Biologia molecular - Nucleotídeos e ácidos nucleicos e Replicação.

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MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
MARIA LAURA – TROLE BIOMEDICINA XLII UFTM 
• Os nucleotídeos são estruturas responsáveis por formar as moléculas de DNA e RNA 
FUNÇÃO DO DNA: armazenamento da informação genética. 
FUNÇÃO DO RNA: rRNA(ribossômico), mRNA(mensageiro), tRNA(transportador) e outros RNA de funções 
especiais (ribozimas - atividade catalítica-, estruturais e regulatórios) 
ESTRUTURA DO NUCLEOTÍDEO 
 - açúcar de 5 carbonos (pentose) 
 - grupo fosfato 
 - base nitrogenada 
No exemplo é possível ver a estrutura básica de um 
DESOXIRIBONUCLEOTÍDEO, isto porque é possível 
observar que no segundo carbono está ligado uma 
molécula de hidrogênio. Ao que difere disto, se na 
segunda posição se encontrasse uma hidroxila (OH) 
o açúcar seria uma ribose. 
A base nitrogenada sempre se encontra ligada ao 
primeiro carbono da pentose, ao passo que o grupo fosfato está ligado ao 5º carbono deste grupo, podendo 
também ser encontrado fazendo ligação com o oxigênio do 3º átomo de carbono da pentose. 
Nucleotídeo na imagem é denominado Desoxi-CTP ou Desoxicitidinatrifosfato, porque: 
 - pentose: desoxirribose 
 - base nitrogenada: citosina 
 - nº de fosfatos: três (trifosfato) 
 
Nesse segundo exemplo têm-se uma RIBOSE, ou seja um 
ribonucleotídeo que pode compor o RNA. Os grupos deste 
nucleotídeo em questão são: 
 - pentose: ribose 
 - base nitrogenada: adenina 
 - nº de fosfatos: três (trifosfato) 
Ainda neste exemplo a porção destacada em azul (base 
nitrogenada e pentose) é um NUCLEOSÍDEO: 
 - molécula formada pela ligação entre uma 
pentose e uma base nitrogenada. 
 - nesse exemplo denomina-se ADENOSINA (adenina+ribose) 
NUCLEOTÍDEO 
 - 1 a 3 grupos fosfatos ligados à um nucleosídeo 
 - adenilato 
Para diferenciar os átomos da base nitrogenada dos átomos da pentose faz-se uma numeração 
T01 -aula 01 
 
 
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 - base nitrogenada: 1 a 6 (para citosina) e 1 a 9 
(para adenina) 
 - pentose: 1’ a 5’ 
CONFORMAÇÕES DA RIBOSE 
Há duas formas para se encontra a ribose: 
 - aldeídica 
 - cetônica (mais estável) 
Quando se identifica-se a forma ALDEÍDICA está posto 
que o primeiro carbono possui como grupo funcional um 
Aldeído, sendo que os seguintes são álcoois. 
A forma cetônica se forma quando o Oxigênio ligado ao 
C4’ da forma aldeídica promove um ataque de nucleofílico ao C1’ do aldeído. Neste momento a ligação 
entre C1’ e O pré-existente é desfeita e forma-se um ciclo, a forma CETÔNICA, com um álccol na posição 
1’. 
 
BASES NITROGENADAS 
Há sempre uma purina e uma pirimidina ligada ao C1’. 
 - purina: adenina (DNA e RNA) e guanina (DNA e RNA) 
• 9 átomos de carbono 
 - pirimidina: citosina (DNA e RNA), timina (DNA) e uracila (RNA) 
• 6 átomos de carbono 
 
DNA 
 
 
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A ligação entre as bases nitrogenadas e as pentoses é denominada LIGAÇÃO N-GLICOSÍDICA, porque sempre 
haverá uma ligação entre um átomo de Nitrogênio e o Carbono 1’ da pentose. 
 - Pirimidina: N 1 ligado ao C1’ 
 - Purinas: N 9 ligado ao C1’ 
O C5’ e C3’ se destacam pois são à esses átomos de carbono que serão realizadas LIGAÇÕES FOSFODIÉSTER. 
- une dois nucleotídeos 
- liga um fósforo a um oxigênio, e este ao carbono da base e assim por diante. 
- o trio Fósforo, oxigênio e carbono denomina-se FOSFOÉSTER 
RELAÇÃO DE CHARGAFF 
Para todo DNA testado nota-se 
- mesma quantidade de Adenina e Timina ( A = T ) 
- mesma quantidade de Guanina e Citosina ( C ≡ G ) 
- Cada uma dessas bases poderia ser encontrada aos pares!!!! 
Chargaff notou que para cada espécie estudada havia uma composição de bases nitrogenadas diferentes. 
 
TIMINA ≠ URACILA 
- presença de um grupo metil presente na dupla ligação do anel da TIMINA 
 
 
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MODELO DE WATSON & CRICK 
TÉCNINA DE ROSALIND FRANKLING 
- purificar a molécula de DNA e gerar cristais 
- incidir raios-X nos cristais 
- nota-se que cada molécula biológica gera um 
padrão de desvios de raios-x que irão refletir na 
estrutura da molécula 
CONCLUSÃO: 
DNA é formado por um grande eixo de 
simetria central que se organiza com ângulos 
diferentes, além de apresentarem duas regiões 
com grande quantidade de elétrons. 
 
CONSTRUÇÃO DO MODELO 
CONSIDERANDO: 
 - composição química da molécula 
 - capacidade de realizar ligações fósfodiester 
 - Relação de Chargaff 
 - Técnica de Rosalind Frankling 
Watson & Crick puderam construir um modelo para a 
molécula de DNA. 
- Envolve o pareamento de duas fitas de forma 
antiparalela, sendo que entre essas há a 
ligação entre duas bases nitrogenadas, 
seguindo então a regra de Chargaff uma 
Adenina liga-se à Timina ao passo que uma 
Guanina se liga à Citosina. 
- O pareamento antiparalelo se dá pelo sentido 
5’---3’ da fita, formando um ASPECTO DE 
DUPLA HÉLICE com um SULCO PRINCIPAL e 
outro SULCO SECUNDÁRIO, sendo que o 
primeiro é notavelmente mais largo e o 
segundo um pouco mais estreito. 
OS NUCLEOTÍDEOS SÃO MAIS FACILMENTE RECONHECIDOS NA REGIÃO DO SULCO PRINCIPAL. 
 
A molécula de DNA apresenta uma parte externa HIDROFÍLICA e uma parte interna HIDROFÓBICA. 
 - a hidrofilia da porção externa se deve à presença dos grupos fosfatos nessa região. 
 
As bases nitrogenadas ligam entre si por interações moleculares fracas de PONTES DE HIDROGÊNIO 
 - A = T (ligação dupla) - C ≡ G (ligação tripla) 
 
No interior das células as cargas negativas dos grupos fostafos são neutralizados por outros compostos 
dessa região, nos eucariotos por exemplo há uma interação direta entre as proteínas Histonas e estes 
grupos. 
 
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PLASTICIDADE DA DUPLA HÉLICE 
 
A forma mais estável do DNA é a forma B, com um interior 
hidrofóbico e exterior hidrofílico. 
GIRO DA MÃO DIREITA 
- ao posicionar a mão direita na frente da figura 
nota-se que os sulcos da molécula fazem o mesmo 
movimento que o polegar faria ao girar a mão. 
Se a molécula continuar sendo torcida ela se torna mais 
curta e com um diâmetro maior, caracterizando a forma A, 
que é menos estável. 
Já na forma Z o giro é inverso e é a mais rara encontrada. 
 
O DNA apresenta capacidade de se dobrar, no entanto a depender do tamanho da dobra pode se quebrar. 
- a quebra é catastrófica pra célula, e se acontecer com frequência como por exemplo no caso de 
uma pessoa exposta à radiação ionizante isso pode gerar acúmulo de mutações nas células deste 
indivíduo. 
Algumas regiões podem ser de TRIPLA HÉLICE, 
- acontece em situações muito específicas, onde uma das fitas é muito rica em purinas que pode 
realizar pareamento com outras duas fitas ricas em pirimidina formando o que é denominado de DNA H, 
uma região onde há 3 fitas. 
 
 
 
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Há a possibilidade de existir uma região da fita de DNA com autocomplementariedade 
- capacidade que as bases de uma mesma fita tem de parear entre si 
- quando acontece em apenas uma fita forma-se uma haste e uma volta, tendo aspecto de grampo 
- quando formam-se dois grampos (duas fitas) em uma mesma região do DNA forma-se uma 
estrutura com aspecto cruciforme 
 
ESTABILIDADE DAS ESTRUTURAS 
A dupla fita formada apenas por ligações de hidrogênio que são caracterizadas fracas, o que mantém a 
estrutura estável são a presença das seguintes propriedades: 
- íons 
- proteínas 
- ligação de Van de Walls 
- repulsão eletrostática 
• ocorre devido à repulsão dos grupos fosfatos, que 
são responsáveis por gerar o giro da molécula. 
A presença dessa ligação fraca entre as fitas permite a separação 
de uma com a outra a partir de um processo de desnaturação, 
que pode ser dado por: 
- aumento da temperatura 
- alterações drásticas de pH 
- alteração de propriedades como a viscosidadeda 
solução, e a Absorção de luz UV. 
O PROCESSO DE DESNATURAÇÃO É REVERSÍVEL. (hibridização) 
 
 
 
 
 
 
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Tm (melting temperature) 
A partir da desnaturação é possível determinar o que é chamado de Tm, onde há 50% de desnaturação, ou 
seja, metade das fitas de DNA em solução estão desnaturadas. O valor Tm depende de: 
- Razão GC x AT 
- pH da solução 
- força iônica 
- tamanho da molécula 
Cada molécula de DNA irá apresentar uma Tm que depende tanto da composição das bases de DNA quanto 
da solução. 
No gráfico mostra duas curvas de desnaturação, em azul é 
possível notar que o valor de Tm é cerca de 83º ao passo que a 
curva vermelha é de 85º. 
Isso se dá porque as soluções podem ser diferentes, seus 
tamanhos podem ser diferentes e podem ser formadas por 
diferentes bases nitrogenadas. 
 
EXEMPLO 1: 
 - 1000 pares de bases nitrogenadas 
 - ph de 7,4 
 - [sal]=9% 
A única coisa que explicaria a diferença de Tm é a composição 
de bases, já que o pareamento entre A e T se dá por DUAS 
LIGAÇÕES DE H, enquanto o pareamento entre C e G é feito por TRÊS LIGAÇÕES DE H. Isso permite dizer que 
possivelmente a molécula que corresponde à curva vermelha teria maior quantidade de bases do tipo C e G. 
 
EXEMPLO 2: 
- mesma solução 
- mesma composição de bases 
- tamanhos diferentes 
O tamanho da molécula de DNA correspondente à curva vermelha é maior. 
 
EXEMPLO 3: 
 - comparar soluções de pH 3 e pH 7 
Uma molécula de DNA que for desnaturada em uma solução de pH MUITO ÁCIDA (muita oferta de 
hidrogênio) ou MUITO BÁSICA (muita oferta de OH-) a Tm será mais baixa. Isso se dá porque as moléculas 
das bases nitrogenadas irão ter preferência por realizar ligação com H+ e OH- em excesso, ao invés de 
parear com as outras bases. 
EXTREMOS DE PH ABAIXAM O VALOR DE Tm!!!!! 
ATENÇÃO!!!!! Se em uma solução há grande quantidade de sais, estes irão retirar a água da solução que 
solvata/dilui as moléculas, e por resultado as cadeias ficam mais próximas favorecendo as interações 
hidrofóbicas, isso elevará o valor de Tm. Ou seja, uma solução com uma força iônica ou [íons] maior eleva a 
Tm. 
 
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O gráfico ao lado mostra a relação da quantidade de C e G 
que mostra que os valores de Tm são cada vez mais altos, 
pois quanto mais ligações de hidrogênio mais difícil de 
quebra-las. 
LEMBRAR!!!!! C e G: três ligações de hidrogênio. 
ATENÇÃO!!!!! A conformação da molécula de DNA pode 
alterar a Tm, sendo que quanto mais torcido mais difícil 
separar as fitas. De modo que Tm da forma A é maior que a 
Tm da forma B. 
 
 
 
 
 
ESTRUTURA DE RNA 
Apresenta EXTREMA PLASTICIDADE, já que é formado por uma fita simples com capacidade de formar uma 
dupla fita regional. 
O fato de ser fita simples concede à molécula uma liberdade de rotação: 
 - não há uma base nitrogenada associada à base nitrogenada da fita 
É possível observar pareamentos que não obedecem às regras de Watson & Crick 
ATENÇÃO!!!!! NA ESTRUTURA 
REPRESNTADA NOTA-SE UM 
NUCLEOTÍDEO DESTACADO QUE 
NÃO SE PAREIA COM NENHUMA 
OUTRA, FORMANDO UMA 
CURVA NA REGIÃO DE DUPLA 
FITA. 
AINDA SE FORMA UM LOOP 
ONDE EXISTEM DIVERS BASES 
QUE NÃO PODEM PAREAR COM 
A BASE CORRESPONDENTE DA 
FITA SEGUINTE FORMANDO 
DUAS CURVAS EM SENTIDOS 
DIFERENTES 
 
Essa estrutura da molécula é possível devido a auto-
pareamento, ou seja uma mesma fita de RNA dobra e forma 
grampos, loopings e nucleotídeos destacados. 
Quando não há pareamento W&C este será representado por 
um ponto, como é o caso de um pareamento entre G e U a 
partir de DUAS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO. 
BASES MODIFICADAS 
 - guanina metilada: Guanina com Metil na posição 7 
→ em uma região a base se pareia com a 
citosina, na outra pareia outra base com a 7-
metilguanina. 
 
 
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FUNCÇÕES ESSENCIAIS DOS NUCLEOTÍDEOS 
Unidades monoméricas dos ácidos nucleicos 
 - carreadores de energia: ATP, CTP, GTP, UTP 
 - cofatores e coenzimas: Coenzima A, FAD, NAD 
 - mensageiros químicos: AMP cíclico, GMP cíclico 
 
AULA T02 – BIOLOGIA MOLECULAR 
Maria Laura – TROLE BIOMEDICINA XLII UFTM 
 
GENOMA: conjunto e toda a informação genética de um organismo 
 - ser humano: formado por 23 pares cromossômicos 
 - bactéria: 1 molécula de DNA circular 
 - Sars-CoV-2: fita dupla de RNA linear 
Nas bactérias e eucariotos o material genético é o DNA ao passo que nos vírus pode ser de RNA ou DNA, 
ainda que podem variar de fita dupla a fita simples. 
SEQUÊNCIAS GÊNICAS e SEQUÊNCIAS NÃO GÊNINAS 
Não é toda extensão de um genoma que é capaz de codificar proteínas. 
- no DNA humano apenas 4% 
realmente pode ser codificador de um RNA 
funcional que irá dar origem à uma 
proteína. 
GENE: segmento de ácido nucleico capaz 
de codificar um produto funcional, que 
pode ser um RNA ou um POLIPEPTÌDEO 
EUCARIOTO: 
- organismo que possui núcleo 
próprio 
- organismos uni/multicelulares 
- DNA presente no 
núcleo/mitocôndria/cloroplastos 
 
PROCARIOTOS: 
 - se formaram antes da existência 
do núcleo 
- o material genético se encontra disperso no citoplasma e acumulado no nucléolo. 
- não há uma membrana que separa o DNA do citoplasma 
 
 
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ESTRUTURA DE CROMOSSMOS PROCARIÓTICOS 
 - ausência de núcleo 
 - cromossomo circular único (dupla fita de DNA) 
 - presença de plasmídeo 
 - ausência de centrômero (é um círculo, então não tem extremidade e nem centro) 
Podem apresentar moléculas de DNA circular extracromossômica denominado plasmídeo. 
 - NÃO É OBRIGATÓRIO QUE UMA BACTÉRIA APRESENTE ESSAS ESTRUTURA 
 - quando está presente na bactéria não é uma estrutura capaz de codificar funções essenciais 
(como a produção de energia) e sim funções acessórias (como fatores de virulência, características que 
podem tornar a bactéria em um organismo patogênico) 
PRIMEIRO GENOMA PROCARIÓTICO SEQUENCIADO 
 - a ordem de todas as bases nitrogenadas foram numeradas 
- obtém-se um arquivo com todas as bases 
sequenciadas 
- tamanho do genoma: 1.130.137 pares de base 
 - Número de ORFs: 1143 
• praticamente um ORF para cada 
1000 pares de base 
 - % CG: 38% 
• concretiza a teoria de Chargaaf que 
diz que cada organismo possui um 
conteúdo específico de bases 
Com técnicas de sequenciamento é possível observar e 
armazenar todas as informações de letras (A,T,C e G) 
Um gene quando reconhecido por computador e até então 
não testado diz-se que é um gene ORF. 
 - quando um programa sequencia o ATG (códon de ínicio) e 
posteriormente tiver mais de 100 códons codificadores de aminoácidos e no final tiver um dos três códons 
de parada (ATG, TAA) esta porção sequenciada é um gene em potencial (ORF). 
 - alguns genes não começam com ATG o que impede o programa de sequenciá-lo 
 
A imagem mostra o sequenciamento do genoma do Haemophilus influenza 
 - molécula única 
 - circular 
- as porções coloridas no genoma indicam ORF, para cada cor uma função do gene no interior da 
células 
 → amarelo: metabolismo de DNA 
 → vermelho: metabolismo 
 - cada banda de tracinhos indica os genes codificados em uma fita de DNA 
* os genes em azul correspondem àqueles que codificam apenas RNAm 
 
 
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Considerando a imagem acima: 
- cada seta indica um gene que foi predito 
- por convenção o sentido da seta indica o sentido da transcrição (5’---3’) 
- as setas ao contrario, mostram que são codificados pela fita complementar 
ROXO: estão envolvidos na síntese de a.a 
AZUL CLARO: produtor do gene está envolvido na biossíntese de cofatores ou carreadores 
VERDE CLARO: produto do gene está envolvido com a formação do envelope celular 
VERMELHO: processos celulares gerais 
AMARELO: metabolismo de DNA 
* Existemalguns que ainda possuem funções desconhecidas como: 
- ROXO: representa outras categorias que não estão descritos 
- HACHURADOS/LISTRADOS são conservados e hipotéticos, ou seja, existe em outras bactérias, mas 
ainda não tem uma função atribuída 
- BRANCO: tem função desconhecida, mas provavelmente não são conservados, logo, só existem nas 
bactérias 
 
 
 
 
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GENOMA HUMANO 
Genoma haploide formado por 23 pares de cromossomos encontrados no núcleo. 
DNA mitocondrial humano foi determinado em 1986 
 - tem forma circular 
 - codifica enzimas envolvidas no processo de fosforilação 
oxidativa, ou seja produção de energia para célula 
 - vermelho: genes que codificam RNAm que irão codificar 
enzimas para produção de energia 
 - em verde: codificam subunidades do RNA ribpossômico 
bacteriano 
 - as enzimas encontradas na mitocôndria não são apenas 
as sintetizadas pelo RNA mitocondrial, algumas que são produzidas 
no núcleo e posteriormente transportadas para o interior da 
mitocôndria 
* As características do DNA mitocondrial se assemelham muito ao 
DNA bacteriano, pois além de ser circular possui uma alta 
densidade de genes, assim como anteriormente apresentado do 
DNA da bactéria. 
 - existem algumas regiões de sobreposição 
 - TEORIA DA ENDOSSIMBIOSE 
 
ESTRUTURAS DE CROMOSSOMOS EUCARIÓTICOS
 
No núcleo encontram-se os cromossomos eucarióticos, cuja regra é: 
- são moléculas lineares 
- moléculas múltiplas – vários cromossomos lineares 
 
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Esse X que representa o cromossomo corresponde ao cromossomo no momento da METÁFASE do ciclo 
celular, na qual o material genético já foi duplicado e as cromátides irmãs estão unidas pelo centrômero. 
Nesse momento da metáfase o DNA está tão compactado que não existe transcrição. Falta então formar 
um fuso mitótico, essas cromátides separarem para dar origem a duas novas células 
O material genético está muito enovelado em torno do próprio eixo. Se desfazer isso, encontra o 
SOLENOIDE que é formado por NUCLEOSSOMOS enovelados. 
Os NUCLEOSSOMOS são proteínas associadas ao DNA, sendo formados pela molécula de DNA envolvendo 
8 histonas, de modo a formar um OCTÂMERO de histonas. 
 
 
 
CENTRÔMEROS 
 
Os cromossomos por serem estruturas lineares possuem 
extremidades e região central denominada CENTRÔMERO 
- Centrômeros são estruturas a partir das quais vai 
formar o CINETÓCORO (com fuso mitótico) para a separação 
das cromátides 
Apesar de se definir que ocupam uma região central os 
centrômeros podem ocupam diferentes regiões dos 
cromossomos. 
 
 
 
 
 
TELÔMEROS 
São estruturas que formam as extremidades dos cromossomos. E 
são organizados por sequências repetidas denominadas UNIDADES 
DE REPETIÇÃO. 
- em humanos, a unidade de repetição é GGGTTA 
A função principal dos telômeros é de proteção do cromossomo, de 
modo a evitar que ele seja desgastado. 
 
 
 
 
 
- Dupla fita de DNA se associa ao octâmero de histonas formam um nucleossomo → forma a fibra de 
cromatina → enovela → solenoide → enovela → super novelo → compacta → cromossomo na metáfase. 
 
 
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ESTRUTURA BÁSICA DE UM GENE HUMANO 
Existem regiões expressas em um RNAm maduros corresponde aos ÉXONS e regiões intercalantes que não 
estão expressos em um RNAm maduro, que se denominam ÍNTRONS. 
* A seta indica o PROMOTOR, ou seja, região onde a síntese de RNAm começa 
 
A produção do RNAm começa na região indicada e vai produzir tanto as regiões expressas que estarão 
presentes no transcrito maduro quanto as regiões intercalantes que não estarão presentes no transcrito 
maduro (são retiradas antes que o transcrito seja traduzido). 
-o inicio da informação biológica (ATG) e o termino é em alguns do códons de paradas (TAA, TAG, TGA) 
 
A transcrição não começa e termina exatamente no códon de início e códon de parada. 
▪ 5’ – UTR : região onde começa a transcrição (no promotor, um pouco antes do códon de início) 
▪ 3’ – UTR : região onde termina a transcrição (um pouco depois do códon de parada) 
▪ UTR : Untranslated Region 
 
 
* O PROCESSO QUE LEVA AFORMAÇÃO DO RNAm ATRAVÉS DE UMA MOLÉCULA DE DNA É A 
TRANSCRIÇÃO. AO PASSO QUE O PROCESSO QUE SINTETIZA PROTEÍNA ATRAVÉS DE UMA MOLÉCULA DE 
RNAm É A TRADUÇÃO.* 
 
 
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UM GENE EUCARIÓTICO TÍPICO 
 
O gene apresentado tem 7 exons e 7 intons, de modo que os exons estão identificados por números 
enquanto os introns são identificados por letras. 
QUANDO A TRANSCRIÇÃO ACONTECE, O RNA PRODUZIDO TEM TODA ESSA INFORMAÇÃO DE EXONS E 
INTRONS. NO ENTANTO SOFRE UM PROCESSAMENTO E PERDE OS ÍNTRONS. 
* O RNA maduro é menor que o gene que o codifica, este RNA maduro que será utilizado pelo ribossomo 
para traduzir a proteína 
IMPORTÂNCIA DE SE ESTUDAR UM GENOMA 
 
RASCUNHO DO GENOMA HUMANO: cobriu mais de 90% da sequência e que tem noção dos genes 
SEQUENCIA COMPLETA: conseguiu sequenciar mais de 98% das regiões codificadoras do genoma humano 
Em 2021 foi sequenciado o cromossomo 8 inteiro ou seja, codificou de telômero a telômero. 
Conhecer quais os genes existem e quais são suas organizações genômicas. 
 
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Ao conhecer um gene pode-se conhecer a capacidade metabólica dele, sabendo o que se pode ou não 
produzir. 
- se um gene pode estar relacionado com a doença, pode ter diagnostico mais rápido para a doença – 
diagnostico molecular 
 → faria um teste para analisar o teste naquele gene específico 
- Sabendo a estrutura da proteína, pode obter moléculas que se liga a ela e pode ativá-las ou desativá-
las 
* Desde 2001, o diagnostico já foi mais direcionado e mais rápido. 
* Capacidade estudar se uma pessoa tem a predisposição genética para determinada doença. 
 
ANÁLISE PRELIMINAR DO GENOMA HUMANO 
TAMANHO DO GENOMA: ~3.200.000.00 pb (pares de base) 
NÚMERO DE GENES PREDITOS: ~19.000 ORFs 
CARACTERÍSTICAS DOS GENES PREDITOS: 
 - número de éxons: 8,8 
 - exons pequenos: ~145 pb 
 - região codificadora: 1340 pb 
 - comprimento do gene: 27000 pb 
- Ítrons são 20x maior que exons 
ESTUDO DE OUTROS ORGANISMOS 
 
O estudo de outro organismos é 
interessante porque, uma vez que 
todos possuem um ancestral 
comum é possível identifica um 
gene homólogo em diferentes 
indivíduos, ou seja, apresentam 
funções semelhantes nos 
humanos. 
• SGS1 que codifica DNA helicase 
está relacionada com uma 
síndrome de Werner que leva ao 
envelhecimento precoce e está 
ligado com a manutenção do DNA, 
ou seja, uma pessoa com essa 
síndrome não corrige os danos que 
vão se acumulando às moléculas 
de DNA . 
 
 
 
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Maria Laura – TROLE BIOMEDICINA XLII UFTM 
DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR AULA T03 
 
O primeiro método a ser estudo é feito para identificar uma sequência de DNA em uma determinada 
amostra. 
As duas figuras mostram fotografias de géis nos quais foram separados fragmentos de DNA a partir de 
uma eletroforese e nessas condições são feitas as separações de acordo com o tamanho de cada 
fragmento. 
O DNA é cortado em áreas específicas de modo que olhando as bandas de DNA das laterais identificadas 
em ambas as imagens e seguindo uma sequência de baixo para cima está posto que: 
 - 560 pb 
 - 2000 pb 
 - 2300 pb 
 - 4500 pb 
 - 6000 pb 
 - 9000 pb 
 - 2400 pb 
Este DNA apresentado e que foi 
identificado a quantidade de pb é 
conhecido e por isso servem como 
REFERÊNCIA. 
Sendo assim, se os fragmentos de DNA 
que forem analisados possuírem um 
tamanho semelhante ao do DNA 
conhecido é possível separá-los em 
bandas, fazer a comparação com este 
DNA conhecido e possivelmente gerar um diagnóstico. 
Todas as amostras das imagens mostramperfis diferentes, no entanto é possível analisar se existe ali 
alguma banda que possa ser indicativa do diagnóstico que interessa. 
EX.: 
Considerar que o DNA analisado é de um vírus e que uma banda com 2350 pb indica uma certa 
característica desse vírus. Sendo assim as amostras de 2 a 6 da prmostram uma banda com esta 
característica. 
* Essa análise visual do gel pode ser feita quando são utilizadas amostras curtas do DNA 
Na imagem dois não é possível observar bandas individuais, porque a amostra é de um DNA humano. 
Sendo que, o DNA foi isolado e fragmentado com enzima de restrição e os fragmentos foram aplicados no 
gel. 
Sabendo que o GENOMA HUMANO possui 3.200.000.00 pb 
Se utilizar uma enzima de restrição que faz um corte a cada 10.0000 pb, teria que 3.200.000.00/10.000 
teriam 320.000 fragmentos de DNA para serem analisados por isso fica uma faixa contínua, sendo 
impossível fazer uma análise visual do gel. 
 
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Considerando que a partir da imagem 2 são 7 indivíduos diferentes e que deseja-se obter sequências 
específicas de cada um dos indivíduos. 
A depender do tipo de enzima de corte utilizada irá obter um resultado diferente, já que irá cortar uma 
região específica do DNA. 
DESNATURAÇÃO DA MOLÉCULA DE DNA 
A capacidade de desnaturar o DNA e depois uma substância que reconheça a fita simples presente na 
amostra que irá permitir revelar um resultado. 
Em géis de eletroforese o DNA é de fita dupla. 
O DNA não pode ser visto em luz visível por isso é corado com brometo de etídio para que posteriormente 
quando for incidido luz UV à essa amostra absorvam a radiação e emitam luz visível em um comprimento 
de onda de 560 nM que possui cor laranja. 
HIBRIDAÇÃO 
EXEMPLO: 
Em uma cena de crime foi coletado amostra de sangue do assassino. Além 
disso foram coletadas 7 amostras de possíveis suspeitos. O processo de 
determinação do perfil genético foi feito, e ao comparar as 8 amostras 
obteve-se a seguinte imagem: 
 Qualquer célula do criminoso deve possuir exatamente o mesmo perfil 
genético da amostra de sangue, sendo que o suspeito 3 possui 100% de 
compatibilidade. 
Em casos de gêmeos idênticos o perfil genético é exatamente o mesmo!!! 
Quando se analisa muitas regiões de gêmeos idênticos com o uso de PCR 
pode ser possível notar pequenas diferenças no perfil genético. 
Nessa imagem foi utilizada uma sonda que corresponde a uma sequência 
de DNA que é capaz de detectar sequências específicas em outras 
moléculas, então neste caso dos 320.000 fragmentos que cada indivíduo 
tinha a sonda vai captar apenas algumas dezenas, que varia de indivíduo 
para indivíduo, caracterizando o perfil genético de cada um. 
 
 
 
* A HIBRIDAÇÃO compreende a detecção de sequências específicas de uma amostra clínica pela utilização 
de sondas de DNA ou RNA 
* As SONDAS são fragmentos de DNA ou RNA que apresentam sequências complementares àquelas a serem 
detectadas, sendo que são específicas e variam a depender do indivíduo. 
- são radioativas ou quimicamente marcadas permitindo sua detecção posterior por 
autorradiografia ou quimioluminescência. 
- é um segmento de DNA de fita simples, e por isso detecta apenas DNA de fita simples. 
O DNA presente no gel de agarose é de fita dupla, por este motivo precisa ser desnaturado. Se a 
desnaturação for feita por variação de temperatura o calor aplicado irá derreter o gel e as amostras 
impedindo a visualização, por isto deve ser feita uma desnaturação química: 
 - adição de OH- 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
TRANSFERÊNCIAS DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS PARA SUPORTES SÓLIDOS 
A primeira técnica foi descrita por Edward Southern, e por isso recebe o nome de SOUTHERN BLOTTING 
sendo que é originalmente uma técnica para análise de DNA mas posteriormente foi aprimorada para 
análise de RNA e por isso fica denominada NORTHERN BLOTTING. Por fim quando aprimorada à análise de 
proteínas recebe o nome de WESTERN BLOTTING. 
 
TÉCNICA SOUTHERN BLOTTING 
- A primeira parte do processo é a fragmentação da molécula de DNA de maneira específica e não 
aleatória, o que permite que o DNA seja cortado sempre em regiões específicas são utilizadas 
ENDONUCLEASES/ENZIMAS DE RESTRIÇÃO. 
* nucleases são quaisquer enzimas que quebram ligações fosfodiéster e por isso uma 
ENDONUCLEASES quebra uma ligação deste tipo em uma região interna da molécula. 
No meio da molécula de DNA encontra-se uma sequência denominada PALÍNDROMO: 
 
 - nota-se que de 5’ para 3’ mantém-se a mesma sequência de nucleotídeos 
LEMBRAR!!!! OS NUCLEOTÍDEOS ESTÃO LIGADOS ENTRE SI POR LIGAÇÕES FOSFODIÉSTER. 
A endonuclease irá reconhecer o palíndromo e irá cortar as ligações fosfodiéster da SEQUÊNCIA 
PALINDRÔMICA de DNA entre os As no caso da EcoRI. 
 
Obtém-se um fragmento de DNA onde sua extremidade é formada por fita simples, (3’CGA5’ e 5’ACG3’) 
- As enzimas de restrição são isoladas de bactérias e por isso recebem nome de acordo com o 
nome científico da bactéria proveniente. 
 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
PROPRIEDADES ELETROCINÉTICAS 
Após a fragmentação o DNA é aplicado no gel de 
agarose, realiza a eletroforese separando os 
fragmentos de acordo com o tamanho, sendo que: 
 - fragmentos menores: migram com rapidez 
 - fragmentos maiores: migram com lentidão 
Essa diferença na velocidade de migração se dá pela 
estrutura em malha da agarose: 
- A agarose é um polímero de ágar de modo 
que forma uma malha chamada de peneira 
molecular, que possui alguns poros por onde 
os fragmentos de DNA irão atravessar. 
A MALHA DE AGAROSE É MAIS FROUXA (que a de poliacrilamida por exemplo) ENTÃO PERMITE QUE OS 
FRAGMENTOS SEJAM TRANSFERIDOS PARA A SUPERFÍCIE DA MEMBRANA. 
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
Pode ser chamada de eletroforese horizontal. 
- realiza o procedimento de eletroforese normal, aplicando os fragmentos de DNA nos sítios que 
irão migrar do polo negativo para o polo positivo 
 
 
 
TRATAMENTO DO GEL DE AGAROSE 
É necessário tratar o gel para que seja possível desnaturar as moléculas de DNA e posteriormente 
transferí-los para uma membrana rígida que não vai mais sofrer interferência de calor. 
- se o fragmento>15.000 pb: DESPURINIZAÇÃO com HCl para diminuir o peso molecular do DNA de 
modo que seja capaz de ser transferido. 
 * precisa posteriormente ser desnaturado. 
 - se o fragmento<15.000 pb: DESNATURAÇÃO do NaOH 
* mergulha o gel em uma solução com NaOH por aproximadamente 30min/1h para que a 
molécula de DNA seja desnaturada ficando com uma fita simples 
Depois de desnaturar a molécula de DNA é necessário NEUTRALIZAR O pH do gel, através de adição de 
fosfato de modo que a molécula não seja renaturada. 
* Depois de tratado coloca-se o gel em um recipiente por cima dele uma membrana de Nylon que tem a 
capacidade de reter a molécula de DNA. 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
 - a solução que mantém o gel úmido atravessa a membrana de Nylon e molha a pilha de papel 
mas o DNA permanece retido. 
* A membrana de Nylon deve ser retirada onde o DNA estará todo adsorvido em sua superfície. 
A molécula de DNA está associada por cargas, por isso a emissão de luz UV nesta superfície irá promover 
a formação de ligações covalentes entre a molécula e a membrana de Nylon, de modo que impede que 
ambos se soltem quando a membrana for mergulhada em uma solução. 
 
 
 
HIBRIDAÇÃO 
Utilização e sondas radioativas ou conjugadas com 
marcadores fluorescentes para que esta detecte ou 
não o DNA presente na amostra. 
Se a sonda tiver um alvo complementar está irá se 
associar e parear, do contrário não irá se associar. 
Segundo a imagem a molécula de DNA está 
representada em verde e a sonda em vermelho. 
* é fundamental que a hibridação aconteça em uma 
temperatura adequada, pois em altos valores de 
temperaturaa sonda pode ser incapaz de se associar 
ao seu alvo específico 
TEMPERATURA ESSENCIAL: próximo à Tm 
 
 
 
Em temperaturas 
muito altas o DNA 
está todo 
dissociado então não haverá associação entre sonda e fragmento da 
amostra. 
Já em temperaturas muito baixas a sonda vai formar uma fita dupla 
em qualquer região do DNA que seja minimamente complementar, 
então diversos fragmentos seriam reconhecidos não obtendo um 
resultado satisfatório. 
esse processo de transferência é o que se 
denomina um SOUTHERN BLOTTING 
O RIGOR DA HIBRIDAÇÃO 
(ESTRINGÊNCIA) DEPENDE DA 
TEMPERATURA DE INCUBAÇÃO. 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
 
A 65º C compreende uma TEMPERATURA ÓTIMA onde a sonda vai reconhecer apenas a sequência a qual é 
realmente compatível. 
 - condição ótima de rigor/estringência 
Se diminui um pouco a temperatura alcançando 60º C nota-se que as bandas específicas foram marcadas 
mais escuras, mas outras que não são de interesse também começam a aparecer, de modo que o resultado 
ainda pode ser interpretado. 
Em 55º C a interpretação já está dificultada porque diversas bandas secundárias começam a ser 
identificadas, ao passo que a 50º C esta condição se mostra ainda mais agravada. 
 
EXPOSIÇÃO E REVELAÇÃO 
Os filtros são expostos a filmes para raio-X e são revelados. 
Após a hibridação nota-se bandas fracas na 1ª e 2ª amostras, e bandas fortes nas 3ª, 4ª, 5ª e 6ª amostras 
e a 7ª amostra não apresenta bandas por isso é dito que o resultado é negativo. 
 
Nota-se que a banda que foi marcada fortemente 
na 5ª amostra foi marcada fracamente nas 
amostras 3,4 e 6. Isso pode identificar alelos 
mutantes. 
A interpretação destes resultados depende de 
outros parâmetros que serão estudados. 
Em um teste de paternidade teriam amostras do 
filho, do suposto pai e da mãe. 
 - filho herda 50% do pai e da mãe 
 - para determinar algum vínculo de paternidade 
o filho deveria apresentar metade das bandas 
compartilhadas com o pai. 
Detecção de um vírus, a amostra coletada deve 
apresentar bandas compatíveis com o perfil 
genético do vírus. 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
 
A imagem acima mostra um resumo de como é feito todo esse processo. 
Na obtenção das amostras de uma cena de crime coloca-se uma amostra de sangue retirada da cena, 
amostra de DNA da vítima e de dois suspeitos. 
* o uso da amostra de DNA da vítima é para garantir que o sangue coletado não foi dela e sim do 
assassino. 
Após feito todo o processo de Southern Blotting e hibridação tem como resultado uma que o perfil 
genético do suspeito 1 se assemelha bem à amostra de sangue obtida. No entanto, as bandas da amostra 
de DNA do suspeito estão marcadas muito mais forte que da amostra de sangue, isso pode ser devido à 
quantidade de sangue coletada. 
Não há bandas compartilhadas com o suspeito 2 e nem com a vítima, o que coloca o suspeito 1 na cena 
do crime, cabendo a ele uma possível justificativa de porque estava ali. 
TÉCNICA NORTHERN BLOTTING 
Compreende a análise de RNA, por isso tem características distintas do Southern Blotting. 
O RNA já se encontra em fragmentos, como RNAm, RNAt e RNAr, por isso não há necessidade do processo 
de fragmentação. Além disso, sua molécula já é de fita simples. 
A molécula de RNA pode ser diretamente aplicada em um gel desnaturante e a eletroforese já pode ser 
realizada, sem necessidade do processo de tratamento do gel. 
PROBLEMA!!!!! A fita simples de RNA é extremamente instável 
o que se difere da amostra de DNA, de modo que pode ser 
rapidamente degradado, por isso deve ser mantido em 
temperaturas extremamente baixas. 
O processo de eletroforese, hibridação e transferência são 
semelhantes às descritas para Southern. 
VANTAGEM: Se utilizar os controles adequados a 
interpretação do resultado pode ser quantitativa, não nota-
se diferença na quantidade de RNA aplicado, mas nota-se 
diferença na intensidade das bandas. O que permite dizer 
que a quantidade de RNAm identificado pela sonda é muito 
maior na amostra 4 do que na amostra 1. 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
Na imagem 1 as bandas que estão fortemente marcadas correspondem ao RNAr que compreende 95% do 
RNA de uma célula, e por isso se mostram tão marcados. Só é possível detectar RNAm quando se faz uso 
da sonda. 
APLICAÇÕES 
- Detecção de rearranjos gênicos e deleções observados numa ampla variedade de doenças humanas. 
- Avaliação da distribuição genômica se sequências (elementos estruturais ou genes) 
o se um gene está encontrado em apenas um local ou mais de um 
- Elucidação de vários processos biológicos (processamento de RNA, rearranjos de oncogenes) 
- Detecção de DNA de organismos infecciosos em amostras biológicas. 
Para Northern Blotting não interessa se o gene está presente ou não e sim se ele foi expresso!! 
EX.: 
- Pesquisa de um gene que codifica P53 (proteína envolvida no controle do ciclo celular), será 
encontrado em todas as pessoas. Mas em alguns tipos de câncer esta proteína se encontra 
expressa em altos níveis. Por isso não adianta simplesmente saber que o gene está presente, é 
necessário compreender em quais níveis P53 pode indicar um estado de saúde ou patologia. 
 
Maria Laura – TROLE BIOMEDICINA XLII UFTM 
DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR AULA T04 
 
Dogma central da biologia molecular, resume os principais elementos e passos do armazenamento e 
expressão da informação genética 
 
 
A REPLICAÇÃO garante a manutenção 
da informação genética, de modo que: 
 - realiza duplicação do material 
genético 
A TRANSCRIÇÃO corresponde à 
expressão da informação contida em 
uma parte do DNA. Então é o que forma 
um RNA. 
No caso da formação de proteína são 
utilizados RNAm para ser feita a 
TRADUÇÃO e serem transformados em 
proteínas. 
 
 
 
 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
A replicação compreende uma das funções dos ácidos nucleicos. O 
estudo da replicação é feito em uma molécula de DNA bacteriano porque 
foi a partir de onde se conheceu os principais elementos e 
características deste processo. 
REPLICAÇÃO DAS BACTÉRIAS 
Segundo Watson e Crick o DNA possui característica de dupla hélice. 
Além disso, os mesmos cientistas propuseram que a REPLICAÇÃO É SEMI-
CONSERVATIVA, ou seja: 
 - cada uma das fitas de DNA serviria como molde para fitas 
novas 
- no momento da divisão celular cada célula filha herda uma fita 
de DNA parental e uma fita de DNA recém sintetizada 
 
COMO A REPLICAÇÃO DO DNA OCORRE? 
Para demonstrar como a replicação acontece Meselson e Stahl 
trabalharam com moléculas de DNA bacteriano marcados com metais 
pesados (identificados pela letra H). 
As bactérias são retiradas do meio de cultura onde estão sendo cultivadas com bases nitrogenadas 
pesadas e transferidas para um meio de cultura com precursores de bases nitrogenadas com isótopos 
leves (identificados pela letra L). 
 
- partindo disto todas as novas moléculas estarão 
marcadas com isótopos leves 
* quando se considera um átomo umadiferençça de um 
nêutron é difícil de ser detectada por métodos laboratoriais 
comuns, mas ao considerar uma cadeia de DNA com 
milhares de pares de base, um nêutron de uma base somado 
ao nêutron de outra base leva um aumento significativo no 
peso molecular/densidade da molécula. 
Por isso foi possível separar o que eram as moléculas 
pesadas e quais eram as leves 
REPLICAÇÃO CONSERVATIVA: 
- 1ª geração: uma dupla fita pesada mantida e uma 
dupla fita leve recém formada 
- 2ª geração: uma dupla fita pesada mantida e três 
duplas fitas leves 
REPLICAÇÃO SEMI-CONSERVATIVA: 
 - 1ª geração: duas duplas fitas contendo uma fita 
parental pesada e uma fita recém formada leve 
- 2ª geração: duas dupla fitas híbridas e duas dupla fitas 
leves 
 
Para determinar a separação/densidade das cadeias foi utilizadoum processo denominada 
ULTRACENTRIFUGAÇÃO: 
 - permite separação de duas moléculas por sua densidade 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
* as moléculas mais pesadas (marcadas com N15) ficam 
no fundo do tubo, ao passo que as moléculas mais leves 
(marcadas com N14) em uma porção superior 
 
 
 
 
 
 
Na geração 0 forma-se apenas uma banda e com DNA 
inteiramente pesado. 
A medida que a bactéria duplicava o material genético 
foi retirado alíquotas para extração de DNA. 
A bactéria Scherichia Coli demora cerca de 20 minutos 
para duplicar totalmente seu material genético em 
uma temperatura de 37º. 
Com 0.3 gerações/6 minutos nota-se que uma parte da 
banda estava sendo deslocada para a esquerda. 
Com 0.7 pouco se via do DNA inicial e nota-se o 
surgimento de uma nova banda mais a esquerda. 
Já com 1 geração vê-se apenas uma banda de DNA que 
está mais deslocada para a esquerda. 
Esses resultados obtidos são compatíveis ao modelo se 
REPLICAÇÃO SEMI-CONSERVATIVA, porque: 
 - ao final da 1ª geração têm-se molécula 
híbridas com fitas leves e pesadas. 
* Se a replicação fosse conservativa ao final da 1ª geração seria possível observar duas bandas, 
uma do DNA inicial e outra do DNA de fitas leves. 
Com 1.9 gerações (quase 2) com 40 minutos de incubação se observa a formação de duas bandas, de modo 
que a banda nova está ainda mais deslocada a esquerda, já que corresponde àquelas moléculas dupla fitas 
inteiramente leves. 
* Se o processo fosse da replicação conservativa ao final da 2ª geração seriam vistas duas bandas 
também, no entanto a primeira delas estaria mais a direita alinhada com a do DNA inicial onde só 
tinham moléculas pesadas. E a banda nova teria que ter intensidade 3 vezes superior à da outra 
banda. 
Em uma mistura dos DNAs das gerações 0 e 1.9 nota-se a formação de três bandas que correspondem, 
respectivamente da direita para a esquerda: 
 - DNA dupla fita pesada 
 - DNA dupla fita híbrida 
 - DNA dupla fita leve 
DUPLICAÇÃO EM PROCARIOTOS 
Como as bactérias possuem um cromossomo único e circular a replicação poderia começar em vários 
pontos, ou apresentar uma única origem com inicio em qualquer local. 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
Cairns em 1963 demonstrou esse processo de replicação aplicando radioisótopos aplicados aos 
cromossomos para produzir lâminas que pudessem exemplificar os contornos das moléculas de DNA sendo 
replicadas. 
 
Foi visto que: 
 - a replicação acontecia a partir de um único ponto e partir daí ia progredindo até ser concluída 
 - CADA CROMOSSOMO BACTERIANO TEM UMA ÚNICA ORIGEM DE REPLICAÇÃO 
Surge uma dúvida de que a direção da replicação poderia ser BIDERECIONAL ou UNIDERECIONAL 
 
 
 
 
 
REPLICAÇÃO BIDIRECIONAL 
Foi feito um estudo com DNA marcado que permitiu afirmar que a replicação é do tipo BIDIRECIONAL. 
Realizado a partir de um DNA viral e com o uso de enzimas de restrição EcoRI, já que este DNA também 
é circular, segue o mesmo padrão de replicação e possui sítio de ligação para EcoRI. 
* o uso da EcoRI é para que quando a molécula for linearizada seu sítio funcione como referencial 
Ao medir a distância das extremidades da bolha de replicação, até a extremidade marcada por EcoRI e 
observar se a medida diminui de apenas um lado ou de ambos, de modo que: 
 - diminuir de um lado: unidirecional 
 - diminuir dos dois lados: bidirecional 
RESULTADO: Conforme a bolha crescia a distância entre as extremidades diminui em ambas as direções. 
Começa em um ponto e a partir dele a replicação 
migra para sentidos opostos até se encontrarem 
em um ponto equidistante à origem. 
Começa em um ponto e a partir dele a replicação 
migra para um único sentido fazendo toda a 
circunferência do cromossomo até retornar à origem. 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
 
 
 
 
 
 
ATENÇÃO!!!!!! Essa característica se aplica às 
bactérias, no entanto em cromossomos eucariotos 
existem vários pontos onde a replicação se inicia, 
o que se denomina SEQUÊNCIA DE REPLICAÇÃO 
AUTÔNOMA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
A SEQUÊNCIA DE ORIGEM É CASUAL OU EXISTE UMA SEQUÊNCIA CONSENSO? 
Ao analisar essa sequência em várias espécies de bactérias notou-se que alguns elementos se conservam 
para todas as bactérias. Sendo que foi encontrado um arranjo com 3 unidades de repetição/sequências de 
13 pares de base. 
* o N indicado significa que pode variar a base naquela posição 
Essa configuração de GATCTNTTNTTTT se repete nas 3 sequências que estão ao lado uma da outra, condição 
que se denomina TANDEM, além de serem do tipo diretas porque seguem a mesma direção para direita. 
 
Essas subunidades possuem pelo menos 9 das bases são A ou T. Podendo ser 11 se considerar o N 
Após essas sequências encontram-se 4 repetições dispersas de 9 pares de base, sendo que duas delas são 
diretas e duas são inversas, sendo que: 
 - fitas diretas: TTATCCACA 
 - fitas inversas: ACACCTATT 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
Foi demonstrando que existe uma proteína denominada 
DnaA que na presença de ATP é capaz de ligar as 
repetições de 9 pares de base, formando uma volta no 
molécula de DNA. 
 - quando essas várias moléculas de proteína do 
DnaA se ligam a região de 9 pb e fazem essa volta na 
molécula geram tensão que separa as bases da dupla fita. 
A separação das bases ocorre no lado do TANDEM porque é 
uma região rica em bases do tipo A e T onde as ligações 
que as unem são mais fracas. 
A separação permite que a extremidade da bolha formada 
fique livre, permitindo o início da replicação. 
Nesse momento a enzima HELICASE reconhece as regiões 
onde as fitas se soltaram e começa a agir na separação 
da dupla-hélice. 
 
COMO É FEITA A SÍNTESE DA NOVA FITA DE 
DNA? 
Uma vez que a HELICASE separa e abre a dupla fita a 
enzima DNA Polimerase 1 
- foi descrita em 1957 por Kornberg, onde 
determinou tudo o que é necessário para o 
funcionamento da DNA polimerase 1. 
REQUERIMENTOS: 
- só trabalha se estiver em uma reação com 
Desoxinucleotídeos trifosfatados (dATP, dCTP, 
dGTP e dTTP) 
- íons Mg+2 
- DNA pré-existente que sirva como molde 
- um seguimento de DNA ou RNA que forneça a OH-3’ para que os dNTP sejam incorporados 
 
 
* em verde: sequência de 
ácido nucleico que serve 
como iniciador/primer 
* em azul: dNTP 
A DNA pol1 incorpora os 
dNTP à molécula de ácido 
nucleico de acordo com o 
molde 
 
 
 
Na bactéria, quem produz o Primer é a PRIMASE que sintetiza uma molécula de RNA curta que serve como 
este iniciador. 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
CARACTERÍSTICAS DA DNA POLIMERASE 
 
- Sintetiza o DNA no sentido 5’------3’ 
- requer iniciadores de RNA (primer) 
- possui uma fidelidade alta, o que indica que só 
irá adicionar o nucleotídeo se for complementar à 
base nitrogenada do DNA molde. 
* pode eventualmente apresentar um erro nessa relação 
de complementariedade, mas a própria enzima é capaz 
de checar se houve esse erro, sendo até mesmo capaz de 
repará-lo 
 
 
DNA polimerase: FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO FOSFODIÉSTER 
 
A DNA polimerase é capaz de catalisar o ataque nucleofílico dos elétrons livres do oxigênio do OH- 
presente na extremidade 3’ ao fosfato-α do dNTP que será incorporado. 
 - elétrons do oxigênio se ligam ao fosfato- α 
 - quebra a ligação entre os fosfatos 
o forma um pirufosfato (PPi) que pode ser quebrando em duas moléculas de Pi 
 - nucleotídeo monofosfato é incorporado 
 - outra hidroxila (OH-) fica livre no C3’ o que permite que a cadeia continue crescendo 
 
 
 
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ATIVIDADE CORRETORA ou ATIVIDADE REVISORA 
ATIVIDADE EXONUCLEÁSICA 3’-5 
A DNA pol1 pode chegar alguns erros que a própria enzima comete, devido a sua capacidade de retirar 
nucleotídeos a partir da quebra de ligações fosfodiéster.- vermelho: fita parental 
 - azul: fita recém sintetizada 
Nesta imagem, a enzima comete um erro ao adicionar 
uma Timina para parear com a Guanina na extremidade 
3’, gerando uma torção no DNA que pode ser reconhecido, 
realizando uma distorção da molécula, onde: 
- a extremidade onde o nucleotídeo foi mal pareado 
é deslocado para um sítio de atividade de 
exonuclease, que possui a capacidade de quebrar a 
ligação fosfodiéster. 
- neste momento o nucleotídeo errado é retirado, 
e a extremidade volta pra o sítio de atividade de 
polimerase (Síntese) e o processo de replicação 
volta a ser feito 
Se uma base nitrogenada for retirada da extremidade 5’ esta que será reconhecida pelo sítio de atividade 
exonucleásica, sendo assim recebe o nome de ATIVIDADE EXONUCLEÁSICA 5’-3’. 
* nuclease: digere ác.nucleico 
* exonuclease: cliva as ligações fosfodiéster a 
partir das extremidades 
* endonuclease: cliva as ligações fosfodiéster 
internas 
Novas enzimas DNA pol foram descobertas 
sendo as principais delas: 
 - DNA pol II 
 → Reparo do DNA 
 → atividade polimerase 5’-5’ 
 → atividade exonuclease 3’-5’ 
 → está mais envolvidas com 
processos de reparo do que a replicação em si. 
 - DNA pol III 
 → possui várias subunidades, ou 
seja, é formada por várias cadeias de 
proteínas diferentes 
 → atividade polimerase 5’-3’ 
 → atividade exonuclease 3’-5’ 
De modo que as principais envolvidas no 
processo de replicação são a DNA pol I e DNA 
pol II 
DNA pol IV e V estão envolvidas em processos 
de reparo e não são consideradas no processo 
de replicação. 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
DNA POLIMERASES 
O que diferencia a DNA polimerase III da DNA polimerase II é a presença de uma estrutura denominada 
anel deslizante 
 - essa estrutura possui a função de aumentar a PROCESSIVIDADE do DNA 
* PROCESSIVIDADE está relacionada com o número de nucleotídeos que a DNA polimerase é capaz de 
adicionar sem se dissociar do molde 
 - o anel deslizante faz com que a DNA pol III consiga adicionar cerca de 500.000 nucleotídeos sem 
dissociar do molde 
 - a DNA pol I tem baixa processividade adicionando apenas algumas dezenas 
 
 VISTA FRONTAL VISTA LATERAL 
 
ETAPAS DA REPLICAÇÃO (E. coli) 
Se divide em INICIAÇÃO, EXTENSÃO e TÉRMINO/CONCLUSÃO. 
 
INÍCIO: 
Quando a DnaA se associa ao TANDEM e leva a abertura para formação da BOLHA DE REPLICAÇÃO, onde 
a HELICASE irá se associar. 
 
EXTENSÃO: 
A HELICASE desenrola o DNA parental. 
Além da HELICASE este processo também necessita da atividade da PRIMASE que quando trabalham 
juntas recebem o nome de PRIMOSSOMO ou INICIOSSOMO. 
 - o que determina o nome do complexo é se o livro coloca a enzima PRIMASE como INICIASE 
 
 
 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
 
 
 
 
 
 
 
 
Enquanto a Helicase desfaz a hélice gera uma tensão torcional na 
molécula de DNA. 
- como ao torcer um barbante nas duas extremidades e 
depois tentar puxar cada ponta para abrir eles irão se 
enrolar e não será possível mais abrir sem que o barbante 
se estore. 
Para diminuir essa tensão gerada é necessário a presença da 
TOPOISOMERASE que atua diminuindo a tensão e permitindo que a 
dupla fita seja desfeita pela helicase. 
A medida que a helicase consegue 
separar as fitas a PRIMASE adiciona o 
PRIMER e na extremidade 3’ desse 
primer a DNA pol III reconhece e 
sintetiza a fita de DNA a partir da 
adição de dNTP. 
 
Na fita da esquerda a replicação 
começou mais pra baixo e a DNA pol 
I vem sintetizando DNA no sentido 
de abertura da dupla fita, quase que 
acompanhando a HELICASE por isso 
se chama de DNA LÍDER. 
 
Já a fita da direita começa a ser 
sintetizada em uma direção oposta a 
abertura da forquilha, além de ser 
sintetizada aos pedaços o que a 
classifica como FITA DESCONTÍNUA, 
que forma pequenos fragmentos de 
DNA denominados FRAGMENTOS DE 
OKASAKI. 
 
Uma bolha de replicação apresenta duas forquilhas como esta apresentada. 
As estruturas em verde são proteínas SSB que se ligam as fitas simples de DNA impedindo que estas se 
reassociem. 
 
 
 
 
MARIA LAURA FARIA DE ANDRADE – BIOMEDICINA XLII BIOMED 
 
 
* a fita que é sintetizada na 
mesma abertura da forquilha 
como é anti-paralela será 
sintetizada no sentido 5’-3’ 
* Como a DNA pol só age no 
sentido 5’-3’ a outra fita será 
sintetizada no sentido contrário 
da forquilha. E por precisar de 
espaço para uma nova fita ser 
sintetizada esse processo é feito 
em pedaços.