Cachorro-do-mato - Relatório parcial

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO MARANHÃO
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Título do Projeto do Orientador:
Filogeografia e História Populacional de Canídeos Sul-Americanos (Carnivora, Canidae), utilizando uma Abordagem Genômica
Título do Plano de Trabalho do Bolsista: 
Filogeografia e História Populacional de Cerdocyon thous (Carnivora, Canidae), com Base em Dados Genômicos
HELEN SUSANY MELO DA SILVA
Orientador(a): Ligia Tchaicka 
Co-orientador(a): Fabricio Silva Garcez 
Equipe Executora:
Ligia Tchaicka – Professora Adjunto III – DBIO (UEMA)
Fabricio Silva Garcez – Doutor em Ecologia e Evolução da Biodiversidade – PUCRS
Helen Susany Melo da Silva – Graduanda em Ciências Biológicas Licenciatura – UEMA
Lucas Mendes Silva - Graduando em Ciências Biológicas Licenciatura - UEMA
São Luís – MA
2022
Título do Projeto do Orientador:
Filogeografia e História Populacional de Canídeos Sul-Americanos (Carnivora, Canidae), utilizando uma Abordagem Genômica
Título do Plano de Trabalho do Bolsista: 
Filogeografia e História Populacional de Cerdocyon thous (Carnivora, Canidae), com Base em Dados Genômicos
Relatório Parcial de Iniciação Científica, pela Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão, FAPEMA, apresentado à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, PPG, da Universidade Estadual do Maranhão – UEMA.
____________________________ ________________________________
 Assinatura do Orientador 				 Assinatura do Bolsista
Dra. Ligia Tchaicka 					Helen Susany Melo da Silva
RESUMO
O Cerdocyon thous é um mamífero carnívoro e generalista com ampla distribuição geográfica, detém um importante papel na dispersão de sementes e ecologia de estradas, além de ser um animal bastante recorrente nos artigos de levantamento de atropelamentos da fauna silvestre. Este trabalho propõe realizar inferências comparativas acerca da estrutura populacional e da história demográfica desta espécie através da análise de dados genômicos obtidos através da técnica de GBS (genotypeby-sequencing) para 39 indivíduos, distribuídos ao longo da área de ocorrência da espécie. Para tal, foram realizados testes de otimização de pipeline com a perspectiva de melhorar a qualidade dos dados, onde, pudemos observar que, quanto maiores os valores utilizados de -m (número mínimo de reads exigidos para formar um stack), menor a quantidade de loci identificados e de SNPs gerados no conjunto de dados final. Sendo o recomendado a utilização de baixos valores de -m para conjuntos de dados que possuem uma baixa cobertura média por indivíduo (< 15), situação concordante com o conjunto de dados gerados no estudo. Desse modo, espera-se otimizar a pipeline com o intuito de melhorar qualidade dos dados e consequentemente torna-los mais confiáveis para a viabilização de medidas para o manejo e conservação da espécie. 
Palavras-chave: Cerdocyon thous. Next-Generation Sequencing. Conservação.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Mapa da atual distribuição geográfica de C. brachyurus (International Unions for Conservation of Nature. Os pontos destacados no mapa correspondem aos locais aonde foram realizadas as coletas para o estudo	11
Quadro 1 - Classificação taxonômica do cachorro-do-mato	8
Quadro 2 - Parâmetros Stacks denovo map.pl padrão	14
Tabela 1 - Resultados dos testes	14
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO	6
1.1 Cachorro-do-mato: caracterização	6
1.2 Cachorro-do-mato: comportamento e alimentação	7
1.3 Cachorro-do-mato: distribuição geográfica	8
1.4 Filogeografia e história evolutiva do Cachorro-do-mato	8
2 OBJETIVOS	9
2.1 Objetivo geral	9
2.2 Objetivos específicos	9
3 METODOLOGIA	9
4 RESULTADOS PARCIAIS	11
4.1 Otimização Do Pipeline Denovo Map.Pl	11
5 CONSIDERAÇÕES PARCIAIS	14
REFERÊNCIAS	16
1 INTRODUÇÃO 
Diante da biodiversidade faunística sul-americana, os canídeos são considerados uma das famílias mais abrangentes em termos de espécies presentes no continente (ZURANO, 2015), adentrando na América do Sul há cerca de três Ma (milhões de anos) através do Istmo do Panamá, sofrendo inúmeros processos de irradiação adaptativa, que possibilitaram sua distribuição ao longo dos mais variados biomas presentes na região (BERTA, 1987; JÚNIOR, 2008; LANGGUTH, 1975). 
Tendo em vista o canídeo de médio porte cachorro-do-mato, Cerdocyon thous (LINNAEUS, 1766), um mamífero carnívoro e generalista com ampla distribuição geográfica (BERTA,1982). Por ser generalista, o animal é encontrado em diferentes tipos de formações vegetais, mas vive principalmente em áreas abertas, savanas, florestas abertas e áreas de borda (CHEIDA et al. 2006; BEISIEGEL et al. 2013).
O cachorro-do-mato detém um importante papel como potencial dispersor de sementes e na ecologia de estradas (MORELLATO, 1992). O Cerdocyon thous é um animal bastante recorrente nos artigos de levantamento de atropelamentos da fauna silvestre, sendo um dos mamíferos mais atropelados no Brasil (DORNAS et al. 2012; BEISIEGEL et al. 2013).
Nessa perspectiva, é necessário investigar por meio de análise de marcadores (NGS, Next Generation Sequencing) mais informações sobre a estrutura genética e a história evolutiva desta espécie. Os dados gerados podem fornecer uma base científica para o desenvolvimento de estratégias que visem proteger a variabilidade genética das populações ao longo de sua distribuição. Dessa forma, acarreta como consequência, na preservação do bioma encontrado na região Maranhense, uma vez que o cachorro-do-mato tem sua ocorrência confirmada no estado (ICMBIO, s.d.).
1.1 Cachorro-do-mato: caracterização
O cachorro-do-mato Cerdocyon thous (LINNAEUS, 1766) foi o primeiro canídeo sul-americano descrito na literatura (BISBAL; OJASTI, 1980). Atualmente, sua classificação taxonômica encontra-se completa e definida, tal como mostrado por Linnaeus, 1766.
Quadro 1 - Classificação taxonômica do cachorro-do-mato
	Categoria
Reino
	Táxon
Animalia
	Filo
	Chordata
	Classe
	Mammalia
	Ordem
	Carnivora
	Família
	Canidae
	Gênero
	Cerdocyon
	Espécie
	C. thous
Fonte: Linanaeus (1766).
O graxaim-do-mato possui membros pélvicos robustos, pernas curtas e fortes e sua cauda é longa e espessa. A pelagem varia entre o preto amarronzado na região das costas, face, calda e nas orelhas, possuindo áreas vermelhas no rosto e pernas. Além disso, a espécie pode atingir um peso adulto de 4,5 a 7,7 quilos, sendo o comprimento médio da cabeça e do corpo de 64,3 centímetros e o comprimento médio da cauda de 28,5 centímetros (BERTA, 1982).
1.2 Cachorro-do-mato: comportamento e alimentação
O animal pode ser observado nas margens de estradas durante o período da noite à procura de vestígios de animais atropelados (BERTA, 1982). Tendem a preferir bordas e ambientes mais abertos a matas densas (VIEIRA; PORT, 2007). Sendo tolerante a perturbações antrópicas (COURTENAY; MAFFEI 2004), eles ocupam uma área de aproximadamente 0,6 a 0,9 km, podendo ser encontrado vivendo, a maior parte do tempo, de forma solitária a não ser durante a época de reprodução. São monogâmicos, vivendo em casais ou grupos familiares estendidos (MACDONALD; COURTENAY 1996, EISENBERG; REDFORD, 1999). 
A espécie apresenta dieta generalista, se alimentando preferencialmente de frutos, no entanto, por ser um animal onívoro, pode se alimentar de aves, crustáceos, insetos, ovos e pequenos roedores (BERTA, 1982). Atuam na dispersão de sementes, de espécies nativas como também de cultivadas, dessa forma contribuem para a manutenção da flora da região e também a recuperação de áreas afetadas (MORELLATO, 1992). 
1.3 Cachorro-do-mato: distribuição geográfica
O Cerdocyon thous possui ampla distribuição na América do Sul, ocorrendo desde o norte da Colômbia, Venezuela, Paraguai, norte da Argentina, Uruguai, Bolívia, tendo poucos registros no Suriname, Guiana, além de possuir grande distribuição em maior parte do Brasil, com exceção de parte da Amazônia. Sua distribuição na Amazônica limita-se a áreas ao sudeste e nordeste do rio Amazonas, rio Negro, rio Araguaiae sul do rio Beni, na Bolívia (COURTENAY; MAFFEI 2004).
A espécie está amplamente distribuída pelo país, mas a lista de unidades de conservação onde há registros de sua existência apresenta dados incompletos (ILUCHERINI, 2009). Ainda de acordo com a IUCN, a área de distribuição geográfica da espécie, que inclui áreas fora do Brasil, está em 98 unidades de conservação, com várias UCs ​​incluídas no SNUC em outras categorias, como terras indígenas e reservas. No entanto, todas essas unidades de conservação contabilizam apenas 14,55% da distribuição geográfica da espécie.
1.4 Filogeografia e história evolutiva do Cachorro-do-mato
Os canídeos originaram-se há cerca de cinquenta milhões de anos, ao final do período Eoceno, advindos de um grupo de carnívoros da família Miacidae, na região América do Norte (SILERO-ZUBURI et al., 2004). O estudo de Tedford (1978) sugere três radiações de canídeos, sendo as subfamílias: Hesperocyninae, Borophaginae e Caninae, no entanto as duas primeiras já foram extintas. 
Estudos indicam que ao final do Mioceno, a subfamília Caninae cruzou o Estreito de Bering e adentrou a Europa, dando início a uma radiação de espécies do Velho Mundo (WAYNE et al., 1989; WANG et al., 2004). Ao final do Piloceno e início do Pleistoceno, há cerca de três milhões de anos, os canídeos chegaram à América do Sul, através da formação do Istmo do Panamá e logo adaptaram-se ao continente (WANG et al., 2004). 
Dessa forma o C. thous que hoje ocupa praticamente toda a América do Sul apresenta duas UES: um clado Norte antigo (ocupa o norte-nordeste Brasileiro) e um clado Sul fruto de expansão recente (nas terras ao sul do estado da Bahia) (TCHAICKA et al, 2007). Dessa forma, haveria o retrato de uma barreira histórica na região próxima ao Sul da Bahia, atribuída aos refúgios de florestas durante as glaciações do Pleistoceno.
Estudos que envolvem uma abordagem filogeográfica possuem o potencial de revelar importantes descobertas a respeito do comportamento histórico da distribuição geográfica de uma espécie, como por exemplo, possíveis rompimentos históricos e locais de maior diversidade (LION, 2007).
Ainda assim, apesar de sua diversidade, e comparados a outros grupos de mamíferos, ainda são poucas pesquisas que abordam a filogeografia e diversidade genética de 13 populações de canídeos no Brasil (JÚNIOR, 2008), como por exemplo, os estudos de Tchaicka et al. (2006), Girman et al. (2001), Vilà et al. (1999) e Garcez (2015) e Tchaicka et al. (2016). O cenário se torna ainda mais desfavorável quando consideramos estudos que envolvam, como base de dados, marcadores genômicos obtidos através de técnicas de NGS.
2 OBJETIVOS 
2.1 Objetivo geral 
· Investigar a influência de processos demográficos recentes e históricos nos padrões de estruturação populacional de Cerdocyon thous
2.2 Objetivos específicos 
· Realizar inferências comparativas acerca da estrutura populacional e da história demográfica de C. thous com base na análise de marcadores gerados a partir de uma investigação genômica. 
· Contribuir com dados úteis ao planejamento da conservação da biodiversidade na região geográfica estudada.
3 METODOLOGIA 
Para o estudo, foram realizadas coletas de material biológico obtido ao longo da maior parte da área de distribuição da espécie (Figura 1). Os tecidos são provenientes de sangue de animais capturados para estudos ecológicos, e preservado com a solução TES (100mM Tris, 100mM EDTA, 2% SDS), ou de animais encontrados atropelados, a partir dos quais amostras de músculo, coletadas e preservadas em etanol 95%. As amostras foram mantidas em laboratório, refrigeradas a -20°C, integrando as coleções de Tecidos do Laboratório de Genômica da PUCRS e a Coleção de Tecidos e DNA da Fauna Silvestre Maranhense – UEMA. 
Figura 1 - Mapa da atual distribuição geográfica de C. brachyurus (International Unions for Conservation of Nature. Os pontos destacados no mapa correspondem aos locais aonde foram realizadas as coletas para o estudo
Fonte: IUCN, 2020.
A extração de DNA foi realizada através de um protocolo de fenol/clorofórmio seguido da precipitação por acetato de sódio/isopropanol, modificado a partir de Sambrook et al. (1989). O grau de integridade e concentração do DNA obtido foi verificado por eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, corado com GelRed (Biotium). Em parceria com a Escola Superior de Agricultura Luis de Queiroz (ESALQ) da Universidade de São Paulo, já foram gerados para o estudo dados de GBS (do inglês, genotype-by-sequencing) para 39 indivíduos (Figura 1). As bibliotecas genômicas foram preparadas seguindo protocolos otimizados pela consultoria ambiental EcoMol em parceria com a ESALQ / USP, Brasil e sequenciadas por meio de sequenciador de alto desempenho HiSeq 2000 (Illumina). 
Com o objetivo de aliar a identificação dos locus de maneira espacial ao longo dos cromossomos da espécie, e a otimização da geração de dados informativos das populações, importantes na realização das análises filogeográficas do estudo, utilizaremos uma abordagem integrada para a identificação de sítios polimórficos (SNPs) entre os indivíduos. As sequências produzidas e identificadas serão alinhadas através do protocolo de novo, sem a utilização inicial do genoma de referência e os SNPs serão identificados por meio do programa Stacks.
 Após a etapa de montagem dos locus e identificação dos SNPs, o conjunto de dados será alinhado com o genoma de referência da espécie, com o objetivo de calcularmos as estatísticas espaciais em cada cromossomo, e então reintegrados às análises do Stacks para os cálculos populacionais (PARIS et al. 2017; ROCHETTE et al. 2017).Também nessa etapa, uma pipeline do Stacks passará por um processo de teste de otimização, onde serão testados os principais parâmetros, com a perspectiva de melhorar a qualidade dos dados.
4 RESULTADOS PARCIAIS
4.1 Otimização Do Pipeline Denovo Map.Pl 
Os algoritmos de bioinformática são executados através de uma sequência de instruções pré-determinadas com a função de processar os dados de NGS (Next- Generation Sequencing) que, em conjunto, são denominados de pipelines. Um pipeline de bioinformática orienta e processa progressivamente dados de NGS através de uma série de conversões de dados, utilizando vários componentes de softwares, bancos de dados e ambientes operacionais, de forma geral os pipelines realizam o reconhecimento, o que envolve otimização de dados de entrada pela execução de padronização de dados, limpeza, aprimoramento e verificações de qualidade.
Assim como os equipamentos de hardware e software passam por um processo de controle de qualidade, cada passo de um pipeline de NGS emite controles de qualidade, que são fundamentais para acompanhar a qualidade das análises para solução de possíveis problemas, e para estar em conformidade com os requisitos de validação e regulamentação do mesmo. 
Além disso, é importante lembrar que um pipeline de bioinformática depende tipicamente da disponibilidade de alguns recursos, como capacidade de armazenamento adequada, computadores, conexão à rede, ambiente apropriado para execução dos softwares. Desse modo, a otimização desses pipelines se torna fator bastante importante a se considerar, pois esta pode contribuir de forma a encorajar pesquisadores e as próprias organizações a avaliar e melhorar os processos de uma forma mais rápida e com a aplicação de métodos ainda mais simples. 
Tendo isso em vista, este trabalho utiliza diversos softwares para realizar análises genômicas e assim realizar inferências de forma a responder os questionamentos gerados através dos anos sobre um grupo ou uma determinada espécie. Um dos softwares utilizados para realizar essas análises é o pacote de programas Stacks (CATCHEN et al., 2013; ROCHETTE et al., 2019), um software que possui um conjunto de pipelines de softwares para construir loci a partir de sequências de leitura curta, como aquelas geradas na plataforma Illumina, sendo desenvolvido para trabalhar com dados baseados em enzimas de restrição, como RAD-seq,com a finalidade de construir mapas genéticos e realizar inferências filogeográficas acerca de populações.
Dentre os pipelines do software, foram realizadas até o momento leituras utilizando as pipelines denovo_map.pl onde este, executa cada um dos componentes do Stacks para criar um mapa de ligação genética ou para identificar os alelos em um conjunto de populações, ou seja, permite a inferência de genótipos através da identificação de locis e SNPS sem um genoma de referência. E posteriormente, serão realizadas inferências com a pipeline denovo ref_map.pl, sendo este recebe os dados de entrada alinhados por referência e executa cada um dos componentes Stacks, usando o alinhamento utilizando um genoma de referência para formar as pilhas e identificar os alelos. 
Com a perspectiva de melhorar os resultados e tentar otimizar o processo de análise, resolvemos testar os parâmetros da pipeline, de forma a realizar testes com os parâmetros padrão modificados, com a proposta de visualizar as possíveis diferenças entre os valores alterados e os padronizados. Cabe mencionar que, os testes foram realizados modificando apenas um parâmetro por vez, separadamente, observando e registrando-se a influência de cada um destes nos números de locis e SNPS gerados no conjunto de dados final.
Quadro 2 - Parâmetros Stacks denovo map.pl padrão
	Descrição do parâmetro
	Parâmetro
	Componente de pipeline
	Parâmetro do componente
	Valor padrão
	
	denovo_map.pl
	
	
	
	Profundidade mínima da pilha/profundidade mínima de cobertura.
	- m
	Ustacks
	- m
	3
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Distância permitida entre pilhas.
	- M
	Ustacks
	- M
	2
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Distância permitida entre os loci do catálogo.
	- n
	Cstacks
	- n
	1
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Fonte: Adaptado de CATCHEN J, Hohenlohe P, Bassham S et al. (2013)
Desse modo, testamos os três principais parâmetros da pipeline denovo map.pl, quanto ao número de SNPs gerados e de loci identificados, sendo estes: i) o número mínimo de reads exigidos para formar um stack (-m); ii) o número de erros permitidos entre locus no processamento de indivíduos (-M); iii) o número de erros permitidos entre locus na construção do catálogo (-n).
Tabela 1 - Resultados dos testes
	Parâmetros Padrão (M,m,n)
	Locis 
	SNPS
	
	4184
	960
	Parâmetros Alterados
	Locis 
	SNPS
	M = 4
	4024
	1457
	M = 5
	4045
	1390
	M = 6
	4079
	1263
	M = 7
	3997
	1810
	M = 8
	3975
	1959
	M = 9
	3969
	2168
	
	
	
	m = 4
	1360
	586
	m = 5
	1582
	660
	m = 6
	2034
	721
	m = 7
	1213
	532
	m = 8
	1131
	478
	m = 9
	1068
	454
	
	
	
	n = 2
	4061
	1308
	n = 3
	4086
	1199
	n = 6
	4129
	1060
	n = 8
	4000
	1658
	n = 10
	3987
	1771
	n = 12
	3978
	1898
Fonte: Próprios autores
Ao analisarmos a quantidade de dados obtidos para cada uma das combinações testadas, podemos observar uma maior influência sendo causada pelos parâmetros -M (número de erros permitidos entre loci no processamento de indivíduos) e -n (número de erros permitidos entre loci na construção do catálogo), sendo que, quanto maior os valores utilizados para ambos, maior a quantidade de SNPs obtidos no conjunto final de dados (Tabela 1).
Altos valores de -n e -M são recomendados para conjuntos de dados de espécies que são caracterizadas por possuírem uma alta taxa de polimorfismos genéticos e de divergência genômica (MASTRETTA-YANES et al., 2015; PARIS, STEVENS, & CATCHEN, 2017). Estudos visando avaliar a diversidade genética nas populações de C. thous, com base na análise de marcadores tradicionais (sequências nucleares e DNA mitocondrial), indicaram um alto nível de polimorfismos para as populações dessa espécie, distribuídas por uma ampla área do continente sul-americano (TCHAICKA et al. 2007). Tais resultados tendem a justificar o uso de valores maiores para ambos os índices (-n e -M), de acordo com as características de diversidade genética já inferidas por estudos anteriores. 
Cabe ressaltar que, ao considerarmos a utilização de valores muito elevados de -M, podemos suprimir a identificação de loci parálogos na população, ocasionando na perda de informações importantes na reconstrução filogeográfica da espécie e de análises de índices de diversidade genética (PARIS, STEVENS & CATCHEN, 2017). Uma maneira de solucionar o problema pode ser conseguida através da utilização do script PMERGE, como etapa adicional na geração do catálogo de SNPs, com o objetivo de identificar prováveis sequências variantes parálogas (ou PSVs, do inglês paralogous sequence variants) nos catálogos gerados durante as análises, e, dessa forma, otimizar a obtenção de um conjunto de dados mais confiáveis (Ravindran et al. 2018).
Por outro lado, pudemos observar durante os testes de otimização dos parâmetros, que quanto maiores os valores utilizados de -m (número mínimo de reads exigidos para formar um stack), menor a quantidade de loci identificados e de SNPs gerados no conjunto de dados final (Tabela 1). Tal parâmetro está diretamente correlacionado com o número de sequências geradas para cada região do genoma de cada indivíduo, ou grau de cobertura das regiões (depth coverage). Sendo o recomendado a utilização de baixos valores de -m para conjuntos de dados que possuem uma baixa cobertura média por indivíduo (< 15) (Catchen et al., 2013), situação concordante com o conjunto de dados gerados no estudo.
5 CONSIDERAÇÕES PARCIAIS
Assim, a otimização dos dados com a perspectiva de garantir a sua qualidade, é um fator primordial para tornar aptas as demais etapas, como as etapas de identificação das possíveis sequências variantes parálogas, análise das relações filogenéticas e a investigação da ancestralidade das populações identificadas o qual demandam um maior trabalho computacional. Entretanto, a condução da pesquisa segue de acordo com o cronograma.
Para os próximos passos, realizaremos mais testes a fim de otimizar as pipelines discutidas no capítulo anterior, só que, dessa vez, utilizando a pipeline denovo ref_map.pl, a fim de conseguir o conjunto de SNPS finais para a realização das inferências. Além da realização dos cálculos de diversidade genética, a fim de elucidar aspectos relevantes da biologia da espécie para fins de manejo e conservação.
Ao final das etapas mencionadas, espera-se detalhar a constituição genética do indivíduo estudado, bem como descrever sua história evolutiva, desse modo, realizado um estudo sobre as inferências filogeográficas e realizar um comparativo de padrões demográficos com outras populações simpátricas de canídeos, oferecendo melhores dados e consequentemente mais confiáveis para a viabilização de medidas para o manejo e conservação do cachorro-do-mato (Cerdocyon thous).
Assim, este estudo se evidencia como precursor para o estado do Maranhão, tornando-se uma das poucas pesquisas realizadas no Nordeste a operar e empregar dados de sequenciamento de nova geração (Next-Generation Sequencing) para estudos abordando fatores filogeográficos.
REFERÊNCIAS
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BISBAL FJ e JD OJASTI. 1980. Nicho trofico del zorro Cerdocyon thous (Mammalia Carnivora). Acta Biologica Venezolana 10: 469-496.
CATCHEN J, Hohenlohe P, Bassham S et al. (2013) Stacks: an analysis tool set for population genomics. Molecular ecology. 22, 3124–40.
Courtenay, O. & Maffei, L. 2004. Crab-eating fox Cerdoyon thous (Linnaeus, 1766). pp. 32-38. Courtenay, O. & Maffei, L. 2008.
EISENBERG, J.; K. REDFORD. Mammals of the Neotropics : the Central Neotropics. Chicago: University of Chicago Press, 1999. 611p
GARCEZ, Fabricio Silva. Filogeografia e história populacional de Lycalopex vetulus (Carnivora, Canidae), incluindo sua hibridação com L. gymnocercus. 2015. 56 p. Dissertação (Mestre) - Faculdade de Biociências - Programa de Pós-Graduação em Zoologia da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre - RS, 2015. Disponível em: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/6409. Acesso em: 14 fev. 2022. 
GIRMAN, D. J. et al. Patterns of population subdivision,gene flow and genetic variability in the African wild dog (Lycaon pictus). Molecular Ecology, p. 1703-1723, 2001. DOI 10.1046 / j.0962-1083.2001.01302.x. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11472538/. Acesso em: 14 fev. 2021.
JÚNIOR, Paulo Henrique de S. Prates. Diversidade genética e história evolutiva do lobo -guará (Chrysocyon brachyurus). PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL, Rio Grande do Sul, p. 1-63, 2008. Disponível em: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/165. Acesso em: 21 novembro 2021. 
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MORELLATO, L. P. C. História Natural da Serra do Japi: ecologia e preservação de uma área florestal no sudeste do Brasil.Campinas: UNICAMP/FAPESP, 1992. 321 p
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TCHAICKA, Ligia. A. Abordagens filogenéticas, filogeográficas e populacionais em canídeos sul americanos. 2006. Tese (Doutor em Ciências) - Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da UFRGS, Porto Alegre, 2006. p. 172. Disponível em: https://lume.ufrgs.br/handle/10183/10935. Acesso em: 13 fev. 2021. 
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