1 Coloração de Gram

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CURSO BACHARELADO EM FARMÁCIA 
 
Disciplina: Microbiologia Geral e Clínica 
Professora: Dra. Narlize Silva Lira Cavalcante 
 
Roteiro de Aula Prática - Técnicas de Coloração 
 
 
Aula 01: Coloração de Gram 
 
1. Introdução: 
 
A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico 
dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, que consiste no tratamento sucessivo de um 
esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com o reagente cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fucsina 
básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas 
e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas, baseando-se nas diferenças 
da parede celular. Assim a parede celular das bactérias Gram positivas é formada por uma camada 
espessa de peptideoglicano, enquanto que a parede celular das Gram negativas é formada por uma 
camada fina de peptideoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacarídeo e proteínas. 
Diferenças na permeabilidade dessas membranas aos reagentes químicos, levam a diferenças de 
coloração. Embora a grande maioria das bactérias possa ser corada por tal método, algumas não o 
fazem satisfatoriamente, exigindo técnicas especiais de coloração. As bactérias Gram-positivas coram-
se em roxo e as Gram-negativas em vermelho. A coloração de Gram é um dos mais importantes 
métodos de coloração utilizados em laboratório de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase 
sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. O método de Gram é utilizado 
na maioria das infecções bacterianas, permitindo o diagnóstico de algumas delas com bastante 
segurança. Porém não se aplica para micoplasmas, bactérias desprovidas de parede, micobactérias 
pela presença de muitos lipídeos insolúveis na parede e espiroquetas pela estrutura muito delgada e 
pouco permeável aos corantes. 
 
2. Objetivo: 
 
• Confeccionar uma lâmina e utilizar a técnica de Gram; 
 
 
 
 
 
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• Reconhecer bactérias Gram-positivas e Gram-negativas ao microscópio; 
• Compreender a importância dessa coloração para a microbiologia clínica; 
• Compreender cada etapa do processo de coloração, bem como a função de cada substância 
utilizada. 
 
3. Material: 
 
• Lâminas para a preparação do esfregaço; 
• Swab estéril, para coletar o material biológico 
• Bico de Bunsen 
• Cristal Violeta 
• Lugol 
• Álcool-Acetona 
• Fucsina 
• Papel de filtro 
• Microscópio 
 
4. Preparação do Esfregaço: 
 
• Limpar uma lâmina de vidro (passar algodão embebido em álcool); 
• Usando o swab, friccionar a superfície da mucosa oral e fazer um esfregaço circular na 
superfície de uma lâmina, formando um esfregaço fino e uniforme; 
• Deixar a lâmina secar à temperatura ambiente; 
• Realizar a fixação, passando de duas a três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. 
 
5. Técnica da coloração de Gram: 
 
• Cobrir o esfregaço bacteriano com cristal violeta, deixar 1 minuto e verter o corante na cuba; 
• Remover o excesso da solução de cristal violeta da lâmina, lavando-a levemente com água 
corrente; 
• Cobrir o esfregaço com solução de lugol, deixar por 1 minuto e retirar a seguir, lavando com 
um filete de água; 
• Descorar o esfregaço usando uma solução de álcool acetona, rapidamente (10 a 15 segundos). 
 
 
 
 
 
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• Lavar com água corrente, imediatamente; 
• Cobrir o esfregaço com a Fucsina, deixar por 30 segundos e retirar; 
• Lavar com água corrente; 
• Secar com papel absorvente; 
• Observar a lâmina: Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço corado e observar 
a lâmina no microscópio, com objetiva de 100x 
 
6. Como utilizar o microscópio ótico: 
 
• Descer a platina e colocar na objetiva de menor aumento, caso não esteja. 
• Colocar a lâmina sobre a platina. Aproximar a lâmina da lente objetiva de 10X com o auxilio do 
macrométrico até focalizar a imagem. Tome cuidado para que a objetiva não toque a lâmina. 
• Após a focagem na objetiva de menor aumento, girar o revólver para a próxima objetiva (40X). 
Ao mudar de objetiva, ajuste novamente a focagem, utilizando o micrométrico. 
• Definido o campo, colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observar ao 
microscópio com a lente objetiva de imersão (100X). 
• Usar óleo de imersão somente na objetiva de 100X. Após a utilização limpar a objetiva com 
papel macio. 
 
7. Exercício Prático: 
 
• Preparar um esfregaço com o material biológico e corar pelo método de Gram. Visualizar e 
esquematizar a morfologia das bactérias existentes nas lâminas; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lâmina 01: Material Biológico Coloração de Gram 
 
 
 
 
 
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8. Interpretação das Relações pelo Método de Gram: 
 
 
Solução e Ordem de Aplicação 
Reação e Aspecto das Bactérias 
Gram-positivas Gram-negativas 
1. Cristal Violeta 
Coradas em violeta Coradas em violeta 
2. Solução de Lugol 
Formação do complexo CV-I no 
interior da célula, que 
permanece violeta 
Formação do complexo 
CV-I no interior da célula, 
que permanece violeta 
3. Álcool Acetona 
Desidratação da parede celular, 
diminuição da porosidade e da 
permeabilidade; o complexo CV-
I não pode sair da célula, que 
permanece violeta 
Dissolve a membrana 
externa da parede 
celular, aumento da 
porosidade; o complexo 
CV-I é removido da célula 
4. Fucsina ou Safranina 
A célula não é afetada, 
permanecendo violeta 
A célula adquire o 
corante, tornando-se 
vermelha 
 
9. Exercício Teórico: 
 
a) Descreva a estrutura e composição da parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas. 
b) Um laboratorista ao realizar a Coloração de Gram cometeu o equívoco e colocou o corante 
verde malaquita ao invés de fucsina de Gram. Qual a possível coloração das bactérias Gram-
positivas e das bactérias Gram-negativas? Explique sua resposta. 
c) Faça uma comparação entre a composição da parede celular das eubactérias com a composição 
da parede celular das arqueobactérias. 
d) Existe bactérias desprovidas de parede celular? Justifique. 
e) Dê dois exemplos de bactérias que a coloração de Gram não funciona e diga como é feito para 
fazer sua coloração. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Aula 02: Coloração de Ziehl Neelsen 
 
1. Introdução: 
 
Coloração de escolha para a observação de bactérias do gênero Mycobacterium, como, por 
exemplo, as espécies Mycobacterium tuberculosis e Mycobacteríum lepra e, bem como para cepas 
patogênicas de bactérias do gênero Nocardia. A parede das micobactérias possui uma espessa camada 
de Iipídeos (ácidos micólicos) que evita a penetração de diversos corantes. Por outro lado, quando o 
corante penetra alcançando o citoplasma da célula, ele não pode ser removido com facilidade, mesmo 
com o uso de álcool ácido. Por isso essas .bactérias são chamadas de BAAR (bacilos álcool ácido 
resistentes). Os bacilos da tuberculose são vistos como bacilos finos, retos, ligeiramente encurvados e 
geralmente, isolados; já os bacilos da lepra, agrupam-se em feixes denominados globias. O resultado 
da baciloscopia do escarro é dado em cruzes e depende da quantidade de bacilos encontrados em 100 
campos microscópicos observados. Assim teremos: 
• + (menos de 1 bacilo por campo) 
• ++ (1 a 1O bacilos por campo) 
• +++ (mais de 10 bacilos por campo) 
 
2. Objetivo: 
 
• Executar a técnica de Ziehl Neelsen. 
• Classificaras bactérias de acordo com a coloração de Ziehl Neelsen. 
• Compreender a importância da solicitação de uma baciloscopia de Ziehl à partir de um material 
biológico, e saber interpretar o resultado da baciloscopia conforme o número de cruzes. 
 
3. Material: 
 
• Lâminas para preparação do esfregaço 
• Solução salina 
• Alça de platina 
• Bico de Bunsen 
• Bateria de corantes para Ziehl Neelsen 
 
 
 
 
 
 
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4. Preparação do Esfregaço: 
 
• Limpar uma lâmina de vidro (passar algodão embebido em álcool); 
• Usando o swab, coletar a amostra e fazer um esfregaço circular na superfície de uma lâmina, 
formando um esfregaço fino e uniforme; 
• Deixar a lâmina secar à temperatura ambiente; 
• Realizar a fixação, passando de duas a três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. 
 
5. Técnica da coloração de Ziehl: 
 
• Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl e aquecê-la até emissão de vapores, mantendo o 
aquecimento por 5 minutos (tendo o cuidado para não deixar o corante ferver, nem secar). O 
bacilo da tuberculose e o da lepra só se cora após aquecimento. 
• Lavar com água corrente. 
• Descorar rapidamente com álcool-clorídrico a 3% até que não se desprenda mais corante. 
• Lavar com água corrente; 
• Corar com azul de metileno- 1 minuto 
• Lavar com água corrente; 
• Secar com papel absorvente; 
• Observar a lâmina: Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço corado e observar 
a lâmina no microscópio, com objetiva de 100x 
 
6. Exercício Prático: 
 
• Preparar um esfregaço com o material biológico e corar pelo método de Ziehl. Visualizar e 
esquematizar a morfologia das bactérias existentes nas lâminas; 
 
 
 
 
 
 
 
Lâmina 02: Material Biológico Coloração de Ziehl 
 
 
 
 
 
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7. Interpretação das Relações pelo Método de Ziehl: 
 
Aspecto das Bactérias 
BAAR Outras Bactérias 
Coradas em Vermelho Coradas em Azul 
 
8. Exercício Prático: 
 
a) Como o bacilo da tuberculose se apresentou na lâmina corada pelo método de Ziehl Neelsen? 
 
b) Por que, quando se suspeita de tuberculose, a coloração de Gram não é empregada para análise 
bacterioscópica na tentativa de identificação de micobactérias?