EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO

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INSTITUTO DE ZOOTECNIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO 
BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH 
 
 
 
 
 
Vinicius Antonio Pelissari Poncio 
 
 
 
 
Nova Odessa 
Fevereiro – 2012 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO 
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO 
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS 
INSTITUTO DE ZOOTECNIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL 
 
 
 
 
EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO 
BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH 
 
Vinicius Antonio Pelissari Poncio 
Keila Maria Roncato Duarte 
Rafael Herrera Alvarez 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nova Odessa 
Fevereiro, 2012 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, 
como parte dos requisitos para obtenção do título 
de Mestre em Produção Animal Sustentável. 
ii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ficha elaborada pelo 
Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia 
Bibliotecária responsável – Ana Paula dos Santos Galletta - CRB8/7166 
 
 
 
 Poncio, Vinicius Antonio Pelissari 
P795e Eficiência de dois protocolos de Iatf utilizando benzoato de 
estradiol ou GnRH. / Vinicius Antonio Pelissari Poncio. Nova 
Odessa - SP, 2012. 
 56p. : il. 
 
 Dissertação (Mestrado) - Instituto de Zootecnia. 
APTA/SAA. 
 Orientador: Prof. Dra. Keila Maria Roncato Duarte. 
 
1. Bovinos - Inseminação artificial. 2. Fêmeas 
sincronizadas. 3. Estradiol. I. Duarte, Keila Maria Roncato. 
II. Título. 
 
CDD 636.20824 
 
 
 
 
iii 
 
 
GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO 
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO 
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS 
INSTITUTO DE ZOOTECNIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL 
 
 
Certificado de aprovação 
 
EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO 
BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH 
 
Vinicius Antonio Pelissari Poncio 
Orientadora: Keila Maria Roncato Duarte 
Co-orientador: Rafael Herrera Alvarez 
 
 
Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em 
produção Animal sustentável, pela Comissão Examinadora: 
 
Profa.Dra. Keila Maria Roncato Duarte 
Instituto de Zootecnia – APTA/SAA 
 
Dr. Fabio Morato Monteiro 
Instituto de Zootecnia – APTA/SAA 
 
Dr. Daniel Jesus Cardoso de Oliveira 
Polo de Andradina– APTA/SAA 
 
 
Data da realização: 08 de fevereiro de 2012 
Presidente da Comissão Examinadora 
Profa.Dra. Keila Maria Roncato Duarte 
 
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Dedicatória 
A minha esposa Camila, pelo seu amor, companheirismo e dedicação, 
sempre vibrando por todas minhas conquistas. 
Aos meus familiares, pela ajuda no decorrer deste percurso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Agradecimentos 
 
Ao Instituto de Zootecnia por oferecer o curso, e aos Docentes e 
Funcionários da Pós-Graduação. 
A minha orientadora Dra. Keila Maria Roncato Duarte pela dedicação, 
comprometimento, paciência e companheirismo. 
Ao meu co-orientador Dr. Rafael Herrera Alvarez pelo experimento e 
apoio técnico do meu trabalho. 
As Bancas de Qualificação e Defesa pelas correções e sugestões que 
enriqueceram meu trabalho. 
Aos colegas de curso em especial ao Alfredo por todos bons momentos 
vividos nesses anos todos. 
A todos os estagiários e funcionários do laboratório. 
 Em fim a todos que de alguma forma colaborou para o termino de mais 
uma fase da minha vida. 
 
Muito Obrigado. 
 
 
 
vi 
 
Sumário 
 
SUMÁRIO ......................................................................................................... vi 
LISTA DE FIGURAS .................................. ..................................................... viii 
LISTA DE TABELAS .................................. ...................................................... ix 
EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO BE NZOATO 
DE ESTRADIOL OU GNRH .............................. ................................................. x 
RESUMO............................................................................................................ x 
PERFORMANCE OF TWO FTAI PROTOCOLS USING OESTRADIOL 
BENZOATE OR GNRH .................................. ................................................... xi 
ABSTRACT .......................................... ............................................................. xi 
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ................. ................................... 1 
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1 
2. REVISÃO DE LITERATURA .......................... ............................................... 6 
2.1. FISIOLOGIA DO CICLO ESTRAL EM BOVINO ......... ............................ 6 
2.1.1. HORMÔNIOS ENVOLVIDOS NO CICLO ESTRAL ....... ................... 7 
2.2. INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL ....................... .......................................... 11 
2.3. INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO (IATF) .. ...................... 12 
2.3.1. PROTOCOLOS DE IATF ......................... ....................................... 13 
2.3.1.1. PROTOCOLO UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL ... 14 
2.3.1.2. PROTOCOLO OVSYNCH ........................................................ 15 
2.3.1.3. PROTOCOLO CO-SYNCH 7 DIA ................. ........................... 16 
2.3.1.4. PROTOCOLO CO-SYNCH 5 DIA ................. ........................... 18 
vii 
 
2.4. QUALIDADE DOS PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL ...... ................. 19 
2.4.1. SUSTENTABILIDADE E MERCADO IMPORTADOR DA CAR NE 
BRASILEIRA ........................................ ..................................................... 21 
2.4.2. RESÍDUO DE AGENTE ANABÓLICO ................ ............................ 24 
2.4.3. MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE RESÍDUOS DE 
ANABOLIZANTES ..................................... ............................................... 25 
3. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 27 
CAPÍTULO 2 – EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO 
BENZOATO DE ESTRADIOL OU GNRH ..................... ................................... 32 
RESUMO.......................................................................................................... 32 
PERFORMANCE OF TWO FTAI PROTOCOLS USING OESTRADIOL 
BENZOATE OR GNRH .................................. .................................................. 33 
ABSTRACT .......................................... ............................................................ 33 
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 34 
2. MATERIAL E MÉTODOS ............................. ............................................... 37 
2.1. LOCAL E ANIMAIS .............................. ................................................. 37 
2.2. TRATAMENTOS .................................. .................................................. 38 
2.3. VARIÁVEIS ANALISADAS ......................... .......................................... 39 
2.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................... ............................................. 40 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................... .......................................... 41 
3.1. ANÁLISE DOS RESULTADOS ....................... ...................................... 46 
3.2. ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................... ............................................. 49 
4. CONCLUSÃO ...................................... ........................................................ 51 
5. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 52 
viii 
 
Lista de FigurasFigura 1 
 
 
Controle hormonal do ciclo estral de fêmeas pelo eixo hipotálamo-hipófise-
ovários. FSH: hormônio folículo estimulante; GnRH: hormônio liberador de 
gonadotrofinas; LH: hormônio luteinizante (DIB et al, 2008). 8 
 Figura 2 
 
 
Representação esquemática das variações, na concentração dos principais 
hormônios que regulam o ciclo estral em bovinos (CNPGC EMBRAPA, 
2011) 10 
 Figura 3 Protocolo de IATF utilizando Benzoato de Estradiol (Arquivo Pessoal). 14 
 Figura 4 Protocolo Ovsynch utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 15 
 Figura 5 Protocolo Co-synch 7 dias utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 17 
 Figura 6 Protocolo Co-synch 5 dias utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 18 
 Figura 7 
 
Protocolo de IATF com Benzoato de Estradiol utilizado no experimento 
(arquivo pessoal). 38 
 Figura 8 Protocolo de IATF com GnRH utilizado no experimento (arquivo pessoal). 39 
 Figura 9 Taxa de Concepção dos Grupos Estudados. 46 
 Figura 10 Comparação da Manifestação do Estro com a Taxa de Concepção. 47 
 Figura 11 
 
Presença do CL no Inicio do Protocolo, Manifestação do Estro e Taxa de 
Concepção 48 
 
 
 
 
ix 
 
Lista de Tabelas 
 
Tabela 1 Resultados observados no grupo 1 (Benzoato de Estradiol) 42 
 Tabela 2 Resultados observados no grupo 2 (GnRH) 42 
 Tabela 3 
 
 
Comparação da Taxa de Concepção com os animais que apresentaram 
corpo lúteo (CL) e Estro. BE - tratamento com benzoato de estradiol e 
GnRh - Hormônimo estimulante de gonadotrofina 46 
 Tabela 4 Frequência Observada para o Teste Qui-quadrado 49 
 Tabela 5 Frequência Esperada para o Teste Qui-quadrado 49 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
x 
 
EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO 
BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH 
Resumo 
A inseminação Artificial (IA) tornou-se uma das principais biotecnologias 
reprodutivas de impacto econômico na produção de bovinos, aumentando a 
produção de carne e leite por hectare. O emprego de alguns fármacos 
disponíveis no mercado possibilitou essa biotecnologia, sem o 
comprometimento na fertilidade do estro induzido. Assim, inúmeros protocolos 
hormonais vêm sendo desenvolvidos para realização da inseminação artificial 
em tempo pré-determinado, ou seja, em tempo fixo com taxas de concepção 
aceitáveis. O emprego de alguns fármacos, dentre eles o Benzoato de 
Estradiol, disponíveis no mercado possibilitou essa biotecnologia, sem o 
comprometimento na fertilidade do estro induzido. A União Européia pela 
Diretiva 2003/74/CE, proibiram o uso de estradiol e seus derivados para a 
finalidade de sincronização do cio em animais de produção. Neste trabalho, 
foram utilizadas 70 novilhas e 20 vacasda raça nelore divididas aleatoriamente 
em dois grupos utilizando dois protocolos de Inseminação Artificial em tempo 
fixo (IATF), um com Benzoato de Estradiol e outro com gonadorelina, o GnRH 
(Hormônio Liberador de Gonadotrofina). Os animais, após a IATF, foram 
avaliados quanto a presença de Corpo Lúteo, estro, taxa de concepção e em 
ambos protocolos os resultados foram semelhantes e sem diferença 
significativa, com a taxa de concepção (prenhez no primeiro serviço) em 32% 
nas novilhas e 50% nas vacas, sem diferença significativa em teste de chi- 
quadrado a 5 %, com ambos os protocolos de IATF. Estes resultados, do ponto 
de vista econômico visando o mercado europeu, são bastante vantajosos, uma 
vez que a Comunidade Européia está restringindo a importação de carnes e 
co-produtos que tenham utilizado estradiol na sua produção. 
Palavras – chave: IATF, estradiol, União Européia, GnRH 
 
 
xi 
 
PERFORMANCE OF TWO FTAI PROTOCOLS USING 
OESTRADIOL BENZOATE OR GNRH 
Abstract 
Artificial Insemination (AI) became one of the major biotechnologies with 
economic impact over the livestock production (cattle and dairy).The use of 
some products enables such technology, without compromising fertility of 
induced estrus. In this way, several hormonal protocols are being developed to 
perform the AI in a pre-determined period of time, at a fixed time with 
conception rates acceptable. The use of some products, among them oestradiol 
benzoate, a common product in the veterinary field, enabled this technology, 
without compromises the induced estrus fertility. Therefore, European Union, 
throughout Directive 2003/74/CE forbids the use of oestradiol and its derivates 
products to aim the estrus synchronization in livestock animals, mainly bovine. 
In this work 70 heifers and 20 cows, all Nellore, randomly divided into two 
groups were submitted to two Artificial insemination at Fixed Time (AIFT), one 
group using oestradiol benzoate and another using gonadoreline- the GnRH 
(Gonadotrofine Hormone inducer). After AIFT, animals were evaluated for 
presence of Luteous Body, heat, conception rate and for both protocols, results 
were similar, with no significant differences, presenting a conception rate ( 
pregnancy at the first service) of 32 % for heifers and 50% for cows, with no 
significant difference on the chi-squared test at 5 %. Such results present an 
advantage looking at the economic point of view, aiming the European market, 
once the European Community is restricting importation of meat and co-
products which had used oestradiol during its production. 
Key-words: Key-words: European Union, FTAI, GnRH, oestradiol 
 
 
 
 
1 
 
 
 
 
 
 
 
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS 
 
1. INTRODUÇÃO 
O rebanho nacional de bovinos em 2010 chegou a 209,5 milhões de 
cabeças, um aumento de 2,1% em relação a 2009, com maiores concentrações 
no Centro-Oeste, Norte e Sudeste. A produção de leite bovino chegou a 30,7 
bilhões de litros, um acréscimo de 5,5% e foram abatidas 29,265 milhões de 
cabeças de bovinos, representando um aumento de 4,3% em relação ao ano 
anterior (IBGE/PPM, 2010). O Brasil possui o maior rebanho bovino comercial 
do mundo e hoje é o primeiro país no ranking de exportação de carne bovina. 
Temos as maiores extensões de terras aptas a agricultura. Apesar de todas 
essas facilidades, a taxa de prenhez dos rebanhos brasileiros, ficam em torno 
de 60%, e com intervalo de parto de até 2 anos (SILVA, 2007). 
2 
 
Com uma demanda crescente de carne e leite e pelo mercado mais 
competitivo e globalizado, os produtores estão sendo forçados a buscar novas 
tecnologias para tornar a pecuária mais eficiente. A eficiência econômica da 
pecuária de leite ou corte, esta vinculada a produção de bezerros. Neste 
contexto, a eficiência reprodutiva desempenha um papel de grande 
importância, pois sem a reprodução não temos a produção, tornando assim a 
atividade inviável. 
Durante os últimos anos, novas tecnologias aplicadas à reprodução 
animal vêm contribuindo de maneira importante para o melhoramento genético. 
A inseminação artificial (IA) se tornou uma das principais biotecnologias 
reprodutivas de impacto econômico na produção de bovinos, apesar de ser a 
mais utilizada, apenas 10% das fêmeas em idade reprodutiva são inseminadas 
no Brasil (ASBIA, 2011). 
O Brasil é um dos países que mais utiliza a IA, com grande expansão a 
partir da década de 70. No Brasil, a IA, cresce anualmente: de 2000 a 2004, 
houve um crescimento da utilização da técnica de IA de 42,7%, em gado de 
corte, e de 10,5%, em gado de leite (DIB et al, 2008). 
Como toda metodologia, a IA possui algumas limitações. Apesar de sua 
simplicidade, a IA necessita de rígido controle nas diferentes etapas, desde o 
monitoramento do rebanho (livre de doenças transmissíveis, sem animais 
subférteis e com registros de vacinações, nascimentos, abortos e estros) e a 
seleção do reprodutor doador do sêmen, com observação das características 
de raça, produção, estado sanitário (livre de doenças), defeitos genéticos e 
cromossômicos (cariótipo), até o processamento tecnológico do sêmen e a 
3 
 
necessidade de um inseminador bem treinado para a realização da técnica 
(DUARTE, 2008). 
No Brasil, um dosfatores que prejudica o desempenho reprodutivo é a 
baixa taxa de serviço, provocada principalmente, pela ausência de ciclicidade 
de fêmeas (anestro) e por falhas de detecção de estro. A detecção de estro 
desprende tempo e requer pessoal treinado. Além disso, fêmeas zebuínas 
apresentam estro de curta duração (cerca de 10-11 horas) e que, geralmente, é 
manifestado durante à noite, dificultando, ainda mais, a detecção e a utilização 
da IA tradicional (NICIURA, 2008). 
Devido a essas limitações, tornou-se de grande interesse econômico, o 
desenvolvimento de tratamentos que tem por objetivo a indução e/ou 
sincronização do ciclo estral. O emprego de alguns fármacos disponíveis no 
mercado, possibilitou essa biotecnologia sem o comprometimento na fertilidade 
do estro induzido. Assim, inúmeros protocolos hormonais vêm sendo 
desenvolvidos para realização da inseminação artificial em tempo pré-
determinado, ou seja, em tempo fixo (IATF) com taxas de concepção 
aceitáveis. 
Na IATF, são utilizados tratamentos hormonais que controlam o 
momento da ovulação e possibilitam que a inseminação seja realizada num 
momento pré-determinado (tempo fixo), sem a necessidade de observação de 
cio (NICIURA, 2008). 
Segundo Machado et al. (2006) aumentar a taxa de serviço é uma meta 
imperativa quando se objetiva elevar a eficiência reprodutiva, uma vez que a 
4 
 
taxa de prenhez é o produto da taxa de serviço e da taxa de concepção. Neste 
cenário, a indução da ovulação apresenta grande importância, a qual permite 
efetuar a inseminação artificial em tempo fixo e aumentar a taxa de serviço 
para 100%. Uma vez obtidas altas taxas de serviço, é importante assegurar a 
fecundação do ovócito. Caso a inseminação ocorra em perfeita sincronização 
com a ovulação, verificam-se elevadas taxas de concepção. 
Os métodos de sincronização compreendem o uso de drogas que agem 
ao nível hipotalâmico-hipofisário e/ou gonadal, Os protocolos de IATF hoje 
mais utilizados em bovinos são os com o uso do estradiol (Benzoato de 
Estradiol), embora outros países utilizem o GnRH em substituição ao estradiol, 
este hormônio ainda tem um custo elevado para os padrões brasileiros. 
Do ponto de vista do mercado de exportações, a União Européia tem se 
mostrado mais preocupada com as questões de saúde e sustentabilidade, 
impondo assim uma série de restrições aos produtos cárneos. 
 A sincronização da ovulação é uma estratégia importante para melhorar 
a eficiência reprodutiva em bovinos. Dentre alguns hormônios utilizados nos 
protocolos de IATF está o estradiol e/ou seus derivados. A União Européia 
(UE) e outros países, pela Diretiva 2003/74/CE, proibiram o uso de estradiol e 
seus derivados para a finalidade de sincronização do cio em animais de 
produção a partir de 14 de outubro de 2006 (LANE et al., 2008). 
 Já o Mercado Norte Americano não impõe nenhuma restrição, incluindo 
a liberação do uso de anabolizantes para a produção de carnes. Desta forma, a 
avaliação de protocolos de IATF (Inseminação Artificial em Tempo Fixo) 
5 
 
utilizando diferentes hormônios pode nos direcionar para o mercado almejado, 
obedecendo a quaisquer restrições impostas. 
Tendo em vista a restrição da hormonioterapia pelos países da União 
Européia, os hormônios usados nos protocolos de IATF deverão ser revistos, 
ou seja, devemos elaborar outros protocolos eficazes, estes sem o uso do 
estradiol (em especial o 17β estradiol), para podermos continuar utilizando esta 
ferramenta reprodutiva importante, sem causar restrições comerciais e riscos à 
saúde humana. 
Este trabalho visa a comparação de dois protocolos de IATF usando 
Benzoato de Estradiol e GnRH e avaliando a eficiência reprodutiva desses 
animais (Taxa de Concepção). Portanto, avaliar uma fonte alternativa para a 
substituição do estradiol nos protocolos de IATF, hormônio este que é proibido 
pela UE, devido a relatos de contaminação de carne e leite. 
6 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. REVISÃO DE LITERATURA 
 
2.1. Fisiologia do Ciclo Estral em Bovino 
Ciclo estral é o período compreendido entre dois estros, de duração 
variável, porém em torno de 17 a 21 dias, apresentando fases bastante 
evidentes e caracterizadas por modificações na genitália tanto interna como 
externa, assim como no comportamento da fêmea. Quanto ao desenvolvimento 
do ciclo estral as vacas são classificadas como poliéstricas anuais. As fases do 
ciclo podem ser didaticamente divididas em pró-estro, estro, metaestro ep 
diestro (REECE, 1996). 
Estro é o período em que a fêmea aceita ser montada pelo macho. As 
glândulas uterinas, cervicais e vaginais secretam grande quantidade de muco 
de consistência viscosa. A vagina e a vulva tornam-se edemaciadas e dilatadas 
7 
 
e a cérvix está relaxada. O tempo de duração de estro é em média de 18 
horas. Metaestro é a fase que sucede ao estro. As células epiteliais que 
revestem o folículo que se rompeu do ovário sofrem rápida hipertrofia, 
tornando-se luteinizadas e formando o corpo lúteo. Visualmente pode ser 
perceptível um corrimento hemorrágico junto ao muco do estro. O tempo de 
duração do metaestro é em torno de 3 a 4 dias. Diestro é o período entre estros 
sucessivos e é denominado pelo corpo lúteo cíclico. As glândulas uterinas 
estão ativas, a musculatura uterina esta relaxada, a cérvix contraída e a vagina 
encontra-se com os lábios enrugados. O tempo de duração do diestro é em 
torno de 10 a 13 dias. Pró-estro é a fase em que ocorre a regressão do corpo 
lúteo e o recrutamento folicular para uma nova ovulação, o tempo de duração 
do pró-estro é de 5 a 7 dias. (ARTHUR, 1979). 
 
2.1.1. Hormônios Envolvidos no Ciclo Estral 
Hormônios são substâncias que produzidas numa célula e são capazes 
de exercer efeito local ou em órgãos distantes. A remoção do órgão de origem 
causa a ausência de seu efeito e a reposição via exógena com a mesma 
substância, no animal cujo órgão de origem foi removido, restabelece seus 
efeitos. A ação no tecido alvo depende de estruturas conhecidas com 
receptores, nas quais o hormônio deve se ligar para exercer sua função 
(ALVES.et.al, 2007) (Figura 1). 
Receptores geralmente são moléculas glicoprotéicas presentes no 
interior (citoplasma) ou em membranas plasmáticas das células alvo. São 
estruturas dinâmicas, ou seja, que podem aumentar ou diminuir de quantidade 
8 
 
em determinados momentos, ou mesmo estarem presentes ou ausentes em 
um tecido dependendo da fase reprodutiva na qual o animal se encontra. 
Muitas vezes, a potência ou atividade de um hormônio, está relacionada mais 
ao número de receptores para o mesmo, que a sua concentração sanguínea ou 
estrutura molecular (ALVES.et.al, 2007). 
 
 
Figura 1 - Controle hormonal do ciclo estral de fêmeas pelo eixo hipotálamo-hipófise-
ovários. FSH: hormônio folículo estimulante; GnRH: hormônio liberador de 
gonadotrofinas; LH: hormônio luteinizante (DIB et al, 2008). 
 
• GnRH: hormônio liberador de gonadotrofinas. É produzido no 
hipotálamo, uma estrutura presente no sistema nervoso central (SNC), e é 
estimulado pelo aumento do estradiol, atingindo a hipófise pelo sistema porta 
hipotalomo-hipofisario. Sua função básica é estimular a liberação de 
9 
 
gonadotrofinas, o FSH de forma constitutiva e o LH de forma pulsátil, pela 
hipófise, hormônios estes responsáveis pelo crescimento, maturação, ovulação 
e luteinização folicular (PALHANO, 2008). 
• FSH: hormônio folículo estimulante. É produzido pela hipófise (ou 
pituitária), sendo secretado em resposta ao GnRH. Atua principalmente ao 
nível dos ovários onde exerce as seguintes funções principais: 
desenvolvimento folicular, produção de estrógeno (E2) pelos folículos, 
produção de inibina por folículos no final do desenvolvimento, aumento dos 
receptores de LH no folículos (HAFEZ, 2004 ). 
• LH: hormônio luteinizante. É produzido pela hipófise (ou pituitária), 
sendo secretado em resposta ao GnRH.Atua principalmente ao nível dos 
ovários onde exerce as seguintes funções principais: promover a ovulação e 
formação do corpo lúteo e secreção inicial de progesterona (HAFEZ,2004) 
• Ocitocina: promove as contrações uterinas em sinergismo com a 
PGF2α no trabalho de parto e promove a ejeção ao atuar nas células da 
glândula mamária (PALHANO, 2008). 
• Estrógeno: denominado também de esteróide ovariano. É produzido 
pelos folículos em desenvolvimento, tem várias funções dentro e fora do 
sistema genital. As principais são: indução da manifestação do estro (SNC), 
aumento da vascularização, contrações e secreções do genital e controle das 
secreções de GnRH e junto com a inibina bloqueia a secreção de FSH, 
fazendo um feedback positivo para a secreção do LH (PALHANO, 2008). 
10 
 
• Progesterona (P4): é também um esteróide ovariano, produzido pelo 
corpo lúteo por ação do LH (em algumas espécies também é produzido pela 
placenta). A nível de hipotálamo exerce um efeito feedback negativo sobre o 
controle da atividade tônica da secreção de GnRH. As glândulas são 
ativamente secretoras, produzindo um líquido formado por proteínas séricas e 
específicas do útero, glicoproteínas, minerais, dos quais são essenciais para 
nutrição do zigoto durante a fase de fixação (HAFEZ, 2004) 
• Prostaglandina: é produzida pelo útero e secretada de forma pulsátil, 
interfere na regulação neuroendócrina do ciclo estral mediante seu efeito 
luteolítico, provocando a queda da progesterona (PALHANO, 2008). 
 
 
Figura 2 - Representação esquemática das variações, na concentração dos principais 
hormônios que regulam o cicio estral em bovinos (CNPGC EMBRAPA, 2011) 
 
11 
 
2.2. Inseminação Artificial 
O melhoramento genético em rebanhos bovinos é baseado na seleção 
de indivíduos com maior desenvolvimento ponderal, rendimento de carcaça, 
capacidade de conversão alimentar, habilidade materna, fertilidade e 
precocidade sexual, possibilitando o aumento da produtividade. Assim, uma 
eficiente disseminação deste material genético proporciona maior retorno 
econômico para a atividade. 
Durante os últimos anos, novas tecnologias aplicadas à reprodução 
animal vêm contribuindo de maneira importante para o melhoramento genético. 
A inseminação artificial (IA) se tornou uma das principais biotecnologias 
reprodutivas de impacto econômico na produção de bovinos, embora apresente 
essas vantagens, apenas 10% das fêmeas em idade reprodutiva são 
inseminadas no Brasil (ASBIA, 2011). 
O Brasil é um dos países que mais utiliza a IA, com grande expansão a 
partir da década de 70. No Brasil, a IA, cresce anualmente: de 2000 a 2004, 
houve um crescimento da utilização da técnica de IA de 42,7%, em gado de 
corte, e de 10,5%, em gado de leite (DIB et al, 2008). 
A Inseminação Artificial nada mais é que a deposição mecânica do 
sêmen no útero da fêmea. Em bovinos a quantidade de sêmen utilizado varia 
entre 0,25 a 0,5 mL (de sêmen com diluente). As suas vantagens são: rápida 
difusão de material genético superior, diminuição de riscos com animais e o 
homem, uso de animais já mortos, controle sanitário, cruzamento ente raças, 
etc, e suas desvantagens: mão de obra qualificada, material e detecção do cio 
(PEREIRA, 2009). 
12 
 
 
2.3. Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) 
No Brasil, um dos fatores que prejudica o desempenho reprodutivo é a 
baixa taxa de serviço, provocada principalmente, pela ausência de ciclicidade 
de fêmeas (anestro) e por falhas de detecção de estro. A detecção de estro 
despende tempo e requer pessoal treinado. Além disso, fêmeas zebuínas 
apresentam estro de curta duração (cerca de 10-11 horas) e que, geralmente, é 
manifestado durante à noite, dificultando ainda mais, a detecção e a utilização 
da IA tradicional. Entretanto, esses problemas podem ser contornados pela 
utilização da biotécnica de IATF (DIB et al., 2008). 
A inseminação artificial é uma ferramenta extremamente importante no 
processo de melhoramento genético do rebanho. No entanto, uma das grandes 
limitações à sua expansão tem sido o custo e a falha associados aos trabalhos 
de observação de cio por longo período de tempo. Como resultado, a eficiência 
reprodutiva de rebanhos de corte em que se usa inseminação artificial em geral 
é baixa, pois as taxas de serviço são insatisfatórias (VALLE, 1991; MACHADO 
et al., 2006). 
Com o objetivo de concentrar o período de manifestação de cio e 
ovulação, possibilitando uma melhor utilização da inseminação artificial, 
diversos métodos de controle foram desenvolvidos. Estes têm também 
colaborado na implementação de outras tecnologias avançadas em 
reprodução, como a transferência de embriões. Todavia, o sucesso de um 
programa de sincronização de cio e ovulação está na dependência do uso 
correto dessa metodologia (VALLE, 1991). 
13 
 
Nesse sentido, a indução e/ou sincronização de estro como 
biotecnologia reprodutiva surge como uma ferramenta de manejo auxiliar, para 
o aumento da eficiência produtiva e econômica da atividade pecuária. Através 
da sincronização, o período de inseminação artificial (IA) pode ser reduzido de 
21 dias para o mínimo de algumas horas, no caso da inseminação artificial em 
tempo fixo (IATF), dependendo do método escolhido. Quando aplicada na 
primeira estação reprodutiva possibilita incrementar o índice de repetição de 
cria nas primíparas, principalmente por concentrar as parições no início da 
temporada (BRAGANÇA, 2007). 
A sincronização do estro pode ser obtida separadamente ou em 
combinação através da inibição da ovulação, indução da ovulação ou ainda 
pela indução ou atraso da regressão do corpo lúteo. Os métodos de 
sincronização incluem a administração de hormônios naturais ou sintéticos via 
oral, injeção intramuscular, implante subcutâneo/intravaginal, além do manejo 
adequado dos animais, o qual inclui um correto manejo nutricional e um 
desmame no período mais apropriado (SANTOS, 2002). 
 
2.3.1. Protocolos de IATF 
Os métodos de sincronização compreendem o uso de drogas que agem 
ao nível hipotalâmico-hipofisário e/ou gonadal, podendo ser diferenciado neste 
trabalho pelo uso ou não do estradiol. 
 
14 
 
2.3.1.1. Protocolo Utilizando Benzoato de Estradiol 
O protocolo mais utilizado na bovinocultura brasileira é o que utiliza o 
Benzoato de Estradiol (BE) (Figura 3), devido ao seu menor custo, comparado 
aos que utilizam GnRH. 
 
Figura 3 - Protocolo de IATF utilizando Benzoato de Estradiol (Arquivo Pessoal). 
 
 Este protocolo inicia com a aplicação de uma fonte intravaginal de 
progesterona (P4) e a aplicação do Benzoato de Estradiol (BE) no dia zero 
(D0), esse procedimento tem por finalidade a regressão folicular, pois altas 
concentrações de estradiol na presença de progesterona, promovem a 
regressão folicular e a emergência de uma nova onda de crescimento dos 
mesmos. 
 Após oito dias (D8), é removida a fonte de progesterona (P4) e aplicado 
a prostaglandina (PGF2α), isso vai simular a luteolise, ou seja, a quebra do 
corpo lúteo (P4) pela prostaglandina (PGF2α). 
15 
 
 No dia nove (D9) é aplicado novamente uma fonte de estradiol (BE) para 
agora dar aporte ao desenvolvimento e maturação do folículo dominante. 
 No dia dez (D10), ou seja, trinta e seis horas após a aplicação do 
estradiol, é feita a inseminação artificial (IA). Esse período de 36 horas é o 
tempo que o folículo dominante leva para acabar sua maturação e ocorre a 
ovulação. 
 
2.3.1.2. Protocolo Ovsynch 
 Foi o primeiro protocolo que substituiu o estradiol pelo GnRH, foi 
desenvolvido na Universidade da Flórida (WOLFENSON et al., 1994) e de 
Wisconsin (PURSLEY et al., 1995), desenvolveram um protocolo experimental 
de sincronização da ovulação (denominado Ovsynch pelo grupo de Wisconsin), 
o qual permite a inseminação em tempo prefixado, sem necessidade de 
observação do estro (ALVAREZ, 2003) (Figura 4). 
 
Figura 4 - ProtocoloOvsynch utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 
16 
 
Este protocolo inicia com a aplicação do GnRH (Hormônio Liberador de 
Gonadotrofina) no dia zero (D0), esse procedimento tem por finalidade a 
emergência de uma nova onda de crescimento folicular. No protocolo Ovsynch 
não utiliza uma fonte de progesterona, pois o animal deve ter um corpo lúteo, 
ou seja, estar ciclando. 
 Após sete dias (D7), é aplicado a prostaglandina (PGF2α), isso vai 
resultar na luteolise, ou seja, a quebra do corpo lúteo (P4) pela prostaglandina 
(PGF2α). 
 No dia nove (D9) é aplicado uma fonte de GnRH para estimular a 
secreção do FSH e do LH e dar aporte ao desenvolvimento, maturação e 
ovulação do folículo dominante. 
 Após 12 a 16 horas é feita a inseminação artificial (IA). 
 
2.3.1.3. Protocolo Co-synch 7 dia 
 O protocolo Co-synch 7 dia é recomendado para vacas e novilhas, a IA 
ocorre de 60 a 66 horas após a remoção da progesterona (BEEFREPRO, 
2011). 
 Esse protocolo é a variação do Ovsynch que utiliza uma fonte de 
progesterona, ou seja, simula a presença de um corpo lúteo, e não precisa 
mais saber se o animal esta ciclando (Figura 5). 
17 
 
 
Figura 5 - Protocolo Co-synch 7 dias utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 
 
Este protocolo inicia com a aplicação do GnRH (Hormônio Liberador de 
Gonadotrofina) e a introdução de uma fonte de progesterona (P4) no dia zero 
(D0), esse procedimento tem por finalidade a regressão e o crescimento de 
uma nova onda folicular, semelhante ao protocolo BE. 
 Após sete dias (D7), é feita a retirada da fonte de progesterona (P4) e é 
aplicado a prostaglandina (PGF2α), isso vai resultar na luteolise, ou seja, a 
quebra do corpo lúteo (P4) pela prostaglandina (PGF2α). 
 No dia oito (D8) é aplicado uma fonte de GnRH para estimular a 
secreção do FSH e do LH e dar aporte ao desenvolvimento, maturação e 
ovulação do folículo dominante. 
 Após 36 a 40 horas da ultima aplicação do GnRH é feita a inseminação 
artificial (IA), dia nove mais 12 horas (D9). 
18 
 
2.3.1.4. Protocolo Co-synch 5 dia 
 O protocolo Co-synch 5 dias é baseado no de 7 dias, a diferença básica 
é que a fonte de progesterona é mantida por apenas 5 dias, ou seja, essa 
redução de 2 dias pode obter um oócito mais jovem e de melhor qualidade. 
 Segundo Chebel et al. (2008) e Bridges et al. (2008), o protocolo Co-
synch 5 dias deve fazer 2 aplicações de prostaglandina (PGF2α), uma na 
retirada da fonte de progesterona e a outra 12 hora depois, isso ocorre devido 
ao corpo lúteo, por ser precoce, não ter uma resposta eficiente a uma só dose 
de prostaglandina, não ocorrendo a luteólise. 
 
Figura 6 - Protocolo Co-synch 5 dias utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 
 
Este protocolo inicia com a aplicação do GnRH (Hormônio Liberador de 
Gonadotrofina) e a introdução de uma fonte de progesterona (P4) no dia zero 
(D0), esse procedimento tem a mesma finalidade do protocolo com 7 dia. 
19 
 
Após cinco dias (D5), é feita a retirada da fonte de progesterona (P4) e é 
aplicado a prostaglandina (PGF2α), isso vai resultar na luteolise, ou seja, a 
quebra do corpo lúteo (P4) pela prostaglandina (PGF2α). 
 Após doze horas é feita a segunda aplicação da prostaglandina 
(PGF2α). 
 No dia seis (D6) é aplicado uma fonte de GnRH para estimular a 
secreção do FSH e do LH e dar aporte ao desenvolvimento, maturação e 
ovulação do folículo dominante. 
 Após 36 a 40 horas da ultima aplicação do GnRH é feita a inseminação 
artificial (IA), dia sete mais 12 horas (D7). 
 
2.4. Qualidade dos Produtos de Origem Animal 
Com os consumidores cada vez mais exigentes com a qualidade dos 
alimentos, além das características tangíveis como cor, tamanho e ausência de 
defeitos, outros padrões passaram a ter grande influência no mercado, como 
as questões ambientais (local do cultivo, praticas culturais, resíduos etc.) e a 
responsabilidade social (direito, saúde e segurança no trabalho e 
desenvolvimento rural). 
Dentre as carnes das diversas espécies de mamíferos e aves mais 
utilizadas na alimentação humana, a bovina não é a mais consumida, mas é, 
provavelmente, a mais valorizada e preferida. A suína é a mais consumida 
devido à enorme produção da China e ao tamanho da população de 
consumidores daquele país, enquanto a produção de carne de aves, 
20 
 
basicamente de frangos, cresce continuamente nas estatísticas globais, 
respondendo rapidamente aos incrementos de demanda por proteína animal de 
boa qualidade e baixo custo.Com uma tradição de quase um século na 
exportação de carne bovina, o Brasil vem conquistando, nos últimos 10 anos, 
uma posição de grande destaque no cenário internacional (Instituto FNP. 
2005). 
Para Euclides Filho (2005), o fortalecimento e a ampliação dos 
mercados com aumento do consumo interno requerem esforços de todos os 
segmentos na implementação das boas práticas de produção, com a 
introdução do APPCC (Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle) - 
Campo, das boas práticas de fabricação na indústria, rastreabilidade e de 
manuseio adequado pelo setor de distribuição. 
A rastreabilidade é uma ferramenta que permite identificar dados e fatos 
referentes a um produto durante o ciclo de sua cadeia produtiva, baseando-se 
no registro histórico dos acontecimentos que a envolvem (LIRANI, 2005). O 
Brasil tem um sistema de rastreabilidade que vem sendo implantado pelo 
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, a partir da 
Instrução Normativa (IN) nº 1/2002, de 09/01/2002, que instituiu o SISBOV – 
Sistema Brasileiro de Identificação e Certificação Bovina e Bubalina. 
O Protocolo EUREPGAP IFA. EUREP (Euro-Retailer Produce Working 
Group) é a sigla do nome de um grupo formado, em 1997, por atacadistas e 
varejistas europeus, que desenvolveu, em 2002, o Protocolo EUREPGAP IFA 
com o objetivo de estimular a implementação de sistemas agrícolas e de 
produção de animais levando em consideração as boas práticas de produção, 
21 
 
a segurança alimentar, bem como a minimização dos impactos adversos ao 
meio-ambiente e a proteção social do trabalhador (Globalgep, 2011) 
A Comissão do Codex Alimentarius executa o Programa Conjunto da 
FAO/OMS sobre Normas Alimentares, cujo objetivo é proteger a saúde dos 
consumidores e garantir práticas eqüitativas no comércio de alimentos. O 
Codex Alimentarius (do latim Lei ou Código dos Alimentos) é uma coletânea de 
normas alimentares adotadas internacionalmente e apresentadas de modo 
uniforme (CARDOSO et al., 1999). 
 
2.4.1. Sustentabilidade e Mercado Importador da Car ne Brasileira 
Nas fêmeas bovinas, o estradiol apresenta papel fundamental na 
fisiologia reprodutiva, particularmente na regulação do ciclo estral e na 
ovulação. O estradiol é utilizado em biotécnicas como sincronização de cio, 
superovulação, transferência de embriões, entre outros procedimentos 
(BARUSELLI et al., 2002), contudo normativas recentes da Comunidade 
Européia vem colocando o β-estradiol na lista de produtos proibidos para uso 
em animais criados para produção de carne, por ser uma substância que vai 
contra as diretrizes de bem estar animal (COMISSÃO DAS COMUNIDADES 
EUROPÉIAS, 2007). 
O parecer do Comitê Científico das Medidas Veterinárias Relacionadas 
com a Saúde Pública, de 30 de Abril de 1999, sobre os riscos potenciais para a 
saúde humana decorrentes dos resíduos de hormonais presentes na carne e 
nos produtos à base de carne de bovino (revisto em 3 de Maio de 2000 e 
22 
 
confirmado em 10 de Abril de 2002), concluiu que existe um grande conjunto 
de provas recentes que sugerem que o estradiol 17β tem de ser considerado 
como um cancerígeno total, na medida em que tem por efeito estimular o 
aparecimento e o crescimento de tumores, e que os dados atualmente 
disponíveis não permitem um cálculo quantitativo do risco para a saúde 
humana. Consequentemente a Diretiva 96/22/CE foi alterada pela Diretiva 
2003/74/CE para, entreoutros, proibir permanentemente a utilização de 
estradiol 17β enquanto promotor de crescimento e a reduzir substancialmente 
todas as outras circunstâncias em que esta substância pode ser administrada a 
todos os animais de criação para fins terapêuticos ou zootécnicos, na 
pendência de um exame mais aprofundado da situação em termos factuais e 
científicos e das práticas veterinárias nos Estados-Membros (Diretiva, 2008). 
O artigo 11-A da Diretiva 96/22/CE impunha à Comissão a 
apresentação, até 14 de Outubro de 2005, de um relatório sobre a 
disponibilidade de medicamentos veterinários alternativos aqueles contendo 
estradiol 17β para animais destinados à produção de alimentos, para fins 
terapêuticos. A Comissão solicitou pareceres periciais e elaborou o relatório 
científico relevante, que foi enviado ao Parlamento Europeu e ao Conselho em 
11 de Outubro de 2005. Esse relatório conclui que o estradiol 17β não é 
essencial na criação de animais para produção de alimentos, visto que a 
utilização por veterinários das alternativas disponíveis (especialmente as 
prostaglandinas) já é bastante comum nos Estados-Membros e que a proibição 
total da utilização de estradiol 17β em animais para produção de alimentos não 
produziria um impacto na criação e no bem-estar animal, ou este seria apenas 
insignificante (Diretiva, 2008). 
23 
 
Foi prevista uma derrogação temporária para a utilização de estradiol 
17β para a indução do estro nos bovinos, equinos, ovinos ou caprinos até 14 
de Outubro de 2006. Dado que existem produtos alternativos eficazes, que já 
são utilizados, e no sentido de garantir um elevado nível de proteção da saúde 
humana na Comunidade, aquela derrogação não deverá ser renovada 
(Diretiva, 2008). 
É inserido o seguinte artigo: Artigo 11-B. A Comissão, em colaboração 
com os Estados-Membros, organiza uma campanha de informação e 
sensibilização sobre a proibição total da utilização de estradiol 17 β nos 
animais para produção de alimentos, destinada às organizações de agricultores 
e veterinários na União Européia, bem como às organizações fora do território 
da União Européia que estejam direta ou indiretamente envolvidas na 
exportação para esta de alimentos de origem animal abrangidos pelo âmbito de 
aplicação da presente diretiva (Diretiva, 2008). 
Atualmente, de acordo com o exposto na Diretiva nº 96/22/CE do 
Conselho, a UE proíbe a importação, a comercialização e o uso de substâncias 
naturais ou artificiais com atividade anabolizante, ou mesmo outras dotadas 
dessa atividade, mas desprovidas de caráter hormonal, para fins de 
crescimento e ganho de peso em animais de produção, com permissão 
exclusiva para fins terapêuticos, como a sincronização do estro, transferência 
de embriões, melhoramento genético e pesquisa experimental em medicina 
veterinária. 
Em países como os EUA, Austrália, Nova Zelândia e Argentina, com 
produtividade de carne elevada e que atendem a mercados exigentes em 
24 
 
qualidade é permitido o uso de compostos anabolizantes naturais como a 
testosterona, a progesterona e o 17-β estradiol e de compostos sintéticos tais 
como o zeranol e o acetato de trembolona. Nesses países, os LMRs dos 
compostos sintéticos são controlados no fígado e músculos dos animais aos 
quais se fez a administração. Esses valores foram estabelecidos pela Food and 
Agriculture Organization – FAO e pela World Health Organization - WHO 
(DUARTE et al., 2002). 
 
2.4.2. Resíduo de Agente Anabólico 
 No mundo moderno, grande parte da segurança alimentar repousa no 
controle de remanescentes residuais nos alimentos, em decorrência do uso de 
pesticidas, ou drogas veterinárias, ou por acidentes envolvendo contaminantes 
ambientais. Resíduos de anabolizantes em carnes trazem sérios problemas de 
saúde pública. De acordo com Epstein (1990), 3000 crianças em Porto Rico 
tiveram sérios problemas de desenvolvimento sexual prematuro e cistos 
ovarianos devido à ingestão de produtos cárneos com resíduos de zeranol. 
Segundo o Comitê Misto do Codex Alimentarius/ FAO/ WHO, a ingestão 
de alimentos contaminados por anabolizantes pode levar ao aparecimento de 
distúrbios endócrinos como indução de puberdade precoce em crianças, 
avanços na idade óssea com repercussões negativas no crescimento, 
modificação dos caracteres sexuais, bem como cânceres principalmente no 
fígado e pâncreas (CARDOSO et al., 1999). 
25 
 
De acordo com Rosa e Dode (1987), a via de administração mais 
utilizada em bovinos é o implante em parte não comestível da carcaça, como 
por exemplo, na orelha. A administração oral ou injeção (oleosa ou cristalina) 
aumenta a possibilidade de abusos e a ocorrência de resíduos em tecidos 
comestíveis, o que torna um problema de saúde pública. 
 
2.4.3. Métodos para Detecção de Resíduos de Anaboli zantes 
A determinação de resíduos de agentes anabolizantes em material 
biológico é uma tarefa difícil. Para tal, os métodos utilizados, para serem 
considerados satisfatórios, deverão preencher uma série de requisitos entre os 
quais: ser adequado a uma rotina regular realizada por pessoa qualificada; 
permitir o manuseio de um grande número de amostras num pequeno espaço 
de tempo, para poder ser usado como um instrumento de fiscalização; ser 
seletivo para o composto, de modo a evitar falsos positivos; quantificar, de 
forma inequívoca, a concentração do composto presente; permitir tanto a 
quantificação do composto livre quanto seu conjugado; não ser muito oneroso, 
para não inviabilizar as análises de vigilância sanitária (PLAIZIER, 1993; 
EECKHOUT et al., 1998). 
Muitos métodos satisfazem alguns desses itens, mas nenhum satisfaz a 
todos. É possível, entretanto, conseguir resultados bastante satisfatórios com 
métodos que preencham a maioria desses requisitos. 
Geralmente, para a detecção de resíduos de anabolizantes, dois tipos de 
métodos podem ser usados: (1) os imunoensaios tais como radioimunoensaio 
26 
 
(RIA) e método imunoenzimático (ELISA), os quais são rotineiramente usados 
para detecção e (2) métodos físico-químicos, por cromatografia (CG-EM, 
CCDAE), os quais são usados para determinações quantitativas e como 
métodos de referência (HOFFMAN e BLIETZ, 1983; LONE, 1997). 
Segundo o MAPA no MEMO SCR/DIPOA N° 32/2005 descrev e sobre o 
PNCR (Plano Nacional de Controle de Resíduos), onde os animais suspeitos 
de contaminação com anabolizantes são submetidos ao exame ante-mortem, 
observando anormalidades (aumento na glândula mamaria e do tecido adiposo, 
vestígios de implantes, cicatriz na orelha, etc), é coletado a tireóide desse 
animais e enviada para análise laboratorial. 
Atendendo aos requisitos de sustentabilidade, o MAPA descreve que “A 
sustentabilidade envolve desenvolvimento econômico, social e respeito ao 
equilíbrio e às limitações dos recursos naturais. De acordo com o relatório da 
Comissão Mundial sobre Meio Ambiente e Desenvolvimento, criada pela ONU 
em 1983, o desenvolvimento sustentável visa "ao atendimento das 
necessidades do presente, sem comprometer a possibilidade de as gerações 
futuras atenderem às próprias necessidades". (MEMO, 2005). 
27 
 
 
 
 
 
 
 
 
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cows. Theriogenology , v. 42, n. 4, p. 633-644, 1994. 
31 
 
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32 
 
CAPÍTULO 2 – EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF 
UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH 
Resumo 
Neste trabalho, foram utilizadas 70 novilhas e 20 vacas da raça nelore 
divididas aleatoriamente em dois grupos utilizando dois protocolos de 
Inseminação Artificial em tempo fixo (IATF), um com Benzoato de Estradiol e 
outro com gonadorelina, o GnRH (Hormônio Liberador de Gonadotrofina). Os 
animais, após a IATF, foram avaliados quanto a presença de Corpo Lúteo, 
estro, taxa de concepção e em ambos protocolos os resultados foram 
semelhantes e sem diferença significativa, com a taxa de concepção (prenhez 
no primeiro serviço) em 32% nas novilhas e 50% nas vacas, sem diferença 
significativa em teste de chi-quadrado a 5 %, com ambos os protocolos de 
IATF. Estes resultados, do ponto de vista econômico visando o mercado 
europeu, são bastante vantajosos, uma vez que a Comunidade Européia está 
restringindo a importação de carnes e co-produtos que tenham utilizado 
estradiol na sua produção. 
 Palavras-chave: estradiol, IATF, taxa de concepção 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
 
PERFORMANCE OF TWO FTAI PROTOCOLS USING 
OESTRADIOL BENZOATE OR GNRH 
Abstract 
In this work 70 heifers and 10 cows, all Nelore, randomly divided into two 
groups were submitted to two Artificial insemination at Fixed Time (AIFT), one 
group using oestradiol benzoate and another using gonadoreline- the GnRH 
(Gonadotrofine Hormone inducer). After AIFT, animals were evaluated for 
presence of Luteous Body, heat, conception rate and for both protocols, results 
were similar, with no significant differences, presenting a conception rate ( 
pregnancy at the first service) of 32 % for heifers and 50% for cows with no 
statistical significant difference in a chi-squared test at 5%. Such results 
represent an advantage looking at the economic point of view, aiming the 
European market, once the European Community is restricting importation of 
meat and co-products which had used oestradiol during its production. 
Key-words: AIFT, conception rate, oestradiol 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
O rebanho nacional de bovinos em 2010 chegou a 209,5 milhões de 
cabeças, um aumento de 2,1% em relação a 2009, com maiores concentrações 
no Centro-Oeste, Norte e Sudeste, a produção de leite bovino chegou a 30,7 
bilhões de litros, um acréscimo de 5,5% e foram abatidas 29.265 milhões de 
cabeças de bovinos, representando um aumento de 4,3% em relação ao ano 
anterior (IBGE/PPM, 2010). Com uma demanda crescente de carne e leite e 
pelo mercado mais competitivoe globalizado, os produtores estão sendo 
forçados a buscar novas tecnologias para tornar a pecuária mais eficiente. 
A eficiência econômica da pecuária de leite ou corte, esta vinculada a 
produção de bezerros. Neste contexto, a reprodução desempenha um papel de 
grande importância. 
35 
 
 A inseminação Artificial (IA) tornou-se uma das principais biotecnologias 
reprodutiva de impacto econômico na produção de bovinos por possibilitar a 
utilização em massa de indivíduos de genética superior e viabilizar os vários 
cruzamentos de raças hoje disponíveis, aumentando a produção de carne e 
leite por hectare. Embora apresente essas vantagens, apenas 10% das fêmeas 
em idade reprodutiva são inseminadas no Brasil. As principais limitações 
impostas ao emprego dessa biotecnologia referem-se às falhas na detecção do 
estro, a puberdade tardia e ao longo período de anestro pós-parto (ASBIA, 
2011). 
Devido a essas limitações, tornou-se de grande interesse econômico nos 
últimos anos, o desenvolvimento de tratamentos que tem por objetivo a indução 
e/ou sincronização do ciclo estral. O emprego de alguns fármacos disponíveis 
no mercado possibilitou essa biotecnologia, sem o comprometimento na 
fertilidade do estro induzido. Assim, inúmeros protocolos hormonais vêm sendo 
desenvolvidos para realização da inseminação artificial em tempo pré-
determinado, ou seja, em tempo fixo com taxas de concepção aceitáveis. 
Do ponto de vista do mercado de exportações, a União Européia tem se 
mostrado mais preocupada com as questões de saúde e sustentabilidade, 
impondo assim uma série de restrições ao produtos cárneos, principalmente, 
que chegam ao continente. A sincronização da ovulação é uma estratégia 
importante para melhorar a eficiência reprodutiva em bovinos. Dentre alguns 
hormônios utilizados nos protocolos de IATF está o estradiol e/ou seus 
derivados. A União Européia (UE) e outros países, pela Diretiva 2003/74/CE, 
proibiram o uso de estradiol e seus derivados para a finalidade de 
36 
 
sincronização do cio em animais de produção a partir de 14 de outubro de 2006 
( LANE et.al. 2008). 
 Já o Mercado Norte Americano não impõe nenhuma restrição , incluindo 
a liberação do uso de anabolizantes para a produção de carnes. Desta forma, a 
avaliação de protocolos de IATF (Inseminação Artificial em Tempo Fixo) 
utilizando diferentes hormônios pode nos direcionar para o mercado almejado, 
obedecendo a quaisquer restrições impostas. 
Tendo em vista a restrição da hormonioterapia pelos países da União 
Européia, os hormônios usados nos protocolos de IATF deverão ser revistos, 
ou seja, devemos elaborar outros protocolos eficazes, estes sem o uso do 
estradiol (em especial o 17β estradiol), para podermos continuar lançando mão 
dessa ferramenta reprodutiva importante, sem causar restrições comerciais e 
riscos à saúde humana. 
Este trabalho visa a comparação de dois protocolos de IATF usando 
estradiol e GnRH e avaliando a eficiência reprodutiva desses animais. 
Portanto, avaliar uma fonte alternativa para a substituição do estradiol nos 
protocolos de IATF, hormônio que será proibido pela UE, devido a relatos de 
contaminação de carne e leite. 
37 
 
 
 
 
 
 
 
2. MATERIAL E MÉTODOS 
2.1. Local e animais 
O presente estudo foi realizado em uma propriedade no município de 
São Pedro, interior de São Paulo, com clima tropical de altitude, com 
temperatura média anual de 22 °C e altitude de 608 metros, onde foram 
utilizadas 90 novilhas da raça nelore divididas aleatoriamente em dois grupos 
(Grupo 1, Benzoato de Estradiol n=45 e Grupo 2, GnRH n=45). Todos os 
animais foram mantidos a pasto de Panicum maximum, cultivar Tanzânia, 
suplementados com sal mineral e com manejo convencional de gado de corte, 
o experimento teve por finalidade comparar dois protocolos de IATF, um 
convencional, usando dentre outros hormônios o benzoato de estradiol, e o 
segundo, substituindo o benzoato de estradiol por uma gonadorelina, o GnRH 
(Hormônio Liberador de Gonadotrofina). 
 
38 
 
2.2. Tratamentos 
 O tratamento hormonal do Grupo 1, Benzoato de Estradiol começou no 
dia 05/10/09 com a introdução de uma fonte intravaginal de progesterona e a 
aplicação de 2mL de benzoato de estradiol (dia zero D0), no dia 13/10/09 
retiramos a fonte de progesterona e aplicamos 2mL de prostaglandina (dia oito 
D8), no dia 14/10/09 aplicamos 2mL de benzoato de estradiol (dia nove D9) e 
no dia 15/10/09 IATF (dia dez D10); todos os tratamentos hormonais foram 
feitos no período da manhã e a IATF no período da tarde (Figura 7) . 
 
Figura 7 Protocolo de IATF com Benzoato de Estradiol utilizado no experimento 
(arquivo pessoal). 
P4 = dispositivo intravaginal com 1g de progesterona ( Primer – tecnopec – São Paulo – Br) 
E2 = 1mg Benzoato de Estradiol (Estrogin – Farmavet – São Paulo – Br) 
PGF = 0,150mg (2mL) de d-Cloprostenol ( Prolise – ARSA – Buenos Aires – Ag) 
IATF = Inseminação Artificial em Tempo Fixo 
 
O tratamento hormonal do Grupo 2, GnRH, começou no dia 08/10/09 
com a introdução de uma fonte intravaginal de progesterona e a aplicação de 
1mL de GnRH (dia zero D0), no dia 13/10/09 retiramos a fonte de progesterona 
e aplicamos 2mL de prostaglandina (dia cinco D5), no dia 14/10/09 foi aplicado 
39 
 
1mL de GnRH e observação de cio (dia seis D6) e no dia 15/10/09 a tarde IATF 
(dia sete D7),(Figura 8). 
 
Figura 8 - Protocolo de IATF com GnRH utilizado no experimento (arquivo pessoal). 
P4 = dispositivo intravaginal com 1g de progesterona ( Primer – tecnopec – São Paulo – Br) 
GnRH = 0,1mg (1mL) de Gonadorelina ( Fertagyl - Intervet - São Paulo – Br) 
PGF = 0,150mg (2mL) de d-Cloprostenol ( Prolise – ARSA – Buenos Aires – Ag) 
IATF = Inseminação Artificial em Tempo Fixo 
 
 
2.3. Variáveis analisadas 
As variáveis observadas no trabalho foram: 
• Presença do CL no inicio do protocolo de IATF: esta variável mostra um 
indicativo de ciclicidade do animal. A presença do CL foi avaliada por palpação 
trans retal no dia do inicio dos tratamentos hormonais dos animais estudados. 
• Manifestação do estro no momento da IATF: esta variável mostra se o 
animal manifestou ou não o estro. Essa variável foi medida no momento da 
inseminação artificial, pela presença do muco cervical e pela facilidade em 
transpassar os anéis cervicais. 
40 
 
• Taxa de concepção: esta variável mostra quantos animais ficaram 
prenhes no primeiro serviço (IATF). A taxa de concepção foi obtida pelo exame 
de ultrasonografia trans retal, o mesmo foi executado pelo Pqc Nelcio Antonio 
Tonizza de Carvalho, APTA – Pólo Vale do Ribeira, com um aparelho mindray 
DP-2200 VET. 
 
2.4. Análise estatística 
 Foi utilizado o teste de probabilidade, o qui-quadrado, para análise dos 
dados obtidos e avaliação do nível de significância dos resultados a 5%. 
41 
 
 
 
 
 
 
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
O uso do Benzoato de Estradiol no protocolo, tem por finalidade 
promover o estimulo da secreção do FSH (Hormônio Folículo Estimulante), 
para o crescimento folicular, e do LH (Hormônio Luteinizante), para promover a 
maturação e ovulação do folículo. Altas concentrações de estrógeno na 
presença de progesterona promoverão a regressão folicular e posteriormente 
com a retirada da progesterona e a formação de um folículo dominante esse 
estrógeno estimulará a maturação e ovulação, ou seja, o estro. 
O uso do GnRH no protocolo tem a mesma finalidade do estradiol no 
Grupo 1, promover o crescimento, maturação e ovulação do folículo, ou seja, a 
manifestação de cio. Por ser um hormônio liberador de gonadotrofinas ele 
estimula a secreção de FSH e LH. 
A escolha do protocolo com Benzoato de Estradiol foi devido a utilização 
em larga escala deste hormônio no Brasil, isso ocorre devido a falta de 
conhecimento e a grande diferença de preço entre o GnRH. Por sua vez o 
protocolo com GnRH (Co-synch), tem uma variação em dias de utilizaçãoda 
42 
 
fonte de progesterona, segundo Chebel (2008) e Bridges (2008), o protocolo 
com 5 dias produz oócitos mais jovens e de melhor qualidade. 
As variáveis analisadas foram: Presença do CL, esta variável foi medida 
por palpação trans retal, apesar de não ser a forma mais confiável, é a de 
maior utilização e menor custo; Manifestação do cio, esta variável foi medida 
pela observação do muco cervical e a facilidade da IA; E a Taxa de Concepção 
que foi a variável mais importante do estudo, afinal quanto maior a taxa de 
concepção, melhor é o protocolo de IATF (Tabelas 1 e 2). 
Tabela 1- Resultados observados no grupo 1 (Benzoato de Estradiol) 
 N IDADE PESO CL ESTRO PRENHA 
NOVILHAS 35 24,6 309 23 (65,70%) 19 (54,30%) 11 (31,50%) 
VACAS 10 58,5 410 2 (20%) 3 (30%) 5 (50%) 
TOTAL 45 41,6 359,5 25 (55,60%) 22 (48,90%) 16 (35,60%) 
N- número de animais; CL- presença de corpo lúteo 
Tabela 2- Resultados observados no grupo 2 (GnRH) 
 N IDADE PESO CL ESTRO PRENHA 
NOVILHAS 35 24,3 330 24 (68,50%) 11 (31,50%) 11 (31,50%) 
VACAS 10 65,3 418 7 (70%) 2 (20%) 5 (50%) 
TOTAL 45 44,8 374 31 (68,90%) 13 (28,90%) 16 (35,60%) 
N- número de animais; CL- presença de corpo lúteo 
43 
 
 As tabelas 1 e 2 revelam os dados observados no grupo 1 (Benzoato de 
Estradiol) e no grupo 2 (GnRH) respectivamente, onde podemos visualizar o 
numero de animais, as médias de idade e peso e as variáveis estudadas (CL, 
Estro e Taxa de Concepção. 
O uso dos dispositivos intravaginais liberadores de P4 associado ao BE 
é um tratamento hormonal bastante utilizado para a IATF, tanto em bovinos de 
leite como de corte; e seu emprego otimiza os índices reprodutivos atenuando 
problemas de manejo como falha na detecção de cio (BÓ et al., 2003). 
A associação do estradiol nos tratamentos com progesterona foi 
realizado quando se descobriu que o estrógeno induzia a regressão luteal 
(WILTBANK et al., 1961). Durante a década de 90, observou se que além do 
efeito luteolítico, o estradiol também suprimia o desenvolvimento de folículos 
antrais. A aplicação do E2 associada ao CIDR, em novilhas ovariectomizadas, 
resultou num pico das concentrações de estrógeno 13,4±1,24 horas após o 
início do tratamento; e este pico suprime as concentrações de FSH por 64 
horas (BÓ et al., 1993). A administração do BE em associação com P4 induz a 
atresia do folículo dominante nos ovários dentro de 36 horas (BURKE et al., 
2003), mas a emergência de uma nova onda de crescimento folicular ocorre 
em média de 4,3 ± 0,2 dias depois (BÓ et al., 1993; Bó et al., 1995). 
Estudos in vivo com animais ovariectomizados demonstraram que 2 
horas após a inserção do dispositivo intravaginal (CIDR) os níveis plasmáticos 
de P4 atingem seu pico (6ng mL-1). Este pico é mantido por 48 horas e então 
as concentrações vão declinando gradativamente, se mantendo em níveis 
aproximados de 3 ng mL-1até a retirada do dispositivo (MUNRO, 1987). Outros 
44 
 
autores relatam amplas variações (4,2 a 7,2 ng mL-1) nos níveis plasmáticos de 
P4 dos animais ovariectomizados tratados com CIDR (PETTERSON; 
HENDERSON, 1990; MACMILLAN; PETERSON, 1993). Durante o período de 
tratamento (9 dias) o CIDR liberou aproximadamente 1,1 g de P4 . Portanto as 
variações nas concentrações plasmáticas de P4 durante o período de inserção 
do dispositivo não é devido a variações nas quantidades de progesterona 
liberada, mas sim na habilidade dos animais tratados em metabolizar este 
esteróide (PETTERSON; HENDERSON, 1990). Em vacas ovariectomizadas 
tratadas com o dispositivo intravaginal DIB, o pico (5-6mg mL-1) das 
concentrações de progesterona foi alcançado dentro de 1-3 horas após a 
inserção do mesmo. Essas concentrações foram mantidas por 
aproximadamente 2 dias, declinando gradualmente, se estabilizando em 2-3 ng 
mL-1, até a retirada do dispositivo (BÓ et al., 2003). 
A administração de benzoato de estradiol em situações em que os níveis 
de P4 estão abaixo de 1,0 ng mL-1, induz o aparecimento do pico ovulatório de 
LH 16 a 24 horas após (BÓ et al., 1995). 
O tratamento com GnRH induz a ovulação do folículo dominante 
(THATCHER et al., 1993), possibilitando a emergência de uma nova onda de 
crescimento folicular aproximadamente 2 dias depois (TWAGIRAMUNGU et 
al.,1995). Porém, o momento do desenvolvimento folicular em que o GnRH é 
aplicado influencia a taxa de ovulação nos animais tratados ( DUNN et al., 
1985). Vasconcelos et al.(1999), observaram que a porcentagem de vacas que 
ovularam a primeira injeção de GnRH no protocolo Ovsynch, foi menor ( 23%) 
nos animais que estavam entre os dias 1 e 4 do ciclo estral, e maior (96%) nos 
45 
 
que estavam entre os dias 5 e 9. Silcox et al. (1993), relataram que o GnRH 
induziu a ovulação em 100% dos folículos, quando estes se encontravam na 
fase de crescimento (>10 mm) , em 33%, quando estavam na fase de platô e 
0% (nenhuma ovulação) quando encontravam-se em atresia. Em novilhas, 
obteve-se taxa de ovulação de 75%, quando a aplicação de GnRH foi feita 
durante a fase de crescimento do folículo dominante, porém a taxa de ovulação 
declinou para 44% quando o folículo dominante encontrava-se na fase estática 
ou em regressão (MARTINEZ et al., 2002). 
A taxa de ovulação de novilhas tratadas com GnRH (D0) geralmente 
situa-se em torno de 56% (PURSLEY et al., 1995) ou 50% (MARTINEZ et al., 
2002) e é alta (17,3%) a incidência de animais que manifestam estro antes da 
aplicação da PGF2α ( ROY; TWAGIRAMUNGU, 1999). Willians et al. (2002) 
relataram que 28,9% das novilhas Bos indicus tratadas com protocolos 
Ovsynch (GnRH- PGF2α-GnRH) exibiram estro entre a primeira aplicação de 
GnRH e o tempo determinado para IATF. A incidência de estros prematuros e 
de baixa fertilidade em novilhas tratadas com GnRH, é devido a inconsistência 
na resposta a primeira aplicação de GnRH (MARTINEZ et al., 2000). Essa 
variabilidade na resposta à aplicação de GnRH, talvez possa ser explicada pelo 
fato do ciclo estral de novilhas ter a predominância de 3 ondas de crescimento 
folicular (FORTUNE, 2001; CASTILHO et al., 2000), o que, aumentaria as 
chances de no momento da aplicação do GnRH, não haver um folículo apto a 
ovular, consequentemente, a sincronização do desenvolvimento folicular, 
decorrente da ovulação induzida pelo GnRH, estaria comprometida 
(MARTINEZ et al., 2000). 
46 
 
Tabela 3- Comparação da Taxa de Concepção com os animais que 
apresentaram corpo lúteo (CL) e Estro. BE - tratamento com benzoato de 
estradiol e GnRh - Hormônimo estimulante de gonadotrofina 
 CL ESTRO 
Novilha BE 10/23 (43%) 6/19 (32%) 
Vaca BE 1/2 (50%) 2/3 (67%) 
Novilha GnRH 9/24 (38%) 5/11 (45%) 
Vaca GnRH 3/7 (43%) 2/2 (100%) 
 
 A tabela 3 é um comparativo entre as variáveis estudadas, ou seja, 
revela quantos animais que estavam ciclando ou que apresentaram estro, 
ficaram prenhas. 
 
3.1. Análise dos Resultados 
 
Figura 9- Taxa de Concepção dos Grupos Estudados. 
47 
 
A Figura 9 mostra que a taxa de concepção dos dois tratamentos foi a 
mesma, mesmo com varias alterações em outros parâmetros avaliados a taxa 
de concepção dos dois grupos não foi alterada. Segundo Bridges (2008) em 
seu experimento, usando o protocolo co-synch em vacas e novilhas, não 
obteve diferença significativa na taxa de prenhez. 
 
GnRH Novilha GnRH Vaca EstradiolNovilha Estradiol Vaca
32%
20%
54%
30%
32%
50%
32%
50%
Manifestação do Cio Taxa de concepção
 
Figura 10 - Comparação da Manifestação do Estro com a Taxa de Concepção. 
A Figura 10 mostra que a manifestação do estro no grupo tratado com 
GnRH foi menor nas duas categorias de animais estudados. Isso está 
relacionado à segunda dose do GnRH ser aplicado próximo ao momento da 
IATF (12 horas antes), contudo não alterando o resultado da taxa de 
concepção. 
Moreira (2002) tratando vacas Nelore paridas e solteiras (sem bezerros) 
com o protocolo Crestar, avaliou a eficiência do BE,GnRH e eCG na 
sincronização da ovulação. Não houve diferença na taxa de ovulação entre os 
48 
 
três hormônios testados. Além de ser uma opção mais barata, o BE, induz um 
comportamento estral mais caracterizado (considerável descarga de muco e 
melhor abertura da cérvix) comparado com animais tratados com GnRH e eCG 
(MARTINEZ et al., 2002). 
 
 
Figura 11- Presença do CL no Inicio do Protocolo, Manifestação do Estro e Taxa de 
Concepção 
Segundo Martinez ( 2000), em seu experimento usando os mesmos dois 
protocolos, observou uma manifestação de estro maior no grupo tratado com 
Benzoato de Estradiol. Na Figura 11 podemos comparar as variáveis 
estudadas, ou seja, presença do CL como indicativo de ciclicidade, 
manifestação do estro como indicativo da sincronização do estro e a taxa de 
concepção. 
O grupo 2 (GnRH) foi o que obteve maiores índices de animais com 
presença de CL no inicio dos tratamentos, e o grupo 1 (benzoato de Estradio) 
foi o que obteve maiores índices de manifestação do estro. Como dito 
49 
 
anteriormente, todos esses parâmetros diferenciados, não alterou a taxa de 
concepção. Segundo Kim (2005), os tratamentos com GnRH apresentou 
melhor taxa de prenhez, sincronia do estro e crescimento folicular e um melhor 
folículo pré-ovulatorio,comparado com os protocolos utilizando Benzoato de 
Estradiol, em vacas de leite. Colazo (2004) mostrou em seu trabalho que não 
teve diferença significativa na taxa de concepção de novilhas tratadas com 
protocolos usando GnRH e ECP respectivamente. 
 
3.2. Análise Estatística 
 A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o teste qui-
quadrado (GOMES, 2009), para frequência das variáveis " prenhez X 
tratamento"( Tabelas 4 e 5). 
Tabela 4 – Frequência Observada para o Teste Qui-quadrado 
 PRENHA N PRENHA TOTAL 
BE NOVILHAS 11 24 35 
BE VACA 5 5 10 
GnRH NOVILHAS 11 24 35 
GnRH VACA 5 5 10 
TOTAL 32 58 90 
 
Tabela 5 – Frequência Esperada para o Teste Qui-quadrado 
 PRENHA N PRENHA 
BE NOVILHAS 12,45 22.56 
BE VACA 3,56 6,45 
GnRH 
NOVILHAS 12,45 22.56 
GnRH VACA 3,56 6,45 
 
50 
 
O valor encontrado para o teste qui-quadrado foi 0,5410 e o tabelado 
para 3 graus de liberdade a 5% é 7,82. Portanto, não há diferença significativa 
a 5 % entre os dois protocolos ( GOMES, 2009). 
 
 
51 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. CONCLUSÃO 
 
Podemos observar que os tratamentos com benzoato de estradiol e 
GnRH não mostraram diferença na taxa de concepção, de novilhas ou vacas. 
 
52 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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