Aula 4 - Exigências nutricionais e condições físicas para o cultivo de microrganismos

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Microbiologia e Imunologia
Dra. Maíra Barcellos Marini
Aula 04 – Principais Aspectos e Exigências Nutricionais
maira.marini@estacio.br
Mestre em Ciências- UFRJ
Doutora em Ciências Farmacêuticas- UFRJ
Pós-doutora em Ciências Farmacêuticas- UFRJ
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Objetivo da Aula
• Reconhecer os principais aspectos do crescimento das bactérias, identificando as exigências
nutricionais para o cultivo de microrganismos para compreender a influência de fatores físicos
e químicos no crescimento bacteriano.
Microbiologia e Imunologia
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• Os meios de cultura têm papel fundamental em microbiologia e auxiliam a análise e
identificação de microrganismos.
• O meio necessário para o crescimento in vitro dos microrganismos interfere em seu
desenvolvimento.
• O mesmo ocorre com outros fatores, como temperatura (microrganismos, psicrífilos,
mesófilos e termófilos) e tensão de oxigênio (microrganismos aeróbios, anaeróbios,
microaerófilos e anaeróbios facultativos).
Quais são os principais tipos de meio de cultura
sólidos utilizados para a cultivo de bactérias?
Situação Problema
Crescimento microbiano
É associado ao crescimento de 
uma população de células de 
um microrganismo e NÃO o 
tamanho de células;
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EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS
Microbiologia e Imunologia
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 Os microrganismos requerem nutrientes para poder crescer, e essa exigência varia
muito entre os diferentes microrganismos.
 Os nutrientes  são utilizados no metabolismo da célula, tendo participação nos
processos de obtenção de energia e na síntese de componentes celulares.
 O conhecimento sobre os princípios da nutrição microbiana é fundamental pois
permite que microrganismos sejam cultivados em laboratório.
EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS
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 O metabolismo pode ser definido como um conjunto de transformações da matéria
orgânica, sendo composto por dois processos:
EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS
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 Os diferentes tipos de microrganismos necessitam não apenas de nutrientes
distintos, mas também de quantidades variada desses nutrientes.
 Os macronutrientes são exigidos em quantidades grandes,
 Os micronutrientes são exigidos em quantidades muito pequenas.
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Macronutrientes
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Macronutrientes
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Macronutrientes
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Macronutrientes
EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS
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Micronutrientes
 São elementos necessários em quantidades muito pequenas, sendo, inclusive, difíceis de detectar.
 Normalmente, são representados por íons metálicos.
 Esses micronutrientes são denominados elementos-traço ou metais-traço, desempenhando,
geralmente, papel de cofatores enzimáticos.
 Outros metais necessários e/ou metabolizados pelos microrganismos são:
boro
O ferro é o principal micronutriente 
para as célula
cobalto manganês molibdênio níquel selênio zinco tungstênio
componente fundamental dos 
citocromos e de proteínas que têm ferro 
e enxofre
participam das reações de transporte de elétrons.
EXIGÊNCIAS NUTRICIONAIS
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Micronutrientes
 Fatores de crescimento são representados pelos micronutrientes orgânicos, que são requeridos em
pequenas quantidades.
 As vitaminas são os exemplos mais comuns, mas alguns microrganismos podem necessitar
também de aminoácidos, purinas, pirimidinas e outras moléculas orgânicas.
 As seguintes vitaminas são consideradas fatores de crescimento importantes:
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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Micronutrientes
 Os microrganismos são encontrados na natureza nos mais variados ambientes.
 As características físicas desses ambientes são capazes de afetar esses microrganismos e seu
crescimento.
 Dessa forma, os principais fatores físicos que afetam o crescimento dos microrganismos são:
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Microbiologia e Imunologia
 A temperatura é um dos fatores físicos determinantes no crescimento microbiano.
 Existem microrganismos capazes de crescer nas mais variadas faixas de
temperatura.
 Existe um limite de temperatura, a partir do qual os componentes das células
sofrem danos irreparáveis, resultando em sua morte.
 Assim, cada microrganismo apresenta uma:
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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Microbiologia e Imunologia
 Os microrganismos são classificados de acordo com sua temperatura ótima de
crescimento.
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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Microbiologia e Imunologia
 O pH corresponde à concentração de íons hidrogênio [H+], e sua variação é grande
nos diferentes ambientes.
 Valores de pH iguais a 7 representam pH neutro, pH inferior a 7 é chamado de
ácido e pH superior a 7 é chamado de alcalino ou básico.
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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 Você sabia que o pH é uma função logarítmica?
 O aumento de uma unidade de pH representa uma alteração de 10 vezes na
concentração de íons hidrogênio;
 O pH também influencia fortemente o crescimento microbiano.
 Cada microrganismo é capaz de crescer em uma faixa de pH, sendo o pH ótimo
aquele em que o crescimento ocorre mais rapidamente.
 Os microrganismos podem ser classificados, de acordo com o pH ótimo de
crescimento
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
Rhodopila globiformis
Acidithiobacillus ferrooxidans
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 Atividade de água é um termo que se refere à disponibilidade de água em um
ambiente.
 Essa disponibilidade não está apenas relacionada ao fato de o ambiente ser
úmido ou seco, mas também à concentração de diferentes solutos dissolvidos na
água, como sais, açúcares etc..
 Os solutos apresentam a capacidade de se ligar à água, deixando-a menos
disponível para os microrganismos.
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
 Ajustes fisiológicos são necessários para que os microrganismos sejam capazes de crescer em ambientes
com solução hipertônica;
 Quando a concentração de soluto do ambiente supera a do citoplasma, a célula perde água por
osmose, o que pode resultar em problemas sérios para a célula se ela não tiver mecanismos para
contrabalançar esse processo, já que uma célula desidratada não consegue crescer.
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CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O 
CULTIVO DE 
MICRORGANISMOS
↑ tem como efeito remover a água necessária para a célula
Célula normal- Isotônica Célula plasmolisada - hipertônico
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 Pressão osmótica
Microbiologia e Imunologia CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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Microrganismos halófilos
 São aqueles que precisam de cloreto de sódio (NaCl) para crescer.
 Os microrganismos marinhos geralmente necessitam de 1% a 4% de NaCl;
 Os microrganismos que vivem em ambientes mais salgados que a água do mar
(chamados hipersalinos) precisam de 3% a 12% de NaCl, ou até mais que isso.
 É importante destacar que os halófilos dependem de NaCl para seu crescimento,
não sendo possível a substituição por outros.
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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Microrganismos halotolerantes
 São aqueles capazes de crescer na presença de solutos dissolvidos, mas que apresentam
melhor crescimento na ausência dos solutos.
Microrganismos halófilos extremos 
 São aqueles que crescem na presença de concentrações extremamente altas de sal (de 15%
a 30%) e, na maioria dos casos, não conseguem crescer em concentrações menores de sal.
Microrganismos osmófilos
 Sobrevivem em locais ricos em açúcar.
Microrganismos xerófilos Crescem em locais muito secos (pela falta de água).
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
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 O oxigênio faz parte da composição de todas as células, sendo fornecido em
grandes quantidades principalmente a partir da água.
 Porém, a capacidade de metabolizar o oxigênio molecular não é universal.
 Assim, para algumas células, o oxigênio é essencial, enquanto, para outras, é
tóxico.
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
Anaeróbicos 
facultativos
Aeróbicos Anaeróbicos
Anaeróbicos 
aerotolerantes
Microaerófilos
Clostridium
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CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
 Os microrganismos podem ser classificados da seguinte maneira, de acordo com a 
sua necessidade ou tolerância ao oxigênio:
E. coli
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CONDIÇÕES FÍSICAS PARA O CULTIVO DE MICRORGANISMOS
CURVA DE CRESCIMENTO MICROBOIANO
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 O crescimento microbiano pode ser definido  como o aumento do número
de células de uma população.
 Nesse sentido, uma população microbiana em um ambiente fechado, como
um frasco ou tubo, não cresce indefinidamente  apresentando o que
chamamos de curva de crescimento.
 A curva de crescimento microbiano apresenta algumas fases, nas quais eventos
bioquímicos diferentes ocorrem.
A – Fase LAG: pouca divisão
celular, os microrganismos estão se
adaptando ao meio em que estão
crescendo. As células aumentam de
volume, mas não se dividem.
B – Fase exponencial (log):
crescimento exponencial, divisões
celulares sucessivas, grande
atividade metabólica.
C – Fase estacionária: decréscimo
na taxa de divisão celular, onde a
velocidade de crescimento =
velocidade de morte
D – Fase de declínio ou morte:
condições impróprias para o
crescimento, meio deficiente em
nutrientes e rico em toxinas, onde
as células mortas excedem o número
de células vivas
CURVA DE CRESCIMENTO MICROBOIANO
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Microbiologia e Imunologia
Crescimento e cultivo microbiano
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Digamos que se queira cultivar um determinado microrganismo,
talvez os micróbios de uma amostra clínica em
específico. Quais critérios o meio de cultura deve preencher?
Microbiologia e Imunologia
O material nutriente preparado para o crescimento de microrganismos 
 nutrientes adequados para o microrganismo especifico que queremos cultivar
 quantidade de água suficiente,
 pH apropriado; 
 um nível conveniente de oxigênio ou talvez nenhum. 
 o meio deve ser estéril
 temperatura apropriada
Antes de cultivar um microrganismo precisamos assegurar....
Os microrganismos introduzidos em um meio de cultura para iniciar o crescimento são chamados de INÓCULO
Os microrganismos que crescem e se multiplicam dentro ou sobre um meio de cultura são 
denominados CULTURA
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Crescimento e cultivo microbianoMeios de CulturaMicrobiologia e Imunologia
• Para que a multiplicação bacteriana seja possível, os seguintes
nutrientes devem estar disponíveis:
• Os microrganismos variam quanto suas exigências aos fatores
de crescimento e a capacidade de utilizarem diferentes
substratos que compõem os alimentos.
http://e-escola.tecnico.ulisboa.pt/topico.asp?id=275
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Crescimento e cultivo microbianoMeios de CulturaMicrobiologia e Imunologia
 água,
 fonte de energia,
 fonte de nitrogênio,
 vitaminas e sais minerais.
O material nutriente preparado para o crescimento de microrganismos
em laboratório é chamado de meio de cultura.
Algumas bactérias, fungos e leveduras:
 podem crescer bem em qualquer meio de cultura; 
 Outras requerem meios especiais,
 e outras ainda não podem crescer em qualquer dos meios não vivos até agora desenvolvidos.
Fator limitante para o cultivo in vivo de 
microrganismos
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Crescimento e cultivo microbianoMeios de CulturaMicrobiologia e Imunologia
 Os microrganismos que são introduzidos em um meio de cultura para dar início ao
crescimento são chamados de inóculo.
 O inóculo pode crescer e se multiplicar no interior ou sobre um meio de cultura.
 Quando crescidos e meios são chamados de cultura.
1° conter os nutrientes adequados para o microrganismo específico que queremos cultivar. 
2° conter também uma quantidade de água suficiente, 
3° pH apropriado e
4° um nível conveniente de oxigênio, ou talvez nenhum.
Quais critérios um meio de cultura deve preencher?
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Crescimento e cultivo microbianoMeios de CulturaMicrobiologia e Imunologia
 O meio deve ser estéril – isto é, inicialmente não deve conter microrganismos vivos,
 dessa forma, a cultura conterá apenas os microrganismos (e sua descendência) que foram
introduzidos.
 Por fim, a cultura em crescimento deve ser incubada em temperatura apropriada.
 Quando se deseja o crescimento das bactérias em meio sólido, um agente solidificante, como
o ágar, é adicionado ao meio.
 O ágar, polissacarídeo complexo derivado de uma alga marinha, tem sido muito utilizado
como espessante em alimentos, como gelatinas e sorvetes.
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Crescimento e cultivo microbianoMeios de CulturaMicrobiologia e Imunologia
 Meio quimicamente definido
 Meio complexo
 Meio e métodos para anaeróbicos
 Meios seletivos e diferencial
 Meios de enriquecimento
Tipos de meio de cultura
Crescimento e cultivo microbiano
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Microbiologia e Imunologia
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Meio de CulturaMicrobiologia e Imunologia
Meio quimicamente definido
 Adição precisa de substâncias orgânicas e inorgânicas;
 Composição química exata.
 Comercializado com componentes pré-misturados
 Para meio sólido utiliza o ágar como agente solidificante
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Meio de CulturaMicrobiologia e Imunologia
Meio complexo
 Não se sabe a composição química exata do meio de cultura.
 Ex.:
 Fontes altamente nutricionais.
 Real composição é desconhecida; 
 A composição química exata varia um pouco de acordo com o lote.
• Caseína (ptn do leite);
• Extrato de levedura (células de levedura);
• Extrato de carne, soja.
A maioria das bactérias e dos fungos, como aqueles analisados em um curso de 
laboratório introdutório, é cultivada rotineiramente em meios complexos
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Meio de CulturaMicrobiologia e Imunologia
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Meio Redutor
 Ausência de oxigênio;
 Esses meios contêm ingredientes, como o tioglicolato de sódio, que
se combinam quimicamente com o oxigênio dissolvido e o eliminam
do meio de cultura;
 Para cultivar e manter rotineiramente culturas puras de anaeróbios
obrigatórios, os microbiologistas utilizam meios redutores
armazenados em tubos de ensaio comuns, firmemente tampados.
 Esses meios são aquecidos rapidamente antes de serem utilizados, a
fim de eliminar o oxigênio absorvido.
 Placas de Petri (OxyPlate  contendo oxirase)
Figura 6.6 Uma jarra para cultivar bactérias anaeróbias em placas de Petri.
Quando água é adicionada à embalagem química contendo bicarbonato de sódio e
boroidreto de sódio, hidrogênio e dióxido de carbono são gerados. O catalisador de
paládio está localizado em uma câmara separada, que também pode ser incorporada à
embalagem química, e na sua superfície ocorrerá a reação entre o hidrogênio e o
oxigênio atmosférico do interior da jarra, que, combinados, formarão água. O oxigênio
é, assim, removido. Na jarra há também um indicador de anaerobiose contendo azul de
metileno, que tem a coloração azul quando oxidado, tornando-se incolor quando o
oxigênio é removido (como mostrado aqui).
Meio de CulturaMicrobiologia e Imunologia
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Microbiologia Clínica
Meio Redutor
 A câmara é preenchida com gases inertes
(geralmente cerca de 85% de N2, 10% de H2 e 5% de
CO2) e é equipada com sistemas de transferência
para a introdução das culturas e dos materiais.
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Na microbiologia clínica
Detecção da presença de microrganismos 
específicos associados com doenças ou 
saneamento deficiente
para essa tarefa
meios seletivos e 
diferenciais são utilizados
faz-se necessária
Meio seletivo
 São elaborados para impedir o crescimento de 
bactérias indesejadas e favorecer o crescimento 
dos microrganismos de interesse. Ex.:
. 
Ágar sulfito de 
bismuto 
um meio utilizado para o isolamento da bactéria da febre tifoide 
(Salmonella typh – gram negativa)  a partir das fezes
inibe bactérias gram-positivas e também a maioria das bactérias 
gram-negativas intestinais (além de S. typhi)
Meio de CulturaMicrobiologia e Imunologia
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Meio diferencial
 Facilitam a diferenciação das colônias de um
microrganismo desejado em relação a outras
colônias crescendo na mesma placa.
 culturas puras de microrganismos têm reações
identificáveis com meios diferenciais em tubos
ou placas.
 O ágar-sangue (que contém hemácias) é um
meio utilizado com frequência pelos
microbiologistas para identificar espécies
bacterianas que destroem hemácias.
 Ex.: Streptococcus pyogenes  bactéria que
causa a faringite estreptocócica.
Meio de CulturaMicrobiologia e Imunologia
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Meio diferencial e seletivo
Meio de CulturaMicrobiologia e Imunologia
 São meios utilizados para isolar um microrganismo de
um meio em que está em pequena quantidade;
 Meios enriquecidos com soros, sangue ou outros
nutrientes;
Ex: Ágar sangue e Ágar chocolate
São meios usados para amostras fecais ( coprocultura) inibindo o crescimento da microbiota
( bactérias normais das fezes) e permitindo o crescimento de Salmonella e Shigella que são 
patogênicos;
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Meio de enriquecimento
Meio de CulturaMicrobiologia e Imunologia
Isolamento e Cultivo de Culturas Puras
• Cultura pura formada por uma população derivada de uma única célula;
• Cultura mista formada por diversas populações de microrganismos (amostra clínica)
Uma população microbiana, sob condições naturais, contém muitas espécies s. Os 
microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os MФ da amostra, para 
então classificá-los e caracterizá-los.
 Ao determinar as características de um MФ:
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Microbiologia e Imunologia
• ele deve estar em cultura pura,
• todas as células na população são idênticas no sentido de que elas se originaram
de uma mesma célula parental.
 O tipo de meio a ser utilizado depende de vários fatores:
 Considerações sobre a origem do material a ser analisado
 A espécie que se imagina estar presente nesta amostra
 As necessidades nutricionais dos organismos.
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Microbiologia e Imunologia
MEIOS DE CULTURA
• Ágar Base – base para outros meios (usado como meio definido) – dosagem.
• Ágar Bile vermelho e violeta - Contagem de Coliformes em águas e alimentos.
• Ágar Cled ou Brolacin - crescimento e contagem de bactérias em urinoculturas.
• Ágar Eosina azul de metileno - EMB (Teague) – Isolamento e diferenciação de enterobactérias.
• Ágar Extrato glicose tripticaseína – Contagem de bactérias em geral.
• Ágar ferro lisina (LIA)– Identificação de enterobactérias.
• Ágar infuso cérebro coração - Cultura de microrganismo exigentes .
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Microbiologia e Imunologia
• Ágar Mac-conkey – Isolamento e diferenciação de enterobactérias.
• Ágar Citrato Simmons – identificação de enterobactérias
• Ágar Mueller Hinton – Teste de sensibilidade a antimicrobianos 
• Ágar nutriente – Uso geral.
• Ágar Salmonella Shigella (Ágar SS) – Isolamento de Salmonella e Shigella.
• Ágar soja tripticaseína – Uso geral.
• Ágar verde brilhante – Isolamento de Salmonella, exceto Salmonella typhi.
• Ágar Dnase – Diferenciação de estafilococos patogênicos.
• Ágar Entérico Hektoen – Isolamento e diferenciação de enterobactérias
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MEIOS DE CULTURA
Microbiologia e Imunologia
• Ágar Estafilococos 110 – Isolamento e investigação de estafilococos.
• Ágar extrato de laranja – Contagem de microrganismo em sucos cítricos.
• Ágar levine eosina azul de metileno – isolamento e diferenciação de enterobactérias.
• Ágar sal manitol – Isolamento e identificação de estafilococos. 
• Ágar seletivo para Bacillus cereus – Isolamento e diferenciação de Bacillus cereus.
• Ágar seletivo para Pseudomonas – Isolamento seletivo de pseudomonas.
• Ágar Bordet Gengou Ágar soja tripticaseína – Uso geral. – Bordettela pertussis
• Ágar Vogel johnson – Isolamento e identificação de estafilococos.
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MEIOS DE CULTURA
Microbiologia e Imunologia
• Caldo lactosado – Detecção e contagem do NMP de coliformes.
• Caldo lisina Descarboxilase – Identificação de enterobactérias. (arginina e ornitina)
• Caldo lisina Descarboxilase – Identificação de enterobactérias. (arginina e ornitina)
• Agar campylobacter – rico – Campylobacter
• Caldo Lauril sulfato de Sódio – Detecção de coliformes em águas e alimentos.
• Ágar sangue com azida – Isolamento de estreptococos.
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MEIOS DE CULTURA
Microbiologia e Imunologia
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