Metodos laboratoriais no diagnostico, seguimento e complicacoes de uma doenca infecciosa

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Métodos laboratoriais no
diagnóstico, seguimento e
complicações de uma doença
infecciosa
Caso clínico
Jovem de 26 anos, sexo masculino, após ter
visto outdoor da Campanha “Fique Sabendo”,
procurou o Centro de Testagem e
Aconselhamento (CTA) de Bauru para
realização de testagem. Mesmo não
apresentando nenhum problema de saúde, há
alguns meses o jovem queria realizar a testagem
para HIV, pois nos últimos anos vinha se
expondo a situações de risco de infecção. Após
acolhimento e aconselhamento pré-teste,
realizado pelo profissional da equipe do CTA, o
jovem foi submetido à testagem para HIV,
seguindo o fluxo definido pelo Ministério da
Saúde, sendo seus exames sorológicos (Teste de
alta sensibilidade) definidos como reagentes.
Após aconselhamento pós-teste, o jovem foi
encaminhado para o Centro de Referência em
Moléstias Infecciosas, onde o médico, após
outros exames (Teste de alta especificidade para
confirmar que o paciente está realmente doente),
introduziu tratamento com antirretrovirais.
Seis meses após do início do tratamento, o
paciente retornou e realizou uma nova bateria
(Teste quantitativo para saber como a infecção
está no paciente) de exames para verificar a
eficiência do tratamento até o momento.
- A contagem de CD4/CD8 é usada para
saber se o paciente está reagindo bem ao
tratamento padrão do HIV.
- O exame de sequenciamento do HIV é
utilizado para saber qual tipo de vírus HIV
infectou o paciente; ele é solicitado
quando o paciente não está reagindo a
tratamento básico contra o HIV sendo
necessário um tratamento direcionado.
Diagnóstico sorológico
O diagnóstico sorológico é pautado em testes de
triagem com alta sensibilidade e testes de
confirmação com alta especificidade.
Os testes de triagem requerem sensibilidade
elevada para que todos os casos sejam detectados;
já os testes de confirmação precisam ser altamente
específicos para confirmar os diagnósticos.
Os testes laboratoriais são requisitados para a
detecção, o diagnóstico ou o monitoramento de
doenças ou de predisposição às doenças.
Indivíduos assintomáticos passam por uma
triagem para a detecção de doença insuspeita,
enquanto pacientes sintomáticos são testados
para confirmar ou identificar a doença.
Os laboratórios de baixa infraestrutura laboratorial,
o paciente faz um teste de triagem com máxima
sensibilidade. Caso haja a confirmação, o paciente
é direcionado para o médico, o qual o encaminha
para o laboratório de análises clínicas que fará o
teste confirmatório de máxima especificidade.
Após o estabelecimento do tratamento, o paciente
retorna ao laboratório de análises clínicas para
fazer o teste quantitativo para ver se o tratamento
padrão está fazendo efeito.
No banco de sangue, há testes para detectar a
purificação do sangue para triar os sangues sem
contaminações.
Os testes Confirmatórios utilizam diferentes
formatos e princípios.
A combinação de 2 ou mais testes, formando um
Fluxograma, tem como objetivo aumentar o Valor
Preditivo Positivo (probabilidade de que cada
positivo avaliado pelo teste seja um doente).
Marcadores da infecção por HIV
- Na primeira semana de infecção, é
recomendado fazer o teste molecular da
RT-PCR (transcrição reversa seguida da
reação da polimerase em cadeia) que
detecta o RNA viral (material genético).
- Na segunda semana de infecção, é
recomendado o teste sorológico de 4º
geração, o qual faz a detecção de antígeno
identificando a proteína P24 presente na
estrutura viral.
- Na terceira semana de infecção, é
recomendado o teste sorológico de 3º
geração, o qual faz a detecção de
anticorpo inespecífico IgM (alta
concentração para o teste dar positivo).
- Da quarta semana de infecção em diante, é
recomendado o teste sorológico de 1º e 2º
para detecção de anticorpo específico IgG
(alta concentração para o teste dar
positivo).
Imunoensaios
Os imunoensaios são métodos bioanalíticos que
medem a presença ou concentração de analitos
(amostra do paciente) através do uso de um
anticorpo ou antígeno como agente de detecção.
As interações específicas que ocorrem durante a
resposta imune possibilitaram o
desenvolvimento dos Imunoensaios.
Os imunoensaios permitem ao avaliador promover
um imunodiagnóstico, um diagnóstico laboratorial
feito por meio de técnicas imunológicas.
As reações imunoquímicas formam a base para
os ensaios clínicos sensíveis e específicos
conhecidos como imunoensaios. Num
imunoensaio típico, um anticorpo é utilizado
como reagente para detectar o analito de
interesse. A excelente especificidade e elevada
afinidade de anticorpos para antígenos
específicos, juntamente com a capacidade única
dos anticorpos para antígenos de ligação
cruzada, permitem a identificação e
quantificação de substâncias específicas por uma
variedade de métodos.
Um antígeno é qualquer material capaz
de reagir com um anticorpo. No
imunoensaio, o antígeno é o analito de
interesse clínico a ser medido. Os
anticorpos são imunoglobulinas que se
ligam especificamente a uma grande
variedade de antígenos naturais e
sintéticos, como proteínas, hidratos de
carbono, ácidos nucleicos, lipídeos e
outras moléculas. Analiticamente, a
imunoglobulina G (IgG) é o reagente
imunoquímico mais prevalente em uso.
Antígenos podem ser definidos como
qualquer substância que possa
representar locais antigênicos
(epítopos) para produzir anticorpos
correspondentes, desde pequenas
moléculas, como haptenos e
hormônios, até macromoléculas,
como proteínas, glicoproteínas, glicolipídeos e outros
produtos naturais.
Imunoglobulina (Ig), uma importante proteína
plasmática, refere-se a anticorpos no contexto das
funções biológicas de uma imunoglobulina
específica contra antígenos. Portanto, anticorpos são
produzidos em resposta à estimulação antigênica. Os
anticorpos são formados por moléculas funcionais e
heterogêneas que se unem aos antígenos por meio do
local de ligação do antígeno. Há cinco classes
(isotipos) de imunoglobulina: IgG, IgM, IgA, IgD e
IgE. A IgG subdivide-se ainda em quatro subclasses,
enquanto a IgA e a IgM têm dois subgrupos.
Reação antígeno-anticorpo
Pesquisa de antígeno
- Na pesquisa de antígeno, há um anticorpo
sintético específico que se ligará ao
antígeno da amostra do paciente, após isso
será necessário uma lavagem da placa
restando apenas a ligação
antígeno-anticorpo.
- Após a lavagem, para identificar a
presença do antígeno na amostra, é preciso
de uma anticorpo secundário com o
marcador, o qual ao encontrar o antígeno
do paciente irá mudar a coloração da
reação no equipamento confirmando o
teste (reagente), caso não haja a emissão
de mudança de coloração o teste deu
negativo (não reagente). Para colocar no
equipamento é necessário uma nova
lavagem e colocar um substrato para
possível emissão de coloração.
Pesquisa de anticorpo
- Na pesquisa de anticorpo, há um antígeno
sintético específico que se ligará ao
anticorpo da amostra do paciente, após
isso será necessário uma lavagem da placa
restando apenas a ligação
antígeno-anticorpo.
- Após a lavagem, para identificar a
presença do anticorpo na amostra, é
preciso de uma anti-anticorpo secundário
com o marcador, o qual ao encontrar o
anticorpo do paciente irá mudar a
coloração da reação no equipamento
confirmando o teste (reagente), caso não
haja a emissão de mudança de coloração o
teste deu negativo (não reagente). Para
colocar no equipamento é necessário uma
nova lavagem e colocar um substrato para
possível emissão de coloração.
A lavagem é necessária para eliminar os demais
componentes da amostra do paciente para evitar
um falso positivo ou falso negativo.
- Os testes de imunodiagnósticos
baseiam-se no princípio da especificidade
da resposta imune. Para se detectar
anticorpos ou linfócitos utilizam-se como
reagentes os antígenos ou seus
componentes, enquanto que, para se
detectar os antígenos, são usados
anticorpos.
No imunoensaio típico, o anticorpo de “captura” é
primeiro adsorvido ou ligado de forma covalente à
superfície de uma fase sólida. Em seguida, o
antígeno da amostra é deixado a reagir e capturado
pelo anticorpode fase sólida. As proteínas são,
então, lavadas e um anticorpo marcado (conjugado)
é adicionado, que reage com o antígeno ligado
através de um segundo e distinto epítopo. Após a
lavagem adicional para remover o excesso de
anticorpo marcado não ligado, o marcador ligado é
medido e a sua concentração ou atividade é
diretamente proporcional à concentração de
antígeno.
Em ensaios, os anticorpos, quer policlonal quer
monoclonal, são utilizados para captura de
anticorpos marcados. Se forem utilizados anticorpos
monoclonais com especificidade para epítopos
distintos, a incubação simultânea da amostra e o
conjugado com o anticorpo de captura são possíveis,
simplificando o protocolo de ensaio.
Imunodiagnóstico
Testes de imunodiagnóstico são aqueles que se
baseiam na especificidade da resposta imune para
detectar anticorpos, antígenos ou linfócitos.
Os métodos de imunodiagnóstico podem ser
divididos em testes sorológicos, quando detectam a
presença de anticorpos ou antígenos no soro ou em
outros líquidos orgânicos e testes cutâneos (exemplo:
teste intradérmico com tuberculina), quando
detectam a presença de linfócitos. São vários
métodos para a realização dos testes sorológicos:
precipitação, floculação, aglutinação,
imunofluorescência, teste imunoenzimáticos e
radioimunoensaios. Cada método apresenta
características, aplicações e limitações próprias.
- Hipersensibilidade: reações intradérmicas e
percutâneas.
- Presença de anticorpo ou antígeno: ensaios
de imunoprecipitação, aglutinação e
neutralização.
- Interação antígeno-anticorpo: Ensaios de
imunofluorescência (Citometria de Fluxo),
radioimunoensaio, imunoenzimáticos
(ELISA; Western Blot),
imunofluorimétricos e
quimioluminescência.
Teste de ELISA (imunoenzimático)
- O imunoensaio enzimático (EIA) utiliza as
propriedades catalíticas de enzimas para
detectar e quantificar reações
imunológicas. Enzimas, como fosfatase
alcalina (ALP), peroxidase de rábano
(HRP), glucose-6-desidrogenase (G6D) e
β-galactosidase, são comumente usadas
como marcadores no EIA.
- O ELISA é uma técnica EIA heterogênea.
Com este tipo de ensaio, um dos
componentes de reação está ligado à
superfície de uma fase sólida, como um
poço de microtitulação. Este acessório
pode ser constituído pela adsorção não
específica ou ligação química ou
imunoquímica e facilita a separação dos
reagentes marcado ligado e livre.
Tipicamente, no ELISA, uma alíquota de
amostra ou calibrador contendo o antígeno
a ser medido é adicionado e deixado ligar
com um anticorpo de fase sólida. Após a
fase sólida ser lavada, um anticorpo
marcado com enzima diferente do
anticorpo ligado é adicionado e forma um
“complexo sanduíche” de fase
sólida-Ab:enzima Ab:Ag. O excesso (não
ligada) de anticorpo, em seguida, é lavado
e o substrato da enzima é adicionado. O
marcador de enzima catalisa a conversão
do substrato em produto (s), cuja
quantidade é proporcional à quantidade de
antígeno na amostra. Os anticorpos em
uma amostra também são quantificados
através da utilização de um procedimento
de ELISA em que o antígeno em vez de
anticorpo está ligado a uma fase sólida e o
segundo reagente é um anticorpo marcado
com enzima específica para o anticorpo
analito. Por exemplo, numa placa de
microtitulação, ensaios de ELISA foram
utilizados extensivamente para a detecção
de anticorpos para vírus e parasitas em
soro ou sangue total. Além disso, os
conjugados de enzima acoplada com
substratos que produzem produtos visíveis
têm sido utilizados para desenvolver
ensaios do tipo ELISA, com resultados
que são interpretados visualmente. Estes
ensaios têm sido muito úteis em triagem,
ponto de cuidado e testagem de aplicativos
em casa.
ELISA- detecção de anticorpos (Ac) e antígenos
(Ag) específicos no soro/plasma sanguíneo
O plasma é colocado em uma solução diluente de 90
uL para diluir o plasma formando uma solução 1/2, o
qual é colocado em 90 uL de solução diluente
formando uma solução 1/4. Essa solução 1/4 é
colocada em 90uL de solução diluente formando
uma solução 1/8, a qual é diluída em uma solução
diluente 90uL formando uma solução 1/16. Ocorre
essa diluição até chegar uma solução 1/256.
Tipo I e II
- Os testes ELISAs I e II têm o formato
indireto, ou seja, a presença de anticorpos
específicos é detectada por um conjugado
constituído por um anticorpo anti-IgG
humano.
- Em média, a janela de soroconversão dos
ensaios de primeira geração é de 6 a 8
semanas. Atualmente, esses ensaios
deixaram de ser utilizados na rotina
diagnóstica dos laboratório
- Em comparação com os ensaios de
primeira geração, os de segunda geração
são mais sensíveis e específicos, por
conter uma maior concentração de
proteínas (epítopos imunodominantes)
relevantes. Em média, a janela de
soroconversão dos ensaios de segunda
geração é de 28 a 30 dias.
- A placa apresenta um antígeno específico,
o qual interage com o anticorpo IgG da
amostra do paciente na fase de incubação
(fase que permite que ocorra a ligação
antígeno/anticorpo). Após essa fase,
ocorre uma lavagem e a inserção de
anti-IgG + enzima, a qual precisa de uma
nova fase de incubação para interação do
anti-anticorpo com o IgG, e depois dessa
interação ocorre uma lavagem para
colocar o substrato que precisa de uma
nova fase de incubação para gerar uma
reação enzimática para mudança de cor.
A lavagem permite a retirada de excesso de
anticorpo, e na ausência de ligação
antígeno/anticorpo, mantém a reação limpa.
Tipo III
- O teste ELISA III tem o formato
“sanduíche” (ou imunométrico). A
característica desse ensaio é utilizar
antígenos recombinantes ou peptídeos
sintéticos tanto na fase sólida quanto sob a
forma de conjugado. Esse formato permite
a detecção simultânea de anticorpos
anti-anticorpo IgM e IgG.
- Em média, a janela de soroconversão dos
ensaios de terceira geração é de 22 a 25
dias
- A placa apresenta os antígenos específicos
para IgM e IgG, os quais interagem com
os anticorpos IgG e IgM da amostra do
paciente na fase de incubação. Após essa
fase, ocorre uma lavagem e a inserção de
peptídeos sintéticos + enzima, a qual
precisa de uma nova fase de incubação
para interação do peptídeo sintético com o
IgG e IgM, e depois dessa interação ocorre
uma lavagem para colocar o substrato que
precisa de uma nova fase de incubação
para gerar uma reação enzimática para
mudança de cor.
- Não há diferenciação do IgG e IgM, só
mostra se há presença deles.
A lavagem permite a retirada de excesso de
anticorpo, e na ausência de ligação
antígeno/anticorpo, mantém a reação limpa.
Tipo IV
- O teste ELISA tipo IV o detecta
simultaneamente o antígeno p24 e
anticorpos específicos IgG/IgM.
- O componente de detecção de anticorpo
tem o formato de “sanduíche”; portanto,
detecta todas as classes de
imunoglobulinas contra proteínas
recombinantes ou peptídeos sintéticos
derivados das glicoproteínas gp41 e
gp120/160.
- O componente de detecção de antígeno
p24 é constituído por um anticorpo
monoclonal na fase sólida (para capturar o
antígeno p24 presente no soro) e de um
conjugado constituído por um antissoro
(anticorpo) poliespecífico contra a
proteína p24.
- Em média, a janela diagnóstica dos
ensaios de quarta geração é de
aproximadamente 15 dias, dependendo do
ensaio utilizado.
A lavagem permite a retirada de excesso de
anticorpo, e na ausência de ligação
antígeno/anticorpo, mantém a reação limpa.
Teste rápido (Imunocromatografia)
- A imunocromatografia é um tipo de teste
rápido que identifica doenças infecciosas,
hormônios e outros analitos, por
associação específica a anticorpos com
partículas coloridas conjugadas. O
resultado de um teste de
imunocromatografia geralmente considera
a presença de antígenos na amostra;
antígenos são substâncias externas que,
uma vez no organismo, desencadeiam a
produção de anticorpos (proteínas que são
as principais responsáveis pelas defesas do
nosso organismo).
- O teste de imunocromatografia é uma
reação que vai ocorrer em casas
horizontais tendo uma sequência de
eventos.
- A imunocromatografia é um teste
qualitativo, assim mostra a presençaou
ausência de uma doença e não a
quantidade de antígeno/anticorpo presente
no paciente.
- Os testes rápidos apresentam grande valor
em situações que o diagnóstico é essencial
para tomada de decisão imediata do
profissional de saúde (parturientes,
acidente ocupacional, mutirões).
- Atualmente, a imunocromatografia é
usada para o imunodiagnóstico de muitas
doenças infecciosas: Dengue, malária,
amebíase, peste bubônica, brucelose,
giardíase, leishmaniose visceral, hepatite
B, infecção por vírus como HIV,
cinomose, parvovirose, coronavirose,
Helicobacter pylori, Streptococcus
pneumoniae, entre outras; sendo usado ou
para a detecção de antígenos ou de
anticorpos.
- A imunocromatografia apresenta o
resultado em poucos minutos (30 minutos)
e tem sua base de análise pautada na
mostra de saliva, sangue, soro/plasma do
paciente. Além disso, os testes rápidos
apresentam uma sensibilidade >99,5% e
Especificidade > 99%.
Características
- Qualitativos;
- Teste de triagem;
- Rápido;
- Econômico;
- Fácil interpretação;
- Leitura é feita a olho nu;
- Apresenta sensibilidade e
especificidade similares ao ELISA de
terceira geração;
Método
- Utiliza uma matriz de membrana de
nitrocelulose ligada a uma tira de acetato
transparente;
- Para detectar antígeno, emprega-se um
anticorpo de captura, ligado à matriz e um
anticorpo marcado com partículas
coloridas que é específico para o antígeno
pesquisado;
- Para detectar anticorpo, utiliza-se um
antígeno específico ligado à matriz e um
anticorpo anti-imunoglobulina marcado
com partículas coloridas;
- Para detecção de antígenos podem ser
utilizados anticorpos fixados na linha de
captura e como conjugado um segundo
anticorpo conjugado a partículas
coloridas. Um dos métodos imunológicos
desses testes emprega partículas coradas,
como ouro coloidal (róseo) ou prata
coloidal (azul marinho) como revelador da
interação antígeno-anticorpo.
- A amostra do paciente apresenta
anticorpos, os quais serão levados para o
ouro coloidal + anticorpo (conjugado)
formando uma ligação do conjugado com
o anticorpo. A substância é levada para
uma amostra de antígenos onde formará
um complexo anticorpo-antígeno emitindo
uma coloração. Seguindo o fluxo, o
conjugado que não se ligou ao anticorpo
da amostra e o excesso de complexo
anticorpo + conjugado será levado ao
anti-anticorpo gerando a reação de
controle.
Um formato de imunoensaio típico é visto em um
dispositivo de fluxo através que possui um anticorpo
covalente acoplado à superfície de uma matriz porosa.
Quando a amostra do paciente é adicionada à matriz,
o analito de interesse se liga ao anticorpo. A adição de
um segundo anticorpo rotulado forma um sanduíche e
prende o marcador à posição do primeiro anticorpo.
Se o marcador consistir em partículas de ouro ou látex
colorido, ele é diretamente visualizado ou
quantificado pela espectrofotometria de refletância
em um leitor separado. Outra importante
característica desse tipo de tecnologia é a
incorporação de um monitor de qualidade embutido
que indica positivamente se todos os reagentes foram
armazenados e o dispositivo é operado corretamente.
Em todos os diferentes formatos, fluxo uniforme e
previsível das amostras através ou ao longo matriz de
fase sólida é um dos determinantes principais da
reprodutibilidade da técnica. Sendo assim, a escolha
da matriz e de como ela interage com a amostra são
de particular importância, e avanços no entendimento
da fase sólida e tecnologia química de superfície têm
trazido grande contribuição para o desenvolvimento
dos imunossensores.
Nesse dispositivo, a amostra de sangue é adicionada e
primeiramente corre através de uma fibra de lã de
vidro, que separa o plasma do resto do sangue.
Simultaneamente, dois anticorpos monoclonais
anti-humanos cardíacos troponina T (cTnT), um
conjugado à biotina e o outro rotulado com partículas
de ouro, vinculam-se à troponina T na amostra. O
complexo de anticorpos/troponina se conecta à
estreptavidina e imobiliza o composto. Este então é
visualizado quando uma faixa roxa, próxima às
partículas de ouro, se conecta a um dos anticorpos. O
anticorpo rotulado com ouro que não reagiu fica mais
pra baixo da tira, onde é capturado pela zona que
contém um peptídeo sintético, consistindo em epítopo
do cTnT humano, e é visualizado como uma faixa
colorida separada, porém similar. A presença da
segunda faixa serve como um importante indicador de
qualidade, pois mostra que a amostra fluiu ao longo
da tira de teste e o dispositivo efetuou o mesmo
corretamente.
Interpretação
- Positivo: Duas linhas são visíveis, sendo
uma linha na região controle (C) e outra
na região teste (T). A intensidade de cor
da linha teste (T) poderá variar de acordo
com a concentração do analito (Ag / Ac)
presente na amostra. Todavia, qualquer
intensidade de cor na linha teste indica
resultado positivo.
- Negativo: Apenas uma linha é visível na
região controle (C), não sendo observada
linha na região teste.
- Inválido: Não é evidenciada a linha
controle (C). As razões mais comuns de
falha são o volume insuficiente de amostra
ou falha no procedimento técnico. Neste
caso, reler a técnica e repetir o teste com
uma nova tira.
Se aparecer o risco do teste e do controle, o teste
deu negativo. Já, se aparecer o risco do controle
e não aparecer o risco do teste, significa que o
teste é negativo. Agora, se aparecer apenas o
risco do teste e não aparecer o risco do controle,
significa que o teste é inválido (necessita
repetição).
Teste de aglutinação
- A aglutinação é a “aglomeração” de uma
suspensão de células contendo antígenos,
microrganismos ou partículas na presença
de anticorpos específicos, também
conhecidos como aglutininas.
- O teste de aglutinação é caracterizado pela
formação de agregados visíveis como
resultado da interação de anticorpos
específicos e partículas insolúveis que
contém determinantes antigênicos na
superfície.
- A aglutinação é um técnica que permite
identificar e quantificar precipitados
resultantes da interação
antígeno-anticorpo, absorvidos a
micropartículas insolúveis ou células.
Aglutinação é a quantificação de um precipitado.
- Os ensaios baseados em aglutinação têm
sido utilizados durante muitos anos para
avaliação qualitativa e quantitativa de
anticorpos e antígenos.
- A aglomeração de partículas visíveis,
como células e partículas de látex, é usada
para indicar a reação primária de
antígeno/anticorpo.
- Os métodos de aglutinação requerem
partículas estáveis e uniformes, antígeno
puro e anticorpos específicos.
- Anticorpos IgM são mais suscetíveis de
produzir aglutinação do que anticorpos
IgG por causa do tamanho e da valência
da molécula IgM. Portanto, quando apenas
anticorpos IgG estão envolvidos, o uso de
reforço químico ou de um método
anti-aglutinação de imunoglobulinas pode
ser necessário.
- Como todas as reações imunoquímicas em
que a agregação é a medida final, a razão
antígeno anticorpo é crítica. Os extremos
de antígeno ou a concentração de
anticorpos inibem a agregação.
- Em geral, os métodos de aglutinação são
bastante sensíveis, mas não são mais
quantitativos que outros métodos
imunoquímicos discutidos anteriormente.
Imunoensaios não isotópicos,
especialmente EIAs, são tão convenientes
como reações de aglutinação e, portanto,
estão substituindo os métodos de
aglutinação em muitos laboratórios.
Características
- Imunoensaio não-marcado.
- O soro é seu material de análise para
detecção de anticorpos IgM e IgG.
- Teste de triagem,
- Teste de fácil execução (sem
equipamentos).
- Baixo custo.
- Sensibilidade e especificidade
semelhante ao teste ELISA.
- Boa especificidade e reprodutibilidade.
- Baixa sensibilidade e pouca
estabilidade Ag-Ac.
- Diagnóstico de vírus, bactérias,
protozoários e fungos; doenças
auto-imunes; detecção de hormônios e
tipagem de grupos sanguíneos.
- Reações de aglutinação ocorrem entre um
antígeno particulado e seu anticorpo
específico (aglutinação direta) ou entre
uma partícula inerte e recoberta de
antígeno solúvel e seu anticorpo
específico (aglutinação indireta).Reação de aglutinação direta
- Na aglutinação direta, a célula da amostra
apresenta um antígeno expresso na sua
membrana celular; assim na reação, o
anticorpo específico se ligará aos
antígenos celulares formando uma
aglutinação.
- Se o antígeno celular não for específico
para o anticorpo do teste, não ocorrerá a
aglutinação.
- A aglutinação direta detecta anticorpos
específicos mediante o emprego de
antígenos conhecidos; ou detecta
antígenos específicos por
- meio de sua reação com anticorpos
conhecidos. Partículas antigênicas
insolúveis são utilizadas em sua forma
íntegra ou fragmentada (Ex: bactérias,
vírus, fungos e protozoários). São
realizadas diluições seriadas do anticorpo
em relação a uma quantidade constante do
antígeno. Após incubação, a aglutinação
se completa e o resultado é geralmente
expresso com a máxima diluição em que
ocorre a aglutinação. Ex: toxoplasmose,
tripanossomíase, tipagem de grupos
sanguíneos (antígenos específicos), reação
de Paul-BunnelDavidson (antígenos
heterófilos), teste de Widal para
salmoneloses.
Reação de aglutinação indireta
- Na aglutinação indireta, ocorre a adição de
uma partícula sintética, a qual absorverá o
antígeno formando uma partícula
sensibilidade que entrará em contato com
o anticorpo específico promovendo a
reação de aglutinação.
- Na aglutinação indireta, o antígeno é
adsorvido a uma partícula que servirá de
fase sólida da reação (Pesquisa de
anticorpo).
- Adsorção de anticorpos ou antígenos
solúveis proteicos ou polissacarídeos na
superfície de micropartículas inertes
(suportes) que não interferem na interação
antígeno-anticorpo. Exemplos de
partículas: hemácias (hemaglutinação) ou
látex, mas podem ser utilizadas também
partículas de bentonita e colóide.
A hemaglutinação descreve uma reação de
aglutinação em que o antígeno está localizado
em um eritrócito. Eritrócitos são bons portadores
passivos de antígeno; eles são revestidos
facilmente com proteínas estranhas e são
facilmente obtidos e armazenados. A pesquisa
direta de eritrócitos para o grupo sanguíneo Rh e
outros tipos antigênicos é amplamente utilizado
em bancos de sangue. Antissoros específicos,
como anticorpos anti-A, anti-C e anti-Kell, são
usados para detectar antígenos na superfície de
eritrócitos. Na hemaglutinação indireta ou
passiva, os eritrócitos são usados como
transportadores particulados de antígenos
estranhos (e em alguns testes de anticorpo); esta
técnica tem amplas aplicações. Outros materiais
disponíveis sob a forma de partículas, como
látex, têm sido utilizados como veículos de
antígenos, mas são mais difíceis de revestir,
padronizar e armazenar. Numa variação desta
técnica relacionada, conhecida como inibição da
hemaglutinação, a capacidade de antígenos,
haptenos ou outras substâncias para inibir
especificamente a hemaglutinação de células
sensibilizadas (revestidas) pelo anticorpo é
determinada.
Western Blot (teste imunoenzimático)
- O teste Western blotting (WB) também
conhecido como protein blotting ou
immunoblotting, é um poderoso e
importante método em biologia molecular
utilizado para imunodetecção de proteínas
após a separação destas por eletroforese
em gel e transferência para membrana
adsorvente. Esta técnica permite detectar,
caracterizar e quantificar múltiplas
proteínas, principalmente aquelas que
estão em baixas quantidades em
determinada amostra.
- É uma técnica que permite a detecção de
proteínas a partir de uma marcação com
anticorpos e enzima.
Método
- A preparação de amostras é um dos passos
cruciais do processo de separação de
proteínas. Os resultados do experimento
dependem das condições iniciais do
material. Por esse motivo, um modelo
experimental adequado e uma preparação
cuidadosa de amostras são essenciais para
se obter resultados significantes e
confiáveis, particularmente em estudos
comparativos de proteínas, em que
normalmente existem diferenças mínimas
entre as amostras experimentais e as do
grupo controle
- A amostra do paciente é colocada no gel
para ativar a eletroforese iniciando a
separação das proteínas da amostra do
paciente, a qual é marcada em uma
localização de um marcador de peso
molecular conhecido da amostra controle.
Ao reconhecer as proteínas, precisa
retirá-las do gel realizando uma nova
eletroforese para transferi-las para uma
membrana. Na membrana, deve-se colocar
um anticorpo específico (anticorpo
primário) para proteína (antígeno) que
estamos detectando no teste de Western
Blot; após inserir a anticorpo primário,
precisa colocar o anticorpo secundário que
se ligará à enzima para retirar a proteína
da membrana gerando uma marcação
ilustrando a presença dessa proteína a
amostra do paciente.
1-Controle positivo
2-Controle negativo
O teste de Western Blot é aplicado para
confirmação de testes positivos pela alta
especificidade. (Ex: HIV)
Tuberculose
Definição
- A tuberculose é uma doença
infectocontagiosa, causada pelo
Mycobacterium tuberculosis, também
denominado de Bacilo de Koch (BK).
O micro-organismo apresenta
evolução em ciclos lentos e de maior
incidência nas áreas urbanas, a doença é
transmitida por meio do ar pelas gotículas
contendo o Mycobacterium tuberculosis ,
as quais são expelidas pelo doente ao
tossir, espirrar ou falar em voz alta.
- A transmissão tuberculose é caracterizada
pela inalação de gotículas de aerossóis
contendo a Mycobacterium tuberculosis
(transmissão direta)
- O indivíduo portador da tuberculose ativa
(bacilífero) é o vetor da transmissão da
Mycobacterium tuberculosis, assim ao
tossir ou espirar promove a saída de
gotículas com bacilos da micobactéria, as
quais são disseminadas no meio
atmosférico para uma possível
contaminação de um novo hospedeiro pela
aspiração com chegada na Mycobacterium
tuberculosis nas estruturas pulmonares
Um portador de tuberculose sintomático
respiratório, é aquele, que durante a estratégia
programática de busca ativa, apresenta tosse por
3 semanas ou mais. Esse paciente deve ser
investigado para tuberculose através de exames
bacteriológicos.
Diagnóstico
Para o diagnóstico da tuberculose são utilizados,
principalmente, os seguintes exames:
- Exame microscópico direto (baciloscopia
direta);
- Cultura para micobactéria com
identificação de espécie;
- Teste de sensibilidade antimicrobiana;
- Teste rápido para tuberculose (TR-TB).
Para efetuar os testes diagnósticos de
tuberculose, a amostra utilizada é o escarro, o
qual deve ser colhido no atendimento e na
manhã do dia seguinte (2 amostras) na UBS
(preferencialmente).
Orientações para coleta de escarro 1ª e 2ª
amostras (Observação: jejum obrigatório
somente para a 2ª amostra)
1. Lave a boca fazendo bochechos com bastante
água.
2. Abra o frasco fornecido pelo laboratório;
3. Force a tosse, do seguinte modo:
a) Inspire profundamente, isto é, puxe o ar pelo
nariz e fique com a boca fechada; prenda a
respiração por alguns instantes e solte o ar
lentamente pela boca. Faça isso mais 2 vezes;
b) inspire profundamente mais 1 vez, prenda a
respiração por alguns instantes e solte o ar com
força e rapidamente pela boca;
c) inspire profundamente mais 1 vez, prenda a
respiração por alguns instantes e, em seguida,
force a tosse para poder liberar o escarro que
está dentro do pulmão;
4. Escarre diretamente dentro do frasco.
CUIDADO para o escarro não escorrer por fora
5. Repita as orientações 3 e 4 por mais duas
vezes, até conseguir uma quantidade maior de
amostra;
6. Feche firmemente, proteja da luz solar e
entregue o frasco ao laboratório.
Microscopia direta
- A baciloscopia é um exame microscópico
com pesquisa de bacilos álcool-ácido
resistentes (BAAR) em esfregaços da
amostra, preparados e corados com
metodologia padronizada.
- A baciloscopia direta do escarro ou exame
direto, é um dos métodos de análise no
diagnóstico e também controle de
tratamento da tuberculose pulmonar por
permitir a descoberta das fontes de
infecção, ou seja, os casos bacilíferos.
Trata-se de um método simples, rápido e
de baixo custo para elucidação diagnóstica
da tuberculose, uma vez que permite a
confirmaçãoda presença do bacilo.
- Em virtude de seu elevado conteúdo
lipídico, a parede celular das
micobactérias têm a capacidade singular
de fixar o corante fucsina, que, assim, não
é removido pelo álcool-ácido.
- O método Ziehl-Neelsen, uma das mais
utilizadas para pesquisa de bacilos,
baseia-se na coloração pela fucsina básica
que confere aos BAAR uma cor
avermelhada após lavagem por
álcool-ácido. Nesse método a amostra
primeiramente é corada com fucsina, em
seguida lavada com o álcool-ácido e,
posteriormente, corada com o corante azul
de metileno. A parede celular dos bacilos,
formada principalmente por lipídeos, não
permitirá a descoloração por álcool-ácido,
sendo assim os bacilos permanecerão
corados em rosa.
- A sensibilidade média da baciloscopia
direta é de aproximadamente 50% a 60%,
na dependência da qualidade da amostra,
da técnica de coloração e da experiência
do profissional. Quanto ao valor preditivo
positivo da baciloscopia positiva no
escarro espontâneo, um estudo realizado
no município do Rio de Janeiro
evidenciou um valor de 98,4% para o
diagnóstico de tuberculose.
Exame Micobacteriológico Cultural
- A cultura permite a identificação da
bactéria e necessita de menor número de
bacilos na amostra examinada para ser
considerada positiva. Além de identificar a
espécie da micobactéria, permite, também,
testar sua sensibilidade aos
quimioterápicos, mas requer maior
sofisticação laboratorial que a
baciloscopia e, pelo menos, 40 dias para o
resultado. O micobacteriológico cultural
permite a identificação do microrganismo
e a realização do teste de sensibilidade,
além de aumentar o rendimento
diagnóstico em 20-40%; os meios sólidos
mais recomendados são o
Lowenstein-Jensen e o Ogawa-Kudoh.
Esse último é recomendado para a
utilização nos laboratórios de menor
complexidade porque não requer o uso de
centrífuga.
- A cultura em meio sólido tem como
limitação o tempo do resultado que pode
levar de 2 a 8 semanas, por isso, quando
possível, deve ser utilizado o meio líquido
através de sistemas automatizados não
radiométrico; os resultados nesse caso
saem no prazo de 10 a 40 dias.
Biologia Molecular
- Os testes para ampliar os ácidos nucléicos,
são avaliações rápidas, com especificidade
e sensibilidade alta. Entre os métodos
mais empregados, está a Reação em
cadeia da Polimerase (PCR), técnica
aplicada diretamente na amostra biológica,
escarro ou em colônia suspeita. Essas
técnicas moleculares surgiram com a
intenção de fornecer ao médico um
resultado mais rápido e preciso; são testes
de detecção rápida, que permitem uma
resposta em 24 a 48 horas. Existem
diversos kits comercializados, sendo que
cada um deles utiliza-se de um método
diferente para amplificar regiões
específicas do DNA.
Teste tuberculínico (prova tuberculínica ou reação
de Mantoux)
- A prova tuberculínica consiste na
inoculação via intradérmica da tuberculina
no terço médio da face anterior do
antebraço esquerdo, na dose de 0,1 ml. A
leitura da prova tuberculínica é realizada
de 48 a 72 horas após a aplicação,
podendo este prazo ser estendido para 96
horas, caso o paciente falte à consulta.
- O teste tuberculínico é iniciado com a
inoculação intradérmica do antígeno
tuberculínico (PPD-Rt23, um derivado
proteico do Mycobacterium tuberculosis).
Os pacientes já sensibilizados pela
tuberculina geram uma reação
inflamatória formando um nódulo na
derme, a qual é medida pelo examinador
para o diagnóstico na leitura do teste.
- A prova ou reação tuberculínica: também
conhecida como PPD (Purified Protein
Derivative - derivado purificado de fração
protéica antigênica do bacilo) é uma
reação intradérmica que apenas verifica se
o indivíduo teve ou não contato com o
bacilo.
Leitura
O maior diâmetro transverso da área de
endurecimento palpável deve ser medido com
régua milimetrada, e o resultado registrado em
milímetros.
- Falso-positivo: vacina BCG,
micobactérias não TB
- Falso-negativo: imunodeprimidos,
gestação.
Está extinta a classificação:
- 0-4 mm: não reativo (não infectado)
- 5-9 mm: reativo fraco (Infectado, ou
BCG, TB ativa em HIV+)
- ≥ 10 mm: reativo forte (TB ativa, ou
BCG recente)
- Possui baixa especificidade, pois existe
grande chance das populações que foram
vacinadas contra o Bacillus
Calmette-Guerin (BCG) apresentarem
reação na pele. Além de demonstrar
também baixa sensibilidade em indivíduos
imunologicamente debilitados.
A Prova Tuberculínica se tornará positiva
aproximadamente 3 a 12 semanas após a
infecção tuberculosa.
IGRA (INTERFERON GAMMA RELEASE
ASSAY)
- Mede a reatividade imunológica de uma
pessoa ao Mycobacterium tuberculosis. As
células brancas do sangue da maioria das
pessoas que foram infectadas com M.
tuberculosis liberam interferon-gama
(IFN-g) quando misturados com antígenos
(substâncias que podem produzir uma
resposta imune) derivados de M.
tuberculosis.
- Amostras de sangue fresco são misturadas
com antígenos e controles.
Características
- Requer uma única visita do paciente
para realizar o teste.
- Os resultados podem estar disponíveis
em 24 horas.
- Não aumenta as respostas medidas por
testes subsequentes.
- A vacinação prévia com BCG não
causa um resultado falso positivo do
teste IGRA.
Letícia Terruel