Replicacao do Livro de Benjamim Pierce

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E
Topoisomerase, replicação e câncer
Em 1966, Monroe Wall e Mansukh Wani encontraram na casca da árvore-feliz (Camptotheca acuminata), uma planta rara
nativa da China, uma cura potencial para o câncer. Wall e Wani trabalhavam na seleção de várias substâncias naturais com
atividade anticâncer, na esperança de encontrar substâncias químicas que pudessem ter eficácia comprovada no tratamento da
doença. Eles descobriram que um extrato dessa árvore era efetivo no tratamento de leucemia em camundongos. Por meio de
análise química, eles conseguiram isolar o composto ativo, que foi batizado de camptotecina.
Na década de 1970, os médicos administravam camptotecina a pacientes com cânceres incuráveis. Embora o fármaco
mostrasse atividade anticâncer, ele tinha efeitos colaterais tóxicos. Os químicos acabaram sintetizando vários análogos da
camptotecina que eram menos tóxicos e mais eficientes no tratamento do câncer. Dois desses análogos, topotecano e
irinotecano, são usados hoje em dia para o tratamento de cânceres de ovário, das células pequenas do pulmão e do cólon.
Por muitos anos, o mecanismo de inibição do câncer pelos derivados da camptotecina era desconhecido. Em 1985, quase 20
anos após sua descoberta, cientistas da Universidade de Johns Hopkins e dos laboratórios Smith Kline and French Laboratories
(atualmente GlaxoSmithKline) mostraram que a camptotecina inibia um componente importante do maquinário da síntese do
DNA nos seres humanos, uma enzima chamada topoisomerase I.
A quimioterapia para o câncer é uma tarefa delicada porque as células-alvo são do próprio paciente, e os fármacos precisam
matar apenas as células do câncer, preservando a vida do paciente. Uma das características do câncer é a proliferação: a divisão
das células do câncer é desregulada e muitas células se dividem muito rapidamente, dando origem a tumores capazes de crescer
e se disseminar. Como aprendemos no Capítulo 2, antes que uma célula possa se dividir, ela precisa replicar seu DNA de modo
que cada célula-filha receba uma cópia exata do material genético. Os pontos de verificação no ciclo celular garantem que a
divisão celular não prossiga se a replicação do DNA for inibida ou defeituosa, e muitos tratamentos de câncer têm como foco a
replicação do DNA.
A replicação do DNA é um processo complexo que requer vários componentes, e suas ações têm de estar intrinsecamente
coordenadas a fim de garantir que o DNA seja copiado com fidelidade. Um componente essencial da replicação é a
topoisomerase. À medida que o DNA se desenrola durante a replicação, tensão se acumula na frente da separação e as duas fitas
se torcem ao redor uma da outra, como um nó de corda à medida que você afasta suas fitas. Essa torção do DNA é chamada
superenrolamento (ver Capítulo 11). Os superenrolamentos, se não são removidos, acabam interrompendo a separação da fita, e
a replicação é pausada.
As enzimas topoisomerase removem os superenrolamentos ao segurar firmemente o DNA e romper uma ou ambas as fitas.
As fitas então rodam ao redor uma da outra, removendo o superenrolamento e a tensão. Após o DNA estar relaxado, a
topoisomerase que removeu os superenrolamentos fecha novamente as extremidades rompidas do DNA.
A camptotecina interfere na topoisomerase I. O fármaco se insere no espaço criado pela ruptura da fita de DNA, impedindo a
topoisomerase de fechar novamente as extremidades rompidas. Originalmente, os pesquisadores acreditavam que esse fármaco
se prendesse à topoisomerase e bloqueasse a ação de outras enzimas necessárias à síntese do DNA. Entretanto, uma pesquisa
recente indica que ele modifica a topoisomerase de modo a incapacitar a remoção dos superenrolamentos à frente da replicação.
O acúmulo de superenrolamentos pausa o maquinário de replicação e evita a proliferação das células de câncer. Como muitos
outros fármacos ativos contra o câncer, a camptotecina também inibe a replicação de células normais, não cancerosas, o que
explica como a quimioterapia afeta a saúde dos pacientes.
ste capítulo estuda a replicação do DNA, o processo pelo qual uma célula duplica seu DNA antes da divisão. Começamos
com o mecanismo básico de replicação que surgiu a partir da estrutura do DNA apresentada por Watson e Crick. Então
examinamos vários modos diferentes de replicação, as exigências da replicação e a direção universal da síntese do DNA.
Examinamos também as enzimas e proteínas que participam do processo. Finalmente, analisamos os detalhes moleculares da
recombinação, que está intimamente relacionada com a replicação e é essencial para a separação dos cromossomos homólogos,
a produção de variação genética e o reparo do DNA.
12.1 As informações genéticas precisam ser copiadas com exatidão a
cada divisão celular
Em um jogo escolar, uma mensagem verbal, como “O cão marrom de João fugiu de casa”, é sussurrada para uma criança que
repete a mensagem para outra criança. A mensagem é transmitida de uma criança para outra no pátio escolar até retornar para a
primeira criança. Inevitavelmente, a última criança retorna com uma mensagem bem diferente, como “João Marrom tem um
porco que vive sob a varanda”. Quanto maior o número de crianças brincando, mais distorcida a mensagem fica. Esse jogo
ilustra um princípio importante: sempre surgem erros quando a informação é copiada, e, quanto mais vezes ela é copiada, maior
o potencial para erros.
Um organismo complexo e multicelular lida com um problema parecido ao das crianças no jogo: como transmitir as
instruções genéticas com fidelidade cada vez que a célula se divide. A solução para esse problema é fundamental para a
replicação. Um único zigoto humano tem 6,4 bilhões de pares de base de DNA; mesmo uma pequena taxa de erro durante a
cópia, como uma vez para cada milhão de pares de base, resultaria em 6.400 erros cada vez que a célula é dividida – erros que
seriam combinados a milhões de divisões celulares que ocorrem no desenvolvimento humano.
O processo de cópia do DNA precisa ser não apenas muito exato, mas também muito rápido. O único cromossomo circular
da E. coli tem cerca de 4,6 milhões de pares de base. Em uma taxa de mais de 1.000 nucleotídios por minuto, a replicação do
cromossomo inteiro levaria quase 3 dias. Ainda, como já foi afirmado, essas bactérias são capazes de se dividir a cada 20 min.
Na verdade, Escherichia coli replica seu DNA em uma taxa de 1.000 nucleotídios por segundo, com menos de um erro em um
bilhão de nucleotídios. Como ocorre esse processo extraordinariamente exato e rápido?
12.2 Toda replicação de DNA ocorre de modo semiconservativo
A partir da estrutura tridimensional do DNA proposta por Watson e Crick em 1953 (ver Figura 10.7), várias implicações
genéticas importantes estavam imediatamente aparentes. A natureza complementar das duas fitas de nucleotídios em uma
molécula de DNA sugere que, durante a replicação, cada fita serve como molde para a síntese de uma nova fita. A
especificidade do pareamento de bases (adenina com timina, guanina com citosina) indica que apenas uma sequência de bases
pode ser especificada para cada molde, e então as duas moléculas de DNA construídas a partir do par de moldes serão idênticas
à molécula original. Esse processo é chamado de replicação semiconservativa, porque cada fita original de nucleotídios
permanece intacta (conservada), apesar de não se combinar mais com a mesma molécula; a molécula original de DNA tem sua
metade (semi) conservada durante a replicação.
Inicialmente, foram propostos três modelos para a replicação do DNA. Na replicação conservativa (Figura 12.1 A), a
molécula inteira de DNA de fita dupla serve como molde para uma nova molécula inteira de DNA, e a molécula de DNA
original é totalmente conservada durante a replicação. Na replicação dispersiva (Figura 12.1 B), as duas fitas de nucleotídios se
rompem (dispersam) em fragmentos, que servem como molde para a síntese de novos fragmentos de DNA, e então de alguma
maneira se reúnem de novo em duas moléculas de DNA completas. Nesse modelo, cada molécula de DNA resultante é
intercaladacom fragmentos de DNA velho e novo; nenhuma molécula original é conservada. A replicação semiconservativa
(Figura 12.1 C) é intermediária entre esses dois modelos; as duas fitas de nucleotídios se desenrolam, e cada uma serve como
molde para uma nova molécula de DNA.
Figura 12.1 Os três modelos de replicação propostos são a replicação conservativa, a replicação dispersiva e a replicação
semiconservativa.
Esses três modelos tornam possível diferentes predições sobre a distribuição do DNA original e do DNA recém-sintetizado
após a replicação. Com a replicação conservativa, após um ciclo de replicação, 50% das moléculas seriam o DNA original e
50% seriam o DNA novo. Após um segundo ciclo de replicação, 25% das moléculas consistiriam totalmente em DNA original e
75% seriam totalmente constituídos por DNA novo. Com um novo adicional de replicação a proporção de moléculas com DNA
novo aumentaria, embora o número de molécula com o DNA original permanecesse constante. A replicação dispersiva sempre
produz moléculas híbridas, contendo DNA original e DNA novo, mas a proporção de DNA novo nas moléculas aumentaria
após cada replicação. Em contrapartida, com a replicação semiconservativa, um ciclo de replicação produziria duas moléculas
híbridas, cada uma com metade de DNA original e metade de DNA novo. Após um segundo ciclo de replicação, metade das
moléculas seria híbrida e a outra metade seria apenas DNA novo. Ciclos adicionais de replicação produziriam mais e mais
moléculas compostas inteiramente por DNA novo, e algumas moléculas híbridas persistiriam.
Experimento de Meselson e Stahl
Para determinar qual dos três modelos de replicação se aplica às células da E. coli, Matthew Meselson e Franklin Stahl
precisavam diferenciar o DNA velho do DNA novo. Eles conseguiram usando dois isótopos de nitrogênio, 14N (a forma
comum) e 15N (a forma rara, pesada). Meselson e Stahl cultivaram uma cultura de E. coli em um meio com 15N como única
fonte de nitrogênio; após várias gerações, todas as células da E. coli tinham 15N incorporado em todas as bases purina e
pirimidina de seu DNA (ver Figura 10.10). Os cientistas tiraram uma amostra dessas bactérias, trocaram o resto das bactérias
para um meio com apenas 14N e então retiraram outras amostras de bactérias durante as gerações seguintes. Em cada meio, o
DNA bacteriano sintetizado antes da troca do meio continha 15N e era relativamente pesado, enquanto qualquer DNA
sintetizado após a troca do meio tinha 14N e era relativamente leve.
Meselson e Stahl distinguiram entre o DNA marcado com 15N pesado e o DNA com 14N leve com o uso da centrifugação
por gradiente de densidade de equilíbrio (Figura 12.2). Nessa técnica, um tubo de centrífuga é preenchido com uma solução
de sal pesado e uma substância de densidade desconhecida – nesse caso, os fragmentos de DNA. O tubo é então centrifugado
em uma centrífuga em altas velocidades. Após vários dias de centrifugação, um gradiente de densidade se desenvolve dentro do
tubo, com a alta densidade no fundo e a baixa densidade no topo. A densidade dos fragmentos de DNA combina com a do sal:
as moléculas leves sobem e as moléculas pesadas descem.
Meselson e Stahl descobriram que o DNA a partir das bactérias que crescem apenas em um meio com 15N produzia uma
única banda na posição esperada do DNA com apenas 15N (Figura 12.3 A). O DNA das bactérias transferidas para o meio com
14N e que sofreram um ciclo de replicação também produziu uma banda única, mas em uma posição intermediária entre o DNA
esperado com apenas 15N e o DNA esperado com apenas 14N (Figura 12.3 B). Esse resultado não é consistente com o modelo
de replicação conservativa, que prevê uma banda pesada (as moléculas originais de DNA) e uma banda leve (as novas
moléculas de DNA). Uma única banda de densidade intermediária está prevista para os modelos semiconservativo e dispersivo.
Figura 12.2 Meselson e Stahl usaram a centrifugação por gradiente de densidade de equilíbrio para diferenciar o DNA pesado,
marcado com 15N, do DNA leve, marcado com 14N.
Para diferenciar entre esses dois modelos, Meselson e Stahl cultivaram as bactérias em um meio com 14N por uma segunda
geração. Após um segundo ciclo de replicação no meio com 14N, apareceram duas bandas de mesma intensidade, uma na
posição intermediária e outra na posição esperada para o DNA com 14N (Figura 12.3 C). Todas as amostras retiradas após
ciclos adicionais de replicação produziam as mesmas duas bandas, e a banda que representava o DNA leve se tornava
progressivamente mais forte (Figura 12.3 D). Os resultados de Meselson e Stahl eram exatamente os resultados esperados para
a replicação semiconservativa e eram incompatíveis com os resultados previstos para as replicações conservativa e dispersiva.
 Resolva o Problema 22
Conceitos
A replicação é semiconservativa: cada fita de DNA serve como molde para a síntese de uma nova molécula
de DNA. Meselson e Stahl demonstraram de modo convincente que a replicação na E. coli é
semiconservativa.
 Checagem dos conceitos 1
Quantas bandas de DNA seriam esperadas no experimento de Meselson e Stahl após dois ciclos de
replicação conservativa?
Experimento
Pergunta: Qual modelo de replicação de DNA – conservativa, dispersiva ou semiconservativa – aplica-se à
E. coli?
Conclusão: A replicação do DNA da E. coli é semiconservativa.
Figura 12.3 Meselson e Stahl demonstraram que a replicação do DNA é semiconservativa.
Modos de replicação
Após o trabalho de Meselson e Stahl, os investigadores confirmaram que outros organismos também usam a replicação
semiconservativa. Não foi encontrado indício da replicação conservativa ou dispersiva. Existem, entretanto, muitas formas
diferentes nas quais a replicação semiconservativa pode ocorrer, com diferença principalmente na natureza do DNA molde, ou
seja, se ele é linear ou circular.
As unidades de replicação são chamadas de replicons, cada uma com uma origem de replicação. A replicação inicia na
origem e continua até o replicon inteiro ser replicado. Os cromossomos bacterianos têm uma única origem de replicação,
enquanto os cromossomos eucarióticos têm várias origens.
Replicação teta. Um tipo comum de replicação que ocorre no DNA circular, como o encontrado na E. coli e em outras
bactérias, é chamado de replicação teta (Figura 12.4 A), porque ela gera uma estrutura que lembra a letra grega teta (ș). Nesta
figura e em todas as outras neste capítulo, a fita original (molde) de DNA é apresentada em cinza e a fita de DNA recém-
sintetizada é apresentada em vermelho.
Na replicação teta, o DNA de fita dupla começa a se desenrolar na origem da replicação, produzindo fitas de nucleotídios de
fita única que servem como moldes nos quais o novo DNA pode ser sintetizado. O desenrolamento da dupla-hélice gera uma
alça, chamada bolha de replicação. O desenrolamento pode ser em uma ou em ambas as extremidades da bolha, tornando-a
progressivamente maior. A replicação do DNA em ambas as fitas molde é simultânea com o desenrolamento. O ponto de
desenrolamento, onde as duas fitas únicas de nucleotídios se separam da hélice de fita dupla do DNA, é chamado de forquilha
de replicação.
Se existem duas forquilhas de replicação, uma em cada extremidade da bolha de replicação, as forquilhas continuam para fora
nos dois sentidos em um processo chamado de replicação bidirecional, simultaneamente abrindo e replicando o DNA até elas
se encontrarem. Se houver uma única forquilha de replicação, ela prossegue ao redor do círculo inteiro. Tanto a replicação
bidirecional quanto a unidirecional produzem duas moléculas de DNA circulares completas, cada uma com uma fita antiga e
uma fita nova de nucleotídios.
John Cairns forneceu a primeira evidência visível da replicação teta em 1963 ao cultivar bactérias na presença de nucleotídios
radioativos. Após a replicação, cada molécula de DNA tinha uma fita “quente” (radioativa) e uma fita “fria” (não radioativa).
Cairns isolou o DNA das bactérias após a replicação, colocou em uma grelha de microscopia eletrônica e entãoa cobriu com
uma emulsão fotográfica. A radioatividade na amostra expôs a emulsão e produziu uma imagem da molécula (chamada de
autorradiografia) semelhante à maneira pela qual a luz expõe um filme fotográfico. Como o DNA recém-sintetizado tem
nucleotídios radioativos, Cairns pode produzir uma micrografia eletrônica do processo de replicação, semelhante ao processo
apresentado na Figura 12.4 B.
Replicação por círculo rolante. Outro modo de replicação, chamado replicação por círculo rolante (Figura 12.5), ocorre
em alguns vírus e no fator F (um pequeno círculo de DNA extracromossômico que controla a reprodução, discutido no Capítulo
9) da E. coli. Esse modo de replicação é iniciado por uma ruptura em uma das fitas de nucleotídios que cria um grupo 3ƍ-OH e
um grupo 5ƍ-fosfato. Novos nucleotídios são adicionados à extremidade 3ƍ da fita rompida, com a fita interna (não rompida)
servindo como molde. À medida que novos nucleotídios são adicionados à extremidade 3ƍ, a extremidade 5ƍ da fita rompida é
deslocada do molde, rolando como um fio sendo retirado de um carretel. A extremidade 3ƍ cresce ao redor do círculo,
originando o nome de círculo rolante.
Figura 12.4 A replicação teta é um tipo de replicação comum na E. coli e em outros organismos com DNA circular. (Parte B:
Bernhard Hirt, L’Institut Suisse de Recherche Éxperimentale sur le Cancer.)
a.
b.
c.
d.
Figura 12.5 A replicação por círculo rolante ocorre em alguns vírus e no fator F da E. coli.
A forquilha de replicação continua ao redor do círculo várias vezes, produzindo várias cópias ligadas da mesma sequência.
Com cada volta ao redor do círculo, a extremidade 3ƍ crescente desloca a fita de nucleotídios sintetizada na volta seguinte.
Finalmente, a molécula de DNA linear é rompida do círculo, gerando uma molécula de DNA circular de fita dupla e uma
molécula de DNA linear de fita única. A molécula linear circula antes ou após servir como molde para a síntese de uma fita
complementar.
Replicação eucariótica linear. As moléculas de DNA circulares que sofrem replicação teta ou por círculo rolante têm uma
única origem de replicação. Por causa do tamanho limitado dessas moléculas de DNA, a replicação que inicia a partir da origem
consegue atravessar o cromossomo inteiro em um tempo razoável. Os cromossomos lineares maiores nas células eucarióticas,
entretanto, têm muito DNA para ser replicado rapidamente a partir de uma única origem. A replicação eucariótica prossegue em
uma taxa de 500 a 5.000 nucleotídios por minuto em cada forquilha de replicação (consideravelmente mais lenta que a
replicação bacteriana). Mesmo a 5.000 nucleotídios por minuto em cada forquilha, a síntese do DNA iniciando a partir de uma
única origem levaria 7 dias para replicar um típico cromossomo humano com 100 milhões de pares de base de DNA. A
replicação dos cromossomos eucarióticos ocorre em questão de minutos ou horas, e não dias. Essa velocidade é possível porque
a replicação inicia em milhares de origens.
Os replicons eucarióticos típicos têm de 20.000 a 300.000 pares de base de comprimento (Quadro 12.1). Em cada origem de
replicação, o DNA se desenrola e produz uma bolha de replicação. A replicação ocorre em ambas as fitas em cada extremidade
da bolha, com as duas forquilhas de replicação se espalhando para fora. Por fim, as forquilhas de replicação dos replicons
adjacentes correm na direção uma da outra, e os replicons se unem para formar longos trechos de DNA recém-sintetizado
(Figura 12.6). A replicação e a fusão de todos os replicons geram duas moléculas idênticas de DNA. As características
importantes das replicações teta, por círculo rolante e eucariótica linear, estão resumidas no Quadro 12.2. Resolva o
Problema 23
Conceitos
A replicação teta, a replicação por círculo rolante e a replicação linear apresentam diferenças com relação ao
início e progresso da replicação, mas todas produzem novas moléculas de DNA por meio da replicação
semiconservativa.
 Checagem dos conceitos 2
Que tipo de replicação requer a ruptura na fita de nucleotídios para começar?
Replicação teta.
Replicação por círculo rolante.
Replicação eucariótica linear.
Todas as opções anteriores.
Quadro 12.1 Número e tamanho dos replicons.
Organismo Número de origens de replicação
Tamanho médio do replicon
(pb)
Escherichia coli (bactéria) 1 4.600.000
Saccharomyces cerevisiae (levedura) 500 40.000
Drosophila melanogaster (mosca-da-
fruta)
3.500 40.000
Xenopus laevis (sapo) 15.000 200.000
Mus musculus (camundongo doméstico) 25.000 150.000
Fonte: Dados de B. L. Lewin, Genes V (Oxford: Oxford University Press, 1994), p. 536.
Figura 12.6 A replicação de DNA linear ocorre nos cromossomos eucarióticos.
Quadro 12.2 Características da replicação teta, por círculo rolante e eucariótica linear.
1.
2.
3.
Modelo de
replicação Molde de DNA
Ruptura da
fita de
nucleotídios
Número de
replicons
Unidirecional
ou
bidirecional Produtos
Teta Circular Não 1 Unidirecional ou
bidirecional
Duas moléculas
circulares
Por círculo rolante Circular Sim 1 Unidirecional Uma molécula circular
e uma molécula
linear que pode
circular
Eucariótica linear Linear Não Muitas Bidirecional Duas moléculas
lineares
Exigências da replicação
Embora o processo de replicação inclua muitos componentes, eles podem ser combinados em três grupos principais:
Um molde de DNA de fita dupla.
Matérias-primas (substratos) a serem montadas em uma nova fita de nucleotídios.
Enzimas e outras proteínas que “leem” o molde e reúnem os substratos em uma molécula de DNA.
Graças à natureza semiconservativa da replicação do DNA, uma molécula de DNA de fita dupla precisa se desenvolver para
expor as bases que atuam como molde para a montagem de novas fitas de polinucleotídios, que serão complementares e
antiparalelas às fitas molde. As matérias-primas a partir das quais novas moléculas de DNA são sintetizadas são os trifosfatos
de desoxirribonucleosídio (dNTPs), cada um composto por um açúcar desoxirribose e uma base (um nucleosídio) ligados a três
grupos fosfato (Figura 12.7 A). Na síntese de DNA, os nucleotídios são acondicionados ao grupo 3ƍ-OH da fita de nucleotídios
crescente (Figura 12.7 B). O grupo 3ƍ-OH do último nucleotídio na fita fixa-se ao grupo 5ƍ-fosfato do dNTP de chegada. Os
dois grupos fosfato são rompidos a partir do dNTP de chegada, e uma ligação fosfodiéster é criada entre os dois nucleotídios.
A síntese de DNA não acontece espontaneamente. Ela requer um grupo de enzimas e proteínas que atuam de maneira
coordenada. Examinaremos esse complexo arranjo de proteínas e enzimas à medida que analisarmos o processo de replicação
com mais detalhes.
Conceitos
A síntese de DNA requer um molde de DNA de fita única, trifosfatos de desoxirribonucleosídio, uma fita de
nucleotídios crescente e um grupo de enzimas e proteínas.
Figura 12.7 O novo DNA é sintetizado a partir de trifosfatos de desoxirribonucleosídio (dNTPs). A fita recém-sintetizada é
complementar e antiparalela à fita molde; as duas fitas estão mantidas unidas por pontes de hidrogênio (representadas por linhas
vermelhas pontilhadas) entre as bases.
Sentido de replicação
Na síntese do DNA, novos nucleotídios são unidos, um de cada vez, à extremidade 3ƍ da fita recém-sintetizada. As DNA
polimerases, enzimas que sintetizam DNA, podem adicionar nucleotídios apenas na extremidade 3ƍ da fita crescente (não na
extremidade 5ƍ), e então novas fitas de DNA sempre alongam no mesmo sentido 5ƍ para 3ƍ (5ƍ ĺ 3ƍ). Como os dois moldes de
DNA de fita única são antiparalelos e o prolongamento de fita é sempre 5ƍ ĺ 3ƍ, se a síntese em um molde segue, por exemplo,
da direita para a esquerda, então a síntese do outro molde deve seguir no sentido oposto, da esquerda para a direita (Figura
12.8). À medida que o DNA se desenrola durante a replicação, a natureza antiparalela das duas fitas de DNA significa que um
molde é exposto no sentido 5ƍ ĺ 3ƍ e o outro é exposto no sentido 3ƍ ĺ 5ƍ. Então, como a síntese pode ocorrer simultaneamente
em ambas as fitas na forquilha?
Replicação contínuae descontínua. À medida que o DNA se desenrola, a fita molde exposta no sentido 3ƍ ĺ 5ƍ (a fita
inferior nas Figuras 12.8 e 12.9) possibilita a síntese contínua da nova fita (no sentido 5ƍ ĺ 3ƍ). Essa nova fita, que sofre
replicação contínua, é denominada fita líder.
A outra fita molde é exposta no sentido 5ƍ ĺ 3ƍ (a fita superior nas Figuras 12.8 e 12.9). À medida que a extensão curta do
DNA for desenrolada, a síntese deve seguir 5ƍ ĺ 3ƍ; ou seja, no sentido oposto da fita não desenrolada (Figura 12.9). Como
apenas uma extensão curta de DNA precisa estar não enrolada antes de a síntese na sua fita começar, o maquinário de replicação
logo fica sem molde. Nesse momento, mais DNA está desenrolando, fornecendo um novo molde na extremidade 5ƍ da nova fita.
A síntese de DNA deve iniciar novamente na forquilha de replicação e seguir na direção oposta do movimento da forquilha até
chegar ao segmento previamente replicado de DNA. Esse processo é repetido várias vezes, então a síntese dessa fita ocorre em
explosões curtas, descontínuas. A fita recém-criada que sofre replicação descontínua é chamada de fita tardia.
Fragmentos de Okazaki. As extensões curtas de DNA produzidas pela replicação descontínua da fita tardia são chamadas
de fragmentos de Okazaki, descobertos por Reiji Okazaki. Nas células bacterianas, cada fragmento de Okazaki varia de 1.000
a 2.000 nucleotídios de extensão; nas células eucarióticas, varia de 100 a 200 nucleotídios. Esses fragmentos na fita tardia estão
ligados para criar uma nova molécula de DNA contínua.
Conceitos
a.
b.
c.
d.
Toda síntese de DNA é 5ƍ ĺ3ƍ, o que significa que novos nucleotídios são sempre adicionados à extremidade 3ƍ da fita de
nucleotídios crescente. Em cada forquilha de replicação, a síntese da fita líder segue de maneira contínua, e a da fita
tardia segue de maneira descontínua.
 Checagem dos conceitos 3
A replicação descontínua é o resultado de qual propriedade do DNA?
Bases complementares.
Grupo fosfato carregado.
Fitas de nucleotídios antiparalelas.
Açúcar de cinco carbonos.
Conceitos conectantes
O sentido da síntese em diferentes modelos de replicação
Vamos relacionar o sentido da síntese de DNA aos tipos de replicação examinados anteriormente. No modelo teta
(Figura 12.10 A), o DNA se desenrola em um lugar particular, a origem, e uma bolha de replicação é formada. Se a
bolha tem duas forquilhas, uma em cada extremidade, a síntese ocorre simultaneamente em ambas as forquilhas
(replicação bidirecional). Em cada forquilha, a síntese em uma das fitas molde prossegue no mesmo sentido que a fita
desenrolada; essa fita recém-replicada é a fita líder com replicação contínua. Na outra fita molde, a síntese segue no
sentido oposto que o da fita desenrolada; essa fita recém-sintetizada é a fita tardia com replicação descontínua. Observe
apenas uma das fitas molde dentro da bolha. Veja que a síntese nessa fita é contínua em uma forquilha, mas descontínua
em outra. Essa diferença surge porque a síntese do DNA está sempre no mesmo sentido (5ƍ ĺ 3ƍ), mas as duas forquilhas
se movem em sentidos opostos.
A replicação no modelo por círculo rolante ( Figura 12.10 B) é diferente, porque não há bolha de replicação. A
replicação começa na extremidade 3ƍ da fita de nucleotídios rompida. A replicação contínua ocorre no molde circular à
medida que novos nucleotídios são adicionados à extremidade 3ƍ.
A replicação de moléculas de DNA lineares, como as encontradas nas células eucarióticas, produz várias bolhas de
replicação (Figura 12.10 C). A síntese de DNA nessas bolhas é a mesma da única bolha de replicação do modelo teta;
ela começa no centro de cada bolha de replicação e segue em duas forquilhas, uma em cada extremidade da bolha. Em
ambas as forquilhas, a síntese da fita líder segue no mesmo sentido que da fita desenrolada, enquanto a síntese da fita
tardia segue no sentido oposto. Resolva o Problema 25 A a C
Figura 12.8 A síntese de DNA ocorre em sentidos opostos nas duas fitas molde de DNA. A replicação do DNA em uma única
forquilha começa quando uma molécula de DNA de fita única se desenrola para fornecer dois moldes de fita única.
Figura 12.9 A síntese do DNA é contínua em uma fita molde de DNA e descontínua em outra.
12.3 A replicação bacteriana exige numerosas enzimas e proteínas
A replicação ocorre em quatro estágios: iniciação, desenrolamento, prolongamento e terminação. A discussão do processo de
replicação a seguir se concentra nos sistemas bacterianos, nos quais a replicação foi estudada a fundo e é mais bem
compreendida. Embora muitos aspectos da replicação nas células eucarióticas sejam semelhantes aos das células bacterianas,
existem diferenças importantes. Vamos comparar a replicação bacteriana e eucariótica posteriormente neste capítulo.
Figura 12.10 O processo de replicação é diferente na replicação teta, na replicação por círculo rolante e na replicação linear.
Iniciação
O cromossomo circular da E. coli tem uma única origem de replicação (oriC). A sequência mínima necessária para oriC
funcionar é composta por 245 pb com vários sítios críticos. Uma proteína de iniciação (conhecida como DnaA na E. coli) liga-
se à oriC e faz um segmento curto do DNA se desenrolar. Esse desenrolamento torna possível que a helicase e outras proteínas
que se ligam à fita única prendam-se à fita de polinucleotídios (Figura 12.11).
Figura 12.11 A replicação do DNA da E. coli começa quando as proteínas de iniciação se ligam à oriC, a origem da replicação.
Desenrolamento
Como a síntese do DNA requer um molde de fita única e o DNA de fita dupla tiver de ser desenrolado antes que ocorra a síntese
de DNA, a célula depende de várias proteínas e enzimas para fazer a desenrolamento.
DNA helicase. A DNA helicase rompe as pontes de hidrogênio entre as bases de duas fitas de nucleotídios de uma molécula
de DNA. A helicase não pode iniciar o desenrolamento do DNA de fita dupla; a proteína de iniciação separa primeiro as fitas de
DNA na origem, fornecendo um curto segmento de DNA de fita dupla onde essa enzima se liga. A helicase liga-se ao molde da
fita tardia em cada forquilha de replicação e move-se na direção 5ƍ ĺ3ƍ ao longo dessa fita, também movendo a forquilha
(Figura 12.12).
Proteínas ligadoras de DNA de fita única. Após o DNA ser desenrolado pela helicase, as proteínas ligadoras de DNA
de fita única (SSBs) prendem-se firmemente ao DNA de fita única exposto (ver Figura 12.12). Essas proteínas protegem as
cadeias de nucleotídios de fita única e evitam a formação de estruturas secundárias como os grampos (ver Figura 10.17) que
interferem na replicação. De forma diversa à de muitas proteínas ligadoras de DNA, as SSBs são indiferentes à sequência de
base: elas se ligam a qualquer DNA de fita única. Essas proteínas formam tetrâmeros (grupos de quatro); cada tetrâmero
abrange de 35 a 65 nucleotídios.
DNA girase. Outra proteína essencial para o processo de desenrolamento é a enzima DNA girase, uma topoisomerase.
Conforme discutido no Capítulo 11 e na introdução deste capítulo, as topoisomerases controlam o superenrolamento do DNA.
Existem dois tipos principais dessa enzima: as topoisomerases tipo I alteram o superenrolamento ao fazer rupturas de fita única
no DNA, enquanto as topoisomerases tipo II criam rupturas de fita dupla. A DNA girase é uma topoisomerase tipo II. Na
replicação, ela reduz a tensão de torção (torque) que surge à frente da forquilha de replicação como resultado do desenrolamento
(ver Figura 12.12). Ela reduz o torque ao romper a fita dupla em um segmento da hélice de DNA, passando outro segmento da
hélice através da ruptura e, então, liberando as extremidades rompidas do DNA. Essa ação, que requer ATP, remove uma
deformação no DNA e reduz o superenrolamento.
Figura 12.12 A DNA helicase desenrola o DNA ao se ligar ao molde de fita tardia em cada forquilha de replicação e mover-se
no sentido 5ƍ ĺ 3ƍ.
Um grupo de antibióticos chamado de 4-quinolonas mata bactérias ao ligar-se à DNA girase e inibir sua ação. A inibição da
DNA girase leva ao términoda síntese de DNA e do crescimento bacteriano. Um exemplo de 4-quinolona é o ácido nalidíxico,
introduzido pela primeira vez nos anos 1960 e que costumava ser usado para tratar infecções urinárias. Muitas bactérias
adquiriram resistência às quinolonas por meio de mutações no gene para DNA girase.
Conceitos
A replicação é iniciada em uma origem de replicação, onde uma proteína de iniciação se liga e faz com que
um pequeno segmento do DNA se desenrole. A enzima DNA helicase rompe as pontes de hidrogênio em
uma forquilha de replicação e as proteínas ligadoras de DNA de fita única estabilizam as fitas separadas. A
DNA girase reduz a tensão de torção que surge à medida que as duas fitas de DNA de dupla-hélice se
desenrolam.
 Checagem dos conceitos 4
Ordene os seguintes componentes na sequência em que são usados durante a replicação: helicase, proteína
ligadora de DNA de fita única, DNA girase, proteína de iniciação.
Alongamento
Na fase de alongamento da replicação, o DNA de fita única é usado como um molde para a síntese de DNA. Esse processo
requer várias enzimas.
Síntese dos primers. Todas as DNA polimerases precisam de um nucleotídio com um grupo 3ƍ-OH ao qual um novo
nucleotídio pode ser adicionado. Por causa dessa exigência, as DNA polimerases não podem iniciar a síntese de DNA em um
molde vazio; elas precisam de um primer – um grupo 3ƍ-OH – para iniciar. Então, como começa a síntese de DNA?
Uma enzima chamada primase sintetiza segmentos curtos (cerca de 10 a 12 nucleotídios) de nucleotídios de RNA, ou
primers, que fornecem um grupo 3ƍ-OH ao qual a DNA polimerase pode prender os nucleotídios de DNA. (Como a primase é
uma RNA polimerase, ela não requer um grupo 3ƍ-OH existente para iniciar a síntese de uma fita de nucleotídios.) Todas as
moléculas de DNA inicialmente têm primers de RNA curtos incrustados dentro delas; esses primers são removidos e
substituídos por nucleotídios de DNA.
Na fita líder, onde a síntese de DNA é contínua, um primer é necessário apenas na extremidade 5ƍ da fita recém-sintetizada.
Na fita tardia, onde a replicação é descontínua, um novo primer deve ser gerado no início de cada fragmento de Okazaki
(Figura 12.13). A primase forma um complexo com a helicase na forquilha de replicação e se desloca ao longo do molde da fita
tardia. É provável que o primer único na fita líder seja sintetizado pelo complexo primase-helicase no molde da fita tardia na
outra forquilha de replicação, na extremidade oposta da bolha de replicação. Resolva o Problema 30
Figura 12.13 A primase sintetiza segmentos curtos de nucleotídios de DNA, fornecendo um grupo 3ƍ-OH ao qual a DNA
polimerase pode adicionar nucleotídios de DNA.
Conceitos
A primase sintetiza um segmento curto de nucleotídios de RNA ( primers), que fornece um grupo 3ƍ-OH para a fixação
dos nucleotídios de DNA para início da síntese de DNA.
a.
b.
c.
d.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
 Checagem dos conceitos 5
Os primers são sintetizados em que região na fita tardia?
Apenas na extremidade 5’ da fita recém-sintetizada.
Apenas na extremidade 3’ da fita recém-sintetizada.
No início de cada fragmento de Okazaki.
Em múltiplos locais dento do fragmento de Okazaki.
Síntese de DNA pelas DNA polimerases. Após o DNA ser desenrolado e um primer ser adicionado, as DNA polimerases
prolongam a fita nova de polinucleotídios ao catalisar a polimerização do DNA. As polimerases mais estudadas são da E. coli,
que tem pelo menos cinco DNA polimerases diferentes. Duas delas, a DNA polimerase I e a DNA polimerase III, sintetizam
DNA na replicação (Quadro 12.3); as outras três têm funções especializadas no reparo do DNA.
A DNA polimerase III é um grande complexo de multiproteínas que atua como ferramenta principal da replicação. Ela
sintetiza fitas de nucleotídios ao adicionar novos nucleotídios à extremidade 3ƍ da molécula de DNA crescente. A DNA
polimerase III tem duas atividades enzimáticas (ver Quadro 12.3). Sua atividade polimerase 5ƍ ĺ 3ƍ possibilita que ela adicione
novos nucleotídios no sentido 5ƍ ĺ 3ƍ. Sua atividade exonuclease 3ƍ ĺ 5ƍ possibilita que ela remova nucleotídios na direção 3ƍ
ĺ 5ƍ, tornando possível a correção de erros. Se um nucleotídio com uma base incorreta é inserido na molécula de DNA
crescente, a DNA polimerase III usa a atividade exonuclease 3ƍ ĺ 5ƍ para apoiar e remover o nucleotídio incorreto. Ela então
reinicia sua atividade polimerase 5ƍ ĺ 3ƍ. Essas duas funções juntas fazem a DNA polimerase III sintetizar de modo eficiente e
preciso novas moléculas de DNA. A DNA polimerase III apresenta alta processividade, sendo, portanto, capaz de adicionar
vários nucleotídios à fita de DNA crescente sem liberar o molde: normalmente ela segura o molde e continua a sintetizar o DNA
até que o molde tenha sido completamente replicado. A alta processividade da DNA polimerase III é garantida por um dos
polipeptídios que compõem a enzima. Esse polipeptídio, chamado de subunidade ȕ, serve como um grampo para a enzima: ele
circula o DNA e mantém a DNA polimerase ligada à fita molde durante a replicação. A DNA polimerase III adiciona
nucleotídios de DNA ao primer, sintetizando o DNA das fitas líder e tardia.
A primeira polimerase da E. coli a ser descoberta, a DNA polimerase I, também apresenta atividades polimerase 5ƍ ĺ 3ƍ e
exonuclease 3ƍ ĺ 5ƍ (ver Quadro 12.3), tornando possível que a enzima sintetize DNA e corrija erros. Diferente da DNA
polimerase III, esta polimerase também tem atividade exonuclease 5ƍ ĺ 3ƍ, que é usada para remover os primers entregues pela
primase e então os substitui por nucleotídios de DNA ao sintetizar na direção 5ƍ ĺ 3ƍ. A DNA polimerase I tem processividade
menor que a DNA polimerase III. A remoção e substituição dos primers parece ser a função principal da DNA polimerase I.
Após a DNA polimerase III iniciar a síntese no primer e mover-se na direção 3ƍ (downstream), a DNA polimerase I remove os
nucleotídios de RNA do primer, substituindo-os por nucleotídios de DNA. As DNA polimerases II, IV e V funcionam no reparo
de DNA.
Apesar de suas diferenças, todas as polimerases da E. coli:
Sintetizam qualquer sequência especificada pela fita molde.
Sintetizam na direção 5ƍ ĺ 3ƍ ao adicionar nucleotídios a um grupo 3ƍ-OH.
Usam dNTPs para sintetizar DNA novo.
Precisam de um grupo 3ƍ-OH para iniciar a síntese.
Catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster ao unir o grupo 5ƍ-fosfato do nucleotídio que chega ao grupo 3ƍ-OH do
nucleotídio anterior na fita crescente, rompendo dois fosfatos no processo.
Produzem fitas recém-sintetizadas que são complementares e antiparalelas às fitas molde.
Estão associadas a várias outras proteínas. Resolva o Problema 27
Conceitos
As DNA polimerases sintetizam DNA no sentido 5ƍ ĺ3ƍ ao adicionar novos nucleotídios à extremidade 3ƍ de uma fita de
nucleotídios crescente.
DNA ligase. Após a DNA polimerase III se ligar ao nucleotídio do grupo 3ƍ-OH no último nucleotídio do primer de RNA,
cada novo nucleotídio de DNA fornece o grupo 3ƍ-OH necessário para que o próximo nucleotídio seja adicionado. Esse
processo continua enquanto o molde estiver disponível (Figura 12.14 A). A DNA polimerase I segue a DNA polimerase III e,
ao usar sua atividade exonuclease 5ƍ ĺ 3ƍ, ela remove o primer de RNA. Ela então usa a atividade polimerase 5ƍ ĺ 3ƍ para
substituir os nucleotídios de RNA por nucleotídios de DNA. A DNA polimerase I se fixa ao primeiro nucleotídio do grupo OH
na extremidade 3ƍ do fragmento de Okazaki anterior e então continua no sentido 5ƍ ĺ 3ƍ ao longo da fita de nucleotídios e
substituindo, um por vez, os nucleotídios de DNA do primer (Figura 12.14 B).
Quadro 12.3 Características das DNA polimerases na E. coli.
DNA polimerase Polimerização 5ƍ ĺ 3′ Exonuclease 3ƍ ĺ 5′ Exonuclease 5ƍ ĺ 3′ Função
I Sim Sim Sim Remove e substitui os
primers
II Sim Sim Não Repara o DNA;
reinicia a replicação
depois de o DNA
danificado parar a
síntese
III Sim Sim Não Alonga o DNA
IV Sim Não Não Repara o DNA
V Sim Não Não Repara o DNA;
sintetiza o DNA
translesão
Figura 12.14 A DNA ligase fechaa ruptura deixada pela DNA polimerase I na estrutura açúcar-fosfato.
Após a polimerase I ter substituído o último nucleotídio do primer de RNA por um nucleotídio DNA, permanece uma ruptura
na estrutura açúcar-fosfato da nova fita de DNA. O grupo 3ƍ-OH do último nucleotídio a ser adicionado pela DNA polimerase I
não está preso ao grupo 5ƍ-fosfato do primeiro nucleotídio adicionado pela DNA polimerase III (Figura 12.14 C). Essa ruptura
a.
b.
c.
d.
1.
é fechada pela enzima DNA ligase, que catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster sem adicionar outro nucleotídio à fita
(Figura 12.14 D). Algumas das principais enzimas e proteínas necessárias para a replicação do DNA procariótico estão
resumidas no Quadro 12.4.
Conceitos
Após os primers serem removidos e substituídos, a ruptura na ligação açúcar-fosfato é fechada pela DNA
ligase.
 Checagem dos conceitos 6
Qual enzima bacteriana remove os primers?
Primase.
DNA polimerase I.
DNA polimerase III.
Ligase.
Alongamento na forquilha de replicação. Agora que os principais componentes enzimáticos do alongamento – DNA
polimerases, helicase, primase e ligase – foram apresentados, analisemos como eles interagem na forquilha de replicação. Como
a síntese de ambas as fitas ocorre simultaneamente, tem de haver duas unidades da DNA polimerase III na forquilha de
replicação, uma para cada fita. Em um modelo do processo de replicação, as duas unidades de DNA polimerase III estão
conectadas (Figura 12.15), o molde da fita tardia se fecha ao redor de modo que fica na posição para replicação 5ƍ ĺ 3ƍ. Dessa
maneira, o complexo da DNA polimerase III é capaz de fazer a replicação 5ƍ ĺ 3ƍ simultaneamente em ambos os moldes,
mesmo que eles estejam em direções opostas. Após cerca de 1.000 pb de DNA novo terem sido sintetizados, a DNA polimerase
III libera o molde da fita tardia e uma nova alça se forma (ver Figura 12.15). A primase sintetiza um novo primer na fita tardia,
e a DNA polimerase III, então, sintetiza um novo fragmento de Okazaki.
Quadro 12.4 Componentes necessários para a replicação nas células bacterianas.
Componente Função
Proteína de iniciação Liga-se à origem e separa as fitas do DNA para iniciar a
replicação
DNA helicase Desenrola o DNA na forquilha de replicação
Proteínas ligadoras de DNA de fita única Prendem-se ao DNA de fita única e evitam a formação de
estruturas secundárias
DNA girase Desloca-se na forquilha de replicação, abrindo e fechando
rupturas no DNA de dupla-hélice para liberar o torque
resultante do desenrolamento na forquilha de replicação
DNA primase Sintetiza um primer de RNA curto para fornecer um grupo
3ƍ-OH para a fixação dos nucleotídios de DNA
DNA polimerase III Alonga a fita nova de nucleotídios a partir do grupo 3ƍ-OH
fornecido pelo primer
DNA polimerase I Remove os primers de RNA e os substitui por DNA
DNA ligase Une os fragmentos de Okazaki ao fechar as rupturas no
esqueleto de açúcar-fosfato do DNA recém-sintetizado
Em resumo, cada forquilha de replicação ativa requer cinco componentes básicos:
A helicase para desenrolar o DNA.
2. As proteínas ligadoras de fita única para proteger as fitas de nucleotídios e evitar a formação de estruturas secundárias.
3.
4.
5.
a.
b.
c.
d.
Figura 12.15 Em um modelo de replicação de DNA na E. coli, as duas unidades de DNA polimerase III estão conectadas. O
molde de fita tardia forma uma alça de modo que a replicação ocorra nas duas fitas de DNA antiparalelas. Os componentes do
maquinário de replicação na forquilha de replicação estão apresentados na parte superior.
A topoisomerase girase para remover a fita à frente da forquilha de replicação.
A primase para sintetizar primers com um grupo 3ƍ-OH no início de cada fragmento de DNA.
A DNA polimerase para sintetizar a fita líder e fita tardia de nucleotídios.
Término
Em algumas moléculas de DNA, a replicação é terminada sempre que duas forquilhas de replicação se encontram. Em outras, as
sequências de término específicas (chamadas sítios Ter) bloqueiam a replicação. Uma proteína de término, chamada Tus na E.
coli, liga-se a essas sequências, criando um complexo Tus-Ter que bloqueia o movimento da helicase, paralisando a forquilha
de replicação e evitando a replicação de DNA. Cada complexo Tus-Ter bloqueia a forquilha de replicação de se deslocar em um
sentido, mas não para o outro.
Fidelidade da replicação do DNA
Em geral, a taxa de erro na replicação é menor que um erro por bilhão de nucleotídios. Como é alcançada essa incrível
exatidão?
As DNA polimerases são muito peculiares no pareamento dos nucleotídios com seus complementos na fita molde. Surgem
erros na seleção de nucleotídios pela DNA polimerase em uma proporção de apenas uma vez a cada 100.000 nucleotídios. A
maioria dos erros que surgem na seleção dos nucleotídios é corrigida em um segundo processo, chamado revisão. Quando uma
DNA polimerase insere um nucleotídio incorreto na fita crescente, o grupo 3ƍ-OH do nucleotídio mal pareado não está
corretamente posicionado no sítio ativo da DNA polimerase para aceitar o próximo nucleotídio. O posicionamento incorreto
atrasa a reação de polimerização e a atividade exonuclease 3ƍ ĺ 5ƍ da DNA polimerase remove o nucleotídio incorretamente
pareado. A DNA polimerase, então, insere o nucleotídio correto. Juntos, a revisão e a seleção de nucleotídios resultam em uma
taxa de erro de apenas um em 10 milhões de nucleotídios.
Um terceiro processo, chamado de reparo de pareamento errado de DNA (discutido com mais detalhes no Capítulo 18),
corrige os erros após o término da replicação. Qualquer nucleotídio incorretamente pareado que permanece após a replicação
produz uma deformação na estrutura secundária do DNA; a deformidade é identificada por enzimas que removem o nucleotídio
incorreto e usam a fita original de nucleotídios como molde para substituir esse nucleotídio. O reparo do pareamento errado
requer a capacidade de distinguir entre as fitas antiga e nova de DNA, porque as enzimas precisam de uma maneira para
determinar qual das duas bases incorretamente pareadas deve ser removida. Na E. coli, grupos metila (–CH3) são adicionados às
sequências específicas de nucleotídios, mas apenas depois da replicação. Assim, imediatamente após a síntese do DNA, apenas
a fita de DNA antiga é metilada. Ela pode ser diferenciada a partir da fita recém-sintetizada, e o reparo do pareamento errado
ocorre preferencialmente na fita de nucleotídios não metilada. Nenhum processo isolado poderia produzir esse grau de exatidão;
são necessários vários processos, e cada um deles identifica os erros não detectados pelos processos anteriores.
Conceitos
A replicação é um processo muito exato, com menos de um erro por um bilhão de nucleotídios. O nível
elevado de exatidão na replicação do DNA é obtido pela seleção dos nucleotídios, revisão e reparo de
pareamento errado.
 Checagem dos conceitos 7
Qual mecanismo consegue diferenciar a fita recém-sintetizada da fita-molde do DNA?
Seleção de nucleotídios.
Revisão do DNA.
Reparo de pareamento errado.
Todas as opções anteriores.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Conceitos conectantes
As regras básicas da replicação
A replicação bacteriana requer várias enzimas (ver Quadro 12.4), proteínas e sequências de DNA que
trabalham juntas para sintetizar uma nova molécula de DNA. Esses componentes são importantes, mas não
nos aprofundamos nos detalhes do processo para não nos perdermos dos princípios gerais da replicação.
A replicação é sempre semiconservativa.
A replicação sempre inicia em sequências chamadas de origens.
A síntese do DNA é iniciada por segmentos curtos de RNA chamados de primers.
O alongamento das fitas de DNA é sempre na direção 5ƍ ĺ 3ƍ.
O DNA novo é sintetizado a partir de dNTPs; na polimerização do DNA, dois grupos de fosfato são rompidos a partir
de um dNTP e o nucleotídio resultante é adicionado ao grupo 3ƍ-OH da fita crescente de nucleotídios.
A replicação é contínua na fita líder e descontínua na fita tardia.
As fitas novas de nucleotídios são complementares e antiparalelas em relação asuas fitas molde.
A replicação ocorre em taxas muito elevadas e é muito precisa, graças à exata seleção de nucleotídios, revisão e reparo
do pareamento errado.
12.4 A replicação do DNA eucariótico é semelhante à replicação
bacteriana, mas existem algumas diferenças
Embora a replicação eucariótica lembre a replicação bacteriana em muitos aspectos, a replicação nas células eucarióticas
apresenta muitos desafios adicionais. Primeiro, o tamanho muito maior dos genomas eucarióticos exige que a replicação seja
iniciada em múltiplas origens. Segundo, os cromossomos eucarióticos são lineares, enquanto os procarióticos são circulares.
Terceiro, o molde de DNA está associado a proteínas histonas na forma de nucleossomos, e a montagem dos nucleossomos
deve ser feita imediatamente à replicação do DNA.
Origens eucarióticas
Os pesquisadores isolaram pela primeira vez as origens eucarióticas da replicação em células de levedura ao demonstrar que
algumas sequências de DNA possibilitam a replicação quando transferidas de um cromossomo de levedura para pequenos
pedaços circulares de DNA (plasmídios). Essas sequências de replicação autônoma (ARSs) possibilitam a replicação de
qualquer DNA ao qual estejam ligadas. Posteriormente, foi demonstrado que elas são as origens da replicação nos cromossomos
de levedura. As origens da replicação de diferentes organismos eucarióticos variam muito na sequência, embora elas tenham
vários pares de base A-T. Um complexo de multiproteínas, o complexo de reconhecimento da origem (ORC), liga-se às origens
e desenrola o DNA nessa região.
Conceitos
O DNA eucariótico tem muitas origens de replicação. Em cada origem, um complexo multiproteico de
reconhecimento da origem se liga para iniciar o desenrolamento do DNA.
 Checagem dos conceitos 8
Em comparação com os procariotos, quais são as diferenças na estrutura do genoma das células eucarióticas
que afetam a maneira como a replicação ocorre?
Licenciamento da replicação do DNA
As células eucarióticas utilizam milhares de origens, de modo que o genoma inteiro possa ser replicado em tempo hábil.
Entretanto, o uso de múltiplas origens cria um problema especial no cronograma da replicação: o genoma inteiro precisa ser
replicado com precisão uma vez, e apenas uma vez, em cada ciclo celular de modo que nenhum gene seja esquecido e nenhum
gene seja replicado mais de uma vez. Como uma célula garante que a replicação seja iniciada em milhares de origens apenas
uma vez por ciclo celular?
A replicação precisa do DNA é possível ao separar a iniciação da replicação em duas etapas diferentes. Na primeira etapa, as
origens são licenciadas, aprovadas para replicação. Isso ocorre no início do ciclo celular, quando um fator de licenciamento de
replicação se prende a uma origem. Na segunda etapa, o maquinário da replicação inicia o processo em cada origem licenciada.
A chave é que o maquinário de replicação atue apenas nas origens licenciadas. À medida que as forquilhas de replicação se
afastam da origem, o fator de licenciamento é removido, deixando a origem em um estado de não licenciada, em que a
replicação não pode ser iniciada novamente até a renovação do licenciamento. Para garantir que a replicação ocorra apenas uma
vez por ciclo celular, o fator de licenciamento é ativado apenas depois de a célula ter completado a mitose e antes que a
replicação seja iniciada.
Um fator de licenciamento eucariótico é um complexo chamado MCM (para manutenção de minicromossomo), com uma
DNA helicase que desenrola um segmento curto de DNA na iniciação da replicação. O MCM deve se ligar ao DNA para iniciar
a replicação em uma origem. Após a replicação começar em uma origem, uma proteína chamada Geminina evita que o MCM se
ligue ao DNA e reinicie a replicação naquela origem. No final da mitose, a Geminina é degradada, tornando possível que o
MCM se ligue mais uma vez ao DNA e autorize novamente a origem. O MCM também funciona como DNA helicase durante o
processo de replicação.
Desenrolamento
Foram isoladas várias helicases diferentes que separam o DNA de fita dupla nas células eucarióticas, como as proteínas
ligadoras de fita única e as topoisomerases (que têm uma função equivalente à DNA girase nas células bacterianas). Essas
enzimas e proteínas atuam no desenrolamento do DNA eucariótico da mesma maneira que as correspondentes bacterianas.
DNA polimerases eucarióticas
Algumas diferenças expressivas nos processos de replicação bacteriana e eucariótica são o número e as funções das DNA
polimerases. As células eucarióticas têm várias DNA polimerases diferentes que atuam na replicação, na recombinação e no
reparo de DNA.
Três DNA polimerases fazem a maior parte da síntese do DNA durante a replicação: DNA polimerase Į, DNA polimerase į e
DNA polimerase İ (Quadro 12.5). A DNA polimerase tem atividade primase e inicia a síntese de DNA nuclear ao sintetizar
um primer de RNA, seguida por uma sequência curta de nucleotídios de DNA. Após a DNA polimerase Į ter se estabelecido
entre 30 e 40 nucleotídios, a DNA polimerase completa a replicação na fita tardia. Semelhante em estrutura e função à DNA
polimerase į, a DNA polimerase replica a fita líder. Outras DNA polimerases participam da replicação e recombinação ou
catalisam a replicação do DNA de organela.
Algumas DNA polimerases, como a DNA polimerase į e a DNA polimerase İ, são capazes de replicar o DNA em alta
velocidade e com grande fidelidade (poucos erros) porque têm sítios ativos que acomodam de modo justo e exclusivo os quatro
nucleotídios normais do DNA, os monofosfatos de adenosina, guanosina, citidina e timidina. Como resultado dessa
especificidade, moldes destorcidos de DNA e bases anormais não são acomodados com facilidade dentro do sítio ativo da
enzima. Quando esses erros são encontrados no molde de DNA, as DNA polimerases de alta fidelidade param e não conseguem
contornar a lesão.
Outras DNA polimerases têm menor fidelidade, mas são capazes de contornar as distorções no molde de DNA. Essas DNA
polimerases translesão especializadas têm um sítio ativo mais aberto e são capazes de acomodar e copiar moldes com bases
anormais, estruturas distorcidas e lesões volumosas. Assim, essas enzimas especializadas podem contornar tais erros, mas como
seus sítios ativos são mais abertos e acomodados, elas tendem a produzir mais erros. Na replicação, as enzimas de alta
velocidade e alta fidelidade são usadas até encontrarem um bloqueio da replicação. Nesse ponto, uma ou mais polimerases
translesão assumem, contornam a lesão e continuam replicando uma seção curta de DNA, Então, as polimerases translesão se
separam da forquilha de replicação e as enzimas de alta fidelidade encerram a replicação com alta velocidade e exatidão. As
enzimas de reparo de DNA reparam os erros produzidos pelas polimerases translesão, embora alguns desses erros possam
escapar da detecção e levem a mutações.
Conceitos
Existem muitas DNA polimerases diferentes nas células eucarióticas. As DNA polimerases Į, į e İ fazem a replicação na
fita líder e na fita tardia. Outras DNA polimerases reparam o DNA. As polimerases translesão especializadas são usadas
para contornar as distorções do molde de DNA que normalmente paralisam as principais DNA polimerases.
 Checagem dos conceitos 9
Algumas das DNA polimerases eucarióticas tendem a fazer erros na replicação. Por que uma célula usaria
uma DNA polimerase suscetível a erro em vez de uma mais exata?
Montagem do nucleossomo
O DNA eucariótico é complexado a proteínas histonas em estruturas chamadas nucleossomos, que contribuem para a
estabilidade e o empacotamento da molécula de DNA (ver Figura 11.3). Na replicação, a estrutura da cromatina é rompida pela
forquilha de replicação, mas os nucleossomos são rapidamente remontados em duas novas moléculas de DNA. As micrografias
eletrônicas do DNA eucariótico, como a apresentada na Figura 12.16, mostram DNA recém-replicado já coberto por
nucleossomos, indicando que os nucleossomos são remontados rapidamente.
Quadro 12.5 DNA polimerases nas células eucarióticas.DNA polimerase
Atividade polimerase 5ƍ ĺ
3′
Atividade exonuclease 3ƍ ĺ
5′ Função celular
Į (alfa) Sim Não Iniciação da síntese de DNA
nuclear e reparo do DNA;
tem atividade da primase
į (delta) Sim Sim Síntese de fita tardia do DNA
nuclear, reparo do DNA e
síntese do DNA translesão
İ (épsilon) Sim Sim Síntese da fita líder
Ȗ (gama) Sim Sim Replicação e reparo do DNA
mitocondrial
ȟ (zeta) Sim Não Síntese de DNA translesão
Ș (eta) Sim Não Síntese de DNA translesão
ș (teta) Sim Não Reparo do DNA
Ț (iota) Sim Não Síntese de DNA translesão
ț (capa) Sim Não Síntese de DNA translesão
Ȝ (lambda) Sim Não Reparo do DNA
ȝ (mi) Sim Não Reparo do DNA
ı (sigma) Sim Não Replicação do DNA nuclear
(possivelmente), reparo do
DNA e coesão da
cromátide-irmã
(fi) ࢥ Sim Não Síntese de DNA translesão
Rev1 Sim Não Reparo do DNA
Nota: As polimerases listadas na parte superior do quadro são as enzimas responsáveis pela replicação do DNA.
Figura 12.16 Os nucleossomos são rapidamente remontados no DNA recém-sintetizado. Esta micrografia eletrônica do DNA
eucariótico no processo de replicação mostra claramente que o DNA recém-replicado já está coberto por nucleossomos (círculos
escuros). (Victoria Foe.)
São necessárias três etapas para a criação de novos nucleossomos: (1) o rompimento dos nucleossomos originais na molécula
de DNA parental à frente da forquilha de replicação; (2) a redistribuição das histonas preexistentes sobre novas moléculas de
DNA e (3) a adição de histonas recém-sintetizadas para completar a formação de novos nucleossomos. Antes da replicação,
uma molécula de DNA única está associada a proteínas histonas. Após a replicação e a montagem do nucleossomo, duas
moléculas de DNA estão associadas às histonas. As histonas originais de um nucleossomo permanecem juntas, fixas a uma das
novas moléculas de DNA, ou elas se desmontam e se misturam com histonas novas em ambas as moléculas de DNA?
Técnicas semelhantes às empregadas por Meselson e Stahl para determinar o modo de replicação do DNA foram usadas para
estudar este assunto. As células foram cultivadas por várias gerações em um meio com aminoácidos marcados com um isótopo
pesado. As proteínas histonas incorporaram esses aminoácidos pesados e ficaram densas (Figura 12.17). As células foram,
então, transferidas para um meio de cultura com aminoácidos marcados com um isótopo leve. As histonas montadas após a
transferência tinham aminoácidos novos, leves, e eram menos densas.
Após a replicação, os octâmeros de histonas foram isolados e centrifugados em um gradiente de densidade. Os resultados
mostraram que, após a replicação, os octâmeros eram uma banda contínua entre a alta densidade (representando os octâmeros
antigos) e baixa densidade (representado os octâmeros novos). Esse achado indica que as estruturas recém-montadas são uma
mistura de histonas antigas e novas. Outras evidências indicam que os nucleossomos reconstituídos aparecem nas novas
moléculas de DNA logo após o novo DNA surgir a partir do maquinário de replicação.
A remontagem dos nucleossomos durante a replicação é facilitada por proteínas denominadas chaperonas de histona,
associadas à enzima helicase que desenrola o DNA. As chaperonas de histonas aceitam as histonas antigas oriundas da molécula
de DNA original e as depositam, junto com as histonas recém-sintetizadas, nas duas novas moléculas de DNA. A evidência
atual sugere que o nucleossomo original é degradado em dois dímeros H2A-H2B (cada dímero com um H2A e um H2B) e um
tetrâmero H3-H4 único (cada tetrâmero com duas histonas H3 e duas histonas H4). O tetrâmero H3-H4 antigo é então
aleatoriamente transferido para uma das novas moléculas de DNA e serve como a fundação na qual as cópias novas e antigas
dos dímeros de H2A-H2B são adicionadas. Os tetrâmeros H3-H4 recém-sintetizados e os dímeros H2A e H2B também são
adicionados a cada nova molécula de DNA para completar a formação de novos nucleossomos. A montagem de novos
nucleossomos é facilitada por uma proteína chamada fator 1 de montagem de cromatina (CAF-1). Resolva o Problema 33
Experimento
Pergunta: O que acontece com as histonas na replicação do DNA eucariótico?
Conclusão: Após a replicação do DNA, os octâmeros recém-remontados são uma mistura aleatória de
histonas antigas e novas.
Figura 12.17 Procedimento experimental para estudar como os nucleossomos se dissociam e se reassociam durante a
replicação.
Conceitos
Após a replicação do DNA, novos nucleossomos são rapidamente remontados nas moléculas de DNA. Os
nucleossomos são degradados durante a replicação e remontados a partir de uma mistura de histonas
antigas e novas. A remontagem dos nucleossomos durante a replicação é facilitada pelas chaperonas de
histonas e pelos fatores de montagem de cromatina.
Localização da replicação no núcleo
As DNA polimerases responsáveis pela replicação são descritas frequentemente como se deslocassem no molde de DNA da
mesma maneira que um trem viaja sobre os trilhos. Evidências recentes sugerem outro conceito. Uma visão mais exata é que a
polimerase está fixa em uma localização e o molde de DNA passa através dela, com as moléculas de DNA recém-sintetizadas
surgindo na outra extremidade.
As técnicas de microscopia por fluorescência, capazes de revelar sítios ativos da síntese do DNA, evidenciam que a maior
parte da replicação no núcleo de uma célula eucariótica ocorre em um número limitado de sítios fixos, denominados fábricas de
replicação. As micrografias time-lapse revelam que o DNA recém-replicado é expulso desses sítios. Resultados semelhantes
foram obtidos nas células bacterianas.
Síntese de DNA e ciclo celular
A replicação do DNA é contínua nas bactérias que se dividem rapidamente. Nas células eucarióticas, entretanto, a replicação é
coordenada com o ciclo celular. A passagem pelo ciclo celular, incluindo o início da replicação, é controlada por pontos de
verificação do ciclo celular. O importante ponto de verificação G1/S (ver Capítulo 2) mantém o ciclo celular em G1 até o DNA
estar pronto para ser replicado. Após passar por esse ponto de verificação, a célula entra na fase S e o DNA é replicado. O
sistema de licenciamento da replicação garante, então, que o DNA não seja replicado novamente até a célula ter passado pela
mitose.
Replicação nas extremidades dos cromossomos
Uma diferença fundamental entre as replicações eucariótica e bacteriana é que os cromossomos eucarióticos são lineares e têm
extremidades. Como já foi afirmado, o grupo 3ƍ-OH necessário para a replicação pelas DNA polimerases é fornecido no início
da replicação por primers de RNA que são sintetizados pela primase. Essa solução é temporária porque, inevitavelmente, os
primers têm de ser removidos e substituídos pelos nucleotídios de DNA. Em uma molécula de DNA circular, o alongamento do
círculo fornece um grupo 3ƍ-OH imediatamente à frente do primer (Figura 12.18 A). Após a remoção do primer, a substituição
dos nucleotídios de DNA pode ser feita para esse grupo 3ƍ-OH.
Problema da replicação da extremidade. Nos cromossomos lineares com múltiplas origens, o alongamento do DNA nos
replicons adjacentes também fornece um grupo 3ƍ-OH anterior a cada primer (Figura 12.18 B). Na extremidade de um
cromossomo linear, entretanto, não existe trecho adjacente do DNA replicado para fornecer esse grupo 3ƍ-OH importante.
Quando o primer na extremidade do cromossomo for removido, ele não pode ser substituído pelos nucleotídios do DNA,
criando uma lacuna na extremidade do cromossomo, sugerindo que o cromossomo deve ficar progressivamente menor em cada
ciclo de replicação. O encurtamento do cromossomo significaria que, quando um organismo se reproduz, ele transmitiria os
cromossomos mais curtos do que os que herdou. Os cromossomos ficariam mais curtos a cada nova geração e,
consequentemente, perderiam a estabilidade. Essa questão é chamada de problema da replicação da extremidade. Na verdade, o
encurtamento do cromossomo ocorre em algumas células somáticas, mas nos organismos unicelulares, células germinativase
células embrionárias iniciais eles não são encurtados nem se autodestroem. Então, como as extremidades dos cromossomos
lineares são replicadas?
Figura 12.18 A síntese de DNA nas extremidades dos cromossomos circulares e lineares é diferente.
Telômeros e telomerase. As extremidades dos cromossomos – os telômeros – têm diversas características singulares, uma
das quais é a variedade de cópias de uma sequência curta repetida. No protozoário Tetrahymena (em que essas sequências
repetidas foram descobertas pela primeira vez) essa repetição telomérica é TTGGGG (ver Quadro 12.2), com essa fita rica em G
se sobressaindo além da fita rica em C (Figura 12.19 A; veja também a seção sobre estrutura do telômero no Capítulo 11):
Direção do centrômero ĸ 5ƍ-TTGGGGTTGGGG-3ƍ
 3ƍ-AACCCC-5ƍ
ĺ Extremidade do cromossomo
A extremidade protrusa de fita única que se sobressai do telômero, conhecida como extremidade 3ƍ protuberante rica em G
(overhang G), pode ser estendida pela telomerase, uma enzima com um componente de proteína e um componente de RNA
(também conhecida como uma ribonucleoproteína). A parte RNA da enzima tem de 15 a 22 nucleotídios que são
complementares à sequência rica em G. Essa sequência pareia com a extremidade 3ƍ que sobressai do DNA (Figura 12.19 B) e
fornece um molde para a síntese de cópias adicionais de DNA das repetições. Os nucleotídios de DNA são adicionados à
extremidade 3ƍ da fita um por vez (Figura 12.19 C) e, após vários nucleotídios serem adicionados, o molde de RNA desloca o
DNA e mais nucleotídios são adicionados à extremidade 3ƍ (Figura 12.19 D). Em geral, são adicionados de 14 a 16 nucleotídios
na extremidade 3ƍ da fita rica em G.
Dessa forma, a telomerase pode expandir a extremidade 3ƍ do cromossomo sem o uso de um molde complementar de DNA
(Figura 12.19 E). Ainda não está claro como a fita complementar rica em C é sintetizada (Figura 12.19 F). Sua síntese pode
ocorrer por meio da replicação convencional, com a DNA polimerase Į sintetizando um primer de RNA na extremidade 5ƍ do
molde estendido (rico em G). A remoção desse primer novamente deixa um espaço na extremidade 5ƍ do cromossomo, mas esse
espaço não é importante, porque a extremidade do cromossomo é estendida em cada replicação pela telomerase; então, o
cromossomo não é encurtado.
A telomerase é encontrada em organismos unicelulares, células germinativas, células embrionárias iniciais e algumas células
somáticas proliferativas (como as da medula óssea e as que revestem o intestino); todas têm obrigatoriamente divisão celular
contínua. A maioria das células somáticas tem pouca ou nenhuma atividade de telomerase, e seus cromossomos são
progressivamente encurtados em cada divisão celular. Essas células podem sofrer um número limitado de divisões; quando os
telômeros são encurtados além de um ponto crítico, o cromossomo torna-se instável, com tendência a sofrer rearranjos, e é
degradado. Esses eventos levam à morte celular.
a.
b.
c.
d.
Figura 12.19 A enzima telomerase é responsável pela replicação das extremidades do cromossomo.
Conceitos
As extremidades dos cromossomos eucarióticos são replicadas por uma enzima RNA-proteína chamada
telomerase. Essa enzima adiciona nucleotídios extras à fita de DNA rica em G do telômero.
 Checagem dos conceitos 10
Qual seria o resultado se a telomerase de um organismo sofresse mutação e se tornasse não funcional?
Não ocorreria replicação do DNA.
A enzima DNA polimerase ficaria parada no telômero.
Os cromossomos seriam encurtados com cada nova geração.
Não seria possível remover os primers de RNA.
Telomerase, envelhecimento e doença. O encurtamento dos telômeros contribui para o processo de envelhecimento. Os
telômeros de camundongos modificados pela engenharia genética sem um gene da telomerase funcional (e, portanto, que não
expressam a telomerase nas células somáticas e germinativas) sofreriam encurtamento progressivo nas gerações sucessivas.
Após várias gerações, esses camundongos apresentam alguns sinais de envelhecimento prematuro, como mudança da cor do
pelo para grisalho, perda de pelo e cicatrização mais lenta de feridas. Por meio da engenharia genética também é possível criar
células somáticas que expressam a telomerase. Nessas células, os telômeros não encurtam, o envelhecimento celular é inibido e
as células se dividem indefinidamente.
Algumas das evidências mais fortes de que o comprimento do telômero está relacionado com o envelhecimento vieram de
estudos dos telômeros em aves. Em 2012, cientistas do Reino Unido mediram o comprimento do telômero nas hemácias
retiradas de 99 mandarins em vários períodos durante suas vidas. Os cientistas encontraram uma forte correlação entre o
comprimento do telômero e a longevidade: os pássaros com telômeros mais longos viviam mais do que aqueles com telômeros
curtos. A previsão mais forte de longevidade era quando o comprimento do telômero era medido no início da vida, aos 25 dias,
que equivale aproximadamente à adolescência humana. Embora essas observações sugiram que o comprimento do telômero
esteja associado ao envelhecimento em alguns animais, a precisão do seu papel no envelhecimento humano ainda é incerta.
Algumas doenças estão associadas a anormalidades da replicação do telômero. Pessoas portadoras da síndrome de Werner,
uma doença autossômica recessiva, mostram sinais de envelhecimento prematuro que começam na adolescência ou no início da
vida adulta, incluindo pele enrugada, cabelo grisalho, calvície, catarata e atrofia muscular. Elas desenvolvem câncer,
osteoporose, cardiopatia e doença arterial e outras condições tipicamente associadas ao envelhecimento. O gene responsável,
WRN, foi mapeado no cromossomo 8 humano e normalmente codifica uma enzima RecQ helicase. Essa enzima é necessária
para a replicação eficiente dos telômeros. Nas pessoas com a síndrome de Werner, essa helicase é defeituosa e,
consequentemente, os telômeros encurtam prematuramente.
Outra doença associada à manutenção anormal dos telômeros é a disqueratose congênita, que leva à insuficiência progressiva
da medula óssea, caracterizada pela falha na produção de novas células sanguíneas pela medula. Pessoas com uma forma ligada
ao X da doença apresentam uma mutação em um gene que codifica a discerina, uma proteína que normalmente ajuda a
processar o componente RNA da telomerase. Essas pessoas herdam telômeros curtos de um genitor que carreia a mutação e que
é incapaz de manter o comprimento do telômero em suas células germinativas em função de uma discerina defeituosa. Nas
famílias que carreiam tal mutação, o comprimento do telômero encurta a cada geração, levando à antecipação – um aumento
progressivo na intensidade da doença nas gerações seguintes (ver Capítulo 5).
É possível que a telomerase participe no desenvolvimento do câncer. As células tumorais têm a capacidade de se dividir
indefinidamente, e a telomerase é expressa em 90% de todos os cânceres. Algumas evidências recentes indicam que a
telomerase estimula a proliferação celular independentemente do seu efeito no comprimento do telômero, mas o mecanismo
usado pela telomerase para contribuir com o câncer não está claro. Como será discutido no Capítulo 23, o câncer é um processo
complexo de várias etapas, que requer mutação em pelo menos vários genes. A ativação da telomerase sozinha não leva ao
crescimento do câncer na maioria das células, mas parece que é necessário, junto com outras mutações, para surgir o câncer.
Algumas drogas experimentais contra essa doença inibem a ação da telomerase.
Uma das dificuldades no estudo do efeito do encurtamento do telômero no processo de envelhecimento é que a expressão da
telomerase nas células somáticas também promove câncer, o que pode encurtar o tempo de vida da pessoa. Para contornar esse
problema, Antonia Tomas-Loba e seus colegas criaram camundongos modificados pela engenharia genética que expressam a
telomerase e carreiam genes que os tornam resistentes ao câncer. Esses camundongos têm telômeros mais longos, vivem mais e
exibem poucas mudançasrelacionadas com a idade, como alterações na pele, redução da coordenação neuromuscular e doenças
degenerativas. Esses resultados apoiam a ideia de que o encurtamento do telômero contribui para o envelhecimento. 
Resolva o Problema 35
Replicação em archaea
O processo de replicação em archaea tem várias características em comum com a replicação nas células eucarióticas; muitas das
proteínas envolvidas são mais semelhantes às proteínas encontradas nas células eucarióticas do que as das eubactérias. Como as
eubactérias, algumas archaea têm uma única origem de replicação, mas a Sulfolobus solfataricus tem duas origens de
replicação, semelhante às múltiplas origens observadas nos genomas eucarióticos. As origens da replicação em archaea não
apresentam as sequências típicas identificadas pelas proteínas de iniciação bacterianas; pelo contrário, elas têm sequências
semelhantes às encontradas nas origens eucarióticas. As proteínas de iniciação de archaea são mais parecidas com as proteínas
dos eucariotos do que com as das eubactérias. Essas semelhanças na replicação entre as células de archaea e eucarióticas
reforçam a conclusão de que as archaea estão mais próximas das células eucarióticas do que as eubactérias procarióticas.
12.5 Recombinação consiste em ruptura, alinhamento e reparo das fitas
de DNA
A recombinação é a troca de informação genética entre as moléculas de DNA; quando a troca é entre moléculas de DNA
homólogas, ela é chamada de recombinação homóloga. Esse processo ocorre no crossing over, no qual as regiões homólogas
dos cromossomos são trocadas (ver Figura 7.5) e os alelos são misturados em novas combinações. A recombinação é um
processo genético muito importante porque aumenta a variação genética. As taxas de recombinação fornecem informações
importantes sobre as relações de ligação entre os genes, que são usadas para criar os mapas genéticos (ver Figuras 7.12 e 7.13).
A recombinação também é essencial para alguns tipos de reparo de DNA (que serão discutidos no Capítulo 18).
A recombinação homóloga é um processo extraordinário: uma fita de nucleotídios de um cromossomo se alinha de maneira
precisa com uma fita de nucleotídios do cromossomo homólogo; as rupturas surgem em regiões correspondentes de diferentes
moléculas de DNA; as partes das moléculas trocam de lugar de modo preciso e, então, os fragmentos são reunidos corretamente.
Nessa série complicada de eventos, não há perda ou ganho de informação genética. Embora o mecanismo molecular preciso da
recombinação homóloga ainda não seja bem compreendido, é possível que a troca seja feita por meio do pareamento das bases
complementares. Uma molécula de DNA de fita única de um cromossomo pareia com uma molécula de DNA de fita única de
outro, formando o DNA heteroduplex.
Na meiose, a recombinação homóloga (crossing over) poderia ocorrer, teoricamente, antes, durante ou após a síntese de
DNA. As evidências citológicas, bioquímicas e genéticas indicam que ela ocorre na prófase I da meiose, enquanto a replicação
do DNA ocorre antes, na interfase. Assim, o crossing over exige a ruptura e a reunião das cromátides quando os cromossomos
homólogos estão no estágio de quatro fitas (ver Figura 7.5). Esta seção explora algumas teorias de como o processo de
recombinação ocorre.
Modelos de recombinação
A recombinação homóloga pode ocorrer por várias vias diferentes. Uma via é iniciada por uma ruptura de fita única em cada
uma das duas moléculas de DNA e inclui a formação de uma estrutura especial chamada junção de Holliday (Figura 12.20).
Nesse modelo, as moléculas de DNA de fita dupla de dois cromossomos homólogos se alinham de maneira precisa. Uma
ruptura de fita única em uma das moléculas de DNA fornece uma extremidade livre que invade e se une à extremidade livre da
outra molécula de DNA. A invasão e a união de fita ocorrem em ambas as moléculas de DNA, criando dois DNA heteroduplex,
cada um com uma fita original mais uma fita nova de outra molécula de DNA. O ponto no qual as fitas de nucleotídios passam
de uma molécula de DNA para a outra é a junção de Holliday. A junção se desloca ao longo das moléculas em um processo
chamado migração de ramificações. A troca de fitas de nucleotídios e a migração de ramificações produzem uma estrutura
chamada intermediário de Holliday, que pode ser rompida em uma das duas formas. A ruptura no plano horizontal, seguida pela
reunião das fitas, produz recombinantes não crossing over, no qual os genes de cada extremidade das moléculas são idênticos
aos que havia originalmente (gene A com gene B e gene a com gene b). A ruptura no plano vertical, seguida pela reunião das
fitas, produz recombinantes crossing over, no qual os genes da extremidade das moléculas são diferentes aos que havia
originalmente (gene A com gene b e gene a com gene B).
Outra via para recombinação é iniciada com rupturas de fita dupla em uma das duas moléculas de DNA alinhadas (Figura
12.21). Nesse modelo, a remoção de alguns nucleotídios nas extremidades das fitas rompidas, seguida por invasão,
deslocamento e replicação de fita, produz duas moléculas de DNA heteroduplex unidas por duas junções de Holliday. As
moléculas interconectadas produzem o molde de ruptura de fita dupla que pode ser separado por ruptura e reunião das fitas de
nucleotídios do mesmo modo que o intermediário de Holliday é separado no modelo de ruptura de fita dupla. A produção de
moléculas crossing over ou não crossing over depende se a ruptura é no plano vertical ou no plano horizontal.
As evidências do modelo de ruptura de fita dupla provêm originalmente de resultados de cruzamentos genéticos na levedura
que não poderiam ser explicados pelo modelo de Holliday. Observações subsequentes mostraram que as rupturas de fita dupla
surgem na prófase I das leveduras, quando ocorre o crossing over, e que as cepas mutantes incapazes de formar rupturas de fita
dupla não exibem recombinação meiótica. Embora exista evidência considerável que apoie o modelo de ruptura de fita dupla na
levedura, a extensão que se aplique a outros organismos ainda é desconhecida.
Conceitos
A recombinação homóloga requer a formação de DNA heteroduplex, com uma fita de nucleotídios a partir de
cada um dos dois cromossomos homólogos. No modelo de Holliday, a recombinação homóloga é obtida por
meio de uma ruptura de fita única no DNA, deslocamento de fita e migração de ramificações. No modelo de
ruptura de fita dupla, a recombinação é obtida por meio de rupturas de fita dupla, deslocamento de fita e
migração de ramificações.
 Checagem dos conceitos 11
Por que a recombinação é importante?
Figura 12.20 O modelo de Holliday da recombinação homóloga. Neste modelo, a recombinação ocorre por meio de uma ruptura
de fita única em cada DNA duplex, deslocamento de fita, migração de ramo e resolução de uma junção de Holliday única.
Enzimas necessárias à recombinação
A recombinação entre moléculas de DNA requer o desenrolamento das hélices de DNA, a clivagem das fitas de nucleotídios,
invasão de fita e migração de ramificações, seguida por clivagem adicional da fita e união para remover as junções de Holliday.
Boa parte do que sabemos sobre esses processos surgiu a partir de estudos da troca de genes na E. coli. Embora as bactérias não
sofram meiose, elas têm um tipo de reprodução sexuada (conjugação), na qual uma bactéria doa seu cromossomo para outra
a.
b.
c.
d.
(discutido com mais detalhes no Capítulo 9). Após a conjugação, a bactéria receptora tem dois cromossomos, que podem sofrer
recombinação homóloga. Os geneticistas isolaram cepas mutantes de E. coli que não apresentam recombinação; o estudo dessas
cepas levou à identificação dos genes e das proteínas que participam da recombinação bacteriana, revelando diversas vias pelas
quais ela pode ser feita.
Três genes com papéis críticos na recombinação na E. coli são recB, recC e recD, responsáveis pela codificação de três
polipeptídios que, juntos, formam a proteína RecBCD. Essa proteína desenrola o DNA de fita dupla e é capaz de romper fitas de
nucleotídios.