EPO ou na sua ação nas células-alvo podem prejudicar a produção dos eritrócitos e, consequentemente, a capacidade de transporte de oxigênio do organismo. Os precursores eritroides representam cerca de um terço das células da medula óssea, sendo o proeritroblasto a primeira célula reconhecida morfologicamente. Entretanto, os precursores mais primitivos podem ser identificados por testes funcionais, a partir de técnicas de cultura de precursores hematopoéticos que permitem a identificação da unidade formadora de crescimento-rápido-eritroide (BFU-E) e a unidade formadora de colônias eritroides (CFU-E) (colony-forming unit-erythroid). As BFU-E originam as CFU-E. Depois desse estágio, os precursores eritroides já são reconhecidos morfologicamente. As BFU-E expressam receptores para SCF e pequeno número de receptores para EPO, por isso, apresentam elevado potencial proliferativo e não respondem à EPO. Já as CFU-E caracterizam-se por menor expressão de receptores para SCF, assim perdem gradualmente a capacidade proliferativa, mas apresentam maior número de receptores para EPO. 22 Unidade I A partir da CFU-E, são produzidas as células denominadaseritroblastos, na seguinte ordem: proeritroblastos, eritroblastos basófilos, eritroblastos policromáticas e eritroblastos ortocromáticos. Essas últimas originam os reticulócitos, que migram para o sangue periférico e se transformam em hemácias (OLIVEIRA; POLI NETO, 2004). Vamos detalhar algumas características das células eritroides no quadro a seguir. Quadro 2 – Características das células da série eritroide Célula Citoplasma Núcleo Proeritroblasto Escasso Basófilo Grande. Cromatina finamente reticulada “frouxa Presença de 1 a 2 nucléolos Eritroblasto basófilo Escasso Intensamente basófilo Grande Cromatina frouxa com apenas 1 nucléolo (nem sempre visível) Eritroblasto policromático Abundante Acinzentado Núcleo central Cromatina densa Ausência de nucléolos Eritroblasto ortocromático Abundante Acidófilo (da mesma cor da hemácia) Núcleo picnótico (pequeno), central ou periférico (pois ocorre a expulsão do núcleo) Cromatina densa Reticulócito Contém resquícios de organelas e RNA mensageiro. Policromatófilo Não apresenta Hemácia Disco bicôncavo Anucleada Rosa Não representa Adaptado de: Zago (2015, p.15). No processo proliferativo de mitoses sucessivas, que ocorre na medula óssea, as CFU-E sofrem mitose e produzem quatro proeritroblastos. Na sequência, os proeritroblastos originam 8 eritroblastos basófilos, que, por sua vez, por mitose, produzem 16 eritroblastos policromáticos. A partir dessa etapa, não sofrem mitose, e os eritroblasto policromáticos se diferenciam em eritroblastos ortocromáticos, quando ocorre a expulsão do núcleo e de uma pequena parte do citoplasma. Forma-se, assim, o reticulócito que retém resquícios de organelas: retículo endoplasmático, ribossomos (com RNA mensageiro) e mitocôndrias. A retenção de RNA mensageiro justifica a policromatofilia observada em esfregaços sanguíneos. Essas células são ligeiramente maiores do que as hemácias maduras e, por isso, aparecem como macrócitos policromatófilos. O reticulócito permanece de um a três dias na medula óssea, quando é liberado para a circulação. Um a dois dias depois de estarem no sangue periférico, os reticulócitos perdem todas as organelas. Além disso, cerca de 10 a 20% da síntese de hemoglobina ocorre nesse estágio, e como ainda há mitocôndrias, também ocorre certa capacidade de respiração aeróbia (OLIVEIRA; POLI NETO, 2004). 23 HEMATOLOGIA CLÍNICA Linhagem eritroide 1 Stem cell ↓ 2 CFU E ↓ 4 Proeritoblastos ↓ 8 Eritoblastos basófilos ↓ 16 Eritoblastos policromáticos ↓ 16 Eritoblastos ortocromáticos ↓ 16 Reticulócitos ↓ 16 Hemácias Figura 14 – Estágios da maturação eritroide A contagem de reticulócitos é um importante indicador da atividade proliferativa da medula óssea. Por exemplo, nas anemias hemolíticas, em que ocorre aumento da destruição das hemácias, a medula óssea exibe atividade compensatória e, assim, ocorre aumento do número de reticulócitos. Por outro lado, um número normal ou reduzido de reticulócitos em paciente anêmico indica que a medula óssea está hipoproliferativa, ou seja, a anemia ocorre por menor produção de hemácias (OLIVEIRA, 2007). Vale ressaltar que 5 a 10% dos eritroblastos não completam o processo de maturação, o que representa a fração ineficaz da eritropoese. Cerca de 4 a 12% da hemoglobina sintetizada nessas células é destruída na própria medula óssea. A eritropoese ineficaz é vista em várias patologias acompanhadas de maior proporção de células da linhagem eritroide na medula óssea em comparação com o número de hemácias liberadas para a circulação. Exemplos destas situações são as anemias megaloblásticas, talassemias, eritroleucemias e síndromes mielodisplásicas. Os exames do paciente vão indicar hiperplasia eritroide medular, número de reticulócitos normais ou baixos e discreto aumento de bilirrubina indireta (OLIVEIRA, 2007). Quais são os fatores necessários para que a eritropoese ocorra? Além da EPO, a medula óssea precisa de fatores fornecidos pela alimentação, entre eles, aminoácidos, ferro, vitamina B12 e ácido fólico. Sabendo que a função primordial dos eritrócitos é o transporte de oxigênio, é vital que a eritropoese seja fortemente regulada. 24 Unidade I A produção de EPO é controlada pela concentração de oxigênio no sangue arterial que irriga as células peritubulares do córtex renal. Alterações nas concentrações de EPO circulante ou na sua ação sobre às células-alvo podem modificar o número de hemácias. A quantidade de hemácias circulante é mantida constante e reflete o equilíbrio entre a proliferação e a destruição de hemácias senescentes. A diminuição da oxigenação renal estimula a produção de EPO e favorece a eritropoese. A EPO se liga a um receptor presente na superfície das células progenitoras eritroides da MO e regula a proliferação e diferenciação destas. Durante o processo de diferenciação, as unidades formadoras de colônias eritroides (CFU-E) (colony-forming units) e os proeritroblastos se tornam mais sensíveis à EPO, de forma que o os proeritroblastos passam a expressar, aproximadamente, 1000 receptores de EPO por célula. À medida que as células se diferenciam, o número de receptores diminui, e assim, os reticulócitos e hemácias não expressam receptores para EPO (OLIVEIRA, 2007). Em relação aos fatores nutricionais, os aminoácidos participam da síntese das cadeias globínicas da hemoglobina, o ferro integra o grupo heme (grupo prostético) da hemoglobina, e as vitaminas B12 e ácido fólico (na forma ativa) atuam em conjunto na síntese dos nucleotídeos, o que permite a divisão celular. Assim, a carência desses fatores vai promover o desenvolvimento das anemias carenciais, ferropriva (carência de ferro) e megaloblástica (carência de vitamina B12 e/ou folato) (OLIVEIRA, 2007). 1.2.2 Granulopoese Os granulócitos se diferenciam a partir da célula-tronco pluripotente da MO, que originam vários intermediários até formarem os neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Durante o processo de diferenciação e maturação dos granulócitos, os mieloblastos são os primeiros precursores morfologicamente reconhecidos e formam, na sequência, promielócitos, mielócitos, metamielócitos, bastonetes e formas segmentadas maduras. Mieloblasto Promielócito Mielócito Metamielócito Batonete Segmentado Figura 15 – Células da granulopoese 25 HEMATOLOGIA CLÍNICA As principais características morfológicas estão resumidas no quadro a seguir. Quadro 3 – Principais características morfológicas dos neutrófilos Célula Principais características Mieloblasto Cromatina rendilhada, nucléolos (um ou mais) podem estar evidentes no núcleo, citoplasma é levemente basofílico e os grânulos podem estar presentes ou não Promielócito Núcleo redondo ou oval com cromatina delicada ou levemente condensada. Citoplasma basofílico com presença de grânulos (azul-violáceo e vermelhos). Complexo de Golgi visível na forma de área perinuclear mais clara Mielócito Ligeiramente menores que os promielócitos. Núcleo oval ou redondo, às vezes, excêntrico. Cromatina com moderado grau de condensação. Nucléolos não são mais visíveis. Citoplasma com quantidade moderada de grânulos vermelho-arroxeados Metamielócito Menores que os mielócitos. Núcleo em forma de rim. Citoplasma claro com grânulos finos característicos de cada linhagem Bastonete Núcleo não segmentado em formato de bastão. Citoplasma abundante, claro e contendo granulação fina e bem distribuída Segmentado Núcleo lobulado (3 a 4 lóbulos) conectados por uma fina ponte de cromatina. Cromatina condensada, cor roxa e organizada em grumos Adaptado de: Palmer et al. (2015). Na medula óssea, mieloblastos, promielócitos e mielócitos apresentam a capacidade de proliferação e, assim, constituem o compartimento mitótico. A partir de metamielócitos, as células não podem proliferar, apenas sofrem maturação até originarem as formas maduras vistas no sangue periférico. Dessa forma, verifica-se a característica hierárquica da granulopoese à medida que o númerode células maduras é maior do que o número de células do compartimento proliferativo. O processo de granulopoese na medula óssea leva cerca de sete a dez dias para ocorrer e um metamielócito demora cerca de cinco a sete dias para sair do estágio de metamielócito e atingir a corrente sanguínea como neutrófilo maduro. Entretanto, alguns estímulos podem modular esse tempo, por exemplo, na vigência de infecções, o metamielócito pode atingir o sangue periférico em 48 horas e também pode ocorrer aumento do número de células produzidas, pois o tempo de maturação será diminuído devido à necessidade de células no local da infecção (LORENZI, 2006). As principais citocinas que regulam a granulopoese são SCF, IL-3, GM-CSF e G-CSF. O CSF estimula a proliferação de células-tronco e em combinação com IL-3, estimula a proliferação de progenitores hematopoéticos primitivos (progenitores mieloide e linfoide). O fator estimulador 26 Unidade I de colônia granulocítica (G-CSF) estimula a produção somente de neutrófilos e o fator estimulador de colônia granulo-monocítica (GM-CSF) estimula a produção de neutrófilos, monócitos e eosinófilos (OLIVEIRA, 2007). Os eosinófilos também são originados a partir do progenitor mieloide presente na medula óssea e, quando maduros, migram para o sangue periférico, onde permanecem por 18 horas antes de migrarem para os tecidos. A principal citocina que regula a produção dos eosinófilos é a IL-5, produzida pelos linfócitos T, que apresentam resposta Th2. Os basófilos são granulócitos do sangue periférico que podem ser recrutados em alguns tecidos onde há foco inflamatório. Entretanto, essas células não residem nos tecidos. As células que residem nos tecidos são os mastócitos, que são originadas dos basófilos que não estão completamente maduros no sangue periférico. Os mastócitos podem ser encontrados próximos a vasos sanguíneos, nervos e tecido conjuntivo. As citocinas IL-3, IL-2, IL-4, IL-5 e IL-8 podem modular a função dos basófilos e induzir a liberação de mediadores em resposta a IgE. 1.2.3 Linfopoese Nesse processo, são produzidos os linfócitos B, T e NK. A célula-tronco hematopoética pluripotente sobre estímulo de SCF, IL-3, IL-11 e IL-7 prolifera e origina a célula progenitora linfoide que, por sua vez, origina os progenitores linfoides comuns ou linfoblastos, que são as primeiras células morfologicamente reconhecíveis da linhagem linfocitária. O amadurecimento do linfoblasto origina o prólinfócito e, finalmente, o linfócito maduro é formado. A proliferação e maturação dos linfócitos B ocorrem na medula óssea, enquanto os linfócitos T migram para o timo, onde ocorre o processo de maturação. Na medula óssea, os linfócitos B podem ainda se diferenciar em plasmócitos, processo que ocorre quando um linfócito B encontra o antígeno no órgão linfoide secundário. Os pró-linfócitos B migram para os tecidos linfoides e formam os compartimentos típicos desses órgãos (SANTOS, 2013). Os linfoblastos do tipo T estão predominantemente no timo, onde sofrem maturação e originam os pró-linfócitos T, que se dirigem ao baço onde formam a bainha periarterial da polpa branca. Os pró-linfócitos T também se dirigem aos linfonodos onde formam a zona paracortical. A partir dos linfoblastos também são formados os pró-linfócitos NK, que amadurecem e originam os linfócitos NK, os quais, por sua vez, não migram para órgãos linfoides e podem ser encontrados no sangue periférico. As principais interleucinas que regulam a linfopoese são IL-6 e IL-7, que participam da proliferação dos precursores de linfócitos B e IL-2 e IL-3, que colaboram com a proliferação dos linfócitos T (SANTOS, 2013). 1.2.4 Monopoese Os monoblastos são os primeiros precursores da linhagem monocítica morfologicamente reconhecíveis, são formados a partir dos progenitores multipotentes. O monoblasto origina o 27 HEMATOLOGIA CLÍNICA promonócito, que é uma célula menor que o monoblasto. O promonócito origina o monócito, que pode formar macrófagos e o sistema monocítico fagocitário ou, ainda, formar os osteoclastos, que são a união de vários monócitos. Em condições fisiológicas, o processo de monopoese da medula óssea até o sangue periférico leva cerca de 13 horas para ocorrer. As principais citocinas que participam do processo são IL-3, IL-6, GM-CSF e o fator estimulador de colônia monocítica (M-CSF). Na circulação, os monócitos exibem meia-vida de entre 8 e 70 horas. Na presença de inflamação, os monócitos migram para os tecidos e se transformam em macrófagos; mas na ausência de estímulos inflamatórios, os monócitos são encontrados na medula óssea e no sangue periférico (LORENZI, 2006). 1.2.5 Plaquetopoese A plaquetopoese ou megacariocitopoese é o processo de proliferação e diferenciação dos megacariócitos que originam as plaquetas. A célula-tronco hematopoética origina o progenitor mieloide comum denominado unidade formadora de colônia de granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócitos (CFU-GEMM), que, por sua vez, se desenvolve em unidade formadora de colônia megacariocítica (CFU-Meg). Os megacarioblastos são as primeiras células reconhecidas morfologicamente na medula óssea e apresentam tamanho avantajado, núcleo grande em relação ao citoplasma, com presença de nucléolos, e o citoplasma é basofílico. Na sequência, os megacarioblastos se diferenciam em megacariócitos, que se caracterizam por apresentarem núcleo lobulado, que se torna poliploide à medida que a célula amadurece. Nos megacariócitos, ocorre um processo denominado endomitose, ou seja, ocorre a síntese de DNA sem ocorrer a divisão celular, então, conforme a célula matura, o número cromossômico aumenta (poliplodia) 8N, 16N, 32N e até 64N (ao invés do habitual 2N), o que confere um grande volume para a célula com cromatina abundante, sem, no entanto, ocorrer a divisão nuclear. Ocorre assincronismo de maturação entre o núcleo e o citoplasma, pois o citoplasma amadurece mais tardiamente, o que confere grande variação morfológica à série megacariocítica na medula óssea (OLIVEIRA; POLI NETO, 2004). O tempo de amadurecimento do megacariócito na medula óssea é de cinco dias e, na sequência, ocorre a fragmentação do citoplasma, o que origina as plaquetas. A plaquetopoese é controlada pelas citocinas IL-3 nos estágios mais precoces e pela IL-6 e IL-11 de modo sinérgico, com IL-3 e trombopoetina (TPO) em todo processo. A TPO é produzida pelos hepatócitos e sinusoides hepáticos e em células do túbulo proximal do rim. Esse hormônio atua na formação de grânulos específicos das plaquetas, na expressão de proteínas específicas da membrana plaquetária e na endomitose. 28 Unidade I Figura 16 – Megacariócito em aspirado de medula óssea 2 HEMOGRAMA O hemograma é um dos exames mais solicitados pelos médicos nos exames de rotina. E, talvez, você já tenha ouvido falar em hemograma completo, como se o segundo exame fosse mais minucioso que o primeiro. Contudo, esse termo é redundante, pois o hemograma já é o exame completo, ou seja, não há distinção de termos. Entretanto, em alguns casos, o clínico pode solicitar apenas a contagem de plaquetas, principalmente em pacientes internados, que necessitam de monitorização do número de plaquetas com maior frequência. Esse exame fornece informações quantitativas e qualitativas das linhagens eritroide, leucocitária e plaquetária, que auxiliam na determinação do diagnóstico do paciente, quando em conjunto com outros exames. As informações fornecidas no hemograma permitem avaliar se a medula óssea está produzindo um número adequado de células ou, ainda, se os processos de proliferação e diferenciação estão ocorrendo normalmente em todas as linhagens. Essas questões podem ser respondidas a partir da interpretação dos valores de contagens de hemácias, leucócitos e plaquetas, índices hematimétricos, contagem diferencial de leucócitos e análise dos aspectos morfológicos das células pela microscopia óptica. 29 HEMATOLOGIA CLÍNICA Série vermelha ResultadoValor referênciaMasc: acima de 16 anos Eritrócitos 6,57 milhões/mm3 4,30 a 5,70 Hemoglobina 13,1 g/dL 13,5 a 15,5 Hematócrito 41,8% 39,0 a 50,0 HCM 19,9 pg 26,0 a 34,0 VCM 63,5 fL 81 a 95 CHCM 31,3 g/dL 31 a 36 RDW 18,1 % 11,8 a 15,6 Caracteres morfológicos: Microcitose moderada; poiquilocitose discreta Série branca Resultado % /mm3 Valor referência (Masc. acima de 16 anos) %mm3 Leucócitos 8.120 3.500 a 10.500 Neutrófilos 51,1 4.150 1.700 a 7.000 Eosinófilos 1,2 100 50 a 500 Basófilos 0,6 50 0 a 300 Linfócitos 37,9 3.080 900 a 2.900 Monócitos 9,2 750 300 a 900 Caracteres morfológicos: Granulações tóxicas pouco abundantes em alguns neutrófilos; não foram observadas atipias linfocitárias Plaquetas Resultado Valor referência (Masc. acima de 16 anos) %mm3 Total de plaquetas 300.000/mm3 150.000 a 450.000/mm3 VPM 10,6 9,2 a 12,6 fL Figura 17 – Exemplo de hemograma. Hemoglobina corpuscular média (HCM); volume corpuscular médio (VCM); concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM); amplitude de distribuição dos eritrócitos (RDW); volume plaquetário médio (VPM) O hemograma pode ser realizado através de técnicas manuais ou por meio de automação. Caso seja realizado sem a utilização de contadores automatizados, serão necessários, pelo menos, três equipamentos: espectrofotômetro, microscópio e microcentrífuga. No microscópio, com o auxílio da câmara de Neubauer e diluentes específicos, é possível fazer a quantificação de hemácias, leucócitos e plaquetas. Também pode ser realizada, em esfregaço sanguíneo corado, a contagem diferencial de leucócitos, ou seja, a identificação de cada subtipo e as 30 Unidade I avaliações qualitativas de hemácias, leucócitos e plaquetas. No espectrofotômetro e com o líquido de Drabkin, é realizada a quantificação da hemoglobina e na microcentrífuga é realizado o hematócrito (OLIVEIRA, 2007). Caso o hemograma seja realizado de forma automatizada, existem muitos equipamentos disponíveis no mercado, com princípios diferentes. Desde o primeiro modelo de contador automatizado, desenvolvido na década de 1950, até os dias atuais, verifica-se uma grande evolução tecnológica na realização do hemograma. A contagem de plaquetas nos contadores automatizados foi incorporada na década de 1970 e a contagem diferencial de leucócitos teve progresso a partir dos anos 1980, principalmente com a contribuição da citometria de fluxo e da citoquímica aos sistemas de identificação de células sanguíneas. Além disso, novos parâmetros vêm sendo incorporados ao hemograma, o que possibilita ampliar o número de informações fornecidas e, consequentemente, melhorar o diagnóstico de um número considerável de patologias. A figura a seguir exemplifica um contador hematológico totalmente automático, que permite a liberação de até 33 parâmetros. Figura 18 – Sistema de hematologia ADVIA® 2120i Disponível em: https://bit.ly/3d1t9r6. Acesso em: 22 jun. 2021. Saiba mais Vale a pena conhecer o princípio de funcionamento de um contador hematológico. Para entender como funciona, assista à animação a seguir. HAEMATOLOGY Analyzer working principle. 1 vídeo (2 min.). Publicado pelo canal Innovative Learner. Disponível em: https://bit.ly/3qjaeNB. Acesso em: 22 jun. 2021. 31 HEMATOLOGIA CLÍNICA Independentemente da metodologia utilizada, a amostra de sangue utilizada para realização do hemograma deve ser coletada em tubo contendo o anticoagulante (EDTA), que preserva a morfologia das células após a coloração com os corantes panópticos, e o tempo entre coleta e realização do exame não deve ser superior a duas horas. Não há necessidade de jejum para a realização do hemograma. Alguns valores de referência são diferentes para homens, mulheres, recém-nascidos e crianças. Gestantes também apresentam valores diferentes. Esses valores de referência, assim como o tipo de amostra e a metodologia utilizada, devem, obrigatoriamente, constar no resultado do exame. Vejamos agora os parâmetros avaliados em cada série. 2.1 Série eritrocitária A série eritrocitária fornece dados sobre a contagem de eritrócitos, a concentração de hemoglobina e o hematócrito. A partir desses valores, são calculados os índices hematimétricos: hemoglobina corpuscular média, volume corpuscular médio e concentração de hemoglobina corpuscular média. Outro parâmetro fornecido por alguns equipamentos, mas que não pode ser calculado, é a amplitude de distribuição dos eritrócitos (RDW, de red distribution widht). O RDW é um parâmetro que indica a presença de anisocitose e é obtido a partir do histograma de distribuição das hemácias de acordo com o volume das células, é expresso em porcentagem. Valores elevados de RDW indicam a presença de população eritrocitária heterogênea, ou seja, formada por células de diferentes tamanhos. O número de hemácias pode ser quantificado a partir da diluição de uma alíquota de sangue em câmara de Neubauer. O número de hemácias, geralmente, está diminuído nas anemias, mas não deve ser utilizado para o diagnóstico de anemias, pois há anemias nas quais verifica-se diminuição da concentração de hemoglobina previamente à diminuição do número de hemácias. Ao contrário, nas policitemias, verifica-se aumento do número de hemácias. As policitemias serão abordadas na próxima unidade, pois trata-se de uma doença mieloproliferativa. A partir do valor de hemoglobina, é possível estabelecer o diagnóstico de anemia. Define-se anemia quando o valor de hemoglobina é menor que 13 g/dL em homens, menor que 12 g/dL em mulheres e menor que 11g/dL em gestantes e crianças. Tabela 1 – Valores de hemoglobina para diagnóstico de anemia Diagnóstico de anemia Hemoglobina Homens adultos < 13 g/dL Mulheres adultas < 12 g/dL Gestantes e crianças < 11 g/dL Adaptada de: WHO (2021). 32 Unidade I O hematócrito corresponde ao percentual de hemácias que ocupam um determinado volume de sangue. Esse parâmetro é proporcional à quantidade de hemoglobina presente no sangue, assim, encontra-se diminuído nas anemias e elevado nas desidratações (redução do volume de plasma) ou nas policitemias. Vejamos como calcular os índices hematimétricos e como interpretá-los. Ao realizar o cálculo, não utilizar a potência 106 (OLIVEIRA, 2007). Figura 19 – Fórmulas dos índices hematimétricos Fonte: Oliveira (2007). Exemplo de aplicação Qual é o valor de HCM de um paciente que apresenta 4,6 x 106 hemácias/mm3 e hemoglobina igual a 11,5 g/dL? Ao aplicarmos a fórmula HCM=Hb/He x 10, obtemos HCM=11,5/4,6 x 10. Assim, o valor de HCM é 25 fL. A HCM é a média do conteúdo (peso) de hemoglobina de uma população de hemácias. Veja que estamos falando de conteúdo e não de concentração. A concentração de uma solução é a proporção do soluto em relação ao solvente, assim, o peso é calculado como o produto da porcentagem de soluto pelo volume. Então, o conteúdo de hemoglobina de uma hemácia corresponde ao HCM. Entretanto, a média da concentração de hemoglobina corresponde ao CHCM. O CHCM é utilizado para avaliar a hipocromia. O peso (conteúdo) de hemoglobina em uma hemácia depende do seu volume e da concentração de hemoglobina. Assim, ocorre aumento de HCM nos casos de macrocitose com CHCM normal (anemia macrocítica e normocrômica) ou, simplesmente, macrocíticas. É errado denominar anemia macrocítica e hipercrômica, apenas por apresentarem HCM aumentado (células maiores e mais pesadas), pois são células com concentrações normais de hemoglobina (CHCM normal) e, portanto, normocoradas. 33 HEMATOLOGIA CLÍNICA O VCM corresponde à média dos volumes de uma população de hemácias, expresso em fentolitros (fL). É obtido pela divisão do volume de eritrócitos (hematócrito) pelo número de eritrócitos que ocupam esse volume. Nas anemias microcíticas, o VCM é menor que 80 fL, nas anemias macrocíticas, é maior que 100 fL; e nas normocíticas, está entre 80 e 100 fL, o que não isenta a presença de micrócitos e/ou macrócitos, pois trata-se de uma média (BAIOCCHI; PENNA, 2019). MacrocíticaVCM > 100 fL Normocítica 80 < VCM > 100 fL Microcítica VCM < 80 fL Figura 20 – Hemácias microcíticas, normocíticas e macrocíticas A CHCM é o índice que avalia a cor dos eritrócitos e corresponde à média das concentrações internas de hemoglobina em uma população de eritrócitos. Hemácias hipocrômicas possuem baixa concentração de hemoglobina, já hemácias como esferócitos e drepanócitos são superconcentrados de hemoglobina (hipercrômicos), ou seja, apresentam CHCM elevado. A partir dos valores de HCM e VCM, é possível classificar a anemia do paciente. Por exemplo, um paciente com anemia e valores diminuídos de VCM e HCM apresenta anemia microcítica e hipocrômica. Quando o VCM e HCM estiverem dentro da faixa de normalidade, a anemia é normocítica e normocrômica, e se o VCM estiver elevado (não há HCM elevado), a anemia é classificada como macrocítica. Vejamos, no quadro a seguir, as unidades utilizadas nas determinações básicas da série vermelha. Quadro 4 – Unidades utilizadas nas determinações básicas da série vermelha Parâmetro Unidade Número de hemácias (He) 106/mm3 Hemoglobina (Hb) g/dL Hematócrito (Ht) % Hemoglobina corpuscular média (HCM) pg Volume corpuscular médio (VCM) fL Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) % Amplitude de distribuição dos eritrócitos (RDW) % 34 Unidade I Exemplo de aplicação Nas anemias microcíticas, que apresentam valor de hemácias menor que 5 x 106/mm3 e RDW elevado, o diagnóstico de anemia ferropriva é mais provável. Enquanto anemias com valor de hemácias superior a 5 x 106/mm3 e RDW normal ou pouco elevado são indicativos de investigação para traço talassêmico. RDW alterado também pode indicar a presença de dupla população, presentes, por exemplo, em pacientes transfundidos. As anormalidades reportadas pelos equipamentos devem ser confirmadas pela microscopia. A leitura em microscópio dos esfregaços sanguíneos tem como objetivo identificar as anormalidades de tamanho, forma, conteúdo de hemoglobina e presença de inclusões. A notificação das alterações morfológicas fornece informações importantes para o clínico e devem ser quantificadas de acordo com a política de cada laboratório. A análise qualitativa dos eritrócitos é realizada por microscopia e os graus de alterações das hemácias é descrito em cruzes (+ a +++) que correspondem a (+) presença discreta, (++) presença moderada, (+++) presença intensa. Vejamos as alterações morfológicas existentes e as principais patologias associadas (Palmer et al., 2015). Normal Eliptócito Estomatócito Macrócito Hemácia “mordida“ Drepanócito (falciforme) Micrócito Dacriócito Esquizócito Em alvo Equinócito (crenada) Acantócito Figura 21 – Alterações em hemácias Em quais patologias podemos verificar as alterações citadas? 35 HEMATOLOGIA CLÍNICA • Hemácia macrocítica: anemias megaloblásticas, anemias hemolíticas, megaloblásticas, doenças hepáticas, alcoolismo e decorrente do uso de determinadas medicações. Figura 22 – Hemácias macrocíticas • Hemácia microcítica: tamanho diminuído. Presente na anemia por deficiência de ferro, talassemias, doenças crônicas, hipertireoidismo e intoxicação por chumbo. Figura 23 – Hemácia microcítica e hipocrômica (ponta da seta) • Hemácias em alvo: hemoglobinopatias. talassemias, icterícia obstrutiva e doenças hepáticas. Figura 24 – Hemácia em alvo (ponta da seta) 36 Unidade I • Hemácias “mordidas”: ocorrem em consequência da hemólise oxidativa, presentes na anemia por deficiência de glicose-6-fosfato-desidrogenase, na anemia microangiopática ou no dano mecânico. Figura 25 – Hemácia “mordida” (ponta da seta) • Dacriócitos ou hemácias em lágrima: talassemia maior e mielofibrose. Figura 26 – Dacriócito (ponta da seta) • Hemácias crenadas: pode ser artefato (demora em realizar o esfregaço), hepatopatias, queimaduras extensas e deficiência de enzimas eritrocitárias. Figura 27 – Hemácias crenadas (ponta da seta) 37 HEMATOLOGIA CLÍNICA • Estomatócito: pode estar presente nas hepatopatias e na estomatocitose hereditária. Figura 28 – Estomatócito (ponta da seta) • Drepanócitos (hemácia em formato de foice): doença falciforme. Figura 29 – Drepanócitos (ponta da seta) • Esquizócitos ou hemácias fragmentadas: hemólise mecânica (próteses cardíacas) e sindrome hemolítico-urêmica. • Acantócitos: desnutrição, distúrbios metabólicos e secundários a doenças hepáticas • Eliptócito: apresentam forma elíptica (o eixo maior é o dobro do eixo menor). Quando o eixo maior é menor que o dobro do menor, as hemácias são denominadas ovalócitos. Além das alterações citadas, a presença de inclusões e microrganismos deve ser reportada no hemograma. Vejamos as principais alterações: • Howell-Jolly: são inclusões basofílicas, pontuais, de formato redondo resultado da fragmentação do DNA. Aparecem em pacientes esplenectomizados e pacientes com anemia falciforme. • Pontilhado basófilo: talassemias, anemias ferropriva e hemolíticas. 38 Unidade I • Corpúsculo de Pappenheimer: pós-esplenectomia, anemias hemolíticas e intoxicação pelo chumbo. • Anel de Cabot: anemias megaloblásticas e intoxicação por chumbo. • Corpúsculos de Heinz: talassemias e Hb instável. • Rouleaux: doenças do colágeno, hiperfibrinogenemia. Entre os microrganismos que podem estar presentes nas hemácias, destacam-se as espécies de Plasmodium em pacientes com malária. Saiba mais Para saber sobre as recomendações para liberação das alterações em eritrócitos, leia o artigo a seguir. PALMER, L. et al. ICSH recommendations for the standardization of nomenclature and grading of peripheral blood cell morphological features. International Journal of Laboratory Hematology, v. 37, n. 3, p. 287-303, 2015. Disponível em: https://bit.ly/3gUQlbv. Acesso em: 30 jul. 2021. 2.2 Na série leucocitária Na avaliação da série leucocitária, também conhecida como leucograma, são realizadas as contagens global e diferencial (valores relativos e absolutos) dos leucócitos e a avaliação morfológica, principalmente, de neutrófilos e linfócitos. A contagem global de leucócitos pode ser realizada manualmente a partir da diluição de uma alíquota de sangue em líquido de Turk e contagem em câmera de Neubauer. Em adultos, os valores de referência estão entre 3.500 e 11.000/mm3. Quando o número de leucócitos está acima do limite superior, denomina-se leucocitose, e valores abaixo do limite inferior denominam-se leucopenia. Na contagem diferencial, são identificados os subtipos de leucócitos. Lembrete No sangue periférico de um indivíduo saudável, estão presentes neutrófilos bastonetes, segmentados, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos. 39 HEMATOLOGIA CLÍNICA No esfregaço de sangue, são contados cem leucócitos, o que corresponde a 100% das células. A partir da quantificação dos subtipos de leucócitos, são obtidos os valores relativos (em porcentagem). O valor absoluto corresponde ao produto do valor global de leucócitos pela porcentagem. Apesar do avanço tecnológico dos equipamentos em relação à identificação das formas neutrofílicas jovens, recomenda-se a revisão morfológica das lâminas de sangue de pacientes que apresentarem alterações quantitativas. A análise morfológica permite a identificação de neutrófilos jovens (bastonestes, metamielócitos, mielócitos e promielócitos), granulações tóxicas e vacúolos citoplasmáticos, características presentes no caso das infecções bacterianas. Presença de inclusões anormais, como as vistas nas anomalias de Chediak-Higashi, May-Hegglin, Alder, entre outras. Também possibilita a identificação de blastos (células jovens presentes nas leucemias agudas), verificação de atipias linfocitárias (aumento de tamanho, cromatina nuclear muito frouxa ou muito condensada, núcleo clivado, entre outros), características que podem indicar presença de infecção viral ou neoplasias (linfomas, LLC etc). Vale a pena ressaltar que algumas patologias estimulam a liberação de eritroblastos (mais frequentemente, policromáticose ortocromáticos) para o sangue periférico e, quando isso acontece, a leucometria deve ser corrigida. Alguns equipamentos já reconhecem esses precursores eritroides e realizam automaticamente a correção da leucometria, mas quando a quantificação é realizada manualmente, devemos realizar esse cálculo. Lembrete Eritroblastos policromáticos e ortocromáticos são formas eritroides mais imaturas presentes na medula óssea e que dão origem a reticulócitos. Essas células apresentam núcleo e, por isso, alguns equipamentos podem contá-las como leucócitos. 2.3 Série plaquetária A quantificação de plaquetas é especialmente importante para o diagnóstico das plaquetopenias, monitoramento da quimioterapia e cirurgias. Na série plaquetária, rotineiramente, é avaliado o número total de plaquetas, que deve estar entre 150.000 e 450.0000/mm3. Valores de plaquetas abaixo de 150.000/mm3 denomina-se plaquetopenia (trombocitopenia) e valores acima de 450.000/mm3 são designados de plaquetose (trombocitose). 150.000 - 450.000/mm3 Trombocitopenia Plaquetopenia Trombocitose Plaquetose Figura 30 – Nomenclatura das alterações quantitativas em plaquetas 40 Unidade I A contagem precisa de plaquetas é um desafio na rotina laboratorial, pelas propriedades das plaquetas de adesão e agregação. Por esses motivos, a contagem manual em câmara de Neubauer não é recomendada, apesar de ainda ser utilizada em alguns laboratórios. A técnica de Fônio também tem sido abandonada na rotina laboratorial. Nesse caso, o número de plaquetas é estimado a partir da contagem em lâmina corada, o que não fornece um resultado exato (LORENZI, 2006). As plaquetas podem ser quantificadas em câmara de Neubauer utilizando-se solução de cloreto de amônio como líquido diluente, por automação a partir do princípio da impedância (método utilizado há muitos anos em vários contadores hematológicos) ou, ainda, através de método imunológico usando marcadores de plaquetas (CD61/CD41), que é o método de referência para contagem de plaquetas. Nessa última técnica, os receptores específicos da superfície das plaquetas ligam-se a anticorpos monoclonais conjugados a anticorpos monoclonais fluorescentes. A utilização de anticorpos monoclonais diminui a possibilidade de serem contados como plaquetas pequenos fragmentos, restos de células e microrganismos. Alguns equipamentos fornecem o valor do VPM, que é análogo ao RDW para hemácias. O aumento do VPM indica presença de plaquetas com volume aumentado. As plaquetas maiores apresentam maior facilidade de agregação plaquetária e formação de trombo, ou seja, favorecem os processos trombóticos. As alterações de tamanho devem ser reportadas no hemograma, pois são relevantes para as correlações clínicas. A plaqueta normal mede cerca de 1,5 a 3 µm de diâmetro, enquanto as macroplaquetas medem entre 3 e 7 µm e as plaquetas gigantes têm tamanho maior que uma hemácia, cerca de 10 a 20 µm. A presença de macroplaquetas pode ocorrer em problemas cardiovasculares, diabetes mellitus, hipertireoidismo, doenças inflamatórias e trombose. Já as plaquetas gigantes podem ocorrer nessas patologias, mas também na Síndrome de Bernard Soulier, entre outras. Figura 31 – Macroplaqueta (ponta da seta) 41 HEMATOLOGIA CLÍNICA Outra correlação interessante é a que pode ser realizada entre o número de plaquetas e o VPM. Sugere-se que as plaquetopenias de origem medular apresentam VPM reduzido, enquanto que as decorrentes de destruição periférica apresentam valores elevados de VPM, refletindo a liberação precoce na circulação de plaquetas mais jovens e de maior volume. Em algumas amostras de sangue, o anticoagulante EDTA-K2 pode induzir a formação de agregados plaquetários causando pseudo-trombocitopenia. Nesses casos, uma nova coleta de sangue deve ser solicitada, mas em tubo contendo citrato como anticoagulante. Estudaremos o satelitismo plaquetário mais adiante. Assim, concluímos que embora o hemograma não permita a conclusão da hipótese diagnóstica, ele fornece informações importantes para a avaliação de doenças hematológicas e o monitoramento terapêutico. Cada vez mais, novos parâmetros são desenvolvidos nos contadores automatizados e, quando interpretados, podem diminuir tempo e gastos para a conclusão do diagnóstico da patologia apresentada pelo paciente. 3 ERITRÓCITOS O eritrócito maduro é um disco bicôncavo com borda externa mais espessa em relação à parte central. Essa característica se torna evidente após coloração de uma extensão sanguínea, o que permite a visualização de uma forma circular, plana e uniforme, com discreta região central mais clara. O volume médio é de 90 fL (85 a 95 fL) e concentração interna de hemoglobina de 33 a 34 g/dL. Um indivíduo adulto, do gênero masculino, tem cerca de 5.000.000 de hemácias/mm3 e cada hemácia, por sua vez, contém cerca de 300.000.000 de moléculas de hemoglobina. O eritrócito não apresenta mitocôndrias, portanto, não realiza cadeia respiratória. Então como obtém energia? A partir da conversão de glicose em lactato, o que permite um baixo rendimento de ATP. Na hemácia, a via metabólica de suma importância é a via das pentoses, na qual ocorre formação de NADPH. Esse é importante para a manutenção das proteínas no estado reduzido (evita a precipitação da hemoglobina e perda de lipídios da membrana). 3.1 Membrana dos eritrócitos A membrana da hemácia é uma bicamada de lipídios e proteínas. Os principais lipídios são o colesterol e os fosfolipídios (fosfatidilcolina, esfingomielina, fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina). Os lipídios conferem flexibilidade à hemácia e fluidez da matriz da membrana onde estão as proteínas transmembranas. Essas proteínas são classificadas em integrais e periféricas. As proteínas integrais compreendem a proteína banda 3 (transportadora de íons) e as glicoforinas A, B, C, D, que auxiliam na estabilização do citoesqueleto através de ligações com a proteína 4.1 (presente na face interna da membrana). Das proteínas integrais, tem grande destaque a proteína banda 3, que apresenta um domínio citoplasmático que interage com muitas proteínas periféricas: anquirina, proteína 4.1, proteína 4.2 e enzimas (aldolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, fosfofrutoquinase), que regulam a interação do citoesqueleto com enzimas glicolíticas. Já as proteínas 42 Unidade I periféricas formam o citoesqueleto da membrana, são estas: espectrina, actina, anquirina, proteínas 4.1 e 4.9 (MURADOR; DEFFUNE, 2007). Defeitos na estrutura dessas proteínas estão associados a diversas doenças, por exemplo, eliptocitose e esferocitose, que são anemias hereditárias. Meio intracelular Proteína banda 3 Glicoforina C Membrana Anquirina Actina Interação horizontal 4.2 4.1 a-espectina β-espectina Figura 32 – Estrutura da membrana da hemácia Adaptada de: Bennett e Healy (2008). 3.2 Hemoglobina A hemoglobina é uma proteína quartenária, sintetizada nos eritroblastos e nos reticulócitos e é formada por quatro cadeias globínicas, nas quais se encontra um grupo prostético, o grupo heme. A síntese do grupo heme foi detalhada em bioquímica metabólica e, de forma sucinta, trata-se de um conjunto de reações catalisadas por diferentes enzimas que resultam na incorporação do ferro (Fe+2) no centro da protoporfirina IX. Em relação às cadeias globínicas, a falta de ferro na formação da hemoglobina resulta em anemia. As cadeias globínicas são diferentes de acordo com a fase de formação do indivíduo. Na fase embrionária, ocorrem Gower I (ζ2ε2), Gower II (a2ε2), Portland (γ2ζ2) e Fetal (HbF) (a2γ2). Durante o período fetal, cerca de 90% corresponde a hemoglobina Fetal (Hb F) (a2γ2); a hemoglobina do adulto (Hb A) (a2β2) corresponde a menos de 10%; e o restante, cerca de 2,5%, corresponde a HbA2 (a2γ2). Após o sexto mês de vida, a criança passa a apresentar os mesmos tipos de hemoglobina do adulto, ou seja, HbA (a2β2) de 96 a 98%, HbA2 (a2γ2) 2,5 a 3,5% e a Hb F (a2γ2) menor que 2%. Confira as diferentes
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