Epigenética na programação fetal por restrição proteica gestacional

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS 
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS 
 
 
 
 
HELOISA BALAN ASSALIN 
 
 
 
Epigenética na programação fetal por restrição proteica gestacional: perfil de 
expressão de microRNAs no ventrículo esquerdo cardíaco 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAMPINAS 
2016 
 
 
 
 
 
HELOISA BALAN ASSALIN 
 
 
 
Epigenética na programação fetal por restrição proteica gestacional: perfil de 
expressão de microRNAs no ventrículo esquerdo cardíaco 
 
 
 
 
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade 
Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a 
obtenção do título de Doutora em Ciências. 
 
 
 
 
ORIENTADORA: Patricia Aline Boer 
COORIENTADOR: Jose Antonio Rocha Gontijo 
 
 
 
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO 
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA 
HELOISA BALAN ASSALIN, E ORIENTADA PELA 
PROFA. DRA. PATRICIA ALINE BOER. 
 
 
 
 
 
CAMPINAS 
2016 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO 
HELOISA BALAN ASSALIN 
 
 
ORIENTADOR (a): PROF(A). DR(A). PATRICIA ALINE BOER 
COORIENTADOR (a): PROF(A). DR(A). JOSE ANTONIO ROCHA GONTIJO 
 
MEMBROS: 
1. PROF(A). DR(A). PATRICIA ALINE BOER 
2. PROF(A). DR(A). SILVANA AUXILIADORA BORDIN DA SILVA 
3. PROF(A). DR(A). MAELI DAL PAI 
4. PROF(A). DR(A). ADRIANA SOUZA TORSONI 
5. PROF(A). DR(A). OTÁVIO RIZZI COELHO FILHO 
 
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências 
Médicas da Universidade Estadual de Campinas. 
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora 
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno. 
Data: 25 de abril de 2016 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Se você pensa que é capaz ou que é incapaz de realizar algo, 
de qualquer maneira você está certo” 
Henry Ford 
 
 
 
 
 
 
Agradecimentos 
 
A Deus, que está sempre presente em meu coração, me fortalecendo a cada dia para 
enfrentar todos os desafios da vida 
 
“ A ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de Deus. Quando 
considero quantas e quão maravilhosas coisas o homem compreende, pesquisa e 
consegue realizar, então reconheço claramente que o espírito humano é obra de 
Deus, e a mais notável” 
Galileu Galilei 
 
Aos meus pais, José Carlos e Roseli, por serem sempre meus exemplos de vida, caráter, 
dedicação, humildade, amor e resilência. Serei eternamente grata por tudo aquilo que me 
proporcionaram, e se hoje, mais essa etapa da minha vida foi cumprida, foi graças a vocês! 
Obrigada por sempre me incentivarem a buscar a realização dos meus sonhos. 
 
Ao meu irmão Carlos Eduardo, pelo carinho e amizade sempre presentes, pelas 
inúmeras conversas e por sempre me mostrar que a vida não precisa ser sempre levada tão a 
sério. 
 
Ao meu noivo Luiz Gustavo, por ser parte da minha vida, pela amizade, pelo amor que 
a cada dia se fortalece, pela cumplicidade e pelo apoio sempre presentes. Obrigada por 
acreditar em mim quando nem eu mesma acreditava. Obrigada por tornar a minha vida 
completa e extremamente feliz! 
 
À minha orientadora Prof. Dra. Patricia Aline Boer, pela oportunidade de ter sido sua 
orientada, por todos os seus ensinamentos e por ter me proporcionado experiências 
 
 
 
 
 
profissionais imprescindíveis na minha formação acadêmica, pela convivência, pela amizade, 
pelo carinho e pelas risadas. Espero ter conseguido retribuir com a seriedade deste trabalho 
a confiança em mim depositada. 
 
Ao Prof. Dr. José Antonio Rocha Gontijo, pela participação na co-autoria desta tese, 
pelos ensinamentos, pela disponibilização de seu tempo precioso e pela serenidade em todos 
os momentos. Obrigada pela amizade e incentivo. 
 
Ao Prof. Dr. Tom P. Fleming, ao Prof. Dr. Tilman Sanchez-Elsner e a todos do 
laboratório no Centro de Ciências Biológicas da Universidade de Southampton, que 
carinhosamente me receberam durante o período de doutorado sanduiche. Não tenho 
palavras para agradecer a oportunidade que me foi oferecida. Foram momentos de intenso 
aprendizado que contribuíram muito não só para a minha formação como pesquisadora, mas 
também para o meu crescimento pessoal. 
 
Ao Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Camara e à Prof. Dra. Marilia Cerqueira Leite 
Seelaender, da Universidade de São Paulo, pela disponibilização do equipamento 
QuantStudioTM para as análises da expressão dos microRNAs. 
 
Se enxerguei mais longe, foi porque estava sobre os ombros de gigantes" 
Isaac Newton 
 
Às amigas e companheiras Daniele Braz Torres, Agnes Lopes da Silve e Letícia de 
Barros Sene, que me acolheram com tanto carinho e amizade no Laboratório de Programação 
Fetal. Dani e Agnes, foi muito bom poder contar com vocês durante estes anos de doutorado! 
Obrigada por todos os ensinamentos e pelo apoio nos momentos mais importantes e difíceis. 
A vida foi muito mais leve tendo vocês para dividir todos momentos. 
 
 
 
 
 
Aos amigos do Laboratório do Metabolismo Hidrossalino, que também me receberam 
com muito carinho, Ize Penhas de Lima, Silmara Ciampone, Noemi Rosa, Daniel Bueno Block, 
Augusto Custódio, Gabriel Grigoletti, Ana Teresa Franco, Lais Fernanda, Ana Letícia Luchiari 
Ferrari, Stephan Macedo, Bruna Bassi e tantos outros que passaram por este laboratório 
enquanto estive por aqui. Cada um de vocês deixaram suas marcas em minha vida, e só tenho 
a agradecer por todos os ensinamentos e pelos momentos de descontração. Não poderia 
deixar de agradecer especialmente à querida amiga Silmara, responsável por momentos 
impagáveis de descontração e pela amizade oferecida principalmente na etapa de finalização 
deste trabalho, em que as energias já estavam se esgotando. Meus sinceros agradecimentos 
a todos vocês! Se eu tiver conseguido ajuda-los ao menos na mesma medida em que fui 
ajudada, já me sinto satisfeita. 
 
A todos os funcionários do Núcleo de Medicina Experimental e da Secretaria de Pós-
Graduação em Fisiopatologia Médica, em especial à Regina, que sempre esteve disposta a 
ajudar. Agradeço especialmente à Dra. Erika Anne, por me socorrer sempre que precisei e à 
Dra. Joseane Morari pela enorme ajuda nos experimentos de PCR. Obrigada pela 
disponibilidade em ajudar e pela amizade. 
 
Agradeço especialmente à Profa. Dra. Iscia Lopes-Cendes, à Profa. Dra. Lucia Elvira 
Alvares e a Dra. Amanda Almeida pelas grandiosas contribuições para a finalização deste 
trabalho. Obrigada pelas sugestões e pelas gentilezas durante o Exame de Qualificação. 
 
À Capes, pela concessão das bolsas de estudo no país e no exterior, sem as quais seria 
inviável a realização deste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resumo 
 
Fatores nutricionais maternos são determinantes da plasticidade fetal e estão associados à 
fisiopatologia de doenças cardiovasculares na prole adulta. O modelo experimental de restrição 
proteica gestacional está relacionado ao baixo peso ao nascimento e ao desenvolvimento de 
alterações cardíacas e hipertensão no adulto. Diversos mecanismos, como a menor disponibilidade de 
substrato e a superexposição fetal aos glicocorticóides maternos, estão envolvidos nas alterações 
decorrentes da restrição proteica gestacional. Além disso, processos epigenéticos, dentre os quais a 
regulação da expressão gênica exercida pelos miRNAs, estão envolvidos na programação. Poucos 
estudos investigaram a importância da regulação dos miRNAs em modelo de programação por 
restrição proteica gestacional. Assim, o objetivo desta tese foi avaliar o padrão de expressão de 
miRNAs e de seus alvos de predileção no ventrículo esquerdo (VE) de ratos Wistar machos submetidos 
à restrição proteica gestacional. Ratas Wistar prenhes foram alocadas em dois grupos, de acordo com 
o conteúdo proteico da dieta oferecida durante a prenhez: NP (normal-protein - 17%) ou LP (low-
protein - 6%). A massa corporal e consumo alimentar foram avaliados semanalmentenas ratas prenhes 
e na prole. A pressão sistólica da prole foi aferida semanalmente a partir da 6ª a 16ª semana de vida; 
a massa do VE, a área de miócitos, a fração de colágeno e a expressão de miRNAs e mRNAs foram 
avaliados na prole de machos após 12 dias (12d) e 16 semanas (16s) do nascimento. Nossos resultados 
corroboram dados da literatura que mostram que a restrição proteica gestacional está associada ao 
menor ganho de peso das ratas durante a prenhez, ao baixo peso ao nascer, com recuperação do peso 
corporal a partir da 2a semana de vida e ao desenvolvimento de hipertensão arterial a partir da 9a 
semana. Não encontramos diferença na massa do VE, entretanto, o grupo LP-16s apresentou maior 
área de miócitos e maior fração de colágeno em relação ao grupo NP-16s. O VE de animais do grupo 
LP-12d apresentou aumento significativo na expressão de miR-184, miR-192, miR-376c, miR-380-3p, 
miR-380-5p, miR-451, miR-582-3p e redução significativa na expressão de miR-547 e miR-743a em 
relação ao grupo NP-12d. O VE dos animais do grupo LP-16s apresentou maior expressão de let-7b, 
miR-125a-3p, miR-142-3p, miR-182, miR-188-5p e menor expressão de let-7g, miR-107, miR-127, miR-
181a, miR-181c, miR-184, miR-324-5p, miR-383, miR-423-5p, miR-484 em relação ao grupo NP-16s. 
Após a predição de mRNAs alvos para os miRNAs diferencialmente expressos temos que o grupo LP-
12d apresentou aumento na expressão dos genes Dnmt3a, Oxct1, Rictor e Trps1 e redução na 
expressão dos genes Bbs1 e Calml3 em relação ao grupo NP-12d. O grupo LP-16s apresentou aumento 
na expressão dos genes Adrkb1, Bbs1, Dnmt3a, Gpr22, Inppl1 e Oxct1 em relação ao grupo NP-16s. 
 
 
 
 
 
Assim, concluímos que a restrição proteica gestacional determina redução no peso ao nascer da prole, 
elevação na pressão sistólica e alterações na morfologia do VE, sugestiva de injúria cardíaca, no adulto. 
Além disso, está relacionada a alterações tanto precoces quanto em adultos, na expressão de miRNAs 
cardíacos que estão associados à regulação de genes importantes durante o desenvolvimento 
cardiovascular, na regulação da morfologia, da função e do metabolismo cardíaco. 
Palavras chaves: Programação fetal. Coração. Hipertensão. Epigenética. MicroRNAs. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abstract 
 
Maternal nutritional factors determines fetal plasticity and are associated with the 
physiopathology of cardiovascular diseases in adult offspring. Gestational protein restriction 
experimental models are related to low birth weight, development of cardiac disorders and 
hypertension in adults. Several mechanisms, such as the lower substrate availability and the fetal 
overexposure to maternal glucocorticoids, are involved with the changes related to gestational protein 
restriction. Furthermore, epigenetic processes, among which the gene expression regulation by miRNA 
action, are involved in fetal programming. Few studies have investigated the importance of miRNA 
regulation on gestational protein restriction model. Thus, the aim of this thesis was to evaluate the 
miRNAs expression pattern and their predicted targets on cardiac left ventricle (LV) of gestational 
protein restricted rats. Pregnant Wistar rats were allocate in two groups, according to protein supply 
during pregnancy: NP (normal-protein – 17%) or LP (low-protein – 6%). Body weight and food 
consumption were evaluated weekly in pregnant rats and offspring. Systolic blood pressure was 
measured weekly in offspring from the sixth to sixteenth week; cardiac LV weight, myocytes cross 
sectional area, collagen fraction and the miRNA and mRNA expression were evaluated in male offspring 
after 12-days (12d) and 16-weeks (16w) after birth. Our results corroborate other studies showing that 
gestational protein restriction is associated with lower body weight gain of pregnant rats, offspring low 
birth weight, followed by rapidly body weight recovery on second week, and hypertension 
development from the ninth to sixteenth week. We found no difference on cardiac LV weight; 
however, the LP-16w group has increased myocytes cross sectional area and collagen fraction versus 
NP-16w group. LV of LP-12d animals has significantly increased expression of miR-184, miR-192, miR-
376c, miR-380-3p, miR-380-5p, miR-451, and miR-582-3p and decreased expression of miR-547 and 
miR-743a versus NP-12d animals. LV of LP-16w animals has increased expression of let-7b, miR-125a-
3p, miR-142-3p, miR-182 and miR-188-5p and decreased expression of let-7g, miR-107, miR-127, miR-
181a, miR-181c, miR-184, miR-324-5p, miR-383, miR-423-5p and miR-484 versus NP-16w animals. 
After mRNAs target prediction to the differentially expressed miRNAs, LP-12d animals has increased 
expression of Dnmt3a, Oxct1, Rictor and Trps1 genes and decreased expression of Bbs1 and Calml3 
genes compared to NP-12d. LP-16w animals has increased expression of Adrbk1, Bbs1, Dnmt3a, Gpr22, 
Inppl1 and Oxct1 genes compared to NP-16w. In conclusion, gestational protein restriction leads to 
offspring low birth weight, increased systolic blood pressure and changes in cardiac LV morphology 
suggestive of cardiac injuries in adults. Furthermore, it is related to early heart miRNA expression 
 
 
 
 
 
changes that are perpetuate into adulthood and which are associated with the regulation of important 
genes involved in cardiovascular development, heart morphology, function, and metabolism. 
Key words: Fetal programming. Heart. Hypertension. Epigenetics. MicroRNAs. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lista de Figuras 
 
Figura 1. Organização genômica dos miRNAs.......................................................................................31 
Figura 2. Biogênese dos miRNAs...........................................................................................................33 
Figura 3. Diferentes aspectos relacionados à modulação da expressão gênica exercida pelos 
miRNAs..................................................................................................................................................36 
Figura 4. Fluxograma experimental.......................................................................................................46 
Figura 5. Fluxograma representativo das etapas envolvidas na predição de mRNAs alvos para os 
miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos NP-12d/ LP-12d e NP-16s/ LP-16s.....................52 
Figura 6. Peso corporal semanal das ratas prenhes dos grupos NP e LP..............................................60 
Figura 7. Ganho de peso das ratas prenhes dos grupos NP e LP...........................................................61 
Figura 8. Consumo alimentar semanal das ratas prenhes dos grupos NP e LP.....................................62 
Figura 9. Consumo semanal de proteínas das ratas prenhes dos grupos NP e LP................................63 
Figura 10. Número de filhotes das ratas prenhes dos grupos NP e LP..................................................64 
Figura 11. Proporção de filhotes machos nascidos das ratas prenhes dos grupos NP e LP..................64 
Figura 12. Correlação entre o ganho de peso e o consumo alimentar das ratas prenhes dos grupos NP 
e LP........................................................................................................................................................65 
Figura 13. Correlação entre o ganho de peso e o número de filhotes das ratas prenhes dos grupos NP 
e LP........................................................................................................................................................65 
Figura 14. Correlação entre o peso corporal médio ao nascer e o número de filhotes em cada prole 
dos grupos NP e LP................................................................................................................................67Figura 15. Peso corporal semanal dos animais dos grupos NP-16s e LP-16s........................................69 
Figura 16. Consumo alimentar semanal dos animais dos grupos NP-16s e LP-16s...............................70 
Figura 17. Pressão arterial sistólica dos animais dos grupos NP-16s e LP-16s......................................71 
Figura 18. Área de miócitos no ventrículo esquerdo dos animais dos grupos NP-12d, LP-12d, NP-16s 
e LP-16s.................................................................................................................................................74 
Figura 19. Conteúdo de colágeno no ventrículo esquerdo dos animais dos grupos NP-12d, LP-12d, 
NP-16s e LP-16s.....................................................................................................................................75 
 
 
 
 
 
Figura 20. Volcano plot da expressão de miRNAs no ventrículo esquerdo dos animais dos grupos NP-
12d e LP-12d..........................................................................................................................................77 
Figura 21. Volcano plot da expressão de miRNAs no ventrículo esquerdo dos animais dos grupos NP-
16s e LP-16s...........................................................................................................................................77 
Figura 22. miRNAs diferencialmente expressos no ventrículo esquerdo de animais dos grupos NP-12d 
e LP-12d.................................................................................................................................................78 
Figura 23. miRNAs diferencialmente expressos no ventrículo esquerdo de animais dos grupos NP-16s 
e LP-16s.................................................................................................................................................79 
Figura 24. Expressão de mRNAs no ventrículo esquerdo de animais dos grupos NP-12d e LP-12d.....81 
Figura 25. Expressão de mRNAs no ventrículo esquerdo de animais dos grupos NP-16s e LP-16s......81 
Figura 26. Representação esquemática da relação entre os genes diferencialmente expressos entre 
os grupos LP-12d X NP-12d e LP-16s x NP-16s e seus respectivos miRNAs moduladores.....................83 
Figura 27. Western blot das proteínas Bbs1, Calml3, Dnmt3a, Oxct1 e Rictor nos animais dos grupos 
NP-12d e LP-12d....................................................................................................................................85 
Figura 28. Western blot das proteínas Bbs1, Calml3, Dnmt3a, Oxct1 e Rictor nos animais dos grupos 
NP-16s e LP-16s.....................................................................................................................................86 
Figura 29. Representação esquemática da relação entre os genes diferencialmente expressos entre 
os grupos LP-12d X NP-12d e LP-16s x NP-16s, os níveis proteicos traduzidos a partir destes genes e 
seus respectivos miRNAs moduladores.................................................................................................88 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lista de Tabelas 
 
Tabela 1. Composição das dietas Purina Labina® e AIN-93G................................................................44 
Tabela 2. mRNAs alvos preditos para os animais NP-12d, LP-12d, NP-16s e LP-16s.............................53 
Tabela 3. Sequências de Primers...........................................................................................................55 
Tabela 4. Anticorpos primários e secundários utilizados na técnica de western blot para os animais 
NP-12d, LP-12d, NP-16s e LP-16s..........................................................................................................57 
Tabela 5. Peso corporal e distância anogenital dos filhotes dos grupos NP e LP..................................66 
Tabela 6. Massa do coração, ventrículo esquerdo (VE) e ventrículo direito (VD) dos animais dos 
grupos NP-12d, LP-12d, NP-16s e LP-16s...............................................................................................73 
Tabela 7. Valores de expressão dos mRNAs preditos para os animais dos grupos NP-12d e LP-12d, NP-
16s e LP-16s...........................................................................................................................................82 
Tabela 8. Western blot das proteínas Bbs1, Calml3, Dnmt3a, Oxct1 e Rictor nos animais dos grupos 
NP-12d, LP-12d, NP-16s e LP-16s..........................................................................................................87 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sumário 
 
Introdução.....................................................................................................................................18 
1. Evidencias Epidemiológicas da Programação Fetal.............................................................18 
2. Programação Fetal e Repercussões Cardiovasculares.........................................................21 
3. Mecanismos Envolvidos na Programação Fetal..................................................................24 
3.1. Regulação Epigenética.......................................................................................................27 
3.1.1. MiRNAs.......................................................................................................................29 
i. Descoberta dos miRNAs.........................................................................................29 
ii. Localização genômica, biogênese e função dos miRNAs.........................................31 
iii. Os miRNAs no tecido cardíaco...............................................................................37 
Objetivo principal..........................................................................................................................41 
Objetivos específicos.....................................................................................................................41 
Material e Métodos.......................................................................................................................42 
1. Protocolo experimental.....................................................................................................42 
2. Protocolo de acasalamento...............................................................................................42 
3. Grupos experimentais.......................................................................................................43 
4. Parâmetros nutricionais e murinométricos da progenitora e da prole................................44 
5. Aferição da pressão sistólica caudal...................................................................................45 
6. Eutanásia e coleta de material...........................................................................................45 
7. Processamento histológico, mensuração da área de miócitos e da fração de colágeno......47 
8. Extração de RNA total para análises de expressão gênica..................................................48 
9. Análise da quantidade, qualidade e integridade do RNA total............................................48 
10. Síntese de cDNA para avaliação da expressão de miRNAs..................................................49 
11. RT-qPCR para avaliação da expressão de miRNAs..............................................................49 
12. Análise bioinformática.......................................................................................................51 
13. Síntese de cDNA para avaliação da expressão de mRNAs...................................................54 
14. RT-qPCR para avaliação da expressão de mRNAs preditos.................................................54 
15. Western blot.....................................................................................................................5616. Análises estatísticas...........................................................................................................58 
Resultados.....................................................................................................................................59 
1. Período de Prenhez...........................................................................................................59 
 
 
 
 
 
2. Peso corporal ao nascer e distância anogenital..................................................................66 
3. Peso corporal semanal, consumo alimentar e pressão sistólica dos animais de 16 
semanas............................................................................................................................68 
4. Parâmetros relacionados à hipertrofia cardíaca e fibrose nos animais de 12 dias e 16 
semanas............................................................................................................................72 
5. Análise da expressão dos miRNAs......................................................................................76 
6. Análise da expressão dos mRNAs preditos.........................................................................80 
7. Western blot das proteínas codificadas pelos genes diferencialmente expressos...............84 
Discussão.......................................................................................................................................89 
Conclusões...................................................................................................................................106 
Referências bibliográficas............................................................................................................107 
Anexo 1 – Certificado Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA – Unesp)...............................132 
Anexo 2 – Concentração, qualidade e integridade do RNA das amostras......................................133 
Anexo 3 – Valores de expressão relativa dos miRNAs avaliados por RT-qPCR comparativamente 
entre os grupos NP-12d e LP-12d, NP-16s e LP-16s.......................................................................135 
Anexo 4 – miRNAs alvos preditos em cada etapa da análise bioinformática.................................144 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
 
Introdução 
 
1. Evidências Epidemiológicas da Programação Fetal 
Datam do início da década de 60 as primeiras evidências de que fatores adversos que acometem 
as gestantes influenciam o desenvolvimento embrionário, fetal e neonatal e estão associados às 
condições de saúde dos indivíduos quando adultos. 
Estudo epidemiológico conduzido pelo pesquisador Geoffrey Rose constatou a prevalência duas 
vezes maior de irmãos natimortos ou mortos durante a infância na família de pacientes infartados 
admitidos no Hospital Johns Hopkins de Baltimore, comparativamente a pacientes controles (Rose, 
1964). 
Em 1977, Forsdahl foi o primeiro pesquisador a evidenciar, na Noruega, a correlação entre altos 
índices de doença isquêmica cardíaca e condições de pobreza pregressa, durante a infância e 
adolescência (Forsdahl, 1977). Correlação similar foi verificada posteriormente em coortes na 
Inglaterra e no País de Gales (Williams et al., 1979). 
Na década de 80, o pesquisador David Barker e seus colaboradores foram pioneiros ao 
evidenciar a associação entre a doença cardiovascular e o baixo peso ao nascimento. Analisando uma 
coorte de 10.141 homens nascidos entre 1911 e 1930 na cidade de Hertfordshire na Inglaterra, 
verificaram que a incidência de óbitos em decorrência de doença cardíaca isquêmica era maior entre 
os indivíduos que apresentaram os menores valores de peso corporal ao nascimento e no primeiro 
ano de vida, comparado a indivíduos com peso ao nascimento normal. Esta correlação entre o baixo 
peso ao nascer e a incidência de doença cardiovascular no indivíduo adulto foi verificada 
independentemente dos hábitos de vida (Barker et al., 1989a; e Barker et al., 1989b). Além disso, a 
análise posterior desta mesma coorte mostrou que indivíduos que nasceram com baixo peso 
apresentaram maior susceptibilidade ao diabetes tipo 2 e à síndrome metabólica quando adultos 
(Barker et al., 1993; Hales et al., 1991). 
Assim, a partir destes estudos fundamentou-se a Hipótese de Barker, que evidencia a 
importância do ambiente materno durante o período gestacional como determinante das condições 
de saúde da prole a longo prazo. Sendo assim, a desnutrição materna (proteica e/ou calórica) 
determina a ocorrência de retardo no crescimento fetal (IUGR – intrauterine growth restriction), baixo 
peso ao nascimento e desproporção corporal (menor perímetro cefálico em relação ao corpo). 
19 
 
 
A hipótese de Barker fundamenta o o conceito de programação fetal que foi definido em 1991 
pelo pesquisador Alan Lucas como sendo a resposta permanente do organismo a um estímulo ou 
insulto durante períodos críticos do desenvolvimento embrionário e fetal (Lucas, 1991). Sendo assim, 
o feto exposto à restrição proteica durante o período intrauterino se adapta fisiologicamente e 
metabolicamente, por meio da modulação da expressão gênica, e das consequentes alterações na 
morfologia e fisiologia de diversos tecidos, a fim de viabilizar sua sobrevivência pós-natal (McMillen et 
al., 2008; Langley-Evans et al., 1999). Entretanto, caso haja incompatibilidade entre a disponibilidade 
de nutrientes sugeridas pelo ambiente intrauterino e a real disponibilidade no ambiente pós-natal, 
estas adaptações fetais, embora inicialmente benéficas, passam a determinar prejuízo para a saúde do 
indivíduo, estando, portanto, associadas ao risco aumentado na incidência de doenças 
cardiovasculares e metabólicas na idade adulta (Gluckman & Hanson 2004; McMillen & Robinson 
2005; Hanson & Gluckman, 2008) 
Diversos estudos epidemiológicos em populações variadas de todo o mundo corroboram os 
achados de Barker (Rich-Edwards et al., 1997; Eriksson et al., 2007; Eriksson et al., 1999; Valdez et al., 
1994; Law et al., 1996; Stein et al., 1996; Jones et al., 1998; Frontini et al., 2004; Banci et al., 2009). 
Nos Estados Unidos, o estudo Nurse’s Health analisou retrospectivamente 121.700 mulheres e 
evidenciou que a associação entre o baixo peso ao nascer e a incidência de doença coronariana ocorre 
mesmo depois de excluídos os efeitos decorrentes do tabagismo, atividade física, hábitos alimentares 
e condições socioeconômicas (Rich-Edwards et al., 1997). Além disso, a intensidade desta associação 
aumenta proporcionalmente à taxa de crescimento após o nascimento, sendo que o crescimento pós-
natal acelerado (catch-up) representa risco adicional à incidência de doença cardiovascular no 
indivíduo adulto (Forsen et al., 1999; Eriksson et al., 1999; Yajnik, 2000; Hemachandra et al., 2007; 
Huang et al., 2007; Huxley et al., 2000; Barker & Thornburg, 2013). 
Na Finlândia, o estudo Helsinki Birth Cohort, que incluiu homens e mulheres nascidos entre 1924 
e 1944, evidenciou que o menor tamanho corporal no momento do nascimento está associado ao 
maior risco de desenvolvimento de doença cardiovascular e diabetes tipo 2 (Eriksson et al., 2002). A 
maior predisposição a doenças tem sido relacionada ao tamanho reduzido ao nascer, resultante da 
nutrição pré-natal inadequada, seguido do rápido crescimento nos primeiros anos da infância (Eriksson 
et al., 1999). 
Além disso, estudos epidemiológicos observaram que o menor tamanho corporal no momento 
do nascimento está associado a maior predisposição à obesidade (Ravelli et al., 1999; Ravelli et al., 
1976), à resistência à insulina e ao diabetes do tipo 2 (Newsome et al., 2003; Hales et al., 1991), à 
dislipidemia (Roseboom et al., 2000) e à hipertensão arterial (Huxley et al., 2000; Law et al., 1991). 
20 
 
 
A correlação entre o baixo peso ao nascer e a hipertensão arterial no adulto está bem 
estabelecida (Tayloret al., 1997; Yiu et al., 1999; Blake et al., 2000; Adair et al., 2005). Diversos estudos 
epidemiológicos na Inglaterra e em outros países europeus sugeriram que a etiologia da hipertensão 
arterial seria determinada durante o período intrauterino (Barker et al., 1989; Barker et al., 1990; Law 
et al., 1996; Law et al., 1993; Leon et al., 1996; Koupilova et al., 1997). Estes estudos mostraram que 
a correlação entre o baixo peso ao nascer e a hipertensão arterial no adulto permanece mesmo 
excluindo-se os efeitos decorrentes de fatores de risco conhecidos para a hipertensão como, por 
exemplo, o consumo de álcool e o índice de massa corporal elevado (Curhan et al., 1996; Uiterwaal et 
al., 1997; Leon et al., 2000). Além disso, assim como a correlação entre o baixo peso ao nascer e o 
maior risco cardiovascular, a correlação entre o baixo peso ao nascer e a hipertensão arterial no adulto 
também parece ser mais intensa quanto mais acelerado for o crescimento pós-natal (Hales & Ozanne, 
2003; Singhal et al., 2004). 
O período da fome holandesa (1944-1945) permitiu o estudo dos efeitos da desnutrição materna 
em humanos, evidenciando a importância da nutrição materna durante o período gestacional 
(Roseboom et al., 2001). A coorte exposta à fome holandesa é composta por indivíduos nascidos em 
Amsterdam entre os anos de 1943-1947, durante a Segunda Guerra Mundial, cujas mães foram 
privadas de alimentação adequada durante 5 meses. A privação alimentar acometeu mulheres antes, 
durante e depois da gestação, sendo que no período de auge da fome holandesa, o consumo alimentar 
destas mulheres oferecia apenas 500 a 600kcal por dia. Indivíduos que foram expostos à desnutrição 
materna no primeiro semestre de gestação apresentam, quando adultos, maiores índices de 
obesidade, doença coronariana, e alteração no metabolismo de lipídios. Por outro lado, a exposição à 
desnutrição materna durante o final da gestação está associada a maiores índices de diabetes do tipo 
2 (Roseboom et al., 2001). 
Assim, nota-se que diversos estudos epidemiológicos evidenciaram a forte correlação existente 
entre a má nutrição materna durante o período gestacional e o aumento da prevalência de doenças 
cardiovasculares no indivíduo adulto. 
Dados publicados em 2012 pela Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que a 
desnutrição materna continua sendo problema de saúde pública mundial e confirmam a sua relação 
com o baixo peso ao nascimento. Anualmente, aproximadamente 20 milhões de crianças em todo o 
mundo nascem com baixo peso, o que representa cerca de 15,5% dos nascimentos (Resolução 
WHA65.6). No Brasil, dados recentes mostram que o baixo peso ao nascer acomete aproximadamente 
8% dos nascidos vivos (Buriol et al., 2016), sendo que os maiores índices de baixo peso foram 
21 
 
 
encontrados em regiões de maior desenvolvimento socioeconômico como o sul e sudeste (Silva et al., 
2010; Lima et al., 2013). 
Assim, a nutrição materna tem recebido atenção das políticas de saúde pública, com o 
desenvolvimento de campanhas de conscientização popular sobre a importância da nutrição adequada 
durante o período intrauterino e nos primeiros anos da infância. Em 2015, a OMS propôs como terceira 
meta global a ser cumprida até o ano de 2025, a redução em 30% do baixo peso ao nascimento 
(http://www.who.int/nutrition/topics/nutrition_globaltargets2025/en/). Além disso, a Pastoral da 
Criança lançou a campanha de conscientização intitulada “Toda gestação dura 1000 dias”, a fim de 
popularizar a importância dos cuidados com as condições de saúde e nutrição desde o período 
gestacional até o segundo ano de vida (http://www.pastoraldacrianca.org.br/pt/noticias2/3591-
globo-e-pastoral-da-crianca-lancam-campanha-toda-gestacao-dura-1000-dias). 
 
2. Programação Fetal e Repercussões Cardiovasculares 
Os estudos epidemiológicos citados anteriormente evidenciam a associação entre as condições 
de saúde materna, principalmente a condição nutricional materna, e o risco aumentado de doença 
cardiovascular no indivíduo adulto. Entretanto, os mecanismos relacionados a estas alterações não 
estão completamente elucidados. Assim, com a finalidade de compreender a maneira pela qual o 
ambiente intrauterino poderia influenciar tanto o desenvolvimento fetal quanto a predisposição a 
diversas doenças, alguns modelos experimentais têm sido propostos. 
A manipulação do conteúdo proteico na dieta materna tem sido experimentada em diversas 
espécies de animais de laboratório, como ratos, camundongos e ovelhas. Dessa maneira, diversos 
modelos animais têm possibilitado a melhor compreensão da fisiopatologia das alterações 
cardiovasculares decorrentes da variação do conteúdo proteico nos diferentes períodos da gestação. 
Corroborando os diversos estudos epidemiológicos já citados, a restrição proteica gestacional 
em ratos está associada ao baixo peso ao nascer e ao desenvolvimento de hipertensão arterial 
(Langley-Evans et al., 1994), bem como a prejuízos no desenvolvimento renal (Langley-Evans et al., 
1999). Além disso, a restrição proteica gestacional está associada a distúrbios na homeostase da 
glicose (Fernandez-Twinn et al., 2005), à disfunção vascular (Torrens et al., 2006), e à maior 
susceptibilidade ao estresse oxidativo (Langley-Evans & Sculley, 2005) e à adiposidade abdominal 
(Bellinger et al., 2004). Ratos submetidos à restrição proteica gestacional, após 18 meses de vida, 
22 
 
 
apresentam esteatose hepática, aumento na concentração de insulina plasmática, hipertrigliceridemia 
e hipercolesterolemia (Erhuma et al., 2007). 
As repercussões cardiovasculares decorrentes da programação fetal pelo modelo de restrição 
proteica gestacional podem ocorrer secundariamente às alterações endócrinas e a alterações em 
órgãos-chaves como os rins. 
Possível mecanismo pelo qual a restrição proteica gestacional estaria associada à etiologia da 
doença cardiovascular no adulto está relacionado a alterações durante o desenvolvimento muscular, 
à obesidade e ao diabetes do tipo 2. Ovelhas submetidas à restrição proteica gestacional apresentam 
redução no número de miofibrilas e aumento na proporção de miosina IIb em relação às demais 
isoformas (Zhu et al., 2006). Além disso, apresentam redução na atividade da enzima carnitina 
palmitoil-transferase 1 e consequentemente, maior predisposição ao acúmulo de gordura (Zhu et al., 
2006). O conteúdo de triglicérides intramuscular é maior nestes animais, predispondo à resistência à 
insulina. Assim, alterações nutricionais maternas determinam prejuízo no desenvolvimento do tecido 
muscular da prole, alterando o número e a composição das miofibrilas, predispondo a alterações 
fisiopatológicas associadas à obesidade e ao diabetes do tipo 2 (Zhu et al., 2006). Em humanos, o baixo 
peso ao nascimento está associado à redução no número de células musculares, em decorrência da 
menor replicação celular durante o desenvolvimento intrauterino. Assim, a redução no número de 
células musculares associada ao excessivo ganho de peso pós-natal favorecem o acúmulo de tecido 
adiposo e o desenvolvimento de resistencia à insulina (Lithel et al., 1996; Barker et al., 1993). No 
entanto, não há evidencias suficientes que comprovem se a relação entre o baixo peso ao nascer e o 
diabetes do tipo 2 é decorrente da resistência periférica à ação da insulina, do déficit funcional das 
células β pancreáticas ou da associação destes dois fatores (Jensen et al. 2002). 
O baixo peso ao nascimento e a disponibilidade de nutrientes durante o período gestacional 
estão também associados a uma série de alterações endócrinas no indivíduo adulto (Roseboom et al., 
2000; Carey & Siragy, 2003; Briffa et al., 2015) e à programação funcional do eixo hipotálamo-hipófise-
adrenal (Seckl, 1997; Langley-Evans et al., 1996; Leonhardt et al., 2002), sendo estas alterações 
associadas ao risco cardiovascular. 
O metabolismo hepático alterado e o consequenteaumento das concentrações séricas de 
colesterol total e do LDL-colesterol (low-density lipoprotein cholesterol), assim como o aumento das 
concentrações plasmáticas de fibrinogênio, representam outro possível mecanismo que associa o 
baixo peso durante a infância e as doenças cardiovasculares no adulto (Fall et al., 1992; Barker et al., 
1992). 
23 
 
 
Outro possível mecanismo associado às repercussões cardiovasculares da restrição proteica 
gestacional está relacionado ao desenvolvimento renal. A restrição proteica gestacional está associada 
à redução no número de nefros tanto em humanos quanto em modelos experimentais (Brenner & 
Chertow, 1993; Merlet-Bénichou et al., 1993, Langley-Evans et al, 1999; Vehaskari et al, 2001; 
Mesquita et al., 2010a). A redução do número de nefros determina a ocorrência de hiperperfusão, 
decorrente do aumento do fluxo sanguíneo em cada glomérulo, podendo, portanto, levar ao 
surgimento de glomeruloslerose precoce em adultos e ao desenvolvimento de hipertensão. A 
glomerulosclerose precoce devido a sobrecarga funcional, associada à perda natural de glomérulos, 
característica do processo de envelhecimento, perpetua o ciclo de aumento progressivo da pressão 
arterial (Lever & Harrap, 1992; Lucas et al., 2001). 
No entanto, a etiologia da hipertensão arterial decorrente da restrição proteica gestacional é 
multifatorial e complexa. A precoce exposição fetal aos glicocorticoides maternos também é fator 
determinante da etiologia da hipertensão arterial decorrente da restrição proteica intrauterina 
(Langley-Evans, 1997). Além disso, a disfunção endotelial e a perda da modulação exercida pelo 
endotélio também contribuem para a etiologia da hipertensão neste modelo (Nakazono et al., 1991). 
Assim, nota-se que diversos estudos corroboram a idéia de que as alterações cardiovasculares 
decorrentes da restrição proteica gestacional possam ser secundárias a outras alterações decorrentes 
da programação fetal. Entretanto, existem evidências de que a restrição proteica gestacional influencia 
diretamente a morfologia e a fisiologia cardiovascular, induzindo alterações primárias que por si só 
predispõem à disfunção cardiovascular tardiamente. 
As adaptações fetais ao ambiente intrauterino restrito em proteínas resultam em alteração 
permanente na estrutura e na função cardíaca (Barker, 1995, McMillen et al., 2005, Thornburg et al., 
2008), sendo que diversos autores mostraram a redução no número de cardiomiócitos binucleados, 
bem como a presença de cardiomiócitos hipertróficos em relação ao tamanho do coração (Morrison 
et al., 2007, Bubb et al., 2007, Louey et al., 2007). 
A expressão de proteínas ultraestruturais no ventrículo esquerdo cardíaco é alterada em 
decorrência da restrição proteica gestacional. Em ratos submetidos à desnutrição intrauterina, a 
relação entre as isoformas β e α da miosina bem como a expressão de colágeno I e III estão aumentadas 
(Xu et al., 2006). Além disso, a expressão de metaloprotease 2 está reduzida nestes animais (Xu et al., 
2006), enquanto que a expressão do fator inibidor de metaloprotease 2 (TIMP-2) está aumentada em 
ratos expostos à restrição proteica gestacional no 70º dia após o nascimento (Menendez-Castro et al., 
2011). A restrição da ingestão proteica materna está associada ao maior número de fibroblastos 
cardíacos (Menendez-Castro et al., 2014) e a maior fibrose intersticial no ventrículo esquerdo de ratos 
24 
 
 
adultos (Lim et al., 2012), predispondo à disfunção cardiovascular (Weber et al., 1993) e a arritmias 
(Spach & Boineau, 1997). 
Os sarcômeros são elementos importantes para a contratilidade do miocárdio, e sarcômeros 
menores apresentam menor número de ligações cruzadas entre a actina e a miosina e menor força de 
contração e capacidade de encurtamento (Sela et al., 2010). Iruretagoyena e colaboradores mostraram 
a redução no comprimento de sarcômeros no coração de fetos humanos com restrição do crescimento 
intrauterino (Iruretagoyena et al., 2014). Além disso, a expressão das isoformas N2B e N2BA de titina, 
importante componente dos sarcômeros, está aumentada no 70º dia após o nascimento em ratos 
expostos à restrição proteica gestacional (Menendez-Castro et al., 2014). 
Ratos submetidos à restrição do crescimento intrauterino em decorrência da restrição proteica 
frequentemente apresentam redução no peso do coração (Muaku et al., 1997; Nutter et al., 1979; 
Cortius et al., 2005; Xu et al., 2006) e redução no número de cardiomiócitos (Cortius et al., 2005; Xu et 
al., 2006). Estas alterações podem refletir prejuízo funcional cardíaco no adulto, especialmente em 
caso de hipertensão arterial (Cortius et al., 2005; Crispi et al., 2010). 
Crianças submetidas à restrição do crescimento intrauterino apresentam alteração na 
morfologia do coração, com ventrículos mais alongados e globulares (Tintu et al., 2009). Medidas 
morfométricas confirmam o aumento dos diâmetros transversais cardíacos e a dilatação das cavidades 
ventriculares (Crispi et al., 2010; Crispi et al., 2014). Essa alteração na arquitetura cardíaca está 
associada à redução no volume sistólico (Blyakhman et al., 2004), e ao consequente aumento na 
frequência cardíaca, como tentativa de manutenção do débito cardíaco (Crispi et al., 2010). 
Além disso, o estudo ecocardiográfico evidenciou a presença de sinais subclínicos de disfunção 
cardíaca em crianças com restrição do crescimento intrauterino (Girsen et al., 2007; Crispi et al., 2008; 
Kiserud et al., 2006; Tsyvian et al. 1995), sendo que aproximadamente 4% dos neonatos apresentam 
níveis detectáveis de troponina I no sangue coletado do cordão umbilical (Chaiworapongsa et al., 2002) 
e concentração aumentada do peptídeo natriurético atrial (Girsen et al., 2007). 
 
3. Mecanismos Envolvidos na Programação Fetal 
Diversas são as causas relacionadas à gênese da programação fetal, desde fatores ambientais 
aos quais a progenitora está submetida, como a exposição à alta altitude e a toxinas, o consumo 
abusivo de substâncias como o álcool e a nicotina; situações de saúde adversas que acometem a 
gestante, como a pré-eclampsia, o diabetes gestacional e infecções virais e bacterianas; situações de 
25 
 
 
estresse gestacional e finalmente, fatores relacionados à condição nutricional materna, como a 
disponibilidade proteica e/ou calórica e de macro e micronutrientes na dieta durante o período 
gestacional (Fowden et al., 2006). Cada um destes fatores, por meio de diversos mecanismos como 
alterações morfológicas e funcionais na placenta, redução na disponibilidade de oxigênio e substrato 
energético para o feto, bem como modulações na secreção hormonal podem determinar alterações 
no crescimento e no desenvolvimento fetal, tendo como consequências, no indivíduo adulto, maior 
propensão ao desenvolvimento de doenças, dentre as quais, as doenças cardiovasculares e 
metabólicas (Fowden et al., 2006). 
Assim, tem-se que um dos fatores determinantes da gênese da programação fetal é a 
disponibilidade de nutrientes para o feto, sendo este diretamente relacionado ao estado nutricional 
materno e à capacidade de transferência destes nutrientes pela via placentária (Jansson & Powell, 
2007). Assim, a placenta atua como um sensor de nutrientes, regulando a sua transferência da 
progenitora para o feto de acordo com a disponibilidade materna e a demanda fetal (Jansson & Powell, 
2007). 
O modelo de restrição proteica gestacional está associado a menor disponibilidade de proteínas 
e aminoácidos, sendo que as alterações no desenvolvimento da prole refletem, em parte, a limitada 
disponibilidade de aminoácidos essenciais (Rees et al., 1999). Além disso, em ratos, a restrição proteica 
gestacional está associada ao aumento no tamanho da placenta (Langley-Evans et al., 1996 a,b) e de 
sua superfície de troca (Doherty et al., 2003), à redução no fluxo sanguíneo uterino (Itoh et al., 2002), 
e portanto, à reduçãona eficiência do transporte placentário de aminoácidos e glicose (Rosso, 1977). 
A prole de mamíferos é capaz de se adaptar à menor disponibilidade proteica durante o período 
gestacional às custas de alterações metabólicas, redistribuição do fluxo sanguíneo fetal e alteração na 
síntese de hormônios fetais e placentários que regulam o crescimento fetal (Fowden, 1995). A resposta 
fetal imediata à desnutrição no período intrauterino está associada ao catabolismo (Harding & 
Johnston, 1995), à redução da taxa metabólica e à consequente redução na taxa de crescimento fetal 
(Barker, 2000). Além disso, ocorre a redistribuição do fluxo sanguíneo nos tecidos fetais, priorizando a 
perfusão de órgãos importantes para a sobrevivência fetal, como o cérebro, com o intuito de proteção 
destes tecidos contra a hipóxia e a escassez de nutrientes (Campbell et al., 1967; Rudolph, 1984). 
A gênese da programação fetal em decorrência, dentre outros fatores, da desnutrição materna 
está também associada à modulação hormonal materna. 
26 
 
 
A nutrição materna também está associada a alterações hormonais fetais, bem como a 
alterações nas interações metabólicas e hormonais entre o feto, a placenta e a progenitora, cuja 
coordenação está relacionada ao crecimento fetal (Harding & Johnston, 1995). 
A secreção fetal de insulina e de fatores de crecimento insulina-like (IGFs) é importante na 
regulação do crescimento fetal e responde rapidamente a alterações na nutrição materna (Fowden, 
1989). Na ocorrência de redução da ingestão alimentar materna, as concentrações fetais de insulina, 
IGF e glicose diminuem provavalemente devido à redução na concentração de IGF materno. A redução 
na concentração destes hormônios fetais está, por sua vez, associada à redução da transferência de 
aminoácidos e glicose da mãe para o feto, e consequentemente, a redução do crescimento fetal 
durante o período intrauterino (Oliver et al., 1993). 
A desnutrição materna assim como a restrição proteica gestacional estão, portanto, associadas 
à redução na concentração de hormônios que controlam o crescimento fetal. Entretanto, as condições 
nutricionais maternas estão também associadas ao aumento na concentração fetal de cortisol 
(Fowden, 1995). 
Embora os glicocorticóides sejam moléculas lipofílicas e, portanto, sejam capazes de atravessar 
livremente a barreira placentária, em condições fisiológicas, sua concentração no feto é menor em 
relação à progenitora (Beitins et al., 1973; Dalle et al., 1978; Montano et al., 1991). Esse gradiente de 
concentração é mantido em decorrência da atividade da enzima 11-β hidroxiesteroide dehidrogenase 
tipo 2 placentária (11- βHSD-2), que atua como barreira bioquímica, inativando os esteroides bioativos 
(cortisol ou corticosterona) e convertendo-os em metabólitos inativos (cortisona ou 11-
deidrocorticosterona), evitando, dessa forma, que os corticoides maternos acessem a circulação fetal 
(Edwards et al., 1993; Seckl & Brown, 1994; Krozowski et al., 1995). De fato, a ação desta enzima 
placentária impede que a maior parte dos glicocorticoides maternos alcance a circulação fetal tanto 
em roedores (Cottrell et al., 2012) quanto e em humanos (Benediktsson et al., 1997). 
Em roedores, a atividade da enzima 11- βHSD-2 placentária correlaciona-se com o peso ao 
nascimento da prole (Benediktsson et al., 1993), sendo que esta correlação também foi verificada em 
humanos (Stewart et al., 1995), sugerindo que as variações fisiológicas da atividade desta enzima e a 
consequente variação nos níveis de exposição a glicocorticoides estão associados às variações 
fisiológicas do crescimento fetal (Chapman et al., 2013). Entretanto, a restrição proteica materna 
determina importante redução tanto da atividade quanto da expressão da enzima 11- βHSD-2 
placentária (Cottrell et al., 2012). Dessa forma, o feto é precocemente exposto à alta concentração de 
glicocorticoides, o que promove alterações no desenvolvimento e a maturação precoce de diversos 
tecidos fetais (Chapman et al., 2013). A superexposição fetal aos glicocorticóides maternos ocasiona a 
27 
 
 
hiperatividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) da prole, que por sua vez, está associada ao 
desenvolvimento de alterações renais e de hipertensão arterial no adulto (Benediktsson et al., 1993; 
Dodic et al., 1998; Lesage et al., 2001; Holmes et al., 2006). Além disso, a precoce exposição aos 
glicocorticoides está associada a diversas alterações deletérias como a redução no peso ao nascer e ao 
maior risco cardiovascular no indivíduo adulto (Edwards et al., 1993). 
As consequências da superexposição precoce aos glicocorticoides maternos são decorrentes da 
ação direta deste hormônio nos diversos órgãos fetais, promovendo alterações tanto na morfologia 
quanto na fisiologia destes órgãos, por meio da regulação da expressão gênica (Chapman et al., 2013). 
Dessa forma, diversos estudos têm evidenciado o papel dos glicocorticoides como agentes de 
regulação epigenética (Nyirenda et al., 1998; Welberg, et al., 2000; Welberg et al., 2001; Weaver et al., 
2004; Drake et al., 2005; Nyirienda et al., 2006; Wyrwoll et al., 2007; Wyrwoll et al., 2007; Seckl, 2008), 
sendo, portanto, a regulação epigenética outro importante mecanismo relacionado à gênese da 
programação fetal. 
 
3.1. Regulação Epigenética 
A expressão gênica resulta de uma regulação molecular complexa que envolve sequências 
regulatórias, RNA polimerases, fatores de transcrição e proteínas reguladoras, que interagem entre si 
para o controle da transcrição e da tradução (Condorelli et al., 2013; Wu et al., 2009). 
A epigenética é importante agente regulador destas interações. O conceito moderno de 
epigenética diz respeito aos padrões estáveis e herdáveis de expressão gênica e que não envolvem 
alterações na sequência de nucleotídeos do DNA (Egger et al., 2004; Feinberg & Tycko, 2004). Em 
mamíferos, os principais mecanismos de regulação epigenética envolvem a metilação do DNA, as 
modificações pós transcricionais nas histonas e a atuação de RNAs não-codificantes, dentre os quais 
se destaca a atuação dos microRNAs (Udali et al., 2013). 
Com exceção aos miRNAs, que desempenham seu papel regulador pós-transcricionalmente, 
todos os demais mecanismos de controle da expressão gênica atuam modificando a estrutura da 
cromatina e, consequentemente, alterando a acessibilidade de fatores promotores da transcrição. 
A regulação epigenética representa um dos mecanismos pelo qual as condições nutricionais 
maternas podem modular a expressão gênica e consequentemente o fenótipo fetal (Armitage et al., 
2004; Armitage et al. 2005; Bertram & Hanson, 2001; Bogdarina et al., 2007; Hochberg et al., 2011). 
28 
 
 
O primeiro mecanismo de regulação epigenética está relacionado à metilação do DNA. A 
metilação do DNA consiste na adição de um grupo metil no carbono 5 de resíduos de citosina (5mC) 
localizados em dinucleotídeos citosina-guanina (CpG). O processo de metilação é mediado por três 
diferentes DNA metiltransferases: DNMT1, DNMT3a e DNMT3b, que catalisam e transferem o 
grupamento metil da S-adenosil-L-metionina para as bases de citosina ou adenina na molécula de DNA 
(Bird, 1992; Okamo et al., 1999; Razin et al., 1984). 
A metilação do DNA pode induzir o silenciamento transcricional por meio de mecanismos 
diretos e indiretos. Primeiramente, a metilação de ilhas CpG presentes nas regiões promotoras dos 
genes bloqueia os sítios de ligação dos fatores de transcrição, resultando na inativação do gene (Comb 
& Goodman, 1990; Prendergast et al., 1991; Bird, 2002). Além disso, a metilação de regiões específicas 
pode estar associada ao recrutamento de proteínas MBP (metyl-CpG-binding domain protein) e MeCP-
2 (methyl-CpG-binding protein 2), que por sua vez, interagem com complexos co-repressores 
(Hendrich & Tweedie, 2003; Nikitina et al., 2007). 
Alguns estudos experimentais investigaram as alteraçõesno padrão de metilação do DNA 
associadas a doenças cardiovasculares em decorrência da restrição proteica gestacional. Lillycrop e 
colaboradores verificaram redução na metilação na região promotora dos genes que codificam o 
receptor glicocorticoide (Nr3c1) e o receptor PPARα (peroxisomal proliferator-activated receptor α) e 
o consequente aumento na transcrição destes genes, importantes não somente durante a 
embriogênese, mas também na fisiopatologia da doença cardiovascular no adulto (Lillycrop et al., 
2005; Lillycrop et al., 2008). Além disso, outros pesquisadores mostraram que a restrição proteica 
gestacional influencia o metabolismo de lipídios no indivíduo adulto por meio da alteração do padrão 
de metilação de DNA (van Straten et al., 2010). 
O segundo mecanismo de regulação epigenética envolve as alterações nas histonas. As 
histonas são proteínas associadas ao DNA nuclear, sob a forma da estrutura básica de condensação do 
DNA, o nucleossomo. O nucleossomo é composto por dois complexos proteicos constituídos por 4 
histonas H2A, H2B, H3 e H4, formando um octâmero, no qual a molécula de DNA está incorporada 
(Peterson & Lainel, 2004; Pruss et al., 1995). Sendo assim, as modificações das histonas regulam as 
funções da cromatina alterando a acessibilidade do DNA aos diferentes fatores de transcrição (Strahl 
& Allis, 2000). 
A porção amino-terminal das histonas que compõem o octâmero estão susceptíveis a uma 
variedade de modificações covalentes pós-transcricionais, tais como acetilação e metilação em 
resíduos específicos. 
29 
 
 
A acetilação das histonas consiste na adição de um radical acetil nos resíduos de lisina das 
histonas H2B, H3 e H4 e está associada à descondensação da cromatina e à ativação da transcrição. 
Por outro lado, a retirada do grupo acetil das histonas promove a condensação da cromatina e a 
repressão da expressão gênica. Sendo assim, a acetilação é um processo dinâmico e finamente 
regulado pela ação de duas famílias de enzimas com atuação oposta: as histonas acetiltransferases 
(HATs) e as histonas desacetilases (HDACs) (Wang & Hayes, 2008). 
A metilação das histonas consiste na adição de um radical metil nos resíduos de lisina ou 
arginina das histonas H3 e H4 e pode estar associada tanto à ativação quanto à repressão da 
transcrição, de acordo com a quantidade de radicais adicionados e a sua localização (Bannister & 
Kouzarides, 2005). Assim como a acetilação, o processo de metilação das histonas é dinâmico e 
regulado por duas classes de enzimas com atuação oposta: as histonas metiltransferases (HMTs) e as 
histonas demetilases (HDMTs) (Zhang & Reinberg, 2001; Kouzarides, 2002; Cloos et al., 2008). 
O terceiro mecanismo de regulação epigenética envolve a ação de RNAs não codificantes. 
Aproximadamente 80% dos transcritos gênicos não são traduzidos em proteínas e originam os RNAs 
não codificantes. Estes podem ser divididos em duas classes, de acordo com o número de nucleotídeos 
(nt) que o compõem: os RNAs não codificantes de cadeia longa (lncRNA), compostos por mais de 200 
nt e os RNAs não codificantes de cadeia curta, compostos por menos de 200 nt, e que englobam os 
piwi-RNAs (piRNAs), os pequenos RNAs de interferência (siRNAs) e os miRNAs (miRNAs) (Wang & 
Chang, 2011; Mitra et al., 2012; Qureshi & Mehler, 2012), que são os principais reguladores 
epigenéticos a serem avaliados no presente estudo. 
 
3.1.1. MiRNAs 
 
i. Descoberta dos miRNAs 
Os miRNAs são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão gênica pós-
transcricionalmente de forma sequência-específica (Bartel, 2004). 
Lin-4 foi o primeiro miRNA a ser descoberto, em 1993, por meio da articulação de esforços entre 
os laboratórios dos pesquisadores Ambros e Ruvkun (Bartel, 2004; Lee et al., 1993). 
Estudos com linhagens mutantes do nematóide Caenorhabditis elegans permitiram identificar a 
importância do gene lin-4 na transição do primeiro (L1) para o segundo (L2) estágio larval (Horvitz et 
al., 1980; Chalfie et al., 1981; Lee et al., 2004). Em 1987, Ferguson e colaboradores do laboratório de 
30 
 
 
Horvitz identificaram que mutação nula no gene lin-14 determina fenótipo exatamente oposto ao 
observado em decorrência da mutação nula no gene lin-4 (Ferguson et al., 1987; Lee et al., 2004). Esta 
observação indica que o gene lin-4 pode regular negativamente o gene lin-14 (Ruvkun & Giusto, 1989; 
Lee et al., 2004). Ambros e os colaboradores Lee e Feinbaum verificaram que lin-4 não codifica proteína 
alguma (Lee et al., 1993; Lee et al., 2004) mas identificaram dois transcritos de 61 e 22 nucleotídeos 
(nt) (Lee et al., 1993). Concomitantemente, outros pesquisadores evidenciaram que a expressão de 
lin-14 era negativamente regulada pós-transcricionalmente e que a região 3’ não traduzida (3’UTR) 
deste gene era suficiente para que a regulação ocorresse (Wightman et al., 1993). Em 1992, Ambros e 
Ruvnkun, de forma independente, concluíram que os transcritos de lin-4 são complementares à 
sequência repetida na região 3’UTR do gene lin-14 (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993; Lee et al., 
2004). Em 1993, ambos pesquisadores publicaram artigos independentes em que evidenciam que o 
transcrito de 22 nt de lin-4 regula negativamente a expressão de lin-14 através da região 3’UTR (Lee et 
al., 1993; Wightman et al., 1993; Lee et al., 2004). Sendo assim, foi revelado o inesperado mecanismo 
celular regulatório envolvendo um transcrito não codificador de proteína. No entanto, os cientistas 
acreditavam que este seria um mecanismo exclusivo de C. elegans. 
Let-7 foi o segundo miRNA a ser descoberto em C. elegans no ano de 2000. Reinhart e 
colaboradores do laboratório de Ruvkun evidenciaram que let-7 codifica um RNA de 21 nt que controla 
a transição quarto do estágio larval (L4) para o adulto. A perda da atividade de let-7 determina 
reaparecimento de células do estágio larval no adulto, enquanto que o aumento na atividade de let-7 
determina a expressão precoce de células do estágio adulto (Reinhart et al., 2000). Os autores também 
identificaram que let-7 é complementar a dois segmentos diferentes na região 3’UTR do gene lin-41 
(Reinhart et al., 2000; Vella et al., 2004; Vella & Slack, 2005). A sequência do let-7 mostrou-se ser 
altamente conservada na maioria dos organismos (Pasquinelli et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2001; 
Kaufman & Miska, 2010), o que evidenciou a não exclusividade dos miRNAs aos nematóides e 
desencadeou uma revolução na pesquisa dessa nova classe de pequenos RNAs não codificadores, os 
miRNAs (Almeida et al., 2001). 
Atualmente, o banco de dados de miRNAs registra mais de 30.000 sequências descritas em 206 
espécies entre vertebrados, invertebrados, plantas e vírus (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014; 
http://www.mirbase.org/). 
 
31 
 
 
ii. Localização genômica, biogênese e função dos miRNAs 
Os miRNAs são filogeneticamente conservados e podem ter várias localizações no genoma: 
intergênicos, intrônicos e exônicos (Olena & Patton, 2010; Kim & Nam, 2006; Figura 1). 
 
 
Figura 1. Organização genômica dos miRNAs. A: miRNAs intergênicos são encontrados em regiões 
genômicas distintas de unidades de transcrição conhecidas. Podem ser monocistrônicos (parte superior) e ter os 
seus próprios promotores ou policistrônicos (parte inferior), em que vários miRNAs são transcritos como um 
conjunto de transcritos primários com um promotor partilhado. B: miRNAs intrônicos estão localizados em 
íntrons de genes conhecidos (codificantes ou não codificantes de proteínas) e podem estar representados por 
apenas um único miRNA (parte superior) ou por um cluster de miRNAs (parte inferior). Os miRNAs intrônicos são 
transcritos a partir do promotor do gene onde se encontram e processados a partir dos íntrons transcritos deste 
gene. No caso dos mirtrons (no meio), o íntron possui a sequência exata do pré-miRNA com locais de splicing de 
cada lado. C: miRNAs exônicos sobrepõem-sea um éxon e a um íntron de um gene não codificante e são 
transcritos pelo promotor do gene onde se encontram. (Adaptado de Olena e Patton, 2010) 
32 
 
 
Os miRNAs intergênicos podem ser encontrados em regiões genômicas distintas das unidades 
de transcrição conhecidas. Estes miRNAs podem ser monocistrônicos e ter os seus próprios 
promotores ou policistrônicos, em que vários miRNAs são transcritos como um conjunto de transcritos 
primários com um promotor partilhado. Os miRNAs intrônicos localizam-se nos íntrons de genes que 
podem ou não codificar proteínas. Estes miRNAs podem estar presentes individualmente ou 
organizados em cluster. Embora raros, alguns miRNAs podem também ter origem exônica, 
sobrepondo-se muitas vezes a um éxon e a um íntron de um gene não codificante (Olena & Patton, 
2010). 
Em humanos, aproximadamente um terço dos miRNAs são organizados em clusters. É provável 
que um dado cluster seja uma única unidade transcricional, sugerindo uma regulação coordenada de 
miRNAs no cluster. Análise in silico, revelou que mais da metade dos clusters contêm duas ou mais 
sequencias de miRNAs semelhantes. No entanto, é muito raro que miRNAs maduros com sequências 
idênticas sejam repetidos em um mesmo cluster. Esta organização genômica confere expressão 
simultânea de miRNAs semelhantes, possivelmente levando à diversidade combinatória e à sinergia 
dos efeitos biológicos. No entanto, todos os miRNAs derivados de um mesmo cluster não são expressos 
em níveis iguais, sugerindo que os miRNAs são modulados também em nível pós-transcricional (Lee & 
Dutta, 2009). 
A primeira etapa da biogênese dos miRNAs ocorre no núcleo (Figura 2). Nesta etapa, os genes 
que codificam miRNAs são transcritos pela RNA polimerase II, dando origem ao miRNA primário (pri-
miRNA), que apresenta estrutura em hairpin e recebe o capeamento da extremidade 5’ e a 
poliadenilação da extremidade 3’ (Cai et al., 2004; Lee et al., 2004; Lee et al., 2002). 
Os pri-miRNAs são inicialmente processados no núcleo da célula animal por um complexo 
microprocessador formado pela DROSHA, enzima tipo RNAse III que possui atividade endonucleolítica, 
e pelo cofator DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region in gene 8). Nesta etapa, o complexo DROSHA-
DGCR8 reconhece a estrutura de hairpin do pri-miRNA e o cliva das sequências flanqueadoras, 
originando estruturas de aproximadamente 65 nt também com estrutura em forma de hairpin, os 
miRNAs precursores (pré-miRNA) (Lee et al., 2003). 
Para miRNAs originados a partir de mirtrons, o processamento inicial é realizado diretamente 
pelo spliceossomo e então a estrutura linear originada é dobrada em forma de hairpin, originando o 
pré-miRNA (Ruby et al., 2007; Okamura et al., 2007; Berezikov et al., 2007). 
 
33 
 
 
 
Figura 2. Biogênese dos miRNAs. O transcrito primário de genes que codificam miRNAs é chamado 
pri-miRNA é processado pela enzima DROSHA em um precursor de aproximadamente 65 nt com estrutura em 
hairpin, chamado pré-miRNA. O pré-miRNA pode também ter origem a partir de splicing em transcritos a partir 
da região de mirtrons. O pré-miRNA é conduzido ao citoplasma com o auxílio da proteína exportina-5. No 
citoplasma, é clivado pela DICER e origina o miRNA de fita dupla miRNA:miRNA*. Incorporada ao complexo RISC, 
cujo principal componente é a proteína argonauta 2, a fita madura de miRNA regula negativamente a expressão 
gênica pela repressão da tradução ou pela degradação do mRNA, de maneira dependente da 
complementariedade entre as sequencias do miRNA e do mRNA alvo (Adaptado de Luo et al., 2015) 
 
34 
 
 
Em seguida, o pré-miRNA originado é exportado do núcleo em direção ao citoplasma, com o 
auxílio da proteína exportina-5, que forma um complexo de transporte através da membrana 
dependente de RanGTP. É através deste complexo que o pré-miRNA é translocado para o citoplasma 
por hidrólise de GTP (Bohnsack, 2004; Lund et al., 2004; Yi et al., 2003; Okada et al., 2009). 
No citoplasma, os pré-miRNAs são clivados por uma segunda ribonuclease III denominada 
DICER, que atua com a proteína TRBP (trans-activation response RNA-binding protein) na formação dos 
miRNAs maduros (Zhang et al., 2004; Lee et al., 2003). Assim, após a ação desse complexo DICER-TRBP 
é originado um duplex imperfeito (miRNA: miRNA*) constituído por duas cadeias de RNA (dsRNA, do 
inglês, double strand RNA) de tamanhos similares. Uma das cadeias corresponde ao miRNA maduro e 
a outra cadeia complementar à primeira corresponde ao miRNA* complementar (Zhang et al., 2004; 
Bartel, 2004). A distinção entre a fita de miRNA maduro e a fita de miRNA* complementar é feita com 
base na estabilidade termodinâmica da extremidade 5’ de ambas as cadeias do duplex (Zeng, 2006). A 
cadeia menos estável termodinamicamente na extremidade 5’ corresponde ao miRNA maduro 
enquanto que a outra cadeia corresponde ao miRNA* complementar e, na maioria dos casos, é 
degradada (Wang et al., 2007; Schwarz et al., 2003). O miRNA maduro, formado por aproximadamente 
21 nt, é então incorporado ao complexo proteico RISC (RNA-induced silencing complex), cujo principal 
componente é a proteína argonauta (AGO 1-4), que reconhece o RNA mensageiro (mRNA) que 
contenha sequências complementares e induzem o silenciamento gênico pós-transcricional (Khvorova 
et al., 2003; Filipowicz et al., 2008). 
Um conjunto de 2 a 8 nt na extremidade 5’ do miRNA, região denominada seed sequence, são 
os mais importantes na seleção do mRNA alvo. No entanto, outros nucleotídeos e a estrutura 
secundária do mRNA nas regiões próximas à sequência alvo também influenciam no pareamento do 
miRNA com seus alvos (van Rooiji et al., 2008). 
O emparelhamento perfeito entre o miRNA e a região 3’UTR do mRNA alvo, promove a 
degradação do mRNA alvo, sendo este o efeito predominante (66-90%) na interação miRNA-mRNA em 
cultura de células de mamíferos (Selbach et al., 2008; Baek et al., 2008; Guo et al., 2010; Eichhorn et 
al., 2014). Evidências sugerem que a degradação do mRNA alvo é catalisada pelas mesmas enzimas 
envolvidas na via de degradação das extremidades 5’ em direção à 3’ dos mRNAs presentes no 
citoplasma celular (Jonas & Izaurralde, 2015). Nesta via, a cauda poli-A dos mRNAs é clivada, em 
seguida as proteínas do CAP são removidas e finalmente, os mRNAs são degradados a partir da 
extremidade 5’ em direção à extremidade 3’ pelas exoribonucleases presentes no citoplasma (Jonas & 
Izaurralde, 2013). 
35 
 
 
Já o emparelhamento imperfeito entre o miRNA e a região 3’UTR do mRNA promove a inibição 
da tradução, sendo este efeito observado em 6-26% das interações miRNA-mRNA em cultura de 
células de mamíferos (Eichhorn et al., 2014). A maneira pela qual os miRNAs promovem a inibição da 
tradução ainda é bastante controversa (Jonas & Izaurralde, 2011; Fabian & Sonenberg, 2012). Acredita-
se que os miRNAs são capazes de inibir a tradução na fase da iniciação, mas o mecanismo molecular 
envolvido nesta inibição ainda não foi elucidado (Wakiyama et al., 2007; Ricci et al., 2013; Mathonnet 
et al., 2007; Humphreys et al., 2005; Thermann et al., 2007). 
Embora o emparelhamento entre o miRNA e o mRNA ocorra predominantemente na região 
3’UTR do mRNA complementar, o emparelhamento também pode existir na região 5’UTR e em outras 
regiões codificantes (Yue et al., 2009) 
Recentemente, estudos tem sugerido que os miRNAs podem também atuar como reguladores 
positivos da transcrição (Jopling et al., 2005; Vasudevan et al., 2007; Orom et al., 2008; Zhang et al., 
2014). Entretanto, o papel dos miRNAs como ativadores pós-transcricionais é relatado somente em 
alguns estudos específicos e até o presente momento, não é amplamente aplicável (Zhang et al., 2014). 
A regulação da expressão gênica exercida pelos miRNAs apresenta diferentes aspectos (Figura 
3). 
O primeiro aspecto a ser destacado é que um miRNA intrônico pode ser transcrito 
simultaneamente a determinadogene que compõe determinada via metabólica sobre o qual este 
miRNA exerce função modulatória (Small & Olson, 2011). Outro aspecto importante é que um único 
miRNA pode modular a tradução de diversos mRNAs simultaneamente, da mesma forma que diversos 
miRNAs podem atuar de forma cooperativa na modulação de determinado mRNA (Enright et al., 2003; 
van Rooiji et al., 2008; Small & Olson, 2011). E, por fim, os miRNAs podem atuar em determinados 
processos biológicos, modulando tanto fatores que estimulam quanto fatores que inibem estes 
processos, a fim de manter a homeostase deste processo, independentemente de flutuações 
ambientais (Small & Olson, 2011). Dessa forma, nota-se que os miRNAs fazem parte de uma rede de 
regulação gênica de alta complexidade e apresentam potencial para regular grande parte do 
transcriptoma (Zhao & Srivastava, 2008). 
 
 
36 
 
 
 
Figura 3. Diferentes aspectos relacionados à modulação da expressão gênica exercida pelos 
miRNAs. (a) miRNA intrônico transcrito simultaneamente a determinado gene que compõe determinada via 
metabólica sobre o qual este miRNA exerce função modulatória; (b) um único miRNA pode modular a tradução 
de diversos mRNAs simultaneamente; (c) diversos miRNAs podem atuar de forma cooperativa na modulação de 
determinado mRNA; (d) miRNAs podem atuar em determinados processos biológicos, modulando tanto fatores 
que estimulam quanto fatores que inibem estes processos, a fim de manter a homeostase deste processo 
(Adaptado de Small & Olson, 2011) 
 
Análises da expressão espacial dos miRNAs evidenciam a expressão tecido e tempo-específica, 
ou seja, cada miRNA apresenta funções específicas em determinados tecidos e em determinadas 
etapas do desenvolvimento embrionário (Lagos-Quintana et al., 2002; Wienholds et al., 2005). Além 
disso, os miRNAs participam da regulação de diversos processos como a proliferação e a diferenciação 
celular e a apoptose, bem como da regulação do sistema imunológico, da fisiologia e do metabolismo 
de diversos tecidos, dentre os quais, o tecido cardíaco (Ambros, 2004; Bartel, 2004; Wienholds & 
Plasterk, 2005; Thum et al., 2008; Sun et al., 2010). 
 
37 
 
 
iii. Os miRNAs no tecido cardíaco 
A recente identificação dos miRNAs como reguladores da morfologia e da função cardiovascular 
aumentou significativamente a compreensão dos processos fisiológicos e fisiopatológicos no sistema 
cardiovascular. Diversos estudos descrevem a função específica de diversos miRNAs tanto no 
desenvolvimento cardiovascular durante a embriogênese quanto na etiologia e na progressão de 
doenças como o infarto do miocárdio, hipertrofia ventricular, a fibrose e a falência cardíaca (Thum et 
al., 2008; Catalucci & Condorelli, 2009; Bauersachs, 2010; Small et al., 2010; Small & Olson, 2011). Além 
disso, evidenciam a perspectiva de que os miRNAs são potencialmente importantes tanto na 
prevenção quanto no diagnóstico e na conduta clínica a serem adotadas em pacientes com doença 
cardiovascular (Fiedler et al., 2012; Gupta et al., 2010). 
Experimentos realizados em camundongos, nos quais foi realizada a deleção cardio-específica 
do gene que codifica a enzima Dicer, possibilitaram a compreensão da importância dos miRNAs 
durante o desenvolvimento cardíaco. O uso de Cre recombinase controlada pelo promotor do gene 
Nkx2.5 (Nk2 homeobox 5), expresso durante o desenvolvimento cardíaco, promove o silenciamento 
da Dicer e está associado a letalidade do embrião em decorrência de defeitos na morfogênese cardíaca 
(Stanley et al., 2002). Por outro lado, o silenciamento da Dicer também pode ser obtido com a 
utilização de Cre recombinase controlada pelo promotor do gene α-MHC (α-myosin heavy chain), 
predominantemente expresso no período pós-natal. Neste caso, os animais apresentam expressão 
anormal de proteínas contráteis, desarranjo dos sarcômeros e redução significativa da função cardíaca, 
que rapidamente progride para cardiomiopatia dilatada, falência cardíaca e letalidade (Chen et al., 
2008). Em camundongos jovens com 3 semanas de idade, a deleção da Dicer está associada a 
moderado remodelamento ventricular, aumento atrial acentuado, reativação de genes fetais e morte 
súbita na primeira semana após a deleção. Em contraste, a deleção em animais adultos com 8 semanas 
de idade está associada a acentuada hipertrofia ventricular, desarranjo das miofibrilas, fibrose cardíaca 
e reativação de genes fetais (da Costa Martins et al., 2008). 
Os miRNAs também modulam o processo de vascularização cardíaca. A deleção do gene que 
codifica a Dicer na musculatura lisa vascular está associada à redução na espessura das paredes dos 
vasos sanguíneos, redução na proliferação e na diferenciação de células musculares lisas bem como 
ao prejuízo da contratilidade vascular e a hemorragias, o que determinam a letalidade do embrião 
(Albinsson et al., 2010). Além disso, a inibição da expressão da Dicer nas células endoteliais demonstra 
a importância dos miRNAs na angiogênese pós-natal (Suarez et al., 2008). 
38 
 
 
Dessa forma, estudos com animais knockout do gene da Dicer estabeleceram a importância da 
redução na expressão global de miRNAs expressos no coração durante o desenvolvimento 
cardiovascular. Entretanto, para compreender a contribuição específica dos diversos miRNAs no 
desenvolvimento cardíaco, a manipulação de miRNAs individualmente permite a delimitação precisa 
de suas funções fisiológicas e de seus mecanismos moleculares de ação (Porrello, 2013). 
O miR-1 é o miRNA mais abundante no coração de mamíferos, é altamente conservado entre as 
espécies e foi o primeiro miRNA a ser associado ao desenvolvimento cardíaco (Rao et al., 2009). O miR-
1 (miR-1-1 e miR-1-2) e o miR-133 (miR-133a-1, miR-133a-2 e miR-133b) são derivados do mesmo 
transcrito policistrônico e sua expressão no tecido cardíaco embrionário é mediada por diversos 
fatores de transcrição como o SRF (serum-response fator), Mef2 (myocyte-enhancer factor 2), MyoD 
(myogenic differentiation factor D) e Nkx2.5 (Zhao et al., 2005; Liu et al., 2007; Qian et al., 2011). 
A regulação da expressão do miR-1 é importante para o equilíbrio entre a diferenciação e a 
proliferação de células precursoras cardíacas durante a cardiogênese (Zhao et al., 2005). A expressão 
aumentada de miR-1 está associada a redução na proliferação de cardiomiócitos sem alteração no 
número de células em apoptose. A inibição da cardiogênese decorrente da expressão aumentada de 
miR-1 é mediada pelo fator de transcrição Hand2 (heart and neural crest derivatives expressed 2) (Zhao 
et al., 2005), que é necessário para a proliferação dos cardiomiócitos no ventrículo durante estágios 
precoces do desenvolvimento (Srivastava et al., 1995; Srivastavaa et al., 1997). A deleção de miR-1-2 
em camundongos associa-se a aumento no número de cardiomiócitos em mitose e a maior expressão 
de Hand2 (Zhao et al., 2007). Os animais que apresentam esta mutação e que sobrevivem até a infância 
apresentam alterações no sistema de condução cardíaco e aproximadamente 15% destes animais 
evoluem para cardiomiopatia dilatada e morte até o terceiro mês de idade. As alterações 
eletrofisiológicas decorrentes da deleção de miR-1-2 são decorrentes da perda da inibição do fator de 
transcrição Irx5 (iroquois homeobox 5), que regula a expressão do canal de cálcio Kcnd2 (potassium 
voltage-gated channel, Shal-related subfamily, member2), que participa da repolarização das células 
cardíacas (Zhao et al., 2007). 
Em contraste à sensibilidade do coração para a haploinsuficiência da expressão de miR-1, a 
ausência dos genes que codificam o miR-133a-1 ou o miR-133a-2 não determina a ocorrência de 
anormalidades cardíacas. A deleção de ambos os genes resulta em letalidade no período embrionário 
tardio ou no período neonatal em decorrência de cardiomiopatia dilatada (Liu et al., 2008). Nestes 
animais há aumento da proliferação de cardiomiócitos, maior apoptose,