Métodos de análise de sequências reguladoras de genes interação DNA-proteína

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-Interação DNA-Proteína- 
 
Métodos computacionais 
Buscam assinaturas de sequências (regiões 
conservadas) que são alvos de ligação de 
fatores de transcrição 
Bancos de dados: 
 
Motivos De novo 
Podemos olhar para uma sequência a partir de 2 pontos 
de vista: 
1) Comparar sequencias e descobrir diversos 
motivos para um fator de transcrição 
 
 
2) Comparar sequencias para buscar por motivos 
de potenciais co-fatores 
-Região agat pode ser um motivo de interação 
de algum cofator 
 
 
Bancos de dados: JASPAR, Motif Comparison 
Tool of the MEME Suite, MACRO-APE, STAMP 
 
 
 
Métodos experimentais 
Usados como uma confirmação e refinamento 
dos métodos computacionais 
Entendimento melhor da expressão tecido-
específico 
Descrição da função biológica 
 
Ensaios de interação DNA-proteína 
• Precisa ter conhecimento das sequencias a ser 
testadas 
• Precisa ter a proteína isolada ou purificada 
• In vitro 
DNA footprinting 
Princípio: A interação do fator de transcrição com o 
DNA leva a uma proteção contra a ação de nucleases, 
impedindo a clivagem da região 
Trabalhamos com duas amostras marcadas 
radiotivamente, uma com DNA e sem a proteína de 
interesse e outra contendo o DNA + a proteína de 
interesse 
1) Amplificamos a porção de interesse do DNA 
genomico → fragmentos marcados 
2) Adiciona a proteína de interesse em uma das 
amostras 
3) Clivagem das amostras com DNase I 
4) Separação por eletroforese 
Se acontecesse a interação DNA-proteína teremos um 
gap na eletroforese pois essa região não foi clivada pela 
enzima 
Confirmamos a posição da interação da proteína 
 
Vantagens: funciona bem para fragmentos de 50 a 200 
bp 
 
EMSA – Ensaio de retardo de mobilidade eletroforética 
Princípio: a mobilidade do DNA ligado a proteína é 
menos que do DNA livre 
Precisamos da proteína purificada e de fragmentos 
marcados 
Incubamos o fragmento marcado com a proteína de 
interesse e comparamos a mobilidade da eletroforese 
em gel de poliamida entre a amostra controle e a 
amostra DNA + proteína 
 
Fatores que afetam a força e especificidade da ligação 
(interação em vitro): composição do tampão, força 
iônica, ph, detergentes, cátions, temperatura, tempo de 
incubação. 
Controles adicionais para confirmar que as interações 
são específicas: 
• Adição de competidor: excesso de 
sonda de DNA não marcada específica para a 
proteína → Esperamos uma redução do sinal de 
mobilidade 
• EMSA supershift: adição de um 
anticorpo anti-proteína de interesse → O 
retardo de mobilidade vai ser mais acentuado 
ChIP – Imunoprecipitação da proteína 
• Avaliar a associação de proteínas com regiões 
específicas do DNA in vivo 
• Análise de proteínas regulatórias ligadas ao 
DNA 
Princípio: Preparação e fragmentação da cromatina 
solúvel, seguida de imunoprecipitação com anticorpo 
contra a proteína de interesse 
 
Etapas 
1) Formação do complexo proteína-DNA in situ 
2) Adição de formaldeído 1% (que faz com que a 
proteína não se desliga do DNA), incubação, 
extração e fragmentação do DNA (geralmente 
sonificação) 
3) Imunoprecipitação: adicionamos o anticorpo 
contra a proteína de interesse que vai separar o 
nosso fragmento que interage com a proteína 
alvo 
4) Reversão do crosslink: desfaz o efeito do 
formaldeído para separar o DNA da proteína 
5) A partir disso podemos usar o que foi 
precipitado para: 
-Identificar os componentes proteicos por 
espectrometria de massas 
-Identificar os fragmentos de DNA por PCR, 
sequenciamento, hibridização de microarranjos 
-Estudos de modificação de histonas 
 
qPCR: quando já temos algum conhecimento sobre os 
fragmentos de DNA e podemos fazer uma amplificação 
específica 
ChIP-chip: combinação com microarranjos onde 
fazemos a identificação da sequência de interação e sua 
localização no genoma por hibridização 
CHIP-seq: imunoprecipitação seguida por 
sequenciamento de todos os isolados 
CLIP-Seq 
• Interações proteína-RNA 
• Crosslink é feito com UV seguido por 
imunoprecipitação 
• Estudar a regulação a nível pós transcricional 
 
3C technique 
• Análise da captura conformacional da 
cromatina (TADs): estudo das interações da 
cromatina 
• Mapeamento gerais, de larga escala a nível 
genômico 
Princípio: utiliza um passo de ligação para unir 
fragmentos distantes que interagem com a cromatina 
(3D), fornecendo informações de possíveis sítios alvo de 
ligação de proteínas regulatórias 
1) Crosslink do DNA + proteínas 
2) Fragmentação da amostra 
3) Ligação dos fragmentos que interagem com a 
proteína de interesse, formando um loop 
4) União de adaptadores: amplificação da região 
 
DamID 
Metilase Dam: enzima que promove a metilação em 
sítios específicos (GATC), produzida por E. coli 
Princípio: expressar a metilase fusionada com o fator de 
transcrição/proteína de interesse 
Região GATC é sítio para enzima de restrição Dpnl 
1) A proteína de interesse interage com DNA e a 
enzima metila os sítios próximos 
2) Clivagem com Dpnl: fragmentação 
3) Ligação de adaptadores 
4) Amplificação 
5) Sequenciamento ou hibridização em chips de 
DNA 
 
Yeast one hybrid system 
Princípio: expressão de um gene repórter vai ser 
regulada por sequencias com potencial para ser 
reconhecida por um fator de transcrição/proteína 
alvo 
Duas construções: uma contendo o gene repórter e 
a região regulatória de interesse e outra contendo o 
fator de transcrição/proteína alvo que contenha um 
domínio de ativação que seja reconhecido pela 
maquinaria de transcrição da levedura. 
 
Objetivo: 
 Centralizar a análise em um fator de 
transcrição: utilizamos um TF e variamos as 
sequencias de DNA 
 Centralizar a sequência de DNA: variamos 
os TF