Imunologia: Sistema Imune e Testes Sorológicos

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Imun�l�gia
Estudo dos mecanismos usados para defesa
contra microrganismos patogênicos ou
substâncias exógenas.
Imunidade = resistência a infecções
Células, tecidos e moléculas que medem
resistência =sistema imune.
➔ Funções do Sistema Imune
Não responder a estruturas próprias;
Reconhecer estruturas potencialmente agressoras;
Tipos de respostas.
➔ Resposta Inata
Não é específica;
Início imediato;
Proteção inicial contra infecções;
Presente em indivíduos saudáveis ao nascer;
Proteção contra partículas exógenas;
Não possui memória.
Componentes: barreiras naturais (físicas, químicas e
biológicas), *resposta inflamatória*, fagocitos e
fatores
humorais.
➔ Resposta Adaptativa, adquirida ou
específica
Mais Efetiva;
Início tardio;
suplementa a proteção dada pela imunidade natural;
Imunidade celular: defesa intracelular e linfócitos
T e B;
(não produz anticorpo e sim célula de memória)
Imunidade Humoral: defesa extracelular e
anticorpos.
Anticorpo é a melhor célula de memória, resposta
adquirida
traz anticorpo.
Para que o anticorpo reconheça a estrutura
específica EPÍTOPO do antígeno.
O corpo não reconhece a bactéria por inteira, só tem
duas coisas totalmente diferentes que é o EPITOPO
e ANTIGÊNICA e por isso tem a produção de
anticorpo.
´´CHAVE FECHADURA``
ANTICORPO NÃO MATA A BACTÉRIA E SIM
NEUTRALIZA.
AGRESSOR—---- RESPOSTA INATA—----
RESPOSTA ADQUIRIDA —--- IDENTIFICAR A
ESTRUTURA (EPITOPO) —---- ANTICORPO.
* quanto mais específico for meu anticorpo e meu
antígeno= + certeiro
* Quanto menos específico for meu anticorpo e meu
antígeno= + possibilidade de FALSO POSITIVO.
*KIT SENSÍVEL= consegue analisar TUDO.
*KIT ESPECÍFICO= análisa algo específico.
➔ Importância dos Testes Sorológicos na
Patologia Clínica
Grande desenvolvimento dos testes sorológicos,
diagnóstico de certeza, demonstração do patógeno
ou identificação dos seus produtos nos tecidos ou
fluidos do hospedeiro.
➔ Problemas encontrados
Ausência do agente, falha na técnica, falta de
sensibilidades dos métodos (direto ou indireto),
longos períodos de análises.
➔ Métodos Imunológicos
São amplamente empregados, suprem as falhas dos
métodos parasitológicos ou microbiológico,
pesquisam antígenos, anticorpos ou
imunocomplexo, rápidos, simples execução,
possibilidade de automação, baixo custo operacional.
➔ Testes sorológicos aplicados em
Laboratórios de Analises clinicas
Especificidade, aumento de resultados
falso-negativo, população doente, considerar as
fases pré-analítico, analítico e pós analítico.
➔ Testes sorológicos em Banco de Sangue
Sensibilidade, aumento de falso positivo, população
não doente e considerar reduzir o risco transfusional.
➔ Testes Imunológicos
Amostras biológicas
Tipos: diretos e indiretos
Uso: diagnóstico de doenças infecciosas e de suas
fases; diagnósticos de doenças relacionadas a
alteração na resposta imune (alergias, doenças
autoimunes e imunodeficiência), seleção de
doadores de sangue e órgão, acompanhamento
terapêutico e avaliação de prognóstico, avaliação da
imunização e imunohistoquímica.
➔ Classes de Imunoglobulinas (Ig)
IgM- Resposta Imune Primária AGUDA
IgG- Imunidade; Capazes de atravessar placenta
CRÔNICA. Anticorpo de memória.
IgA- Presente em Mucosas e Secreções/ Leite
Materno.
IgE- Ligam-se a Alérgenos
IgD- Associadas aos Linfócitos B
*Exemplo: Indivíduo que tem alergia a proteína do
leite e fica cheio de bolinha no corpo (queixa de
manifestação de alergia IgE).
*Constante é a região que se repete
*Variável muda conforme o antígeno
EPITOPO= Estrutura específica de cada antígeno
Antígeno se encaixa no anticorpo.
Diferença de antígeno e anticorpo
Antígeno: Toda substância estranha ao organismo,
desencadeia resposta imune. Bactéria, vírus,
helmintos, toxinas.
Anticorpo: São produzidos pelo corpo,
neutralizando o antígeno. ´´Y`` , Linfócitos B.
➔ Interação Antígeno- Anticorpo IN VITRO
Ocorre devido ao perfeito encaixe espacial entre duas
moléculas, lembrando a ideia de chave-
fechadura.
*Pode ocorrer falso positivo (quando o epitopo se
liga a outra estrutura parecida).
➔ Interação antígeno- anticorpo
-Chave- fechadura
-dependente de 4 tipos de forças não covalentes;
-pode ocorrer dissociação.
➔ Interação Ag-Ac in vitro
-Usada para padronização testes imunológicos
utilizados para diagnóstico laboratorial
-Interferentes: concentração de AC e AG, classe
dos acs envolvidos, pureza dos antígenos
utilizados, características da reação pH do meio,
temperatura e tempo.
*Excesso de anticorpo pode dar reação a falso
negativo.
➔ Reações Cruzadas
Capacidade de um anticorpo reagir com mais de
um antígeno diferente
-epitopos semelhantes estruturalmente
-Antígenos diferentes possuem o mesmo epítopo.
➔ Especificidade
Capacidade de um sítio combinatório do
Anticorpo reagir com apenas um determinante
antigênico- grau de complementaridade.
-alto grau- reações normais
-baixo grau- REAÇÕES CRUZADAS
● um kit mais sensível pode dar reação
cruzada
● + especificidade - reações cruzadas
➔ Afinidade
Força resultante da soma das ligações não-
covalentes entre um único sítio de ligação do
anticorpo e um único epítopo do antígeno.
-Anticorpo baixa a finalidade- dissociação
-Anticorpo alta finalidade- ligação duradoura.
➔ Avidez
Força resultante de interações múltiplas entre uma
molécula de anticorpo e os epitopos de um
antígeno complexo.
-maior avidez- melhor efeito biológico final
-baixa afinidade compensa por alta avidez.
➔ Reações Inespecíficas
-Ligação a anticorpos naturais a substâncias
metabólicas circulates
-Acontece em qualquer amostra
-Anticorpos inespecíficos ou naturais devem ser
considerados na padronização dos testes
imunológicos- amostras- controle de indivíduos
supostamente sadios.
➔ Título
Diluição máxima na qual um teste, em que a
amostra sofre diluição seriada, apresenta-se
reagente (reação positiva).
➔ Teste padrão-ouro
Teste de referência utilizado o diagnóstico
diferencial ou confirmatório de uma determinada
doença
-Também é utilizado para verificar se uma
metodologia recentemente padronizada é
confiável
-Gold standard.
➔ Testes Imunológicos
-Detectam a presença ou não de antígeno e
anticorpo
-Resultados imunológicos devem ser associados
dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais
para determinação do diagnóstico
-Amostragem- seleção de população: doentes, não
doentes e residentes de áreas endêmicas.
➔ Parâmetros sorológicos
Validade intrínseca: desempenho de um teste em
relação ao teste de referência
- sensibilidade= a/(a+c)
- especificidade= d/(b+d)
- eficiência= a+d/(a+b+c+d)
- prevalência= a+c/(a+b+c+d)
- valor preditivo positivo= a/(a+b+c+d)
- valor preditivo negativo= d/(a+b+c+d)
➔ Utilização dos testes sorológicos
A maior ou menor sensibilidade e especificidade
de um teste sorológico depende de qual a sua
finalidade
Para Diagnóstico: é necessário a utilização de
testes mais específicos. Nestes casos, é importante
que sejam evitados testes falsos positivos.
Para triagem em banco de sangue: os testes são
usados com fins preventivos, ou seja, a função é
prevenir a contaminação do receptor, buscando
evitar os testes falso negativo.
-Validade Extrínseca: real situação da população +
desempenho do teste
Precisão: determina se existe concordância entre
os resultados obtidos
Acurácia ou exatidão: capacidade do teste de
fornecer resultados próximos ao verdadeiro valor
que se está medindo.
➔ Limiar de reatividade (CUT OFF)
Valor a partir do qual o resultado é considerado
reagente
Observação: não existe teste sorológico que
estabeleça claramente o que é um resultado
positivo e um negativo, sempre existem amostras
cujos resultados são inconclusivos.
➔ Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos que surgem a partir de um único
clone de linfócitos B são homogêneos e
denominados MONOCLONAIS.
➔ Anticorpos Policlonais
Anticorpos policlonais que surgem em resposta a
um antígeno são provenientes de vários clones de
células B, que se diferenciam em plasmócitos, e
secretam anticorpos capazes de reagir a diferentes
epítopos do antígeno.
➔ Amostras utilizadas em Imunoensaios
A validaçãodos testes de imunoensaios: o quanto
o teste, em termos quantitativos, é útil para um
diagnóstico.
É realizada com base dos parâmetros de
sensibilidade, especificidade, repetitividade,
reprodutibilidade e estabilidade
Atendendo a esses critérios: uso comercial
Brasil ANVISA e INMETRO.
➢ Paciente
Preparo e instruções ao paciente
Questões investigadas SEM CONTROLE
laboratorial: idade, sexo, etnia, gravidez, clico
mestrual e uso de medicamentos.
➢ Jejum
Sem grandes alterações para os testes de
imunoensaios
Lipídios em excesso: alteração nos testes de
precipitação e aglutinação.
➢ Gravidez
Podem ocorrer resultados falso positivo por conta
de hipotiroidismo na gestação pe a doença
autoimune tireoidiana
Imunidade passiva.
➢ Idade
Diferentes valores de referência de acordo com a
idade. Hormônios, proteínas, metabolismo
bioquímico e dosagem de anticorpos.
➢ Coleta de sangue
Padronizado por protocolos internacionais, evitar
muito tempo de garroteamento, evitar hemólise,
evitar recoleta, seguir procedimento apropriado e
material sempre limpo.
➢ Amostras: soro ou plasma
O soro é obtido após a coleta, coagulação da
amostra e posterior centrifugação, sendo que
nenhum anticoagulante é utilizado. O objetivo é
que haja a formação de coágulo, e nesse processo
os fatores da coagulação, plaquetas e fibrinogênio
são consumidos.
-Transporte
-Armazenamento -20°C
-Sempre em tubo secundário.
➢ Urina
Pesquisa de Anticorpo anti receptores químicos
LÍQUIDO CEFALORRAQUIDIANO LCR
Pesquisa a antígenos bacterianos, virais e
parasitários
Pesquisa de Anticorpo.
➢ Líquido amniótico
Pesquisa de agentes patogênicos
Após 16 semanas de gestação.
➢ Fezes
Pesquisa de antígenos
➢ Sêmen
Anticorpos antiespermatozoides
3 dias de abstinência sexual
Analisar o material em até 2 horas.
➔ Imunodiagnóstico
Técnicas não marcadas
Analise
Qualitativos: indica a presença ou ausência
Quantitativos: indica a presença ou ausencia e
determina a quantidade.
-Presença de um antígeno ou anticorpo=
REAGENTE.
-Ausência do antígeno ou anticorpo= NÃO
REAGENTE.
Marcados: ag+ac conjugado
Não marcados: ag+ac latex
➢ Ensaios NÃO MARCADOS
São ensaios onde a ligação antígeno/anticorpo é
visualizada sem o auxílio de marcadores. A
ligação antígeno e anticorpo é detectada
macroscópicamente podendo, em alguns casos,
ser auxiliada pelo microscópio óptico.
- Principais técnicas imunes não marcadas
são:
1. Imunoprecipitação(imunodifusão radial
simples e dupla)
2. Aglutinação
3. Ensaio líticos|(fixação de complemento) .
➢ Reação de imunoprecipitação
Curva de precipitação
AC
livre
+ - -
AG
livre
- - +
Zona de
excesso
de
anticorpo
Zona de
equivalência
Zona de
excesso
de
antígen
o
Efeito pré zona: Maior quantidade de
anticorpo com relação ao antígeno;
Zona de equivalência: Equilíbrio entre
quantidade de anticorpo e antígeno;
Efeito pós zona: Maior quantidade de
antígeno com relação ao anticorpo.
➢ Reação de imunoprecipitação
Técnicas de precipitação são baseadas na
quantificação de precipitados formados
pela reação antígeno anticorpo.
Imunodifusão: difusão de substâncias solúveis
por movimentos moleculares em meio gelificado.
Baseia-se na difusão solúvel por movimentos
moleculares em meio gelificado com ágar ou gel
de agarose em lâmina de vidro ou placa de petri.
Difusão radial simples: um dos componentes ag
ou ac está fixado ao gel enquanto o outro migra
até a formação do imunocomplexo.
Difusão radial dupla: os dois elementos migrar
juntos em direção um ao outro.
-Vantagem e desvantagem: é um método
semiquantitativo de baixa sensibilidade e requer o
uso de extratos antigênicos com concentrações
elevadas de ordem de mg/Dl
É um método barato e com necessidade de
extratos brutos de antígenos.
Nefelometria e turbidimetria
70° nefelometria
0° turbidimetria
A ligação ag e ac dispensa a luz
Vantagem: rápida, sensibilidade adequada
Desvantagem: alto custo.
Aglutinação: formação de agregados visíveis
provocados pela ligação de um anticorpo
específico para um determinado antígeno em
diferentes superfícies.
Direta: ag faz naturalmente na superfície
Indireta: ag absorvido a superfície (latex).
*olhar slide 15*
Hemaglutinação Passiva: são utilizadas
hemácias de aves e de mamíferos quimicamente
tratadas. As hemácias de aves são mais utilizadas
por serem nucleadas reduzindo assim, o tempo do
teste e acaba sedimentando mais rápido.
Negativo é quando as hemácias sedimentam
formando um botão.
O último positivo antes do negativo é o equilíbrio.
Teste de floculação: é uma variação de técnica de
aglutinação indireta. Ocorre quando a interação
direta do ac específico com o ag leva a formação
de imunocomplexos em meio líquido, detectadas
com auxílio de lupa ou microscopia óptica.
A técnica é o fundamento do VDRL que utiliza
uma suspensão alcoólica de cardiolipina, cristais
de colesterol e lecitina preparada em salina
tamponada.
Sífilis diagnóstica: VDRL: teste de floculação
composto de cardiolipina, colesterol e lecitina.
➔ Ensaios imunológicos MARCADOS
Ligação entre ag e ac mas esses devem estar
marcados com enzimas, corantes fluorescentes,
isótopos radioativos, entre outros tipos de
marcadores.
A marcação de um ag ou de um ac resulta na
formação de um conjugado.
Qualitativas e muita das vezes quantitativas
Ag ou ac em amostras biológicas.
Reagente marcado: marcação não modifica
interação de Ag-Ac, alto custo, detecção de
classes específicas de Ac para um determinado
Ag, tipo de marcados determina nome de teste
MARCADOR:
-Radioisótopo- radioimunoensaip
-Fluorocromo- Imunofluorescência
-Enzima- ELISA, western blot e imuno
histoquímica.
Conjugado
Fluorocromo- reação de imunofluorescência
Enzima- reação imunoenzimática.
Imunofluorescência: Fluorocromos são
moléculas que absorvem luz em um determinado
comprimento de onda baixa emitem luz conhecida
como fluorescência.
Imunofluorescência direta (IFD): o antígeno
está aderido a fase sólida ( lâmina). O Ag
normalmente se encontra na superfície celular de
células e de microrganismos.
Imunofluorescência indireta (IFI): O anticorpo
conjugado vai reconhecer outro anticorpo como
um antígeno. Feito em tecido, pesquisa de Ag e
marcadores tumorais.
Imunofluorescência: é utilizada na pesquisa de
anticorpos contra patógenos infecciosos como
causadores da sífilis, toxoplasmose,
citomegalovírus, vírus da herpes, rubéola, doença
de chagas e doenças autoimunes.
Imunofluorescência direta,a indireta é mais
sensível e específica.
Desvantagem: custo
vantagem: específica e reprodutível.
Citometria de fluxo: diferentes emissões de
fluorescia e cada um deles emite uma vibração.
De acordo com o tamanho, formato do Ag já
manda mensagem para o computador e traduz em
números para quantificar.
Imunocromatografia: princípio de teste rápido,
tem a membrana sensibilizada com o Ag ou Ac e
coloca a amostra do paciente e em seguida tem o
Ac marcado.
Ag: teste de gravidez
Ac: anti hiv, anti hcv.
Imunoistoquímica (?)
➔ Ensaios Luminescentes
Reação de imunoperoxidase ou
imunoenzimática
O Ac que vai detectar o Ag está marcado. No
entanto, nessa reação o Ac não está conjugado
com um fluoróforo mas sim com uma enzima e
por isso também é chamada de imunoenzimática.
Técnicas Enzimáticas: o Ac marcado com
enzima- conjugado.
ELISA: utilizado para identificar e quantificar Ag
ou Ac marcados com uma enzima ou outra
molécula que produza um sinal visível. Seu uso é
bastante útil para detectar patógenos,
medicamentos, hormônios, marcadores tumorais,
alérgenos, entre outros, também pode detectar AC
produzidos contra agentes infecciosos como vírus,
bactéria, protozoa e fungos.
Elisa direito ou Sanduíche: é uma técnica
utilizada para detecção de ANTÍGENO
Poço coberto de ac - adiciona o ag - lavagem-
adiciona o conjugado enigmático- lavagem-
adiciona o substrato e mede a cor.
Elisa direto de competição: neste tipo de elisa o
antígeno alvo compete pelo sítio de ligação do
anticorpo.
placa de elisa revestida com ac específico- adição
de ag teste, adição de ag marcado.competição para
ligar AC- lavagem - quanto maior a quantidade de
ag teste, menora possibilidade de ligação do ag
marcado e assim menor a intensidade de cor.
Elisa indireto: é uma técnica utilizada para
detecção de ANTICORPO.
Poço coberto com Ag- adiciona Ac específico-
lavagem- adiciona conjugado enzimático-
lavagem- adiciona o substrato mede a cor.
➔ Interpretação dos resultados
Espectrofotômetro
No ELISA, o resultado de uma reação é definido
pela leitura da ABS ou densidade óptica em
espectrofotômetro.
Princípio da técnica: medida de abs ou
transmissão de luz. A abs de luz depende
basicamente da concentração das moléculas.
Determinação do CUT OFF
Usualmente cada conjugado tem sua forma de
calcular o cut off, acima ou abaixo do qual as
amostras são consideradas reagentes, não
reagentes ou indeterminadas.
dot- ELISA
Elisa em membrana de nitrocelulose, pode ser
utilizado como método quantitativo quando se
deseja verificar a concentração do antígeno ou
ainda qualitativo separando amostras em positiva
ou negativa.
Western Blotting
Método utilizado para imunodetecção de
proteínas após a separação destas por eletroforese
em gel e transferência para membrana adsorvente.
Permite detectar, caracterizar, e semi-quantificar
múltiplas proteínas, principalmente aquelas que
estão em baixas quantidades na amostra.
MÉTODO UTILIZADO PARA A
CONFIRMAÇÃO DE HIV ( que tem 5, 6
proteínas específicas)
Feito em gelatina, a amostra do paciente é uma
PROTEÍNA e a carga se desloca para o gel.