AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA - RESUMO

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Resumo do manual de prática de microbiologia 
 
1- Esterilização e desinfecção 
Esterilização é o processo de destruição por meio de agentes físicos ou químicos 
todas as formas de vida microbiana presentes em um material. 
>Esterilização por métodos físicos: 
1. Calor úmido: 
Autoclavação: ​É um processo de esterilização pelo vapor sob a pressão de 
câmaras chamadas de autoclaves, onde o vapor de água é mantido em temperatura 
acima de 100°C, pelo emprego de uma pressão maior que a atmosférica a uma 
temperatura de 121°C.O tempo de exposição depende do material a ser 
esterilizado. Serve para esterilizar vidraria, instrumentos cirúrgico, meio de cultivo e 
outros. 
Tindalização ou esterificação fracionada: Temperatura de 100°C durante 30min, 
repetindo o aquecimento 2 a 3 dias consecutivos. Usados para certo meio de cultivo 
que se alteram em temperatura elevada, açúcares e leite… 
 ​2​. ​Calor seco 
Forno de pasteur: ​São usados fornos ou estufas, onde a temperatura pode ser 
regulada e mantida pelo tempo necessário. (170-180°C) em estufas elétricas por 1 a 
2h. O material a ser esterilizado deve ser distribuidos de modo uniforme para 
facilitar a distribuição do calor. Indicado para esterilizar vidraria, inst. cirúrgicos 
passíveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais impermeáveis como ceras, 
pomadas, pó e óleos. 
Incineração: ​Para materiais descartáveis e carcaça de animais utilizados em 
experimentos. 
Flambagem: ​Aquecimento direto na chama do bico de Busen utilizado em rotina de 
laboratório para esterilização de alças de platina e bordas da boca de tubos e 
balões. 
​3. Filtração > ​usado ​para esterilização de gases e líquidos tais como soros, 
soluções de enzimas e vitaminas, açúcares, que não podem ser submetidos a calor. 
Consiste em passar o material por poros muito pequenos que não permitem 
passagem de bactérias e fungos. 
Tipos de filtro:​ Disco de amianto- Filtro de SEITZ 
 Membrana de ester de celulose- Millipore 
Filtros de partículas de ar de alta eficiência - HEPA (reduz o n° de 
micróbios transmitidos pelo ar). 
 
 4. Radiações 
Radiação UV : ​Esterilização do ar e de ambientes. ( Superfícies de pães, xaropes, 
sacos plásticos, garrafas de água mineral, carnes..) Porém seu uso é limitado, 
devido ao baixo poder de penetração, pois é uma radiação não-ionizante. 
 
Raios gama e raios x (radiações ionizantes) ​: Tem alto poder de penetração. 
Usada para esterilizar vacinas e sanitização de alimentos embalados. 
 
Métodos Químicos 
Utilizados para materiais termossensíveis 
Glutaraldeído 2%: 
Formaldeído (solução alcoolica 8%): ​Sua ativ. germicida é atribuída à inativação 
de proteínas e ác. nucleicos microbianos. 
Formaldeido (solução aquosa 10%) 
 
Esterilização por óxido de etileno 
Feita em baixa temperatura, para materiais de implantes e próteses se recomenda 
aeração ambiental em torno de 7 dias. 
Esterilização por vapor de formaldeído à baixa temperatura 
É realizada em autoclaves, deve-se usar luvas ou pinças para o manuseio, 
mantê-las(soluções alcoólicas) em cubas fechadas em ambientes ventilados. 
 
DESINFECÇÃO E ASSEPSIA 
 
Desinfecção: ​Destruição ou diminuição dos microorganismos na forma vegetativa, 
presentes no material. Não implica a eliminação de todos os microorganismos 
viáveis, porém elimina a potencialidade infecciosa. 
Assepsia: ​Desinfecção de tecidos vivos. impede penetração de microorganismos 
em um ambiente que não os contém (livre de infecção). 
 
OBS: Não são recomendadas a utilização de iodofóros em recém-nascidos, pois 
pode ocorrer absorção transcutânea com supressão da função tireoideana. 
 
*para antissepsia não são permitidas utilização de mercuriais orgânicos, acetona, 
hipoclorito, éter, clorofórmio, quaternário de amônio. 
 
AGENTES FÍSICOS 
> Pasteurização: ​usado na indústria de alimentos, que elimina microorganismos 
patogênicos. temperatura de 63°c por 30 min ou 75°c por 15 segundos. Não é um 
processo de esterilização> os esporos e bactérias não patogênicas podem 
permanecer viáveis. 
> Água fervente : ​desinfecção por imersão na água a 100°c por 10 min. 
 
AGENTES QUÍMICOS 
Desinfecção e assepsia 
Álcoois, Fenóis e derivados, Halogênios, Metais pesados, Corantes, Detergentes 
sintéticos, Oxidantes, Ácidos, Álcalis. 
 
PRECAUÇÕES 
● Escolha do processo de esterilização 
O mais eficaz é o vapor saturado, seguindo o vapor seco e depois os processos 
químicos. 
● Limpeza prévia 
Porque a matéria orgânica protege os microrganismos contaminantes do contato 
com o agente esterilizante. 
● Invólucros e pacotes 
Devem permitir o contato com o agente esterilizante bem como proteger durante a 
estocagem. 
● Estocagem 
É essencial que os pacotes estejam íntegros , secos e frios. (se tiver quente o vapor 
cria uma pressão negativa que aspira o ar contaminado) o invólucro funciona como 
um filtro, não permitindo a recontaminação. 
*os pacotes devem ser manuseados sempre com delicadeza e estocados em 
ambientes limpos e secos(30 a 60% de umidade) , a uma temperatura em torno de 
25°C, reesterilizados quinzenalmente quando não utilizados. 
● Medidas preventivas 
Uso de luvas, avental e , se preciso, máscara. 
Materiais contaminados devem ser esterilizados antes de serem descartados. 
Lavar cuidadosamente as mãos 
 
 
2- Técnicas de coloração de bactérias 
Permitem distinguir as células bacterianas quanto a morfologia, tamanho e arranjo 
celular de acordo com as características tintoriais. Os corantes podem ser: ácidos 
(coram o citoplasma) ou básicos (sais com base corada que tem afinidade por 
estruturas ácidas- material nuclear). Os básicos são os mais usados porque as 
bactérias se comportam como material nuclear. 
● Morfologia: 
Tamanho: desfoque decorar tamanho… 
Forma: 
1. coco: esférico 
2. bacilo: alongada 
3. espirilo: espiralada 
4. vibrio: em forma de vírgula 
 
Arranjo: grupamento de bactérias: 
1. cocos: pares (diplococos), cadeias (estreptococos), cubos ou tétrades 
(sarcina), cacho (estafilococos). 
obs: bacilos e espirilos em geral ficam isolados, mas existem diplobacilos e 
estreptobacilos. 
 
● Preparação do esfregaço para coloração: 
1. Meio líquido:Com a alça de platina pegar um pouco da cultura bacteriana e 
colocar em cima da lâmina com movimentos circulares. Deixar secar a 
temperatura ambiente e depois passar a lâmina rapidinho na chama (bico de 
bunsen) pra fixar. 
2. Meio sólido: igual ao anterior, só que colocar um pouquinho de água 
destilada na lâmina antes. 
3. Material biológico: usar um swab e friccionar sobre a lesão, depois passar em 
cima da lâmina. Secar e fixar igual. 
● Coloração simples: 
1 corante. Dá pra ver a forma, tamanho e arranjo (muito usada amostra de LCR- 
meningite) 
Faz o esfregaço, cobre de azul de metileno, deixa 5 min e depois joga fora o 
excesso. Lava com água, seca com papel de filtro e olha no microscópio de maior 
aumento (com óleo de imersão). 
● Coloração de gram (diferencial): dá pra diferenciar bactérias com morfologia 
similares mas com características tintoriais (depende da parede celular) 
diferentes: 
Faz o esfregaço, cobre de cristal violeta, deixa 1 min e depois joga o excesso. 
Cobre a lâmina com lugol (iodo), deixa 1 min e depois joga o excesso. Inclinar a 
lâmina e lavar com álcool-acetona. Lavar com água corrente. Cobrir com fucsina de 
gram e deixar 30 seg. Lavar, secar e olhar no micro, maior aumento, com óleo de 
imersão. 
 
Obs: o cristal violeta se liga à parede bacteriana por causa do iodo presente no 
lugol. O álcool funciona como descorante, pois cria uma porosidade na parede 
bacteriana gram negativa que facilita a saída do corante. As bactérias que não 
descoram após a lavagem com álcool são gram positivas, que desidratam com o 
álcool, a porosidade da parede diminuie o corante não tem como sair. 
Obs: culturas velhas gram positivas podem parecer gram negativas. 
Gram + = roxo 
Gram - = rosa 
● Coloração de Ziehl-Neelsen (diferencial): 
 Usado para a pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes (tuberculose, hanseníase 
e micobactérias atípicas). 
Princípio: micobactérias (parede rica em lipídeos) se coram pela carbolfucsina e 
resistem à descoloração com álcool-ácido. 
- Coleta: manda o paciente não usar pasta de dente, enxaguar a boca várias 
vezes, tossir profundamente e escarrar (primeiro escarro do dia, antes de 
comer). Coletar e analisar (o escarro deve ser purulento e não só saliva). 
- Esfregaço: com aplicador de madeira colocar na lâmina e arrastar por ⅓ da 
lâmina, deixar secar e fixar na chama (bico de bunsen). 
 
- Técnica: cobrir com fucsina, colocar na chama até sair vapores 2 vezes, 
aguardar 2 min (não deixar ferver nem secar). Depois lavar com água 
corrente, tirar o corante com álcool ácido clorídrico até parar de sair corante. 
Lavar com água, cobrir com azul de metileno por 30 seg, lavar com água de 
novo e deixar secar. Olhar no micro. 
Bactérias álcool-ácido resistente = vermelho 
Não resistentes = azul 
 
3- Meios de cultivo bacteriano 
Um meio de cultivo deve conter extrato de carne para o fornecimento de proteínas, 
carboidratos e sais, além de peptonas e cloreto de sódio. Entretanto, a constituição 
do meio de cultivo pode variar muito e depende das necessidades nutricionais dos 
microrganismos. 
. Os meios de cultivo são divididos: 
a) Quanto à consistência: 1- meio líquido: nutrientes dissolvidos; 2- meio 
semi-sólido: nutrientes + ágar (polissacarídeo extraído de algas marinhas) a 
5%; 3- meio sólido: nutrientes + ágar a 1,5% 
b) Quanto à função: 1-meio enriquecido: permite o crescimento de 
microrganismos que precisam de fatores de crescimento, como BHI, ágar 
sangue e ágar chocolate; 2- meio seletivo: inibe o crescimento de alguns 
microrganismos, sem impedir o crescimento de outros, como ágar ss- 
Salmonella, Shigella); 3- meio diferenciador ou indicador: detecta bactérias 
com propriedades distintas, como mudança de coloração a depender do 
meio; 4- meio de manutenção: é um meio de estocagem que tem baixo teor 
nutritivo para evitar a morte rápida dos microrganismos. 
c) Quanto a procedência: 1- natural (vegetal- batata ou animal-cérebro; 2- 
artificial sintético- glicose; 3- artificial complexo- extrato de carne 
 
4- Técnicas de semeio ( não tem no manual) 
● Em tubo de ensaio 
 meio inclinado: estria sinuosa ou estria reta 
 meio em pé: em picada 
● Em placa de Petri 
 em superfície: estrias múltiplas ou esgotamento ou por distensão 
 em profundidade ou disseminação (por Plate) 
 
5- Isolamento e identificação de bactérias gram positivas 
 
Não deve ser administrado antimicrobianos antes de colher o material clínico porque 
a bactéria pode ser sensível aquele antimicrobiano e não crescer no meio de 
cultura. 
 
Para colher e isolar precisa dos seguintes materiais: abaixador de língua, “swab” e 
ágar sangue. 
Com a amostra colhida pelo swab e distribuída para um ponto na superfície do 
meio, deve ser distribuído pela placa através de estrias e, após isso, incubar a placa 
a 37oC por 24h e fazer identificação bioquímica e diferenciação de atividade 
hemolítica e enzimática. 
As culturas podem ser feitas em placas de Petri, tubos de ensaio ou em outros tipos 
de frascos. A grande maioria das bactérias podem ser cultivadas em 24 a 48 horas, 
com exceções: ​Neisseria ​(14-18h) e ​Mycobacterium​ ( até 21 dias). 
● IDENTIFICAÇÃO 
○ Gênero ​Streptococcus 
As espécies de maior interesse clínico são: ​Streptococcus pyogenes, Streptococcus 
agalactiae, Streptococcus pneumoniae. ​O ​Streptococcus ​são identificados de 
acordo com atividade hemolítica, morfologia celular e composição antigênica. 
1- Atividade hemolítica​: podem ser ​beta-hemolíticos, ​quando lisam 
completamentamente as hemácias (in vitro) e liberam hemoglobina formando uma 
zona clara ao redor da colônia, ​alfa-hemolíticos​, quando causam a lise incompleta 
das hemácias liberando um pigmento verde e promovendo uma zona esverdeada 
ao redor da colônia, ou ​gama-hemolíticos​, que são os que não possuem atividade 
hemolítica. 
2- Morfologia Celular​: corados pelo método de Gram, sendo positivos esféricos ou 
lanceolados, de tamanho variável, isolados ou em grupos formando cadeias curtas 
ou longas. 
3- Diferenciação bioquímica​:são utilizados testes com antimicrobianos para 
diferenciação de ​Streptococcus alfa, beta e gama hemolíticos, com também 
realização de testes presuntivos para pesquisa de enzimas produzidas pelos 
isolados. 
4- Composição antigênica​: estreptococos beta-hemolíticos elaboram carboidratos 
que são utilizados em reações de precipitação com anti-soro específico, que 
possibilita a separação dos grupos. 
* Estreptococus alfa-hemolíticos 
Teste de sensibilidade a optoquina e teste de solubilidade em bile → ​Streptococcus 
pneumoniae ​(sensível e solúvel) ​x estreptococos viridescentes (resistentes e 
insolúveis). 
Teste de optoquina​: é um fármaco solúvel e água que se difunde rapidamente em 
meio de cultura sólido. Deve semear a suspensão do isolado em uma placa de ágar 
sangue de carneiro 5% e após a absorção da suspensão, colocar um disco de 
optoquina na superfície do meio semeado, após 24h, incubado a 35oC, fazer a 
leitura do halo de inibição do crescimento, sendo a cultura sensível se houver halo 
com 14 mm, e indicando que é ​Streptococcus pneumoniae. 
* Estreptococos beta-hemolíticos 
 
Teste de bracitracina: objetivo é diferenciar ​S. pyogenes de outras cepas do grupo 
A de outros grupos de ​Streptococcus beta-hemolíticos. Deve-se aplicar um disco de 
bracitracina na placa de ágar sangue de carneiro que tenha um inóculo com 4 a 5 
colônias puras de ​Streptococcus spp. e incubar 12 horas a 35oC. A presença de um 
halo de inibição com 10mm ao redor do disco é interpretado como sensibilidade e 
indica ​S.pyogenes. 
Teste de Camp: visa a identificação de linhagens de ​S. agalactiae (grupo B), que 
produzem o fator CAMP o qual atua sinergicamente com a β-hemolisina produzida 
pelo Staphylococcus aureus em ágar sangue. Deve-se semear um inóculos de S. 
aureus de um ponto a outro da placa de ágar sangue; semear perpendicularmente a 
colônia de ​Streptococcus beta-hemolítico a ser testado (sem contato com a estria de 
S. aureus​) e incubar a 35oC por 48h. A formação de uma seta ou meia-lua 
convergindo para o S.aureus na intersecção do crescimento das duas bactérias 
indica que o teste é positivo e indicativo de​ S.agalactiae​. 
 
 
○ Gênero ​Staphylococcus 
As três espécies de maior interesse clínico são: Staphylococcus aureus, 
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus. ​São cocos Gram 
positivos que podem apresentar-se isolados ou em pares, em pequenas cadeias ou 
aglomerados em cachos​. 
Identificação e diferenciação: 
1- Prova de coagulase: ​adicionar 0,1 ml de cultura em caldo a 0,5 ml de plasma de 
coelho e incubar em banho-maria a 37oC, verificando a intervalos de 30 min se 
forma coágulo. ​S. aureus ​é produtor de coagulase, já o ​S. epidermidis ​não é, e 
apesar de ser considerado não patogênico, pode estar envolvido em certas 
situações clínicas: endocardite bacteriana, em cirurgia comprótese, em transplante 
de medula e em cateterismo venoso. 
2- Sensibilidade a novobiocina: colocar disco de novobiocina na suspensão em 
caldo semeada em ágar, incubar a 37oC por 24h e verificar formação de um halo de 
inibição de 14mm. Esse teste diferencia diferencia o ​S. saprophyticus (resistente ao 
fármaco) do ​S. epidermidis (sensível à droga). O ​S. saprophyticus é causa 
relativamente freqüente de infecção do trato urinário em pacientes jovens. 
 
3- Teste de fermentação em Manitol: tem a finalidade de verificar se o 
microrganismo consegue fermentar o manitol contendo 7,5% de NaCl. Deve-se 
fazer pequenos círculos no ágar com a colônia suspeita e incubar a 35oC por 
18-24h. Se formar um halo amarelo ao redor das colônias é indicativo de ​S. aureus 
e se o meio permanecer inalterado ao redor das colônias, indica ​Staphylococcus 
coagulase negativa. 
4- Teste da Catalase: é utilizado para diferenciar estafilococos (catalase positiva) 
dos estreptococos (catalase negativa). OBS.: existem relatos na literatura de ​S. 
aureus​ catalase negativa relacionados a processos infecciosos! 
Para o teste deve-se colocar uma gota de peróxido de hidrogênio 3% sobre a lâmina 
e agregar a colônia em estudo na gota com ajuda de um fio bacteriológico. O teste é 
positivo se houver presença imediata de bolhas (conversão de H2O2 em água e 
oxigênio gasoso) e é negativo se não houver bolhas ou esfervescência. OBS1.: 
Evitar usar meios contendo sangue porque as hemácias podem produzir reação 
fraca de catalase. OBS2.: Utilizar outra linhagem de ​Staphylococcus ​para controle 
positivo e ​Streptococcus ​spp. como controle negativo. 
 
6- Antibiograma: técnicas de preparação e interpretação 
As substâncias antimicrobianas são adicionadas ao meio de cultivo em 
concentrações inibitórias para organismos sensíveis. 
● Método de difusão com disco ( técnica de Kirby Bauer)- qualitativo: pesquisa 
que grupos de drogas antimicrobianas são bactericidas para determinada 
espécie de bactérias em determinada concentração. Pode ser feita pelo 
método de padronização do inóculo bacteriano ou pelo método do semeio. 
Basicamente, coloca-se sob a superfície do meio inoculado os discos de 
antibióticos em pontos equidistantes (30mm). 
Leitura: observar o halo de inibição em torno do disco de antimicrobiano. O diâmetro 
do halo é medido em halômetro (mm) e pode ser interpretado como sensível (maior 
ou igual a 20), intermediário ( 19-18) ou resistente (menor ou igual a 17). 
● Teste E: concentração mínima inibitória (CMI)- quantitativo: Determina a 
menor concentração de antibiótico que impede o crescimento bacteriano. 
Considera-se uma população sensível a determinada droga quando esta população 
é inibida por concentração 3 ou mais vezes inferior a concentração que a substância 
atinge no sangue. Amostras resistentes são inibidas por concentrações 
intermediárias. EX: uma droga atinge concentração sérica de 32 microgramas/ ml. 
Populações inibidas com 8 microgramas são sensíveis e aquelas inibidas por [ ] 
acima de 16 são consideradas resistentes. 
Limitações do método: O critério dos halos não são apropriados para patógenos de 
crescimento lento e para antibióticos que se difundem lentamente em ágar. 
 
7- Isolamento e identificação de bactérias gram negativas 
 
a) bacilos fermentadores de carboidratos : ENTEROBACTÉRIAS (Ex: 
Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Shigella, salmonella, 
Proteus, Serratia, etc.) 
b) bacilos não fermentadores de carboidratos (Ex.: Pseudomonas, 
Acinetobacter) 
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa são as 
bactérias gram-negativas mais envolvidas em infecções hospitalares. 
1 - ISOLAMENTO: 
a) meios: Ágar salmonella Shigella (SS), Ágar Hektoen (HE), Ágar Xilose Lisina 
Desoxicolato (XLD), entre outros. 
b) técnica de semeio para isolamento: Transferir o inóculo bacteriano para um 
ponto da superfície do meio de cultivo distribuído em placa.Incubar a placa a 
37oC por 18-24h e fazer a diferenciação e identificação bioquímica 
2- IDENTIFICAÇÃO 
PROVA 
BIOQUÍMICA 
PRINCÍPIO MEIO TÉCNICA RESULTADO 
Fermentação 
de 
carboidratos 
(lactose, 
sacarose, 
glicose) 
Determinam a 
capacidade do MO* em 
hidrolisar certo açúcar, 
incorporado numa 
concentração de 0,5 a 
1,0% em meio base de 
vermelho de fenol, 
produzindo ácidos com 
ou sem gás. Todas as 
enterobactérias 
fermentam a glicose pela 
via Embden-Meyerhof, 
formando ácido pirúvico. 
Base de vermelho 
de fenol 
Indicador de pH: 
Vermelho de fenol 
 
Ácido​ ​(amarela) - 
pH < 6,8 
Alcalino​(vermelha)-
pH >8,4 
Neutro ​(laranja) - 
pH = 7,4 
Transferir, com 
alça de platina 
estéril, uma 
colônia isolada 
para o meio 
líquido vermelho 
de fenol 
adicionado do 
carboidrato a ser 
fermentado. 
Incubar a 37oC 
por 18-24h. 
POSITIVO:​ cor amarela -- 
presença de ácido 
(carboidrato fermentado) 
NEGATIVO​: cor vermelha 
-- ausência de ácido 
(Carboidrato não 
fermentado) 
 
 
Teste TSI 
(Ágar 
Tríplice-açúcar
-ferro) 
Tubos de 
ensaio 
Observa-se a 
fermentação ou não dos 
açúcares pelas bactérias 
Gram-negativas, com 
produção ou não de gás 
CO2. Também pode se 
observar a formação de 
H2S (gás sulfídrico ou 
sulfeto de hidrogênio) 
pela sua reação com o 
sulfato ferroso (presente 
no TSI), resultando num 
precipitado de sulfeto 
ferroso que se manifesta 
por uma reação visível 
de cor negra. 
Meio TSI 
 
Neste meio, além 
do ágar e das 
fontes de carbono 
e de nitrogênio, 
também estão 
presentes o 
tiossulfato de sódio 
que é uma fonte de 
enxofre para a 
produção de H2S e 
o indicador de pH 
vermelho de fenol. 
Transferir a 
colônia isolada 
para o meio TSI, 
utilizando-se a 
agulha de platina 
flambada. A 
inoculação deverá 
ter a profundidade 
de 2/3 do meio 
em uma única 
picada. Em 
seguida, 
fazem-se estrias 
na superfície 
inclinada. Incubar 
a 37oC por 
18-24h. 
1- ​Pico alcalino/fundo 
alcalino ​- Ausência de 
fermentação dos 
açúcares. Ex: 
Pseudomonas 
aeruginosa, 
Acinetobacter. 
2-​ Pico alcalino/fundo 
ácido​ - Fermentação 
apenas da glicose. 
Ex: Shigella. 
3-​Pico alcalino/fundo 
ácido e negro​ - 
Fermentação da glicose 
e produção de H2S. Ex: 
Salmonella, Proteus, 
Citrobacter. 
4-​Pico ácido/fundo ácido​ - 
Fermentação dos três 
açucares. Ex: 
Escherichia coli, 
Klebsiella, Enterobacter, 
Hafnia e outros 
componentes do grupo 
coliforme. 
Teste de 
Motilidade 
O meio de cultivo 
apropriado para teste de 
motilidade bacteriana 
deve ser semi-sólido 
(0,5% de ágar) para 
permitir a difusão de 
bactérias móveis. 
O meio SIM (S= 
H2S,I=Indol, 
M=Motilidade)é um 
dos meios 
utilizados para o 
teste de motilidade. 
Inocular em uma 
única picada a 
colônia isolada no 
meio,utilizando-se 
a agulha de 
platina estéril. 
Incubar a 37oC 
por 18-24h. 
A motilidade é detectada 
pelo exame macroscópico 
do meio; observa-se uma 
zona de crescimento 
difuso (turbidez) que 
parte da linha de 
inoculação feita com a 
agulha. 
Teste do 
Citrato 
Determinar se um MO é 
capaz de utilizar o citrato 
como única fonte de 
carbono para seu 
metabolismo e 
crescimento. Se o citrato 
for utilizado, o nitrogênio 
(do fosfato de amônia) 
presente no meio 
também será, havendo 
liberação da amônia com 
a conseqüente 
alcalinização do meio 
Ágar Citrato de 
Simmons 
meio sólido, no 
qual a única fonte 
de carbono é o 
citrato de sódio 
(obs: não contém 
proteínas ou 
carboidratos que 
são fontes de 
carbono,tendo 
como indicador de 
pH o azul de 
bromotimol 
A bactéria em é 
inoculada na 
superfície do ágar 
inclinado em tubo 
fazendo-se 
estrias na 
superfície do 
meio, 
utilizando-se a 
alça de platinaflambada. Incubar 
a 37oC por 
18-24h ou até 3 
dias, se 
necessário. 
POSITIVO​: meio azul 
(alcalino) - Utilização do 
citrato 
NEGATIVO​: meio verde 
(neutro) - Não utilização 
do citrato 
 
 
Teste da lisina 
descarboxilase 
Determinar a habilidade 
enzimática de uma 
determinada bactéria em 
descarboxilar o 
aminoácido lisina, com a 
subsequente 
alcalinização do meio 
devido a formação de 
amina alcalina 
(cadaverina). 
LIA (Ágar lisina 
ferro 
 
indicador: púrpura 
de bromocresol 
Ácido:​ cor amarela 
-- pH < 5.2 
Neutro a básico: 
cor púrpura -- pH = 
6.8 
 
A bactéria é 
inoculada em 
uma única picada 
no meio LIA em 
tubo de ensaio, 
utilizando-se uma 
agulha de platina 
estéril. Depois, 
fazem-se estrias 
na superfície 
inclinada. Incubar 
a 37oC por 24h. 
POSITIVO:​ meio púrpura 
(alcalino) - Ocorreu a 
descarboxilação da lisina 
e conseqüente formação 
de aminas. 
NEGATIVO​: meio 
amarelo (ácido) - Não 
ocorreu a 
descarboxilação da lisina. 
A acidificação do meio 
ocorre porque a bactéria 
fermenta uma pequena 
quantidade de glicose 
presente no meio. 
Teste de Indol Determinar a habilidade 
do organismo em 
produzir o indol a partir 
da molécula de 
triptofano ou outros 
aminoácido presentes no 
meio SIM. Quando 
ocorre a degradação 
deste aminoácido por 
bactérias que possuem a 
enzima triptofanase 
ocorre a formação de: 
Indol, ácido pirúvico e 
amônia. Este teste é útil 
para diferenciar a E.coli 
(indol positiva) de outras 
enterobactérias. 
Meio SIM 
 
• Reativo de Kovac 
ou Reativo de 
Ehrlich 
Inocular com 
agulha de platina 
o meio SIM com a 
bactéria em 
estudo e incubar 
a 37oC por 
18-24h. Em 
seguida, adicionar 
gotas do reativo 
Ehrlich ou de 
Kovac n​o tubo. 
O desenvolvimento de 
uma cor vermelha na 
superfície do meio após a 
adição do reativo indica a 
presença de indol e uma 
prova positiva. A cor 
vermelha aparece na 
camada de álcool quando 
o indol produzido reage 
com o p- 
Dimetilaminobenzaldeído 
presente nos reativos de 
Ehrlich ou de Kovac​. 
Teste de 
urease 
Determinar a habilidade 
de um microrganismo 
em degradar 
enzimaticamente a uréia 
pela urease com a 
formação de duas 
moléculas de amônia 
(NH3), resultando na 
alcalinização do meio. 
Meio caldo uréia 
 
Este meio tem 
como indicador de 
pH o vermelho de 
fenol 
 
Inocular o caldo 
uréia com uma 
alça de platina 
carregada de 
cultura pura do 
organismo em 
estudo. Incubar a 
37oC por 
18-24h, ou até 
48h se 
necessário. 
POSITIVO​:​ meio rosa 
(alcalino) - Presença de 
urease 
NEGATIVO​: meio 
amarelo (neutro) - 
Ausência de urease 
* Microorganismo 
3. MÉTODOS RÁPIDOS DE IDENTIFICAÇÃO 
1. Sistema API 20E (bio Mérieux) – Identificação de Enterobactérias 
Consiste em tiras plásticas com 20 compartimentos que contêm os substratos 
desidratados (meio de identificação bioquímica) e uma câmara plástica de 
incubação com tampa frouxa. A ação bacteriana sobre o substrato (20 no total) 
 
produz mudança de cor que é interpretada visualmente em 24 horas a 35ºC. O 
fabricante fornece folhas de trabalho para registro das interpretações visuais das 
reações coloridas, que em seguida são convertidas em número do biótipo de 7 
dígitos, levando a identificação da espécie bacteriana. 
Pelo sistema API 20E são identificadas mais de 100 espécies de bactérias 
gram-negativas. Esse sistema é um dos mais utilizados nos laboratórios clínicos e 
de pesquisa. 
Obs: Também são comercializados outros sistemas API para identificação de 
bactérias Gram-positivas. 
2. Sistema VITEK (SISTEMA AUTOMATIZADO) 
É utilizado com cartões de teste VITEK para identificação bacteriana e provas 
de susceptibilidade a antibióticos, totalmente automatizadas. Este sistema permite a 
identificação de enterobactérias em 8 horas, sendo aceito como um método 
confiável para identificação rápida de bacilos gram negativos nos laboratórios de 
microbiologia clínica. Cada cartão de identificação possui 30 testes bioquímicos que 
não necessita adição de reagentes, evitando erros. VITEK é capaz de detectar mais 
de 300 espécies de microrganismos (bactérias gram-negativas e gram-positivas e 
leveduras).