Uma vacina visando o mutante IDH1 em glioma recém-diagnosticado _ Natureza

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17/04/22, 20:07 Uma vacina visando o mutante IDH1 em glioma recém-diagnosticado | Natureza
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Artigo Acesso livre Publicados:24 de março de 2021
Uma vacina visando o mutante IDH1 em glioma recém-
diagnosticado
Michael Platten ,Lucas Bunse ,… Wolfgang Wick  Mostrar autores
Natureza  592 , 463–468 ( 2021 )
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Resumo
A isocitrato desidrogenase 1 ( IDH1 ) mutada define um subtipo molecularmente
distinto de glioma difuso . A mutação IDH1 mais comum em gliomas afeta o
códon 132 e codifica IDH1(R132H), que abriga um neoepítopo clonal compartilhado
que é apresentado no complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II 
. Uma vacina peptídica específica de IDH1(R132H) (IDH1-vac) induz respostas
terapêuticas específicas de células T auxiliares que são eficazes contra tumores
IDH1(R132H) em camundongos humanizados com MHC singênico . Aqui
descrevemos um estudo multicêntrico, de braço único, aberto, primeiro em
humanos de fase I que realizamos em 33 pacientes com diagnóstico recente de IDH1
(R132H) grau 3 e 4 da Organização Mundial da Saúde astrocitomas (Neurooncology
Working Group of the German Cancer Society trial 16 (NOA16), identificador
ClinicalTrials.gov NCT02454634). O estudo atingiu seu objetivo primário de
segurança, com eventos adversos relacionados à vacina restritos ao grau 1. As
respostas imunes induzidas pela vacina foram observadas em 93,3% dos pacientes
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em vários alelos do MHC. As taxas de três anos sem progressão e sem morte foram de
0,63 e 0,84, respectivamente. Os pacientes com respostas imunes mostraram uma
taxa livre de progressão de dois anos de 0,82. Dois pacientes sem resposta imune
apresentaram progressão tumoral dentro de dois anos após o primeiro diagnóstico.
Uma pontuação de especificidade de mutação que incorpora a duração e o nível de
respostas de células T específicas de IDH1(R132H) induzidas por vacina foi associada
à apresentação intratumoral do neoantígeno IDH1(R132H) em tecido tumoral pré-
tratamento. Houve alta frequência de pseudoprogressão, o que indica reações
inflamatórias intratumorais. A pseudoprogressão foi associada ao aumento das
respostas de células T periféricas induzidas pela vacina. O sequenciamento
combinado de RNA de célula única e receptor de células T mostrou que o CD40LG
infiltrante de tumor e CXCL13 em um paciente com
pseudoprogressão foram dominados por um único receptor de células T reativo a
IDH1(R132H).
Principal
Foram selecionados 44 pacientes em 7 dos 8 centros que fazem parte do German
Cancer Consortium (DKTK) e/ou do Grupo de Trabalho de Neurooncologia da
Sociedade Alemã de Câncer (NOA; Tabela Suplementar 1 ). Destes, 33 pacientes foram
incluídos no estudo (Dados Estendidos Fig. 1 ). Os motivos da exclusão estão listados
na Tabela Complementar 2 . Um paciente (ID16) não foi vacinado devido a um evento
adverso (febre de origem desconhecida) antes da vacinação. Assim, 32 pacientes
foram tratados e, portanto, incluídos no conjunto de dados de segurança (SDS; Fig.
1). Vinte pacientes da SDS (62,5%) eram do sexo masculino e 12 (37,5%) do sexo
feminino, com média de idade de 40,4 ± 8,95 anos (média ± dp). A população do
estudo foi dividida em três grupos de tratamento (TG1–TG3) com base no tratamento
padrão de cuidados (SOC) que os pacientes receberam antes da inscrição:
radioterapia isolada (RT, TG1), três ciclos de quimioterapia com TMZ isoladamente
(mono- TMZ, TG2) ou radioquimioterapia combinada com TMZ (RT + cTMZ, TG3)
(Dados Estendidos Fig. 1 ). A maioria dos pacientes fez radioterapia e TMZ antes da
vacinação com IDH1 ( n  = 23, 71,9%); três (9,4%) foram tratados apenas com TMZ e
Os agrupamentos de células T auxiliares + +
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seis (18,8%) foram submetidos à radioterapia isolada. A dose total média de
radioterapia ( n = 29) foi de 59,4 Gy. Dos 32 pacientes, 21 (65,6%) apresentavam
astrocitoma grau 3 da Organização Mundial da Saúde (OMS) e 11 (34,4%) grau 4. A
localização predominante dos astrocitomas foi nos lobos frontais (23/32, 71,9%) .
Quanto à cirurgia, 17 dos 32 pacientes (53,1%) foram submetidos à ressecção
completa do tumor, 12 (37,5%) foram submetidos à ressecção subtotal e 3 (9,4%)
foram submetidos apenas à biópsia. Para todos os tecidos de astrocitoma com
material suficiente (24 de 32; 75,0%), a subclasse de metilação foi definida
retrospectivamente. A metilação de baixo grau foi responsável por 14 desses 24
astrocitomas (58,3%), e os 10 restantes (41,7%) foram de classe de metilação de alto
grau (Fig. 1 , Tabela Complementar 3). Dois pacientes (ID19, ID21) foram inscritos,
mas não puderam ser avaliados para teste de imunogenicidade e, portanto, foram
excluídos da análise de imunogenicidade. Trinta dos 32 pacientes no SDS (93,8%) e 28
dos 30 pacientes no conjunto de dados de imunogenicidade (IDS; 93,3%) chegaram
ao fim do tratamento (EOT). A duração máxima do tratamento foi de 23 semanas. O
tempo médio de acompanhamento (em junho de 2020) foi de 46,9 meses (intervalo
de confiança de 95% (IC): 45,2–49,2 meses) para o SDS e 47,1 (45,2–49,2) meses para o
IDS.
Fig. 1: Características do paciente na linha de base e tratamento SOC.
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cTMZ, TMZ concomitante (75 mg m de área de superfície corporal (ASC)) diariamente
durante a radioterapia; TMZ, monoterapia com TMZ (três ciclos); XRT, radioterapia (30 × 2
Gy, se não especificado de outra forma na Tabela Complementar 3 ); Classe de metilação de
baixo grau (Meth.); Classe de metilação de alto grau; ND, não determinado; OMS, grau de
tumor da OMS. n  = 32 pacientes. Ilustração do cérebro retirada do Adobe Stock Standard
sob a ID de licença 222738500.
IDH1-vac é seguro e imunogênico
A SDS compreendeu 249 vacinas administradas a 32 pacientes. Vinte e nove dos 32
pacientes do SDS (90,6%) e 27 dos 30 pacientes do IDS (90,0%) receberam todas as 8
vacinas; um paciente recebeu 7, um recebeu 6 e um recebeu 4 vacinas. A duração do
tratamento no SDS variou de 44 a 162 dias (mediana de 155 dias) e a duração da
observação variou de 153 a 484 dias (mediana de 376 dias). O controle de qualidade
demonstrou que todas as vacinas continham 300 ± 30 μg de peptídeo, e eram
estéreis e livres de endotoxinas. Nenhuma toxicidade limitante de regime (RLT) foi
observada. O perfil geral de citocinasséricas foi indicativo de uma liberação adversa
de citocinas em resposta a IDH1-vac (Dados Estendidos Fig. 2). Vinte e nove dos 32
pacientes (90,6%) tiveram eventos adversos relacionados ao tratamento, nenhum
dos quais foi grave. Um paciente (3,1%) teve eventos adversos graves relacionados ao
tratamento e um paciente (3,1%) descontinuou temporariamente o medicamento do
estudo devido a eventos adversos relacionados ao tratamento (Tabelas
Suplementares 4 , 5 ). Vinte e um (65,6%; IC 95% 46,81–81,43%) e 15 (46,9%; IC 95%
29,09–65,26%) dos eventos adversos classificados como possivelmente relacionados
ao IDH1-vac foram condições no local de administração (induração no local da
injeção ou eritema, respectivamente). Dos 30 pacientes no IDS, 28 (93,3%; IC 95%
77,93-99,18%) apresentaram respostas imunes induzidas por IDH1-vac (Fig. 2a, b).
Respostas imunes de células T induzidas por IDH1-vac foram observadas em 26 de 30
−2
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pacientes e respostas imunes de células B em 28 de 30 pacientes através de múltiplos
alelos de antígeno leucocitário humano (HLA); estas respostas não se
correlacionaram com afinidades HLA in vitro do péptido IDH1(R132H) (Dados
Estendidos Fig. 3 , Tabela Suplementar 6 ). Dois pacientes (6,7%) não desenvolveram
respostas imunes de células T nem células B (Dados Estendidos Fig. 3 ). Para
incorporar a duração e o nível de respostas imunes de células T induzidas por IDH1-
vac especificamente para IDH1(R132H), estabelecemos uma pontuação de
especificidade de mutação exploratória (MSS; Tabela Suplementar 7 , Dados
Estendidos Figs. 4 , 5). A subfenotipagem efetora de citometria de fluxo de células T
periféricas induzidas por IDH1-vac de amostras de pacientes disponíveis com MSSs
elevados mostrou fator de necrose tumoral predominante (TNF), interferon-γ (IFNγ)
e produção de citocinas de interleucina-17 (IL-17) por Células T auxiliares ( ) após
re-estimulação in vitro com IDH1(R132H), que indica o envolvimento de subtipos TH1
e TH17 de células . 2c , Dados Estendidos Fig. 4 ). Nem a produção de IL-10 por
células T reguladoras nem a produção de TNF ou IFNγ por células T citotóxicas foi
observada (Fig. 2c). Além disso, o MSS foi associado à apresentação de antígeno
intratumoral IDH1(R132H) no tecido tumoral pré-tratamento, conforme avaliado por
um ensaio de ligação de proximidade (PLA) in situ MHCII-IDH1(R132H) (Fig. 2d,
Dados Estendidos Fig. 5 e Tabela Suplementar 8 ).
Fig. 2: Imunogenicidade celular e humoral de IDH1-vac.
TH
TH ( Fig
5
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a , b , Análise semi-quantitativa de células T ( a ) e células B ( b ) respostas imunes (IR) em
todos os pacientes no IDS medido pelo ensaio de ponto imunossorvente ligado à enzima
IFNγ (ELISpot) ( a ) ou enzima peptídica IDH1 ensaio imunossorvente ligado (ELISA) ( b ) ( n
 = 30 pacientes). Os pacientes são classificados como respondedores de células T ( n  = 24
pacientes) e não respondedores ( n  = 6 pacientes) com base no ponto de corte específico
da contagem de 50, conforme definido no protocolo do estudo. A resposta para cada visita
(V) é mostrada. c , Fenotipagem efetora de citometria de fluxo de células T periféricas
induzidas por IDH1-vac (CD3 células) de amostras de pacientes disponíveis com
alto MSS ( n  = 5 amostras de pacientes). Os valores relativos após a reestimulação com o
peptídeo IDH1(R132H) em comparação com o peptídeo de controle negativo (glicoproteína
de oligodendrócitos de mielina; MOG) são mostrados. FC, mudança de dobra. A estratégia
de bloqueio é mostrada em Dados Estendidos Fig. 4c . d , Correlação da apresentação do
peptídeo IDH1(R132H) intratumoral na linha de base (quantificado pelo sinal PLA) com a
magnitude e sustentabilidade de respostas de células T periféricas específicas (quantificadas
+ vivo único
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pelo MSS; ver Dados Estendidos Fig. 5 ). r , coeficiente de correlação de Pearson. Os números
de identificação do paciente são mostrados em a – d .
Eficácia do IDH1-vac
A taxa de resposta global foi de 84,4% (IC 95% 67,21–94,72%, 27 de 32 pacientes) do
SDS, correspondendo a 86,7% (IC 95% 69,28–96,24%, 26 de 30 pacientes) do IDS no
final do estudo (EOS; Fig. 3a , Dados Estendidos Fig. 6 ). Nas análises de
acompanhamento do SDS, as taxas de três anos livres de progressão e sem morte
foram 0,63 (IC 95% 0,44–0,77) e 0,84 (IC 95% 0,67–0,93), respectivamente. Dois
pacientes do IDS (ID05 e ID30) que não montaram uma resposta imune induzida por
IDH1-vac (Dados Estendidos Fig. 3 ) mostraram progressão dentro de dois anos, em
comparação com pacientes com respostas imunes (taxa livre de progressão de dois
anos de 0,82 (IC 95% 0,623-0,921) em pacientes com respostas imunes; Fig. 3b ).
Fig. 3: Eficácia de IDH1-vac, pseudoprogressão e resposta de células T.
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a , gráfico Swimmer representando a progressão da doença e intervenções para cada
paciente na SDS ( n  = 32 pacientes). b , gráfico de Simon e Makuch de probabilidades de
sobrevida global e livre de progressão de acordo com a resposta imune induzida por IDH1-
vac covariável tempo-dependente no IDS ( n  = 30 pacientes). x -axes mostram o tempo
desde o primeiro diagnóstico. c , Recuperação de inversão atenuada por fluido de RM
exemplar (FLAIR) e sequências ponderadas em T1 com realce de contraste (CE) de PsPD do
paciente ID01 na visita 12 em comparação com RM de triagem clínica. d, Frequências de
PsPD, doença estável (SD) e doença progressiva (PD) de acordo com os tipos de resposta
das células T para pacientes no IDS. Para definição de respostas transientes e sustentadas,
veja  Métodos . e , Magnitude da melhor resposta de células T definida pela contagem
máxima específica de ELISpot com controle negativo subtraído de acordo com a progressão
da doença. Valores individuais, mediana (linhas sólidas) e quartis (linhas pontilhadas) são
mostrados em gráficos de violino. SD, IC 95% 80–183; PsPD, IC 95% 103–228; PD, IC 95% 11–
88. Teste de Kruskal-Wallis bilateral, comparação múltipla de Dunn. f , Escores de
especificidade de mutação e perfil molecular de cada paciente no IDS ( n  = 30 pacientes).
Classe de metilação de baixo grau ou ND, n = 20; classe de metilação alto grau,  n  = 10,
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sendo CDKN2A/B n  = 4, CDKN2A/B n  = 4 e CDKN2A/B n  = 2 pacientes. g ,
gráfico de Simon e Makuch de probabilidades de sobrevida global e livre de progressão de
acordo com a covariável MSS tempo-dependente em gliomas de alto grau de classe de
metilação molecularmente definidos. n  = 10 pacientes. x -axes mostram o tempo desde o
primeiro diagnóstico.
Respostas de células T específicas de IDH1 e pseudoprogressão
Na SDS, pseudoprogressão (PsPD) ocorreu em 12 de 32 pacientes (37,5%) em
comparação com 10 de 60 (16,7%) em uma coorte de controle pareado
molecularmente (Tabela Complementar 3 ). A PsPD com aumento de contraste
diagnosticada por imagem cerebral é indicativa de reações inflamatórias
intratumorais (Fig. 3c ). Não houve associação aparente com idade, extensão da
ressecção, tratamento SOC ou grau da OMS. O períodomédio de observação mais
longo (7,3 anos) na coorte pareada causou um viés para a detecção de mais PsPD. Em
NOA16, a PsPD foi associada ao início de respostas imunes periféricas induzidas por
IDH1-vac (Dados Estendidos Fig. 7 ) e foi restrita a pacientes com respostas imunes de
células T transitórias ou sustentadas; não detectamos PsPD em pacientes não
responsivos (Fig. 3d). Pacientes com PsPD apresentaram níveis máximos mais altos
de respostas imunes de células T periféricas induzidas por IDH1-vac do que pacientes
com doença progressiva (Fig. 3e ). A avaliação retrospectiva de marcadores
moleculares prognósticos em tecidos de astrocitoma pré-tratamento (Tabela
Suplementar 9 , Dados Estendidos Fig. 8 ) permitiu um subgrupo adicional de 24 de
32 (75,0%) pacientes no SDS. A PsPD não foi associada a nenhum dos marcadores
moleculares intrínsecos ao tumor avaliados, como carga de variação do número de
cópias (CNV-L), classe de metilação, status de deleção de CDKN2A ou CDKN2B ,
frequências de subconjuntos de células imunes periféricas ou alterações nas células
T periféricas superiores clonótipos (Tabela Complementar 9, Dados Estendidos Figs.
7 , 9 , 10 ). Durante o acompanhamento, quatro em cada dez pacientes (40%) com
glioma de alto grau de classe de metilação apresentaram doença progressiva. Destes,
pacientes com MSS que permaneceu abaixo da mediana tiveram uma taxa livre de
progressão de 2 anos de 0,4 (IC 95% 0,052–0,753) em comparação com 0,8 (IC 95%
−/− +/− ++/+ 
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0,204–0,969) para pacientes com MSS que atingiu acima da mediana , apesar de uma
distribuição igual de marcadores moleculares desfavoráveis (Fig. 3f, g ). Sete dos 12
(58,3%) dos pacientes com PsPD, incluindo o paciente ID08, ainda têm doença estável
com tempo médio de acompanhamento de 53,1 meses (IC 95% 45,8–58,2 meses).
Receptor de células T específico em PsPD
Entre os pacientes com PsPD, apenas o paciente ID08 foi submetido à ressecção da
lesão (Tabela Complementar 8 ). Um ensaio ELISpot de IFNγ ex vivo com leucócitos
infiltrantes de lesão (LILs) mostrou células T reativas a IDH1(R132H) (Fig. 4a ). Com
base em dados pré-clínicos e nas observações de que nem CD8 LILs ex vivo
produtoras de citocinas ativamente citotóxicas nem CD8 + células T CD8 
recuperadas por clonótipo de células transgênicas (TCR) reagiram a IDH1 (R132H)
(Dados Estendidos Fig. 11 ), nós nos concentramos em células T CD4 . O
sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) identificou três grupos de CD4
Células T dentro da lesão de PsPD do paciente ID08: células T reguladoras, células T
CD40LG CD4 ativadas e células T CXCL13 CD4 (Fig. 4b, c , Dados Estendidos Fig.
12). As células T CXCL13 CD4 têm sido relatadas como importantes para a
imunidade antitumoral . Ao combinar o sequenciamento de scRNA-seq e TCR,
descobrimos que os aglomerados de células T CD40LG CD4 e CXCL13 CD4 
foram dominados por um TCR (TCR14; Fig. 4d ). No total, o TCR14 foi o quarto TCR
mais abundante dentro do CD4 repertório de células T únicas, enquanto os três
principais TCRs CD4 abundantes (TCR11-13) foram expressos em células T
reguladoras que careciam amplamente de TCR14. O TCR14 foi enriquecido 50,6 vezes
na lesão PsPD do paciente ID08 em comparação com o sangue periférico deste
paciente após a administração de IDH1-vac (Dados Estendidos Figs. 10 , 12 ). A
expressão de TCR transgênico em uma linha de células T humana deficiente em TCR
co-cultivada com células apresentadoras de antígeno autólogas do paciente ID08
mostrou que TCR14 reagiu com IDH1(R132H) (Fig. 4e , Dados Estendidos Fig. 12 ). 
 específicas de IDH1(R132H)
que se infiltraram na lesão ressecada.
4 , 5 , 8 +
+
+
+
+ + + +
+ +
9
+ + + +
+
+
Estes
resultados indicam que IDH1-vac induziu a expansão clonal de células TH
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Fig. 4: Fenótipo de células T moleculares de PsPD associado a IDH1-vac.
a , contagens de IFNγ ELISpot de LILs de PsPD do paciente ID08 na visita 07 após
estimulação ex vivo com reagentes indicados (ver  Métodos ). Células mononucleares de
sangue periférico (PBMCs) estimuladas com peptídeos de citomegalovírus e adenovírus
(CMV/AdV) foram usadas como controle positivo do ensaio. Dados apresentados como
valores individuais e a média de três réplicas técnicas (para controle negativo, IDH1(R132H)).
Unicates técnicos para CMV/AdV, apenas células dendríticas (DCs), apenas LILs, CMV/AdV
PBMCs. b , gráfico UMAP representando agrupamentos moleculares definidos por
transcriptoma de célula única de LILs ( n  = 16.720 células) de PsPD do paciente ID08. c ,
expressão de CXCL13 em LILs de PsPD do paciente ID08 dentro de agrupamentos como em
b .d , mapeamento de gráfico de bolhas top clones de TCR em células T CD4 e CD8 
definidas por sequenciação de TCR de célula única em agrupamentos transcriptômicos
definidos em b . e , ativação de células T medida pelo ensaio repórter NFAT de luciferase
após superexpressão de um TCR CD4 top-cinco (TCR14 in d ) em células T Jurkat humanas
e co-cultura com PBMCs autólogos carregados com peptídeo. Dados descritos como valores
individuais e a média de três réplicas técnicas. Representativo de três experimentos
independentes.
+ +
+
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Conclusões
NOA16 atingiu seus endpoints primários, demonstrando a segurança e
imunogenicidade de IDH1-vac em pacientes recém-diagnosticados com IDH1 (R132H)
 astrocitomas de grau 3 e 4 da OMS sem outros fatores prognósticos positivos. A
imunogenicidade, independentemente do tipo de HLA, e a alta taxa de PsPD
justificam uma investigação clínica adicional de IDH1-vac. Os pacientes que não
montaram uma resposta imune induzida por IDH1-vac mostraram eficácia reduzida
da vacina e progressão da doença dentro de dois anos (Dados Estendidos Fig. 3 ) em
comparação com pacientes que montaram uma resposta imune (Fig. 3b ). IDH1-vac
foi imunogênico em vários alelos HLA, apoiando o conceito de promiscuidade de
apresentação em MHCII e justificar a inclusão do paciente independente dos alelos
HLA. Para caracterizar a especificidade e a dinâmica das respostas imunes periféricas
induzidas pela vacina, usamos o sequenciamento profundo de TCR da maioria das
amostras de pacientes, além de revisão de imagem central, patologia molecular e
monitoramento imunológico. O sequenciamento de células T de células T do sangue
periférico pós-vacina e uma amostra de tecido forneceram informações importantes
sobre as respostas imunes sistêmicas e locais induzidas pela vacina e os mecanismos
biológicos subjacentes da PsPD induzida pela vacina, que foi associada a um curso
clínico favorável em alguns pacientes. Embora este estudo forneça fortes evidências
circunstanciais de indução de novo de respostas de células T citotóxicas por células
TH reativas a IDH1 (R132H) do SNC (Fig. 2c, Dados Estendidos Figs. 11 , 12 ), são
necessárias mais investigações funcionais usando tecidos de teste. A alta frequência
de PsPD em participantes do NOA16 em comparação com uma coorte pareada
molecularmente e relatos anteriores (3 de 60 pacientes, 5,0%) pode indicar uma
reação imune intratumoral que resulta em ruptura da barreira hematoencefálica e
aumento de contraste. Os critérios de Avaliação de Resposta em Neuro-Oncologia
(RANO) aplicados neste estudo consideram que a PsPD é secundária à radioterapia
ou radioquimioterapia combinada com TMZ, particularmente quatro semanas após
a conclusão da radioterapia , e a maioria dos estudos exige exames de imagem de
acompanhamento para demonstrar progressão real nacasos de suspeita de PsPD,
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dentro
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segundo RANO . Excluímos pacientes com suspeita de PsPD do estudo NOA16,
enriquecendo assim os pacientes com PsPD induzida por IDH1-vac, mas
reconhecemos que a PsPD tardia pode ocorrer como resultado da radioterapia .
Além disso, pode ocorrer PsPD tardia seis meses após o início da imunoterapia,
conforme reconhecido nos critérios de imunoterapia RANO (iRANO) , que não
foram definidos no momento do início deste estudo. Notavelmente, a taxa de PsPD
em NOA16 não diferiu quando analisada de acordo com os critérios iRANO. No
entanto, existem limitações para a prova definitiva de PsPD, mesmo com tomografia
por emissão de pósitrons (PET) ou análise histológica de ressecção, pois não existem
critérios firmes .
NOA16 é baseado em dados pré-clínicos fortes e a decisão de integrar IDH1-vac no
tratamento primário de pacientes recém-diagnosticados forneceu uma janela
terapêutica suficiente e nos permitiu explorar potenciais interações imunes positivas
entre SOC e vacinação. Embora essa estratégia tenha sido escolhida em outros
ensaios que visaram neoepítopos compartilhados ou personalizados , NOA16
teve como alvo um neoepítopo clonal compartilhado para minimizar o risco de
evasão imune por seleção clonal ou perda espontânea de neoantígeno . A
clonalidade dos neoepítopos é um determinante-chave da eficácia dos inibidores do
checkpoint imunológico em muitas entidades de câncer . Os gliomas são
particularmente propensos ao desenvolvimento de eventos mutacionais subclonais
que contribuem para a resistência aos inibidores de checkpoint imunológico . O
direcionamento de uma mutação de driver clonal compartilhado em pacientes
recém-diagnosticados supera essas limitações e pode fornecer uma base para
futuros ensaios que visam neoepítopos clonais compartilhados e personalizados
restritos ao MHCII na imunoterapia do câncer.
Métodos
Pacientes e desenho do ensaio
O NOA16 foi um estudo de fase I não controlado, aberto, de braço único,
multicêntrico, primeiro em humanos para avaliar a segurança, tolerabilidade e
13 ,14
 15
 13
 16
4 , 6
17 18 , 19
17
20
21
6
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imunogenicidade de oito doses repetidas de IDH1-vac em pacientes com
IDH1(R132H) , não-1p/19q codelecionado, ATRX OMS grau 3 e 4 gliomas. O estudo
decorreu de maio de 2015 a novembro de 2018 em sete centros de ensaio na
Alemanha (Tabela Complementar 1). O acompanhamento para avaliar a duração da
resposta, sobrevida e eventos adversos tardios está em andamento. O estudo foi
aprovado pela autoridade reguladora nacional (Paul-Ehrlich Institut) e pelo conselho
de revisão institucional (Ethikkommission) em cada local de estudo, a saber:
Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Heidelberg (Heidelberg), Ethik-
Kommission Albert-Ludwigs-Universität Freiburg (Freiburg ), Ethik-Kommission des
Landes Berlin (Berlim), Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Universität
Duisburg-Essen (Essen), Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät “Carl Gustav
Carus” (Dresden), Ethikkommission des Fachbereichs Medizin der Goethe-
Universität Frankfurt am Main (Frankfurt), Ethikkommission der Medizinischen
Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München (Munique), Ethik-
Kommission an der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am
Universitätsklinikum Tübingen (Tübingen). O estudo foi conduzido de acordo com as
diretrizes de Boas Práticas Clínicas da Conferência Internacional de Harmonização.
Todos os participantes forneceram consentimento informado assinado por escrito.
Cumprimos todos os regulamentos éticos relevantes. A população do estudo
compreendeu três grupos de tratamento (TGs) com base no tratamento SOC que os
pacientes receberam antes da inscrição: radioterapia isolada (RT, TG1), três ciclos de
quimioterapia com TMZ isoladamente (mono-TMZ, TG2) ou radioquimioterapia
combinada com TMZ ( RT + cTMZ, TG3). No TG1, a vacinação foi feita isoladamente a
partir de 4 a 6 semanas após a radioterapia. Em TG2 e TG3, a vacinação foi feita em
paralelo com TMZ começando no dia 10 do quarto ciclo da monoterapia com TMZ
(TG2) ou no dia 10 do primeiro ciclo adjuvante (a)TMZ após radioterapia
concomitante (TG3). O tratamento consistiu em oito vacinações com IDH1-vac nas
semanas 1, 3, 5, 7, 11, 15, 19 e 23 (visitas (V) 03-10; Dados Estendidos Fig.1b ). Para
avaliação de imunogenicidade, as respostas imunes de células T periféricas e células
B foram avaliadas em seis pontos de tempo: V03 (linha de base), V05, V07, V10, V12 e
V13 (Dados Estendidos Fig. 1b ). Os critérios de elegibilidade incluíram a presença de
um IDH1(R132H) glioma histologicamente confirmado (com ou sem tumor residual
mensurável após ressecção ou biópsia) com ausência de codeleção cromossômica
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1p/19q e perda de expressão nuclear de ATRX no tecido tumoral, limitando assim
inclusão neste primeiro ensaio em humanos para o subgrupo de astrocitoma
molecular sem fatores prognósticos positivos . Os critérios de exclusão incluíram
tratamento concomitante com dexametasona (ou equivalente) > 2 mg/dia, estado de
desempenho de Karnofsky (KPS) < 70 e progressivo (incluindo PsPD ) ou doença
recorrente após SOC. A coorte de controle correspondente foi construída a partir de
pacientes tratados no centro em Heidelberg fora do estudo entre 2007 e 2018 com
informações clínicas e de ressonância magnética suficientes disponíveis para avaliar
a PsPD. A correspondência foi feita de acordo com a primeira fase de tratamento de
um IDH1(R132H) glioma histologicamente confirmado (com ou sem tumor residual
mensurável após ressecção ou biópsia completa ou parcial) sem codeleção de 1p/19q
ou perda de expressão nuclear de ATRX no tumor tecido, e de acordo com o grau 3 ou
4 da OMS, bem como a frequência de adaptações de tratamento (RT + cTMZ versus
mono-TMZ ou RT; Tabela Complementar 3). Não foram utilizados métodos
estatísticos para predeterminar o tamanho da amostra. A estimativa do tamanho da
amostra foi baseada principalmente nos requisitos de precisão para a resposta imune
do endpoint primário (taxa de resposta) à vacina peptídica IDH1. O tamanho da
amostra foi ajustado para pacientes não avaliáveis. Estimou-se que 70% dos pacientes
que seriam avaliáveis para testes de imunogenicidade seriam avaliáveis para todos os
momentos. Como 21 pacientes foram suficientes para o teste de imunogenicidade
com todos os pontos de tempo, 30 pacientes avaliáveis tiveram que ser inscritos.
Devido a uma taxa de abandono esperada de 20% (por progressão ou outras razões),
39 pacientes tiveram que ser recrutados. Todos os pacientes receberam a
intervenção relacionada ao estudo; o estudo não foi randomizado e os
investigadores não foram cegos em relação à intervenção relacionada ao estudo
durante os experimentos e avaliação de resultados.
Vacinação IDH1
IDH1-vac consistiu em 300 μg de um peptídeo IDH1(R132H) 20-mer (p123-142)
fabricado pela instalação GMP da Universidade de Tübingen, Alemanha e
emulsionado em Montanide (ISA50) conforme descrito anteriormente pela
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instalação central GMP no Hospital Universitário de Heidelberg, Alemanha, com no
máximo um dia de antecedência. Foi administrado por via subcutânea em
combinação com imiquimod tópico (5%, Aldara). Controles de qualidade para
conteúdo, esterilidade e ausência de endotoxina foram realizados para cadaemulsão
na Labor LS se & Co. KG, Alemanha.
Pontos de extremidade
Os endpoints primários foram segurança e imunogenicidade. O endpoint de
segurança foi o RLT, que foi definido como um dos seguintes relacionados à
administração de IDH1-vac: qualquer reação no local de injeção do National Cancer
Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) versão 4.0 grau
4; qualquer reação no local de injeção de grau CTCAE 3 que persistiu após duas
semanas; qualquer outra hipersensibilidade, anafilaxia ou reação alérgica local de
pelo menos grau 3 CTCAE; edema cerebral (CTCAE grau 4); autoimunidade de grau 3
ou superior do CTCAE; Toxicidade de grau 3 ou mais CTCAE para outros órgãos que
não a medula óssea, mas excluindo náusea de grau 3, vômito de grau 3 ou 4 em
pacientes que não receberam tratamento ideal com antieméticos, diarreia de grau 3
ou 4 em pacientes que não receberam tratamento ideal tratamento com
antidiarreicos e fadiga grau 3; e morte. Os eventos adversos foram contados como
relacionados ao tratamento se a relação com o tratamento fosse 'certa', 'relacionada',
'provável', 'possível' ou não relatada. Para avaliação de segurança, os pacientes foram
avaliados clinicamente em cada visita. Para excluir tolerância imunológica induzida
por IDH1-vac inesperada contra IDH1(R132H), encurtamento da sobrevida livre de
progressão (PFS), definido como uma diminuição observada na taxa de PFS estimada
em 12 meses de pelo menos 10% em comparação com o valor antecipado de 70,7%
derivados de estudos anteriores, foi definido como um critério de segurança para o
término precoce do estudo. A análise de segurança foi baseada em todos os pacientes
inscritos que receberam uma ou mais administrações de IDH1-vac. O endpoint de
imunogenicidade foi definido como a presença de uma célula T específica de
IDH1(R132H) e/ou resposta de anticorpos em qualquer ponto do tempo durante o
estudo. As respostas de células T e anticorpos específicas de IDH1(R132H) foram
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medidas em PBMCs usando IFNγ ELISpot e em soro usando ELISA revestido com
peptídeo, respectivamente. Para IFNγ ELISpot, um corte de 50 pontos de IFNγ após a
subtração do controle negativo foi definido como positivo. Para ELISA, o ponto de
corte para positividade foi definido como densidade óptica relacionada ao controle
negativo ≥5.
Avaliação da doença
A avaliação da doença, incluindo taxa de resposta global e diagnóstico de PsPD, foi
realizada por meio de ressonância magnética padronizada trimestral de acordo com
os critérios RANO por revisão de neurorradiologia central . Em NOA16 e na coorte
de controle molecularmente pareado, PsPD, que pode indicar principalmente uma
reação inflamatória intratumoral , foi definido como um aumento no tamanho do
tumor em sequências de RM T2-FLAIR e/ou o aparecimento ou aumento de contraste
lesões seguidas de estabilização ou regressão na RM de acompanhamento até três
meses após o início do SOC e/ou imunoterapia .
Preparação de peptídeos para análises
Peptídeos liofilizados foram reconstituídos em DMSO 100% e diluídos para uma
concentração final de 10 mg ml - com aqua ad iniectabilia (Braun). A concentração
final de DMSO foi de 10%.
Isolamento de soro
Os tubos de soro foram mantidos em pé à temperatura ambiente por 15 minutos
antes do isolamento. Os tubos de soro foram centrifugados a 1.000 g por 10 min à
temperatura ambiente. O sobrenadante foi aliquotado em gelo e congelado a -80°C.
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Isolamento de PBMCs
As PBMCs foram isoladas de sangue heparinizado de pacientes com glioma por
centrifugação em gradiente de densidade (800 g sem freio à temperatura ambiente)
carregando em Biocoll Separation Solution (Biochrom) após diluição com solução
salina tamponada com fosfato (PBS) e usando tubos Leucosep (Greiner Bio -Um). As
PBMCs foram congeladas em 50% de meio de congelamento A (60% X-Vivo 20, 40%
de soro fetal de vitela (FCS)) e 50% de meio B (80% FCS, 20% DMSO) e armazenados
em nitrogênio líquido a -140 °C até análise.
Isolamento de LILs
O tecido da lesão foi dissecado em pedaços pequenos (2 × 2 mm) e transferido para
placas tratadas com cultura de tecidos de 24 poços em três peças por poço em 2 ml
de meio de linfócitos invasores de tumor humano (TIL) (RPMI1640 (Pan Biotec) com
10% soro humano (Sigma Aldrich), 2 mM de L -glutamina, 1,25 μg/ml de anfotericina B
(ambos Gibco), 1.000 U/ml de IL-2 (Proleucina)) contendo 30 ng/ml de anti-CD3
humano (clone OKT-3, eBiociência). O meio foi trocado a cada 2-3 dias e pedaços de
tecido removidos no dia 7. Os LILs que migraram do tumor para o meio foram
expandidos até o dia 14 e criopreservados como acima.
Geração de células REP do paciente
Para permitir o teste autólogo de HLA para reatividade específica de antígeno de LILs
e células transgênicas de TCR, PBMCs autólogos rapidamente expandidos (células
REP), que expressam altos níveis de moléculas de MHC e podem servir como células
apresentadoras de antígeno (APCs), foram gerado. PBMCs (1 × 10 ) foram co-
cultivados em uma cultura de alta densidade com 3 × 10 células alimentadoras
irradiadas (40 Gy) (PBMCs de doadores não autólogos) em meio X-vivo15
suplementado com 2% de soro AB humano ( Sigma-Aldrich) e 30 ng/ml de anticorpo
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OKT-3 (Invitrogen) em frascos T-25 em volume total de 25 ml. Após 24 h, as células
foram suplementadas com 300 UI/ml de hIL-2. O meio foi substituído a cada 5 dias
com suplementação de hIL-2 e as células foram divididas conforme necessário. As
células foram coletadas após 14 dias de co-cultura e criopreservadas.
IFNγ ELISpot de PBMCs
Placas HTS multiscreen de fundo branco ELISpot (MSIPS4W10, Millipore) foram
revestidas com IFNγ anti-humano (1-D1K, Mabtech) e bloqueadas com X-Vivo-20
(Lonza) contendo 2% de albumina humana (HA). As PBMCs foram descongeladas,
descansadas durante a noite em meio X-Vivo e semeadas a 4 × 10 células por poço e
estimulados com 2 μg de peptídeos por poço em 100 μl de volume. As PBMCs foram
estimuladas com IDH1(R132H) (p123-142), IDH1 de tipo selvagem (p123-142) ou MOG
(p35-55) em concentrações iguais ou com diluente de peptídeo aqua ad iniectabilia
(Braun) com 10% de DMSO (veículo ) em igual volume como controles negativos, ou
com 1 μg de enterotoxina estafilocócica B (Sigma-Aldrich) por poço e 0,05 μg de CMV
com 0,05 μg de AdV por poço (ambos em volume de 100 μl) como controles
positivos. Após 40 h, as células produtoras de IFNγ foram detectadas com anticorpos
biotinilados anti-IFNγ humano (7-B6-1), estreptavidina-ALP (ambos Mabtech) e
tampão de desenvolvimento de cor ALP (Bio-Rad) e quantificados usando um
ImmunoSpot Analyzer (Cellular Tecnologia Ltda). O controle de qualidade foi
realizado e revisado por uma segunda pessoa. Para categorização de respostas de
células T, As respostas transitórias de células T foram definidas como uma contagem
pontual acima de 50 seguida por uma contagem pontual inferior a 50 em EOS. As
respostas de células T sustentadas foram definidas como uma contagem de pontos
acima de 50 seguida por uma contagem de pontos de mais de 50 em EOS.
IFNγ ELISpot de LILs
Para gerar células dendríticas (DCs) para servir como células apresentadoras de
antígenos, PBMCs de pacientes autólogos foram descongelados em meio X-Vivo-20 e
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plaqueados em placas tratadas com cultura de tecidos a uma densidade de 5 × 10
células por ml durante 1 h. O sobrenadante foi removidoe os monócitos aderentes
foram diferenciados em DCs cultivando em meio X-Vivo-20 contendo 500 U/ml de
hIL-4 (Miltenyi) e 560 U/ml de fator estimulador de colônia de granulócitos-
macrófagos humanos (hGM-CSF) ( Genzyme) por 7 dias. As DCs foram coletadas e
purificadas usando classificação de células ativadas por magnetismo (MACS).
Anticorpos anti-CD56 acoplados a Dynabeads de IgG pan-ratinho, Dynabeads CD19
pan B e Dynabeads CD3 (todos Invitrogen) foram usados para remover populações
de células contaminantes de acordo com o protocolo do fabricante. Para enriquecer
LILs para células T reativas ao antígeno, as DCs foram semeadas a uma densidade de 2
× 10 células por ml em meio RPMI1640 contendo 10% de soro AB, 100 U/ml de
penicilina e 100μg/ml de estreptomicina e carregado com 10 μg/ml de IDH1(R132H)
(p123-142) por 4 h. Eles foram então co-cultivados com LILs, que haviam sido
descongelados e deixados em repouso durante a noite em meio X-VIVO-20, na
proporção de 1:5 (DCs:LILs). Para proliferação de células T, a partir do dia 3, o meio de
co-cultura foi suplementado com 40 U/ml de IL-2 (Proleukin) e 20 ng/ml de IL-7
(Peprotech) e renovado a cada 2 a 4 dias. Os LILs foram coletados após 24 dias de co-
cultura, descansaram durante a noite em meio RPMI1640 contendo 10% de soro AB,
100 U/ml de penicilina e 100μg/ml de estreptomicina e usados para ELISpot em co-
cultura com DCs autólogas isoladas recentemente como acima, que havia sido
carregado com 2 μg/100 μl de peptídeo IDH1(R132H) (p123-142) ou peptídeo MOG
(p35-55) como controle negativo durante a noite no mesmo meio, DCs:6 × 10 LILs)
por 40 h. O ELISpot foi realizado como descrito acima.
Citometria de fluxo
Para monitoramento imunológico periférico, 3 × 10 As PBMCs foram coradas com os
seguintes anticorpos direcionados às proteínas de superfície: anti-CD3-FITC (clone
UCHT1, cat # 300452, 1:100), anti-CD4-Alexa Fluor700 (clone RPA-T4, cat # 300526,
1:100), anti-CD8-PerCP (clone RPA-T8, cat # 301030, 1:100), anti-CD11b-BV510 (clone
M1/70, cat # 101263, 1:20), anti-HLA-DR-PE-Cy7 ( clone L243, cat # 307616, 1:50), anti-
CD14-BV711 (clone M5E2, cat # 301838, 1:100), anti-CD16-PE/Dazzle594 (clone 3G8,
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cat # 302054, 1:10), anti-CD25-BV605 (clone BC96, cat # 302632, 1:20), anti-CD33-APC
(clone P67.6, cat # 366606, 1:50) e anti-CD127-BV421 (clone A019D5, cat # 351310,
1:20) (todos BioLegend); e corante de viabilidade fixável-eFluor780 (1:1.000,
Invitrogen), seguido de coloração intracelular com anti-FOXP3-PE (clone 206D, cat #
320108, 1:100, BioLegend) usando o Fixation and Permeabilization Buffer Set
(ebioscience). As quantidades de anticorpos foram tituladas previamente. Em todos
os experimentos, os controles correspondentes de fluorescência menos um (FMO)
foram usados (Dados Estendidos Fig. 9). O maior número possível de eventos foi
medido em um Citômetro de Fluxo Attune NxT usando o software Attune Nxt versão
2.7 (ThermoFisher Scientific).
Para análise de subconjuntos de células T reativas a IDH1(R132H), realizamos um
ensaio de recuperação de peptídeos ex vivo. As PBMCs foram descongeladas,
repousaram por 4 h em meio X-Vivo 20 e semeadas em placas de fundo em U de 96
poços. PBMCs (1,5–2 × 10 ) foram estimulados com 2 μg de peptídeo por poço
usando IDH1(R132H) (p123-142), MOG (p35-55) como controle negativo ou pool de
peptídeos CEFT (0,05 µg/ml por peptídeo, jpt) como controle positivo por 3 h antes
de adicionar 10 μg/ml de brefeldina A (Sigma-Aldrich, pedido nº B6542) e 1 ×
GolgiStop (BD Bioscience). As células foram incubadas por mais 12 h e
subsequentemente coradas com os seguintes anticorpos de superfície: anti-CD3-
BV510 (clone HIT3a, cat # 564713, 1:20), anti-CD4-BV605 (clone SK3, cat # 566908, 1:
50), anti-CD8-APC-H7 (clone SK1, cat # 560179, 1:10) (painéis 1 e 2), anti-CD25-BV711
(clone 2A3, cat # 563159, 1:10) e anti- CD127-FITC (clone HIL-7R-M21, cat # 560549,
1:2,5) (painel 2) (todos BD Biosciences); e corante de viabilidade fixável-APC-R700
(1:1.000, Invitrogen), seguido por coloração intracelular com anti-IFNγ-BV421 (clone
4S.B3, cat # 564791, 1: 20, BD Biosciences), anti-TNF-APC (clone MAb11, cat # 502912,
1:20, Biolegend), anti-IL17-PE (clone N49-653, cat # 560486, 1:5) e anti-IL4-PerCP -
Cy5.5 (clone 8D4-8, cat # 561234, 1:20) (painel 1), ou anti-FOXP3-PE (clone 259D/C7,
cat # 560046, 1:5) e anti-IL10-APC ( clone JES3-19F1, cat # 554707, 1:50) (todos BD
Biosciences), usando o conjunto de tampão de coloração Foxp3/Fator de transcrição
(ebioscience). As quantidades de anticorpos foram tituladas previamente ou usadas
de acordo com as instruções do fabricante e aumentadas de acordo com o número
de células no momento da semeadura. Em todos os experimentos, os controles FMO
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correspondentes foram usados (Dados Estendidos Fig. 4). O maior número possível
de eventos foi medido em um Lyric Flow Cytometer (BD Bioscience) usando o
software BD FACSuite versão 1.3. cat # 560486, 1:5), e anti-IL4-PerCP-Cy5.5 (clone
8D4-8, cat # 561234, 1:20) (painel 1), ou anti-FOXP3-PE (clone 259D/C7, cat # 560046,
1:5) e anti-IL10-APC (clone JES3-19F1, cat # 554707, 1:50) (todos BD Biosciences),
usando o Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (ebioscience). As
quantidades de anticorpos foram tituladas previamente ou usadas de acordo com as
instruções do fabricante e aumentadas de acordo com o número de células no
momento da semeadura. Em todos os experimentos, os controles FMO
correspondentes foram usados (Dados Estendidos Fig. 4). O maior número possível
de eventos foi medido em um Lyric Flow Cytometer (BD Bioscience) usando o
software BD FACSuite versão 1.3. cat # 560486, 1:5), e anti-IL4-PerCP-Cy5.5 (clone
8D4-8, cat # 561234, 1:20) (painel 1), ou anti-FOXP3-PE (clone 259D/C7, cat # 560046,
1:5) e anti-IL10-APC (clone JES3-19F1, cat # 554707, 1:50) (todos BD Biosciences),
usando o Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (ebioscience). As
quantidades de anticorpos foram tituladas previamente ou usadas de acordo com as
instruções do fabricante e aumentadas de acordo com o número de células no
momento da semeadura. Em todos os experimentos, os controles FMO
correspondentes foram usados (Dados Estendidos Fig. 4). O maior número possível
de eventos foi medido em um Lyric Flow Cytometer (BD Bioscience) usando o
software BD FACSuite versão 1.3. usando o Foxp3/Transcription Factor Staining
Buffer Set (ebioscience). As quantidades de anticorpos foram tituladas previamente
ou usadas de acordo com as instruções do fabricante e aumentadas de acordo com o
número de células no momento da semeadura. Em todos os experimentos, os
controles FMO correspondentes foram usados (Dados Estendidos Fig. 4). O maior
número possível de eventos foi medido em um Lyric Flow Cytometer (BD Bioscience)
usando o software BD FACSuite versão 1.3. usando o Foxp3/Transcription Factor
Staining Buffer Set (ebioscience). As quantidades de anticorpos foram tituladas
previamente ou usadas de acordo com as instruções do fabricante e aumentadas de
acordo com o número de células no momento da semeadura. Em todos os
experimentos, os controles FMO correspondentes foram usados (Dados Estendidos
Fig. 4). O maior número possível de eventos foi medido em um Lyric Flow Cytometer
(BD Bioscience) usando o software BD FACSuite versão 1.3.
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Para classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de LILs, o tecido do
paciente foi dissecado em pequenos pedaços, transferido para HBSS (Sigma Aldrich)
e coado sucessivamente atravésde filtros de células de 100 μm, 70 μm e 40 μm com
lavagens intermitentes com HBSS para obter uma suspensão de célula única. As
células foram coradas com os seguintes anticorpos direcionados às proteínas de
superfície: anti-CD45-eFluor450 (clone 2D1, cat # 48-9459-42, 1:50, ebioscience) e
anti-CD3-PE (clone HIT3a, cat # 300308, 1: 50, BioLegend); e corante de viabilidade
fixável-eFluor780 (1:1.000, Invitrogen). As células foram fechadas para linfócitos,
células únicas e células vivas e classificadas em populações de células CD45 CD3 e
CD45 CD3 (Dados Estendidos Fig. 12) em um FACSAria IIu com software FACSDiva
versão 8.0 (BD Biosciences).
Para testes ex vivo da reatividade de CD8 LILs para IDH1(R132H), LILs
criopreservados expandidos de pedaços de tumor e células REP específicas do
paciente foram descongeladas em meio X-vivo 15 contendo 50 U/ml de Benzonase
(Sigma Aldrich) e descansadas durante 12 h em meio X-vivo 15 com 2% de soro
humano AB (Sigma-Aldrich) e 20 IU/ml de hIL-2 (Proleukin). As células REP foram
irradiadas (30 Gy), semeadas em placas de fundo em U de 96 poços a 1 × 10 células
por poço e carregado com 10 μg/ml de peptídeo IDH1(R132H) (p123-142) ou MOG
(p35-55) por 2 h. Enquanto isso, os LILs foram marcados com CFSE (ThermoFisher) de
acordo com o protocolo do fabricante para ajudar a distingui-los durante a
citometria de fluxo e co-cultivados com células REP carregadas com peptídeo na
proporção de 1:1. Após 12 h, 10 μg/ml de Brefeldina A foi adicionado à co-cultura por
mais 5 h. As células de controle positivo foram estimuladas com 20 ng/ml de forbol
12-miristato 13-acetato (PMA) e 1 μg/ml de ionomicina (Sigma-Aldrich). As células
foram subsequentemente coradas com os seguintes anticorpos de superfície: anti-
CD3-BV510 (clone HIT3a, cat # 564713, 1:20, BD Biosciences) e anti-CD8-PerCP-Cy5.5
(clone RPA-T8, cat # 45- 0088-42, 1:100, ebiociência); e corante de viabilidade fixável-
eFluor780 (1:1.000, Invitrogen), seguido por coloração intracelular com anti-TNF-
APC (clone MAb11, cat # 17-7349-82, 1:50) e anti-IFNγ-eFluor450 (clone 4S.B3, cat #
48-7319-42, 1:50) (todos ebioscience) usando o kit IC Fixation buffer (eBioscience).
Controles de FMO correspondentes foram usados (Dados estendidos Fig. 11) e os
+ +
+ −
+
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https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z 25/45
eventos foram medidos em um citômetro de fluxo FACSCanto II com software
FACSDiva versão 9.0 (BD Biosciences).
A análise dos dados para todos os experimentos foi feita usando o software FlowJo
v.10.5.0.
IgG ELISA
Placas de polissorção de ELISA (Nunc) foram revestidas com IDH1 humano (R132H) e
IDH1 de tipo selvagem humano (p122-136 e p123-142) para detecção de IgG do
paciente e com MOG de controle negativo (p35-55) (10 μg por poço em PBS). Os
poços foram lavados com PBS 0,05% Tween 20 e bloqueados com 3% FBS em PBS
0,05% Tween 20. O controle positivo para o soro do paciente foi o toxóide tetânico
(Millipore) com EBNA-1 (RayBiotech) (cada 0,5 ng por poço). Os soros de pacientes e
controles saudáveis foram obtidos de tubos de soro por centrifugação. O soro do
paciente foi usado nas seguintes diluições: 1:10, 1:100, 1:333, 1:1.000 e 1:3.333. O soro
de controle saudável foi usado não diluído. Anti-IDH1(R132H) de camundongo
(1:1.000, H09, Dianova) foi usado como controle de revestimento peptídico. Os
anticorpos secundários conjugados com HRP foram IgG-HRP anti-camundongo de
ovelha (1:5.000, Amersham) e IgG-Fc-HRP anti-humano de cabra (1:10.000, Bethyl
Laboratories, Inc.). O substrato foi tetrametilbenzidina (ebioscience) e a reação foi
interrompida com 1 MH SO . A densidade óptica foi medida a 450 nm.
Detecção de citocinas no soro
O soro foi analisado usando tecnologia de esferas multiplex (painel Bio-Plex Pro
Human Cytokine 27-plex, nº de pedido M500KCAFOY, Bio-Rad, Hercules, CA) de
acordo com as instruções do fabricante. O soro foi diluído 1:2. As curvas padrão
foram geradas usando a amostra de citocina de referência fornecida no kit e foram
usadas para calcular as concentrações de citocina nas amostras. A aquisição e a
análise dos dados foram realizadas pelo Bio-plex Manager.
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17/04/22, 20:07 Uma vacina visando o mutante IDH1 em glioma recém-diagnosticado | Natureza
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z 26/45
Ensaio de ligação de proximidade
O PLA foi realizado em tecidos de glioma embebidos em parafina da linha de base,
conforme descrito anteriormente . Para aquisição de imagem, um ajuste não linear
(mudanças gama) foi usado para fins de visualização.
Sequenciamento profundo de TCRB
O DNA genômico foi isolado do sangue EDTA do paciente usando o DNeasy Blood
and Tissue Kit (Qiagen). O sequenciamento profundo da cadeia beta do TCR (TCRB)
foi realizado para detectar sequências do gene TCRβ rearranjadas usando o kit
hsTCRB (Adaptive Biotechnologies) de acordo com o protocolo do fabricante. A
biblioteca preparada foi sequenciada em um Illumina MiSeq pela Genomics &
Proteomics Core Facility, German Cancer Research Center (DKFZ). O processamento
dos dados (desmultiplexação, trimming, mapeamento genético) foi feito usando a
plataforma proprietária Adaptive Biotechnologies. Os dados foram visualizados
usando o pacote Treemap Visualization versão 2.4.2 ( https://cran.r-
project.org/web/packages/treemap/index.html ). Os dados de sequenciamento de
TCRB estão disponíveis em https://clients.adaptivebiotech.com/pub/platten-2021-
nature .
Digitação HLA de última geração
O DNA genômico foi isolado do sangue EDTA do paciente usando o QIAamp DNA
Blood Mini Kit (Qiagen). Subsequentemente, os domínios de ligação a peptídeos
foram sequenciados conforme descrito anteriormente .
850k matrizes de metilação
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https://cran.r-project.org/web/packages/treemap/index.html
https://clients.adaptivebiotech.com/pub/platten-2021-nature
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https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z 27/45
As matrizes de metilação de 850k foram realizadas conforme descrito anteriormente
 .
Sequenciamento do painel
O DNA do tecido FFPE foi extraído no dispositivo Promega Maxwell (Promega)
seguindo as instruções do fabricante. O DNA extraído foi então cortado em um
Covaris M220 (Covaris). A integridade do DNA e o tamanho do fragmento foram
determinados em um Bioanalyzer 2100 (Agilent). O sequenciamento foi realizado em
instrumento NextSeq 500 (Illumina) com cobertura média de 550 vezes .
Sequenciamento de RNA de célula única e TCR
A captura de célula única e as construções de biblioteca a jusante de células
classificadas por FACS foram realizadas usando a química do kit de reagente
Chromium Single Cell V(D)J v1 (10x Genomics; PN-1000006, PN-1000020, PN-
1000005, PN-120262) de acordo com protocolo do fabricante. A biblioteca scVDJ
construída e as bibliotecas scGEX foram sequenciadas nas plataformas HiSeq2500
rapid e HiSeq4000 (Illumina), respectivamente.
Os dados de RNA de célula única foram processados usando o pipeline cellranger
(versão 3.1.0) com montagem do genoma GRCh38 (versão 3.0.0, 10x Genomics) com
configuração padrão. As matrizes filtradas foram então analisadas usando Seurat .
As células com menos de 2.000 identificadores moleculares exclusivos, menos de
900 genes e/ou mais de 10% de expressão gênica mitocondrial foram excluídas da
análise. Os genes detectados em menos de três células foram excluídos. A expressão
gênica foi transformada e normalizada usando regressão binomial negativa
regularizada conforme implementado em sctransform . Os genes VDJ foram
removidos dos genes variáveis para evitar o agrupamento de células com base em
clones de TCR. Genes altamente variáveis foram selecionados usando análise de
componentes principais, e 40 componentes principais foram selecionados com base
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no ponto de inflexão no gráfico de cotovelo. As células foram agrupadas usando
agrupamento baseado em gráfico com modularidade de Louvain de 0,45 e UMAPs
foram plotados para visualização. A análise diferencial de expressão gênica foi
realizada usando MAST para determinar a identidade de cada cluster e genes
altamente regulados foram usados para rotular cada cluster. Aglomerados com
proteínas de choque térmico reguladas positivamente e CD3 as células foram
excluídas e as células foram renormalizadas e re-agrupadas como descrito acima. Os
dados de VDJ de célula única foram processados de forma semelhante usando o
pipeline cellranger. Os códigos de barras de TCRs superiores individuais foram então
mapeados em dados de RNA de célula única para determinar a distribuição de clones
de TCR nos agrupamentos.
Os dados de sequenciamento de célula única foram depositados no NCBI Sequence
Read Archive com os códigos de acesso SRR12880623 e SRR12880624.
Clonagem de TCR
Fragmentos sintéticos alfa e beta VDJ da região variável do TCR compatível com a
clonagem Golden Gate Assembly mediada por BsaI foram obtidos de Twist
Biosciences. Um vetor de expressão com sequência S/MAR (pSMARTer) que permite
a replicação extracromossômica do vetor em células eucarióticas foi usado e
projetado para abrigar regiões TCR constantes alfa e beta de camundongo e um
ligante peptídico de autoclivagem p2a para facilitar a produção de alfa e beta
separados cadeias polipeptídicas beta do TCR. Os fragmentos variáveis de TCR foram
inseridos no vetor de expressão usando uma reação Golden Gate de etapa única e
transformados em Escherichia coli NEB5-alfa-competente(NEB). As colônias foram
rastreadas para o transgene por resistência a antibióticos, e um plasmídeo livre de
endotoxina foi preparado usando o kit NucleoBond Extra Maxi EF (Macherey-Nagel)
para transfecção.
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https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z 29/45
Ensaio repórter TCR-NFAT
O vetor de expressão de TCR clonado e um vetor repórter de NFAT baseado em nano-
luciferase (pDONR, com 4 × elementos de resposta NFAT) foram entregues em células
Jurkat Δ76 (obtidas de TRON gGmbH, autenticadas usando o perfil de Multiplexion
STR e comparadas com células Jurkat normais , testado regularmente para
contaminação por micoplasma e com resultado negativo em todos os momentos)
usando eletroporação (sistema de transfecção de néon, ThermoFisher Scientific). Em
resumo, 2 × 10 as células foram usadas por eletroporação com pontas Neon de 100
μl (8 μg de vetor de expressão de TCR com 5 μg de vetor repórter de NFAT). As células
foram preparadas de acordo com o protocolo do fabricante; eletroporado com 1.325
V, 10 ms, 3 pulsos; e transferido para meio RPM1 1640 sem antibiótico contendo 10%
de FCS. PBMCs ou células REP autólogas do paciente foram usadas como APCs
conforme indicado e descongeladas 24 h antes da co-cultura em meio X-VIVO 15
(Lonza) contendo 50 U/ml de benzonase (Sigma-Aldrich), em repouso por 6-8 h antes
da semeadura em placas tratadas com cultura de tecido branco-opaco de 96 poços
(Falcon) a 1,5 × 10 células por poço e carregados com peptídeos em uma
concentração final de 10 μg/ml em um volume total de 150 μl por 16 h. Um pool de
peptídeos humanos IDH1(R132H) (p122-136, p124-138, p126-140) foi usado. MOG
(p35-55) em concentrações iguais e PBS + 10% DMSO (veículo) em igual volume foram
usados como controles negativos. Quarenta e oito horas após a eletroporação, as
células Jurkat Δ76 foram coletadas e co-cultivadas com PBMCs carregados com
peptídeo por 6 h na proporção de 1:1. Grânulos TransAct de células T humanas
(Miltenyi) foram usados como controle positivo. A indução de nano-luciferase,
indicando ativação de TCR, foi testada usando o sistema de ensaio Nano-Glo
Luciferase (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante e o sinal foi detectado
em um leitor de placas PHERAstar FS (BMG Labtech).
Análises de afinidade de HLA in vitro
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Os peptídeos foram sintetizados por Genscript e dissolvidos em DMSO seguido de
diluição em tampão de ensaio. A concentração final de DMSO foi de 10%. Os
peptídeos não continham cisteínas, portanto, nenhum agente redutor foi
adicionado. Como controles positivos, foram utilizados os peptídeos CLIP
(PVSKMRMATPLLMQA), KLAT (HA306–318, YKYVKQNTLKLAT) ou PADRE
(AKFVAAWTLKAAA). Os peptídeos foram titulados em tampão de ensaio (10.000,
1.000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 nM) e foi adicionado MHC II recombinante de
diferentes alelos e parálogos. Após pelo menos 24 h de redobramento, as soluções
foram transferidas para os aceitadores de optiplates AlphaScreen e as esferas
doadoras foram adicionadas. Os dados brutos foram importados para o Microsoft
Excel e deconvoluídos. Para alguns peptídeos, as concentrações mais altas levaram a
uma redução no sinal (efeito de gancho). Esses pontos de dados foram excluídos. Os
dados foram importados para o software GraphPad Prism versão 9.0. 0 e analisado
por ajuste de curva sigmóide. Todos os experimentos foram feitos em duplicata com
boa correlação.
Estatisticas
Para análises estatísticas de endpoints primários, foram definidas duas populações
de análise de pacientes. A população de segurança incluiu todos os pacientes
inscritos que receberam pelo menos uma dose de IDH1-vac. Este foi o conjunto de
dados de análise para avaliar as características do paciente, administração do estudo,
eficácia (taxa de resposta geral, ou seja, doença estável) e parâmetros de segurança
(conjunto de dados de segurança, SDS). A população de imunogenicidade (conjunto
de dados de imunogenicidade, IDS) incluiu todos os pacientes que puderam ser
avaliados para avaliação de imunogenicidade. Um paciente foi definido como
avaliável se tivesse completado o estudo até e incluindo V07, tivesse recebido pelo
menos quatro vacinas até V07 e tivesse todas as amostras de sangue pretendidas
coletadas para monitoramento imunológico até V07; ou recebeu pelo menos 6 de 8
vacinas, e linha de base mais pelo menos mais duas amostras de sangue foram
coletadas para monitoramento imunológico através de V12. Os pacientes não
avaliáveis foram substituídos para avaliação da imunogenicidade, exceto os
17/04/22, 20:07 Uma vacina visando o mutante IDH1 em glioma recém-diagnosticado | Natureza
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z 31/45
pacientes que deixaram o estudo precocemente devido a RLT. Para os desfechos
primários (RLT e resposta imune), foram geradas tabelas de resumo, porcentagens e
ICs exatos de 95% de acordo com Clopper-Pearson.
Todas as variáveis secundárias foram analisadas por métodos exploratórios e
principalmente descritivos por meio do software GraphPad Prism versão 9.0.0. Para
PLA, foi calculado o coeficiente de correlação de Pearson. Para as análises de
contingência, foi realizado o teste exato de Fisher. Para comparações múltiplas, foi
realizado o teste de Kruskal-Wallis (KWT) por ranks e apresentados os valores P
ajustados por multiplicidade (teste de Dunn). Todos os testes estatísticos foram
bicaudais a um nível de significância de 5%. Para descrição detalhada das análises
exploratórias, consulte a Tabela Complementar 8. Para análise das variáveis 
secundárias selecionadas, foi definido um conjunto de dados moleculares. O
conjunto de dados moleculares incluiu todos os pacientes cujos astrocitomas
pudessem ser definidos retrospectivamente molecularmente de acordo com a carga
de variação do número de cópias (CNV-L), classe de metilação e status CDKN2A/B .
Resumo do relatório
Mais informações sobre o projeto de pesquisa estão disponíveis noNature Research
Reporting Summary vinculado a este artigo.
Disponibilidade de dados
Dados de RNA-seq de célula única que estão associados à Fig. 4 e às Figs de Dados
Estendidos. 11 , 12 foram depositados no NCBI Sequence Read Archive com os
códigos de acesso SRR12880623 e SRR12880624 . Os dados de sequenciamento TCRB
que estão associados ao Extended Data Fig. 10 estão disponíveis em
https://clients.adaptivebiotech.com/pub/platten-2021-nature .
Referências
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR12880623
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR12880624
https://clients.adaptivebiotech.com/pub/platten-2021-nature
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Acknowledgements
We are indebted to all patients and their relatives, and all trial sites. The NOA16 trial
was funded by the German Ministry of Education and Science and the National
Center for Tumor Diseases (ClinicalTrials.gov number NCT02454634). We
acknowledge the support of the DKFZ Light Microscopy Facility and the DKFZ
Genomics and Proteomics Core Facility. We thank S. Bauer, M. Bucur, E. Hallauer, G.
Haltenhof, K. Jähne, A. Siebenmorgen, S. Jünger, S. Sachse, and L. Umansky for
technical support; N. Kehl for visualization of longitudinal peripheral TCR
repertoires; and S. Uhlig (FlowCore Mannheim and Institute of Transfusion Medicine
and Immunology) for technical FACS support. This work was supported by the
German Ministry of Education and Science (National Center for Tumor Diseases
Heidelberg NCT 3.0 program ‘Precision immunotherapy of brain tumors’ and the
DKTK program), the DKFZ-MOST program (project number 2526) and the Helmholtz
Program Future Topic Immunology and Inflammation (ZT-0027, WP3), the Dr. Rolf M.
Schwiete Foundation and the German Research Foundation (DFG) (FOR2289:
PL315/3-1), the Sonderförderlinie ‘Neuroinflammation’ of the Ministry of Science of
Baden Württemberg, the Joint Funding Program MGH-Heidelberg Alliance in Neuro-
Oncology, the Wilhelm Sander Foundation (2012.118.1), the NCT 3.0 program “Cancer
immunotherapy program” program “genetically modified cells for cancer immune
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therapy”, the Baden-Württemberg Stiftung (BWST_ISF2018-046), German Cancer Aid
(70112399) to M.P., the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research
Foundation) – Project-ID 404521405, SFB 1389 - UNITE Glioblastoma, Work Package
B01 to M.P. and T.B., the epigenetics@dkfz program, the Swiss Cancer Foundation,
the Else Kröner Fresenius Foundation, the University Heidelberg Foundation, the
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – Project-ID
404521405, SFB 1389- UNITE Glioblastoma, Work Package B03 to L.B., and German
Cancer Aid (110624) to W.W. L.B. was funded by Heidelberg Medical Faculty and the
Heidelberg University (Hella Bühler Award). T.B. and K.S. are supported by the
Medical Faculty and University Hospital Mannheim and the University Heidelberg.
K.S. was supported by a doctoral fellowship of the DKFZ. F.S. is supported by a
postdoctoral fellowship of the University Hospital Heidelberg. E.G. was supported by
a Marie-Curie fellowship.
Funding
Open access funding provided by Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ).
Author information
Affiliations
DKTK (German Cancer Consortium) Clinical Cooperation Unit (CCU) Neuroimmunology and Brain Tumor Immunology, German Cancer
Research Center (DKFZ), Heidelberg, Germany
Michael Platten, Lukas Bunse, Theresa Bunse, Khwab Sanghvi, Chin Leng Tan, Isabel Poschke & Edward Green
Department of Neurology, Medical Faculty Mannheim, MCTN, University of Heidelberg, Mannheim, Germany
Michael Platten, Lukas Bunse & Theresa Bunse
Immune Monitoring Unit, National Center for Tumor Diseases (NCT), Heidelberg, Germany
Michael Platten & Isabel Poschke
Neurology Clinic, Heidelberg University Hospital, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany
Antje Wick & Wolfgang Wick
NCT, Heidelberg, Germany
Antje Wick & Wolfgang Wick
NCT Trial Center, NCT, Heidelberg, Germany
Lucian Le Cornet, Angelika Freitag & Lisa-Marie Rother
Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany
17/04/22, 20:07 Uma vacina visando o mutante IDH1 em glioma recém-diagnosticado | Natureza
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z 37/45
Inga Harting, Michael O. Breckwoldt & Martin Bendszus
DKTK CCU Neuropathology, DKFZ, Heidelberg, Germany
Felix Sahm & Andreas von Deimling
Department of Neuropathology, Heidelberg University Hospital, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany
Felix Sahm & Andreas von Deimling
Immunitrack, Copenhagen, Denmark
Sune Justesen
DKMS Life Science Lab GmbH, Dresden, Germany
Geoffrey A. Behrens
Department of Internal Medicine V, Heidelberg University Hospital, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany
Anita Schmitt & Michael Schmitt
Department of Neurosurgery, University of Freiburg, Freiburg, Germany
Oliver Schnell
Department of Medical Oncology, West German Cancer Center, University Hospital Essen, University of Duisburg-Essen, Essen, Germany
Jörg Hense
Department of Neurosurgery, Charité Medical Center, University of Berlin, Berlin, Germany
Martin Misch
Department of Neurosurgery, Carl Gustav Carus University Hospital, University of Dresden, Dresden, Germany
Dietmar Krex
Institute of Cell Biology, Department of Immunology, University of Tübingen, Tübingen, Germany
Stefan Stevanovic
Department of Neurology, University of Tübingen, Tübingen, Germany
Ghazaleh Tabatabai
Dr. Senckenberg Institute of Neurooncology, Frankfurt, Germany
Joachim P. Steinbach
DKTK CCU Neurooncology, DKFZ, Heidelberg, Germany
Wolfgang Wick
Contributions
M.P. conceptualized and designed the trial, interpreted data, and wrote the paper.
L.B. designed and performed translational analyses, analysed and interpreted data,
and wrote the paper. A.W., O.S., J.H., M.M., D.K., G.T. and J.P.S. treated patients and
interpreted data. T.B. performed and analysed translational analyses. L.L.C., A.F. and
L.-M.R. performed primary endpoint statistical analyses. I.H., M.O.B. and M.B.
performed disease assessment and analysed PsPD. F.S. and A.v.D. performed and
interpreted molecular screening of tumour material and 850k arrays. K.S. performed
single-cell sequencing and TCR testing, and designed the NFAT reporter assay. C.L.T.
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https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z 38/45
and E.G. analysed single-cell sequencing data. I.P. performed and analysed immune
monitoring of primary immunogenicity endpoints and translational analyses. E.G.
designed and cloned TCR vectors. S.J. performed in vitro HLA affinity analyses. G.A.B.
performed HLA typing. A.S. and M.S. provided the GMP facility for generating
peptide emulsion. S.S. synthesized peptides. W.W. conceptualized the trial,
interpreted data, and wrote the paper.
Corresponding author
Correspondence to Michael Platten.
Ethics declarations
Competing interests
M.P., T.B. and W.W. are inventors and patent-holders on ‘Peptides for use in treating or
diagnosing IDH1R132H positive cancers’ (EP2800580B1).
Additional information
Peer review information Nature thanks Cornelis Melief, Vicky Wu and the other,
anonymous, reviewer(s) for their contribution to the peer review of this work.
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims
in published maps and institutional affiliations.
Extended data figures and tables
Extended Data Fig. 1 Trial design and recruitment.
a, Patient disposition CONSORT flow diagram. Forty-four patients were enrolled and
screened across 7 trial sites, of which 11 were excluded. Of 33 allocated patients, 32
received the intervention. Twenty-eight patients completed the study, because four
discontinued the intervention owing to disease progression. The safety dataset (SDS)
for analysis contained all patients who received the intervention (n = 32); 30 of these
mailto:m.platten@dkfz.de
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z/figures/5
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https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z 39/45
were evaluable for immunogenicity and comprised the immunogenicity dataset (IDS)
(n = 30). b, Study flow chart. The trial population comprised three treatment groups
(arms) according to the standard therapy received. IDH1-vac was administered at V03
(week 1), V04 (week 3), V05 (week 5) V06 (week 7), V07 (week 11), V08 (week 15), V09
(week 19), and V10 (week 23). Blood for primary endpoint immunogenicity testing
was drawn at V03 (baseline), V05, V07, V10, V12 (week 35, safety follow-up (SFU)), and
V13 (week 47, EOS). MRI scans (represented by brain images) were performed at
clinical screening, V07, V10, V12, and V13. XRT, radiotherapy; TMZ, temozolomide;
cTMZ, concomitant TMZ, RT + TMZ; aTMZ, adjuvant TMZ. TMZ cycle numbers
indicated.
Extended Data Fig. 2 Serum cytokine levels during treatment with IDH1-
vac.
Heat maps depicting longitudinal (V03–V13) cytokine concentrations in sera from
transient (n = 16) and sustained (n = 9) T cell responder patients, measured by
multiplex bead technology. For definition of transient and sustained responses,
see Methods. White, sample not available; red, concentration out of depicted range.
Extended Data Fig. 3 Relationship between MHC alleles and T cell
response.
a, Venn diagram of T cell non-responders and B cell non-responders in the IDS. b, c,
Allele prevalence of MHC class I supertype families (b), and MHC class II DRB1* alleles
with a total prevalence of three or more, and paralogues (c). Grey, numbers of alleles
present or absent (for paralogues) in patients with T cell responses to IDH1-vac (T cell
response); black, numbers of alleles present or absent (for paralogues) in patients
without T cell responses to IDH1-vac (T cell non-response). n (total alleles) = 64 for 32
patients in the SDS. d, IDH1 and IDH1(R132H) 20-mer p123–142 affinities to six MHCII
DRB1* alleles and DRB3*, DRB4*, and DRB5* MHCII paralogues were assessed in vitro.
Four alleles and DRB4* paralogue are shown as examples in the graphs. CLIP, KLAT,
and PADRE represent positive control peptides. GB, good binder; B, intermediate
binder; WB, weak binder; NB, non-binder. n = 1 of 2 independent experiments. e,
Correlation analysis of in vitro MHC class II affinities with MSS. White, no affinity-
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03363-z/figures/6
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