Extração e identificação de Ácidos Nucleicos

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NUTRIÇÃO, UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA 
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Extração e identificação de ácidos 
nucleicos 
Ácidos nucleicos: São macromoléculas 
formadas por subunidades denominadas 
nucleotídeos. 
 Funções: Armazenar e transmitir a 
informação genética. 
 Localização em eucariontes: 
DNA: núcleo e dentro de organelas 
(mitocôndrias e cloroplastos). 
RNA: núcleo e citoplasma. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Extração dos ácidos nucleicos 
 
 Identificação dos ácidos nucleicos: 
 Reativo de difenilamina: identificação 
de DNA na amostra. 
 Reativo de orcinol (teste de Bial → 
identifica pentose): identificação de 
RNA na amostra. 
Evidenciar a presença de ácidos nucleicos 
(DNA e RNA) encontrados em frações 
celulares de um homogeneizado, mediante 
reações características para pentoses que 
os compõem. 
 Preparar um extrato celular e explicar 
as funções dos reagentes utilizados; 
 Realizar precipitação diferencial de 
biomoléculas (proteínas e ácidos 
nuclécios); 
 Utilizar centrífuga e recuperar 
sobrenadantes e precipitados; 
 Realizar testes para identificar a 
presença de DNA e de RNA em 
amostras de ácidos nuclécos; 
 Explicar as reações para identificação 
de ácidos nucléicos. 
 
Introdução 
R
V 
RNA (uracila no 
lugar da timina) 
Objetivo Geral 
Objetivos Específicos 
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 Preparo do homogeineizado de 
células: 
1. Colocar 5 g de um tablete de fermento 
biológico em um gral ou almofariz; 
2. Adicionar 5 mL de éter etílico; 
3. Adicionar água destilada até formar um 
homogeneizado (denso). 
 
Quando coloca o éter etílico e faz-se a 
maceração, rompe as membranas celulares e 
libera material intracelular, no caso, proteínas, 
ácidos nucleicos, etc. 
 Extração de ácidos nucleicos: 
1. Em um tubo de centrífuga, colocar 2 mL 
do homogenato; 
2. Adicionar 1 mL de TCA a 20%, misturar 
e deixar em repouso por 10 min; 
3. Centrifugar por 5 min a 5000 rpm; 
4. Descartar o sobrenadante; 
 
 
 
5. Adicionar 3 ml de TCA 5% ao 
precipitado. Ressuspender utilizando 
um bastão de vidro; 
6. Transferir a suspensão para um tubo 
de ensaio grande. Aquecer em banho 
fervente por 5 min; 
7. Transferir novamente para um tubo de 
centrífuga. Centrifugar por 5 min a 
2500 rpm; 
8. Transferir o sobrenadante para um 
tubo de ensaio. Descartar o 
precipitado. 
O TCA 20% vai precipitar dentro do 
homogeineizado apenas proteínas e ácido 
nucleicos. 
O TCA 5% vai ressuspender o precipitado, 
solubilizar o precipitado. 
Quando acontecer o aquecimento vai 
precipitar as proteínas e os ácidos nucleicos 
vão ficar no sobrenadante. Então o 
precipitado será descartado. 
 Identificação de ácidos nucleicos 
Material 
Cuidados Necessários 
Métodos 
orcinol 
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 Estrutura e função dos ácidos nucleicos; 
 Reações que ocorreram na identificação 
dos ácidos nucleicos; 
 Emprego de cada reagente nos 
procedimentos; 
 Resultados obtidos nos ensaios pra DNA 
e RNA. 
1. Preparo do homogeineizado de 
células 
Os 5 g de um tablete de 
fermento biológico já foi 
colocado no almofariz. 
Foi adicionado 5 mL de éter etílico (que vai 
romper a membrana celular). Esse 
procedimento é feito na capela. 
Foi adicionado água destilada até formar um 
homogeneizado (denso). A agitação mecânica 
do pistilo ajuda o rompimento da membrana 
celular. 
2 mL do homogeneizado foi transferido para um 
tubo de centrífuga. 
2. Extração de ácidos nucleicos 
1 mL de TCA (ácido tricloroacético) 20% foi 
adiconado ao homogenato, misturou-se e 
deixou em repouso por 20 minutos, para 
garantir que houvesse a precipitação das 
proteínas e ácidos nucleicos. 
Após o repouso, o tubo foi 
centrifugado por 5 minutos. A 
centrifugação formou um precipitado 
com os ácidos nucleicos e as 
proteínas. O sobrenadante contém 
outros componentes celulares e foi 
descartado. 
Para separar os ácidos nucleicos das proteínas 
contidas no precipitado, foi adicionado 3 mL de 
TCA 5% ao mesmo, o que vai ressuspender ele, 
ressolubilizá-lo. 
 
 
A suspensão foi transferida pra 
um tubo de ensaio grande, que foi 
aquecido em banho-maria 
fervente por 5 minutos. 
Após o aquecimento, o material foi tranferido 
para um tubo de centrífuga, que foi 
centrifugado por 5 minutos. 
Depois da centrifugação, o pellet 
(precipitado) contém as proteínas 
e os ácidos nucleicos estão no 
sobrenadante. Então o 
sobrenadante foi tranferido para 
um tubo de ensaio e o precipitado 
foi descartado. 
3. Indentificação dos ácidos 
nucleicos 
 
 Teste para DNA 
Foram enumerado 3 tubos de ensaio. 
No tubo 1 (controle negativo), foi adicionado 
1 mL de água. No tubo 2 (controle positivo) 
foi adicionado 1 mL de DNA padrão. E no 
tubo 3 foi adicionado 1 mL do extrato de Ac. 
Nuc. 
Depois pipetou-se 1 mL do reativo da 
difenilamina. (na capela de exaustão) 
Então os tubos foram colocados em banho 
fervente por 10 minutos. 
O controle negativo não desenvolveu 
nenhuma cor. O controle positivo 
desenvolveu um cor azul forte. Já a amostra 
de DNA desenvolveu uma coloração azul um 
pouco mais clara. 
 Teste para RNA 
Assim como o teste anterior, foram 
enumerado 3 tubos de ensaio. 
No tubo 1 (controle negativo), foi adicionado 
1 mL de água. No tubo 2 (controle positivo) 
foi adicionado 1 mL de RNA padrão (ou 
ribose). E no tubo 3 foi adicionado 1 mL do 
extrato de Ac. Nuc. 
 
Resultados e Discussão 
Aula Prática 
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Depois pipetou-se 1 mL do reativo de orcinol. 
(na capela de exaustão) 
Então os tubos foram colocados em banho 
fervente por 10 minutos. 
O controle negativo fica amarelo, dá cor do 
orcinol mesmo. O controle positivo desenvolveu 
uma cor azul intensa. Já a amostra de RNA 
desenvolveu uma coloração azul-esverdeada.