Western Blot - Apostila

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Western Blot 
 
1. Introdução 
A técnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon 
1984) também pode ser denominada protein immunoblot e consiste na detecção de 
proteínas específicas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a 
elaboração dessa técnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extração e quantificação 
das proteínas; (2) fracionamento das proteínas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3) 
transferências dessas proteínas para uma membrana; (4) incubação da membrana com um 
anticorpo para detectar a proteína específica a ser analisada; e (5) revelação dessa 
membrana para análise dos dados. 
 
2. Extração e quantificação de proteínas 
Para realização dos experimentos de western blotting é necessário, inicialmente, 
realizar a extração e a quantificação das proteínas. Diversos métodos espectroscópicos são 
utilizados para quantificar proteínas em uma solução. O ensaio de Bradford é o mais 
utilizado e apresenta diversas vantagens em relação aos demais, como rapidez, não exige 
aquecimento e alta sensibilidade para baixas concentrações de proteínas. O método de 
Bradford se baseia na mudança de cor do corante Coomassie Blue G-250 em solução ácida 
(cor avermelhada) para cor azulada na presença de proteínas. As interações hidrofóbicas e 
iônicas estabilizam o complexo proteína-corante. Para quantificar a concentração de 
proteínas na amostra deve-se fazer uma curva de padronização com concentrações 
conhecidas de uma proteína (comumente se utiliza soroalbumina bovina, BSA) versus 
absorbância em 595 nm (comprimento de onda que o complexo proteína-corante absorve). 
A partir dessa curva obtém-se a equação de ajuste linear na qual é possível substituir os 
valores médios de absorbâncias das amostras, obtendo-se assim os valores da 
concentração das proteínas. É importante ressaltar, que para uma maior confiabilidade dos 
resultados, o coeficiente de correlação linear deve ser maior que 0,98. 
 
3. Fracionamento de proteínas 
Para separar as proteínas de uma amostra homogênea, a técnica mais utilizada é a 
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de 
SDS-poliacrilamida, que será uma matriz inerte através da qual as proteínas poderão 
migrar. O gel é preparado pela polimerização de monômeros de acrilamida e o tamanho dos 
poros do gel pode ser ajustado variando a concentração da acrilamida adicionada para 
retardar a migração da sua proteína de interesse. As proteínas podem possuir cargas 
positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminoácidos que as compõem. É 
utilizado, então, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um poderoso detergente carregado 
negativamente, que se liga nas regiões hidrofóbicas das moléculas de proteínas 
mascarando a carga intrínseca, e permitindo que as proteínas migrem em direção ao polo 
positivo em um campo elétrico. Além disso, o SDS quebra as ligações não covalentes das 
proteínas, fazendo com que elas voltem a sua estrutura primária, liberadas da associação 
com outros monômeros ou outras proteínas e moléculas de lipídeos. Além disso, usa-se, 
geralmente, um agente redutor tal como o β-mercaptoetanol, que quebra as ligações 
dissulfito (S-S) dos resíduos de cisteína que promovem a ligação de proteínas a outros 
monômeros, outras proteínas ou mesmo a estrutura terciária da mesma proteína, mantendo 
assim, as proteínas separadas e linearizadas (Figura 1a). A partir dessas condições, 
proteínas de um mesmo tamanho tendem a correr em um gel de poliacrilamida, na 
presença de um campo elétrico com as mesmas velocidades, uma vez que (1) suas 
estruturas nativas encontram-se completamente desnaturadas devido ao SDS e ao β-
mercaptoetanol fazendo com que suas formas sejam as mesmas e, (2) elas se ligam na 
mesma quantidade de SDS e portanto tem a mesma quantidade de cargas negativas 
(Figura 1b, c). 
 
 
 
A técnica de SDS-PAGE é largamente utilizada, pois é capaz de separar todos os 
tipos de proteínas, mesmo aquelas que são normalmente insolúveis em água (como por 
exemplo muitas proteínas de membranas). Além disso, como as proteínas são separadas 
por tamanho, é possível estimar o peso molecular e a composição das subunidades da 
proteína. Essas proteínas podem ser visualizadas diretamente no SDS-PAGE por coloração 
direta do gel, por corantes como o Comassie-Blue ou por tratamentos com nitrato de prata. 
O nitrato de prata é um dos métodos mais sensíveis de detecção, que permite a 
visualização de proteínas de até 10ng, enquanto que a coloração por Coomassie-Blue 
detecta proteínas de até 300ng. A Figura 2 representa proteínas coradas com Coomassie-
Blue e com Nitrato de Prata. 
 
 
 
 
 
4) Transferência para membrana 
Embora seja essencialmente uma técnica analítica, o SDS-PAGE somente não 
permite a análise de proteínas individuais e separadas. Para que isso seja possível é 
necessário utilizar anticorpos específicos para a proteína desejada, mas antes, é preciso 
que essas proteínas estejam em um suporte sólido, como membranas de nitrocelulose, 
PVDF ou de catiônicas de nylon. Essa transferência das proteínas do gel para a membrana 
inicialmente era feita por meio da capilaridade, mas atualmente usa-se a transferência 
eletroforética que é muito mais rápida e eficiente (Figura 3). 
 
 
 
Existem três tipos de membranas usadas para western blotting: de nitrocelulose, 
nylon ou PVDF (polyvinylidene fluoride). Diferentes proteínas podem se ligar com eficiências 
diferentes nessas membranas, e particulares epítopos antigênicos podem ser melhor 
preservados em um tipo em relação a outro. Os detalhes de cada tipo de membrana podem 
ser visualizados na Tabela 2. 
 
 
 
 
 
 
Depois de terminado o tempo de aplicação da corrente elétrica, usa-se um corante 
denominado Ponceau S para confirmar a transferência das proteínas para a membrana, e 
verificar se essa transferência ocorreu de maneira igual para todas as amostras. Em caso 
afirmativo, pode ser dada continuidade ao experimento de western blotting. 
 
 
 
 
5) Detecção da proteína específica 
Para visualizar uma proteína de interesse é utilizado um anticorpo específico que vai 
reagir com um epítopo da proteína, formando um complexo anticorpo-antígeno. Esse 
anticorpo é denominado anticorpo primário, pode ser policlonal (reconhece mais de um 
epítopo) ou monoclonal (reconhece apenas um epítopo da proteína de interesse) e é 
produzido geralmente em camundongo ou em coelho. Além disso, esse anticorpo não 
possui nenhum tipo de radiomarcação, ou conjugação com alguma enzima. A incubação da 
membrana com o anticorpo primário geralmente ocorre overnight a 4ºC e, depois disso, a 
membrana é lavada intensamente com tampão de lavagem para retirar todo o anticorpo que 
não está especificamente ligado à proteína de interesse. 
Depois da lavagem, a membrana é incubada com um anticorpo secundário. Esse 
anticorpo é um anti-IgG, ou seja, é um anticorpo que reconhece um anticorpo. Por exemplo, 
se foi utilizado um anticorpo primário anti uma proteína de interesse, produzido em 
camundongo, será utilizado um anticorpo secundário anti-IgG de camundongo, que 
reconhecerá qualquer anticorpo produzido em camundongo. Esse anticorpo secundário 
possui alguma modificação que permitirá a visualização da proteína de interesse. As 
principais modificações utilizadas atualmente são (Figura 4): 
 
a) Conjugação do anticorpo com uma enzima: tais como peroxidade ou fosfatase 
alcalina. Neste caso, no momento da revelação da membrana, adiciona-se um substrato 
dessa enzima. Nos locais onde essa enzima está presente (apenas nos locais onde tem o 
anticorpo primário, ou seja, na proteína específica), ocorrerá a reação e a formação do 
produto dessa reação. É utilizado um filme, e aparecerá a marcação nas regiões em que 
ocorreu essa reação, permitindo localizar a proteína de interesse. 
 
 
 
 
b) Associaçãodo anticorpo com um fluoróforo: que será posteriormente excitado 
com um laser de comprimento de onda específico para esse fluoróforo, e então as regiões 
onde o anticorpo se ligou serão evidenciadas.