Microbiologia COLORAÇÃO DE GRAM

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Disciplina: MICROBIOLOGIA Prof. Dr. Luis Carlos F.
Carvalho PRÁTICA: COLORAÇÃO DE GRAM
GRUPO 01
Isadora viana, Larissa de Sousa, Juliana santos,
Luanna Kamada, Milena Carvalho e Eva Carla
Objetivo: Observar formas, disposição e comportamento tintorial das bactérias.
Distinguir bactérias Gram-positivas das Gram-negativas
Princípio: O método de Gram permite classificar as bactérias em dois grandes
grupos: as que retêm Violeta de genciana ( Gram-positiva ) e as que não retém o
violeta genciana (Gram-negativa). Além do mais, é útil para determinar a forma (
cocos e bacilos ), e o arranjo das células após a divisão celular ( em forma de cacho,
cadeias, sarcina etc., ). As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente:
● Comportamento tintorial: Gram-positiva ou Gram-negativa
● Forma: cocos (esféricos), bacilos (cilindricos) e espirilos (espiralados)
● Arranjo: Disposição das células entre si. Os cocos podem estar isolados, aos
pares(diplococos), agrupados em cachos (estafilococos), em cadeia
(estreptococos). Os bacilos e espirilos se apresentam em geral como células
isoladas porém, ocasionalmente, pode-se observar bacilos aos pares
(diplobacilos) ou em cadeia ( estreptobacilos ).
Quanto ao tamanho, as células bacterianas são sempre de dimensões
microscópicas, o diâmetro da maioria delas varia de 0,2 a 1,5 μm e comprimento de 1
a 6 μm.
Material: Reagentes de Gram: sol. cristal-violeta 2%; sol. aquosa de iodo (Lugol);
mistura álcool-acetona; sol. alcoólica de safranina1, Lâminas: Suporte para lâminas;
alça de platina; Bico de Bunsen; Microscópio; Óleo de Imersão
Método:
● Cobrir a área do esfregaço com a solução de cristal-violeta por cerca de 1min.;
● Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
● Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
● Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra
incolor;
● Cobrir o esfregaço com a solução de safranina1 por cerca de 30 segundos;
● Lavar com água corrente;
● Deixar secar ao ar .
REAGENTES PARA COLORAÇÃO DE GRAM
Cristal Violeta
Solução A
Cristal-violeta 2g
Álcool etílico 20 ml
Solução B
Oxalato de amônio 0,8g
Água destilada 80 ml
MISTURA A + B
Lugol
Iodo 1g
Iodeto de potássio 2g
água destilada 300ml
Contracorante
Solução estoque:
Safranina 2,5 g / 100ml
Solução uso: Diluir sol. estoque 1/10
1 Ou Fucsina de Ziehl diluida 1/10
Interpretação: As bactérias Gram-positivas retém o cristal-violeta e se apresentam
com coloração violeta, enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo
álcool-acetona, sendo, portanto, coradas pela safranina e se apresentam róseas.
Comentários:
Em 1884, o médico Dinamarquês Cristian Gram descobriu, empiricamente, ao corar
cortes histológicos com violeta genciana, através do método de Ehrlich (1882), que
as bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente
tratadas com solução de iodo. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante
(safranina, fucsina básica, etc.,) e estabeleceu, a partir dai, uma metodologia de
coloração diferencial. Ao longo destes anos, o mecanismo de coloração de Gram foi
sobejamente estudado. E nesta medida, muitas modificações foram propostas, sem
contudo afetar substancialmente a idéia original.Os microrganismos respondem
diferentemente ao método. Há os que retém o pigmento característico do corante
(cristal violeta) em vista da formação de um complexo com a solução iodo-iodeto
(lugol), apesar da lavagem com álcool ou acetona, motivando uma desidratação da
parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade. São os
Gram-positivos. E há os que permitem a remoção do pigmento do corante pela
lavagem com álcool ou acetona, em decorrência da extração de lipídios da parede, o
que leva a um aumento da porosidade celular. São os Gram-negativos. Tratando, os
dois grupos, com contra-corante (safranina ou fucsina básica) observa-se que as
células do primeiro (Gram- positivos) não são afetadas e permanecem azuis ou
violeta; enquanto que para o outro (Gram-negativos) as células absorvem o
contra-corante, tornando-as vermelhas.A parede celular bacteriana apresenta
particularidades na sua composição química. Este dado é absolutamente coincidente
com a resposta à reação de Gram. A presença de maior teor de peptideoglicano nos
Gram-positivos, tem sido apontado como fator determinante da retenção do
complexo ao nível de parede. Tanto assim que os protoplastos, produzidos por ação
de lisozima ou por efeito de penicilina sobre os Gram- positivos, não são capazes de
reter o pigmento, após lavagem com álcool ou acetona. Portanto, a reação de Gram
resulta essencialmente das interações do complexo, cristal violeta ou violeta de
genciana e iodo, com o peptídeoglicano da parede celular, numa combinação ainda
não de todo esclarecida, na qual a presença de ribonucleato de magnésio é mediadora
da fixação do corante.A reação de Gram tem largo relacionamento com o estado
fisiológico da célula. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial.
As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar como Gram-variaável,
pela perda da capacidade de retenção do corante.A coloração é hoje empregada com
elevado significação taxonômica. Assim, são Gram-positivos quase todos os bacilos
esporulados, móveis por flagelos peritríquios e a quase totalidade dos cocos. São
Gram-negativos a quase totalidade dos bacilos não esporulados, móveis por flagelos
peritríquios ou polares, e todas as espiroquetas, apenas para citar alguns exemplos.
QUESTÕES
1)A coloração de Gram possibilita caracterizar as bactérias quanto ao
comportamento tintorial (Gram-positiva e Gram-negativa), morfologia (cocos,
bacilos, espirilos) e arranjo (em cacho, em cadeias, aos pares). Qual o significado
destas informações para a medicina? 
É importante porque auxilia no diagnóstico e tratamento das doenças infecciosas.
2) A coloração de Gram exerce alguma importância em diagnósticos clínicos de
bactérias isoladas de infecções humanas e animais? Citar pelo menos um exemplo.
 Sim, Algumas bactérias, tais como a Neisseria, apresenta características peculiares.
Assim o achado de diplococcus Gram-negativos, intra e extracelulares em secreções
pode sugerir uma gonorréia, no caso da secreção uretral, ou uma meningitide, no caso
do material for um liquor.
3 Empiricamente, Gram estabeleceu uma sequência para a aplicação dos corantes
que integram a metodologia. Comentar os resultados possíveis de serem obtidos
com as inversões da sequência referida no método. 
Os microrganismos respondem diferentemente ao método. Há os que retém o pigmento
característico do corante (cristal violeta) em vista da formação de um complexo com a
solução iodo-iodeto (lugol), apesar da lavagem com álcool ou acetona, motivando uma
desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade. São os
Gram-positivos. E há os que permitem a remoção do pigmento do corante pela lavagem
com álcool ou acetona, em decorrência da extração de lipídios da parede, o que leva a
um aumento da porosidade celular. São os Gram-negativos. Tratando, os dois grupos,
com contra-corante (safranina ou fucsina básica) observa-se que as células do primeiro
(Gram-positivos) não são afetadas e permanecem azuis ou violeta; enquanto que para o
outro (Gram-negativos) as células absorvem o contra-corante, tornando-as vermelhas.
4) Sabe-se que se a parede celular é o sítio preferido pela fixação da reação de
Gram. Fazer um esquema mostrando esta associação, para o caso típico de uma
bactéria Gram-positiva. 
A parede celular bacteriana apresenta particularidades na sua composição química. Este
dado é absolutamente coincidente com a resposta à reação de Gram. A presença de
maior teor de peptideoglicano nos Gram-positivos, tem sido apontado como fator
determinante da retenção do complexo ao nível de parede. Tanto assim que os
protoplastos, produzidos por ação de lisozima ou por efeito de penicilina sobre os
Gram-positivos, não são capazes de reter o pigmento, após lavagem com álcoolou
acetona. Portanto, a reação de Gram resulta essencialmente das interações do complexo,
cristal violeta ou violeta de genciana e iodo, com o peptídeoglicano da parede celular,
numa combinação ainda não de todo esclarecida, na qual a presença de ribonucleato de
magnésio é mediadora da fixação do corante.
5) Sendo o Gram um método de coloração diferencial, como esta reação pode ser
empregada para a verificação do estado de pureza de uma determinada cultura?
Resp = A realização periódica do exame de uma cultura pura demonstra que todas as
colônias apresentam a mesma característica morfotintorial.
6) Comente o efeito da penicilina sobre a parede celular bacteriana,
correlacionando-o com a reação tintorial de Gram. 
A penicilina agem sobre a parede celular, causando ruptura e conseqüentemente altera
todas as características morfotintorial observada na coloração de Gram.
7) Comente a frase: “Uma bactéria Gram-negativa pode tornar-se Gram-positiva,
dependendo do tempo de incubação da cultura, mas o inverso não é verdadeiro”.
A característica tintorial de Gram-negativa é devido a presença da membrana externa,
que pode ser perdida em certas condições de cultivo desfavorável, fazendo com que a
bactéria apresente característica de Gram-positiva (roxa), mas o contrário não é possível
porque uma bactéria Gram-positiva jamais adquire a membrana externa, ou seja, uma
vez, Gram-positiva, sempre Gram-positiva
8) Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as
alterações ou adaptações realizadas. 
Sim, estavam todos de acordo com o protocolo
9) Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais
outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela
falta ou substituição do material? 
Os matérias estavam de acordo com o protocolo. Os matérias utilizados foram bico de
busen, alça de platina, lamina, violeta, lugol, água, álcool acetona, água e fucsina.
10) Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática? 
Não houve dificuldade nessa pratica, pois conseguimos vizualizar os estafilococos
11) Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os
possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram?
Comente sobre as normas de biossegurança.
Os procedimentos de biossegurança foram todos seguidos; os acadêmicos estavam com
os EPI´S adequados. Os possíveis riscos que poderíamos sofrer é a contaminação com
os materiais ou um corte caso a lamina quebrasse
12) Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor
esclarecimento das suas dúvidas.
1.Quais os métodos de observação microscópica de bactérias?
2.Quais as Doenças Infecciosas e seu agente infeccioso que são diagnosticados
seguramente pela uma coloração simples?
3.Quais as limitações do exame de colocaração de gram?
4.Quais cuidados a serem tomados para execução satisfatória da tecnica?
5.Qual a aplicação da coloração no Diagnóstico Laboratorial de doenças infecciosas?
6.Qual a base da coloração de Gram?
7.Se caso ao fazermos a coloração de Gram de um esfregaço, esquecemos de descorar
com álcool-acetona, ao examinar uma cultura de bacilos e cocos, o que poderíamos
observar?
8. A coloração pelo método de Gram identifica as bactérias gram-positivas por
apresentarem um maior percentual de?
9. Qual o elemento que permite a fixação da coloração vermelha nas bactérias gram-
negativas?
10. Por qual motivo é necessário a utilização da Fucsina e ter que esperar 30 segundos?