DNA PRONTO COMPLETO

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INTRODUÇÃO
	O DNA pode ser detectado no núcleo de qualquer célula de um organismo, assim, o DNA das células brancas de seu sangue é exatamente igual ao DNA das células de sua pele, dos tecidos, da raiz do cabelo, dos ossos, do sêmen, da saliva, dos músculos, das células contidas na urina. O DNA é composto por ''blocos'' denominados nucleotídeos.Cada nucleotídeo se liga a outro,como elos formando uma corrente.O DNA é formado no momento da concepção e jamais mudará, mesmo depois da morte.
		A análise em DNA é o teste de paternidade mais preciso possível atualmente. Tomadas as devidas precauções no controle de qualidade do teste, este é um teste absolutamente preciso. Um resultado de exclusão significa com 100% de certeza que o suposto pai não é o pai biológico. Um resultado de inclusão vem acompanhado de cálculos estatísticos baseados na frequência de aparecimento destes marcadores na população. Desta maneira chegamos aos valores que são significativamente expressivos, que são indicativos de paternidade biológica.
	A investigação de paternidade por DNA analisa o material que carrega toda a informação genética do indivíduo. Quando uma criança é gerada, recebe metade do material genético da mãe e a outra metade do pai podendo assim confirmar a existência ou não de vínculo genético.
	O que se procura é a comparação entre marcadores genéticos das pessoas envolvidas. Uma vez identificado os marcadores genéticos comuns entre mãe e filho, os marcadores remanescentes são comparados aos marcadores do Suposto Pai. 
	Na eventualidade de discordância entre marcadores genéticos entre o filho e suposto pai, ocorre a exclusão de paternidade. No caso de uma correspondência entre os marcadores genéticos entre suposto pai e filho, pode-se indicar paternidade biológica.	
	O teste de paternidade pode ser realizado analisando o sangue, saliva ou fio de cabelo da mãe, do suposto pai, do filho, ou dos três. 
	Nesse trabalho vamos abordar as técnicas de realização do teste de paternidade atravéz do DNA utilizando-se o sangue.
OBJETIVO
	Realizar levantamento bibliográfico sobre o teste de paternidade com análise do DNA,através do sangue,relatando sua precisão diagnóstica e técnicas utilizadas.
METODOLOGIA
	O seguinte trabalho foi desenvolvido no período de 01 de setembro de 2015 até 13 de novembro de 2015 na Universidade do Estado de Minas Gerais- UEMG e será apresentado à matéria de projeto integrador ,professora Luciana,em conjunto com o professor Antônio.	Foram utilizados sites de pesquisa acadêmica como: Google acadêmico, sciello e livros da biblioteca da Universidade do Estado de Minas Gerais de sua unidade de Passos.
	Ao todo foram utilizados fontes, sendo artigos da internet e livros da biblioteca da UEMG. 
DESENVOLVIMENTO
Como é feito o teste de paternidade
	O teste de paternidade pode ser feito através da comparação do DNA encontrado no sangue, saliva ou fio de cabelo da mãe, do pai e do filho. O resultado do teste de paternidade é 99,99% correto e sai entre 6 e 20 dias dependendo do tipo de teste e do laboratório onde ele será realizado.
Onde fazer o teste de paternidade
	O teste de paternidade pode ser realizado em laboratórios especializados com um pedido judicial ou de forma anônima. O uso de medicamentos ou bebidas alcoólicas não podem alterar o resultado do teste de paternidade, pois o DNA não é atingido por fatores externos. No entanto, se a mãe ou se o suposto pai tiverem realizado uma transfusão sanguínea ou um transplante de medula 6 meses antes da realização do teste, este pode conferir resultado duvidoso. Neste caso é mais indicado realizar o exame de DNA pela saliva.
Extração de DNA
	Hoje em dia existem numerosos kits prontos de extração rápida de DNA a partir de amostras de sangue disponíveis no mercado. O material sangüíneo é portanto o preferido pela maioria dos laboratórios que realizam o exame de DNA por ser um material de fácil obtenção e por apresentar uma técnica de extração de DNA extremamente mais rápida, barata e eficiente. Porém há situações em que a coleta deste material é difícil (em crianças rescém-nascidas) ou impossível (post-mortem). No caso de crianças pode-se utilizar o swabbucal, uma espécie de cotonete que é passado na mucosa oral para obtenção de células bucais. E em casos de post-mortem deve-se pedir ao juiz autorização para a exumação do cadáver, porém é um processo laborioso e caro. Ou fazer a reconstituição do perfil do morto utilizando-se amostras de sangues de parentes próximos ou dos próprios pais (quando estes ainda forem vivos, obviamente). Este é o método indireto.
Precauções para realização do exame
	Casos de transfusão sanguínea nos últimos 90 dias antes da coleta do sangue ou transplante de medula óssea, merecem uma precaução especial. 	Neste caso o exame de DNA detectará a presença de componente genético de dois indivíduos em uma única amostra (doador e receptor) indicando que o teste deve ser repetido com uma nova coleta. Quando alguma parte declarar alguma destas duas situações possa estar ocorrendo, basta solicitar que na coleta seja coletada amostra de mucosa oral (saliva) que contêm o DNA “original” da pessoa.
	O uso de qualquer medicamento, a ingestão de bebidas alcoólicas ou uso de drogas não afetará o exame. O padrão de DNA de um individuo não é alterado por drogas, álcool, medicamentos, alimentos, idade ou modo de vida.
	Não existe necessidade de jejum. Os participantes podem se alimentar normalmente.
Técnica para coleta de sangue e obtenção do DNA
	Primeiramente faz-se a coleta de 5mL de sangue através da punção venosa com o auxílio de uma seringa e uma agulha.
· Pipetar um pouco deste sangue em um tubinho de centrífuga.
· Colocar uma solução de fenol-cloroformo-álcool isoamílico no tubinho com sangue.
· Homogeneizar e deixar repousar por 5min.
· Centrifugar à velocidade máxima por 3min.
· Haverá a separação de fases. O DNA estará na fase aquosa e na fase orgânica ficarão as proteínas e os restos celulares.
· Pipetar a fase aquosa para um outro tubinho limpo e acrescentar álcool isopropílico para ocorrer a precipitação do DNA.
· Inverter o tubo várias vezes até a obtenção da medusa.
· Centrifugar à velocidade máxima por 3min.
· Descartar o sobrenadante e acrescentar etanol para a lavagem do DNA.
· Homogeneizar e centrifugar à velocidade máxima por 3min.
· Descartar o etanol (sobrenadante) e acrescentar água milli-Q.
· Incubar a amostra à 56oC por 10min. para ocorrer a dissolução do DNA na água.
	Pronto para a PCR.
Método da PCR
	Polimerase Chain Reaction PCR é um método in vitro que sintetiza fragmentos específicos de DNA, desde que uma pelo menos uma parte já seja conhecida. Dois oligonucleotídeos sintéticos, complementares as fitas de DNA serão os iniciadores, posicionados em lados opostos da região a ser amplificada. São os primers.
	Esta polimerização é catalisada pela enzima Taq polimerase(DNA polimerase), assim chamada por ter sido isolada da bactéria termófila Thermus aquaticus. O PCR envolve ciclos repetidos de desnaturação do DNA, anelamento dos primers e polimerização da fita complementar ao molde. A Taq polimerase permite vários ciclos com uma adição e suporta altas temperaturas sem ser degradada.
	São necessários para a reação:
· d’NTPs (nucleotídeos),(bases nitrogenadas)
· os primers,
· Taq polimerase e seu tampão(solução onde a enzima está)
· template (molde) do DNA de interesse.(molde do pai)
· MgCl2 cofator da enzima.
Técnica da PCR ,passo a passo	
	A amostra de DNA , a enzima que faz a replicação(DNA) polimerase,os nucleotídeos de Dna e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio.
	Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (máquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa).Os passos seguintes,de aquecimento e resfriamento,acontecem dentro da máquina controlados pelo programa.
	Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA.
        Cada fita simples do DNA que foi desnaturado servede molde para a síntese de novas cadeias               complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas               fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase.
          Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase)              para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os              nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma  nova fita dupla.
	A cada ciclo a reação se inicia com a desnaturação do DNA através de aumento da temperatura, em seguida a temperatura diminui permitindo o anelamento dos primers à seqüência complementar do DNA molde. A Taq polimerase catalisa a ligação de nucleotídeos para formar uma nova cópia da região de interesse do DNA. Cada cópia produzida em um ciclo pode servir de template no próximo ciclo, a cópia do DNA ocorre de forma exponencial. Cada ciclo dobra a quantidade sintetizada no ciclo anterior. Em aproximadamente 20 ciclos, a concentração de DNA aumenta aproximadamente um milhão de vezes.
	A técnica de PCR é muito sensível e pode detectar quantidades mínimas de DNA. Por isto as amostras devem ser preparadas em ambiente estéril.	As condições para realização do PCR geralmente são:
Temperatura de desnaturação entre 90 e 95ºC
	Tempo de desnaturação 1 minuto, o tempo de desnaturação não pode ser longo ou poderá desnaturar a enzima.
	Temperatura de anelamento entre 40 e 60ºC, dependendo da composição de bases e da concentração dos primers.
	Temperatura de alongamento entre 70 e 75ºC.
	Em condições ideais são incorporados 2000 nucleotídeos por minuto.
	O resultado do PCR é observado através de eletroforese, uma técnica que se baseia na migração diferencial de moléculas com carga sujeitas a carga elétrica. A velocidade de migração é constante e depende do equilíbrio de forças e ao retardamento por atrito entre a amostra e o meio circundante. O DNA tem carga negativa, quando submetido a uma corrente elétrica migra para o pólo positivo. Fragmentos de tamanhos diferentes migram com velocidades diferentes, fragmentos maiores são mais lentos. As amostras do PCR são aplicadas em um gel de poliacrilamida com coloração de prata e submetidas à corrente elétrica. Assim os fragmentos podem ser observados.
Eletroforese
	
	É uma técnica de separação de partículas de acordo com sua carga elétrica e peso molecular. Proporciona a separação de frações de moléculas orgânicas como RNA, DNA, proteínas e enzimas, pela migração destas em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico. (Gruman,2010)
	Seu princípio para separação de DNA, baseia-se na carga total negativa do DNA (dada pelos oxigênios do grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA obtidos da técnica de PCR, podem ser separados pela aplicação de uma voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao polo positivo. (Gruman,2010)
	Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade de migrar pelo gel do que as de maior peso molecular, e percorrerão uma distância maior ficando mais próximas do pólo positivo.
	Na técnica, utiliza-se um cuba com dois compartimentos separados. Os eletrodos determinam os pólos positivo e negativo em cada compartimento. Neles, coloca-se uma solução salina que conduz eletricidade. Entre os compartimentos, ajusta-se o gel que deve ficar submerso. (Gruman,2010)
	As amostras (de DNA, por exemplo) são colocadas com pipetas em pequenos poços no gel, que são feitos com um pente durante a sua preparação. Antes, porém, elas são misturadas a um corante, chamado gel loading buffer. Esse corante é uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e é utilizado para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poços, além de dar a coloração que serve como indicador do progresso eletroforético. Para a migração, aplica-se voltagem e corrente elétrica ao sistema. (Gruman,2010)
	A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e equidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo. (Gruman,2010)
	Tanto na eletroforese com gel de acrilamida como na com gel de agarose, a separação das moléculas terá sua eficácia determinada tanto pela concentração do polímero como pela intensidade da voltagem e amperagem aplicadas. (Gruman,2010)
	
	1 - Gel; 2 - Aplicação do marcador; 3 - Aplicação das amostras; 4 - Indução de corrente elétrica; 5 - Deslocamento e separação dos fragmentos; 6-Eletroforese realizada.
	
	
	
	
Eletroforese em gel de poliacrilamida
	A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros: acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". Misturando essas duas moléculas, tem-se a formação de uma "rede". Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação. Para preparar um gel de poliacrilamida, deve-se misturar as duas substâncias formadoras nas concentrações desejadas, colocá-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como catalizadores da polimerização. A identificação dos produtos pode ser feita pelo brometo de etídio, mas o nitrato de prata é mais utilizado. (Gruman,2010)
	Cada pessoa carrega duas cópias de cada região de seu DNA, uma proveniente do pai e outra da mãe. Quando uma região apresenta formas alternativas na população (regiões polimórficas) esta pode ser utilizada para a investigação de vínculo genético. Estas regiões são constituídas por pequenas seqüências de 3 a 5 bases repetidas lado a lado. O número de vezes que a seqüência se repete varia, tornando possível a existência de diferentes alelos, que são definidos pelo número de repetições que cada um apresenta. Assim o alelo 5 apresenta cinco repetições, o alelo 6 apresenta seis repetições, e assim por diante. O DNA de cada pessoa envolvida é purificado geralmente a partir de células sanguíneas e submetido PCR que permite o isolamento destas regiões.
	Os alelos assim obtidos são aplicados no gel de acrilamida, submetidos à corrente elétrica e separados por tamanho, e assim pode-se verificar se existe compartilhamento dos alelos entre as pessoas envolvidas. Quando existe este compartilhamento, o vínculo não pode ser descartado e é feito um cálculo de probabilidade, que indica a chance do alelo em questão ter sido herdado do suposto pai e não de qualquer outra pessoa da população. Quando não existe um alelo compartilhado, o vínculo genético é descartado.
CONCLUSÃO
	O teste de paternidade pode ser feito através da comparação do DNA encontrado no sangue.O resultado do teste de paternidade é 99,99% correto e sai entre 6 e 20 dias dependendo do tipo de teste e laboratório onde será realizado.O preço do teste de paternidade varia entre 2 mil a 4 mil reais.
	Atualmente um dos laboratórios da cidade de Passos realiza a coleta do material a ser analisado ,enviando assim este para análise na cidade de Belo Horizonte no laboratório Hermes Pardini.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
GRUMANN C. Eletroforese. Disponível em: < http://www.biomedicinabrasil.com > Acesso em 03 de Novembro de 2015. 
LTDA. Sobre o exame de Dna. Disponível em :< http://www.dnavida.com.br/arquivos/duvidas.pdf >. Acesso em: 04 de Novembro de 2015.
LABORATÓRIOS. Teste de Paternidade. Disponível em: < http://www.biolider.com.br/media/images/622.pd f >. Acesso em: 05 de Novembro de 2015.
LTDA. Tipos de Exame. Disponível em: < http://www.dnavida.com.br/arquivos/duvidas.pdf >. Acesso em: 06 de Novembro de 2015.