Aula 2_Acesso ao material genético

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Acesso ao Material Genético
Extração de Ácidos Nucléicos
Profa. Thaise Gonçalves de Araújo
Universidade Federal de Uberlândia
Instituto de Genética e Bioquímica
Qual o propóstito da disciplina?
Número de Etapas do Processo
R
e
n
d
im
e
n
to
To
ta
l (
%
)
1. Natureza do Ácido Nucléico: DNA ou RNA;
2. Origem: eucarioto, procarioto, mitocôndria, cloroplasto, plasmidial, vírus.
3. Quantidade e pureza;
4. Fonte: tecidos vegetais e animais, cultura, sangue, etc...
5. Armazenamento
6. Métodos para verificação de pureza e quantificação
7. Métodos de purificação
O processo de extração
MATERIAIS BÁSICOS UTILIZADOS
Micropipetas
Ponteiras
Microtubos
Tubos tipo Falcon
Considerações
Organismo Procedimento
Eucariotos sem parede celular Proteinase K, detergente e extração com 
Fenol
Leveduras e Fungos Glucanases, quitinases ou outras
hidrolases
Nitrogênio líquido
Gram-positivas Lisozima
Gram-negativas Detergentes iônicos e substâncias alcalinas
Separação do material a ser utilizado1
Estoque do material:
1) Sangue: -20°C, 1 ano;
2) Cartões de papel: 4°C, muitos anos, tomar o cuidado de
não deixar que as gotas de sangue entrem em contato
umas com as outras.
Lise Celular: liberação do conteúdo celular2
Lise Celular: liberação do conteúdo celular2
Liberação de componentes celulares
Membrana celular e nuclear
Proteínas
➢ Triton
➢ Sarcosil
➢ SDS
➢ CTAB
➢ EDTA
➢ DTT
➢ Β-M
➢ PVP
Detergentes lise de membrana solubilização de lipídeos
Desnaturação de proteínas ➢ TAMPÃ0 pH 8.0 e 9.0
Fenol
Sólido Cristalino líquido incolor (41°C)
✓ Fenol equilibrado em pH 5 – 6: DNA na fase orgânica (fase 
inferior) e RNA na fase aquosa (fase superior)
✓ Fenol equilibrado em pH 7,6: determinam a perda de mRNA-
poli(A) para a fase orgânica, ou ainda a clivagem da cauda 
poli(A). 
✓ Fenol equilibrado em pH ≥ 8: DNA e RNA na fase aquosa.
O pH da mistura determina qual o ácido nucleico será purificado:
• Condições ácidas (pH4-6) – DNA na fase orgânica e RNA na fase aquosa
• Condições neutras – (pH7-8) – DNA na fase aquosa.
Método Fenol-Clorofórmio-Álcool Isoamílico
Precipitação3
A precipitação com etanol é útil para concentrar os ácidos nucléicos e para remover
resíduos de fenol e clorofórmio de amostras desproteinizadas.
NaCL Acetato
Sal Etanol absoluto
Isopropanol
A maioria dos sais são solúveis em etanol 70% - dessalinização da amostra de DNA através 
de múltiplas lavagens com EtOH 70%. Devido a menor solubilidade, o NaCl é mais difícil de 
ser removido.
Lavagens4
Enzimas5
Remoção enzimática do contaminante: DNAse e RNAse
Extração de RNA
✓ Para RNA, quase todos os métodos de análise requerem a purificação de
moléculas de RNA que sejam intactas e de tamanho completo.
✓ A quebra dos polímeros afeta mais DNA do que RNA, mas a hidrólise enzimática
(nucleases) afeta mais os RNAs do que DNA
DNases - requerem íons metálicos para sua atividade,
podendo ser inativadas por agentes quelantes como o
EDTA
RNases - não necesitam íons metálicos, usam o
grupamento 2´ OH como espécie reativa.
Contaminação Exógena
Tratamento das soluções com DEPC
1. Adicionar DEPC à sua solução para que fique na concentração final de 0.1%
2. Misturar bem (agitação constante)
3. Incubar à temperatura ambiente de 2h a durante a noite (devidamente
vedada) 
4. Autoclavar
Contaminação Endógena
DEFINIÇÃO DO MÉTODO
• Tipo de tecido utilizado como fonte do ácido nucléico
(composição, grau de agregação celular)
• Finalidade do experimento
• Disponibilidade de reagentes no laboratório
• Fenol-Clorofórmio
o Mais comum
o Potentes desnaturantes de proteínas (e também as solubiliza)
o Fase solvente – fase aquosa (Ác. Nucléico)
o Piotr Chomczynski e Nicoletta Sacchi em 1987
Método descrito por Choemschisky: FENOL/CLOROFÓRMIO
Centrifugação – separação das frações celulares 
por densidade 
Glóbulos Brancos (leucócitos) camada 
intermediária
Plasma
Camada 
de leucócitos
Fase de eritrócitos
Ou Solução (Cloreto/Bicarbonato 
de Amônio) para Precipitação de 
Glóbulos Brancos
Lise Celular auxiliada mecanicamente
Solução Tampão de Lise contendo Isotiocianato de 
Guanidina; Sarcosil; Acetato de Sódio pH 4,0; 
Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico
Precipitação do RNA com álcool isopropílico
Ressuspensão do RNA
Quantificação em Espectrofotômetro
ANÁLISE DO DNA E RNA EXTRAÍDOS
Ex.: DNA - 0.02 X 200 X 50 = 200 ng/L 
Ex.: RNA - 0.02 X 200 X 40 = 160 ng/L 
Absorbância à 280 nm: utilizada para determinar 
o grau de PUREZA da amostra
A260nm/A280nm: 
1,7 a 1,9 para DNA
1,8 a 2,0 para RNA
FÓRMULA GERAL –
[ ] ng/L: A260nmX Fator Diluição X Constante
QUALIFICAÇÃO DO MATERIAL - ELETROFORESE
QUALIFICAÇÃO DO MATERIAL - ELETROFORESE
-Sob diferença de potencial elétrico, moléculas com carga, em solução aquosa, migram na
direção do eletrodo com carga oposta.
- Como as moléculas têm cargas e massas variáveis, a migração em um meio com viscosidade
definida se dará em diferentes velocidades, com separação das várias frações de uma mistura.
- A mobilidade eletroforética: a velocidade de migração por unidade de campo elétrico.
- Ácidos nucléicos: carga??? (grupamentos fosfato)
QUALIFICAÇÃO DA EXTRAÇÃO - ELETROFORESE 
- As análises por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida são
rotineiramente utilizadas em experimentos envolvendo ácidos nucléicos,
sendo que o poliacrilamida também é empregado amplamente em análise
de proteínas.
- MÉTODO ANALÍTICO E PREPARATIVO
Separadas as moléculas de
DNA, um fragmento de
tamanho específico pode ser
excisado do gel e purificado
para, posteriormente, ser
usado em uma gama de
procedimentos utilizados em
técnicas de manipulação
genética.
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
Parâmetros que afetam a migração do DNA de fita dupla 
- A velocidade de migração de uma molécula é inversamente
proporcional ao seu tamanho.
- A concentração de agarose desempenha importante papel na
resolução obtida, uma vez que densidade do gel determina o intervalo
de tamanho das moléculas que podem ser adequadamente separadas.
- A migração também é afetada por outras condições do sistema, tais
como força iônica do tampão de corrida e voltagem aplicada.
- Contaminação do DNA por sais e proteínas podem também interferir
de forma negativa na eletroforese.
Porcentagem de gel de agarose para resolução 
de DNA linear
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
Marcadores- O tamanho de uma molécula de DNA pode
ser determinado com precisão razoável se
um marcador de massa molecular
adequado migra em paralelo com as
moléculas que estão sendo fracionadas e
analisadas.
- Existem diferentes tipos de marcadores
com massa molecular variando de poucos
pares de bases até dezenas de Kb.
- A faixa de tamanhos de fragmentos de
DNA contida no marcador deverá ser
compatível com o material analisado.
Tampões de amostra 
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
- O tampão de amostra é usado com dois propósitos:
1) Agente espessante (glicerol, sacarose), reagente de alta densidade que evita o
refluxo da amostra de DNA ao ser aplicada no poço do gel;
2) Corante que permite o acompanhamento da frente de corrida.
- Azul de Bromofenol: migra concomitantemente com os fragmentos de 300
pb.
- Xileno Cianol: migra com a mesma velocidade dos fragmentos de cerca de 4
Kb.
- Portanto, o primeiro corante não é indicado para corrida em que se deseja
visualizar fragmentos de DNA de tamanhos pequenos, e vice-versa.
• O gel não ficou complemente submerso no tampão de corrida.
• O volume de amostra aplicado no gel foi muito pequeno.
• Condições de corrida impróprias.
- Voltagem muito alta
*Procure descobrir a voltagem recomendada pelo fabricante (padrão do
tamanho da cuba).
• Bolhas ou partículas no gel ou nos poços também podem atrapalhar.
PROBLEMAS NA CORRIDA
BANDAS 
SORRISO
QUALIDADE DO DNA EM GEL DE AGAROSE
DNA contaminado com RNA: purificação pelo uso de 
RNAses
DNA
RNA
RNA contaminado com DNA: purificação pelo uso de 
DNAses.
QUALIDADE DO RNAEM GEL DE AGAROSE
DNA