Helio Aneta__Monografia Ultims VersaoLippia javanica

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Hélio Aneta Macuácua
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIMALÁRICA DA LÍPPIA JAVÁNICA, USADA TRADICIONALMENTE PARA O TRATAMENTO DA MALÁRIA NO DISTRITO DE MATUTUINE, PROVÍNCIA DE MAPUTO.
Licenciatura em Ensino de Química com Habilitações em Ensino de Biologia
Universidade Save
Chongoene
II
	
2021
Hélio Aneta Macuácua
 
AVALIAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIMALÁRICA DA LÍPPIA JAVÁNICA, USADA TRADICIONALMENTE PARA O TRATAMENTO DA MALÁRIA NO DISTRITO DE MATUTUINE, PROVÍNCIA DE MAPUTO.
 (
Monografia a ser apresentada na Faculdade de Ciências Naturais e Exactas, para Obtenção do Grau Académico de Licenciatura em Ensino de Química com habilitações em Ensino de Biologia
.
Supervisor: 
MSc. Agostinho Chambe
Co-Supervisor: 
MSc. Alfredo Dique
)
Universidade Save
Chongoene
2021
Índice 	Pág.
Lista de Figuras	v
Lista de tabelas.	vi
Lista de símbolos, abreviaturas e acrónimos	vii
Declaração	ix
Dedicatória	x
Agradecimentos	xi
Resumo	xii
Abstract	xiii
CAPÍTULO I	14
1.Introdução	14
1.1.	Problematização	15
1.2.	Objectivos	16
1.2.1.	Geral	16
1.2.2.	Específicos	16
1.3.	Questões científicas	16
1.4.	Justificativa	16
CAPÍTULO II	18
2.Revisão da literatura	18
2.1.	Fundamentação teórica	18
2.1.1 Uso medicinal das plantas	18
2.1.2. Plantas medicinais no combate a malária	18
2.2.	Conceitos básicos	19
2.2.1.	Malária	19
2.2.2.	Produtos naturais	19
2.2.3.	Metabólitos secundários	19
2.2.4.	Extracção	20
2.3.	Aspectos Gerais sobre a malária	20
2.3.1.	Cinco espécies de Plasmodium podem produzir a doença:	20
2.3.2.	Situação da Malária no País	21
2.3.3.	Ciclo de vida do plasmodium	21
2.4.	Mecanismo de acção dos fármacos antimaláricos clinicamente usados	23
2.4.1.	Inibidores da produção da hemozoina (β – hematina)	23
2.4.2.	Terapia combinada da artemisinina	23
2.4.3.	Tratamento da malária em Moçambique	24
2.4.4.	Malária Não Complicada	25
2.4.5.	Malária Grave/Complicada	25
2.5.	Produtos naturais de origem vegetal	25
2.5.1.	Família Verbenaceae	26
2.5.2.	Actividades biológicas atribuídas ao género Líppia	26
2.5.3.	Líppia javánica (Burm.F.) Spreng. Família (Verbenaceae)	27
2.5.4.	Descrição botânica	28
2.5.5.	Ocorrência e habitat	28
2.5.6.	Usos tradicionais	28
2.5.7.	Composição fitoquímica do óleo essencial da L. Javánica	28
2.6.	Metabólitos Secundários das Plantas	29
2.6.1.	Tipos Metabólitos secundários	29
2.7.	Métodos de obtenção dos metabólitos secundários	34
2.7.1.	Trituração	34
2.7.2.	Extracção	35
2.7.3.	Métodos de secagem	35
CAPÍTULO III	36
3.Metodologias ou métodos científicos	36
3.1.	Localização geográfica do local da Colheita das amostras	36
3.2.	Local da realização de ensaios experimentais	36
3.3.	Métodos da pesquisa	36
3.3.1.	Quanto ao método científico	36
3.3.2.	Quanto à natureza	37
3.3.3.	Quanto aos objectivos	37
3.3.4.	Quanto à abordagem	37
3.3.5.	Métodos de procedimentos	38
3.3.6.	Técnicas de recolha de dados	38
CAPÍTULO IV	39
4.Actividades experimentais	39
4.1.	Identificação taxonómica da espécie em estudo	39
4.2.	Preparação da amostra	41
4.3.	Trituração	41
4.4.	Extracção	42
4.4.1.	Processo de Extracção	42
4.4.2.	Extracção por decocção	43
4.4.3.	Filtração da amostra	43
4.4.4.	Liofilização da amostra	44
4.5.	Identificação fitoquímica dos metabólitos secundários da L. J	45
4.5.1.	Testes para a detecção de Alcalóides	45
4.5.2.	Testes para a detecção dos taninos	45
4.5.3.	Testes para a detecção de saponinas	46
4.5.4.	Testes para a detecção dos flavonóides	46
4.5.5.	Testes para a detecção de triterpenos	46
4.6.	Determinação da actividade antimalárica pela inibição de formação de β-hematina	47
4.6.1.	Amostras	47
4.6.2.	Solução β-hematina	47
CAPÍTULO VI	49
5.Apresentação dos resultados	49
5.1.	Rendimento percentual do extracto da Líppia javánica.	49
5.2.	Identificação fitoquímica do extracto aquoso da L.J	50
5.2.1.	Identificação de Alcalóides	50
5.2.2.	Identificação dos taninos	50
5.2.3.	Identificação de saponinas	50
5.2.4.	Identificação dos flavonóides	51
5.2.5.	Identificação de triterpenos	51
5.3.	Determinação da actividade antimalárica do extracto da L.J	51
5.4.	Discussão dos resultados	53
5.4.1.	Testes fitoquímicos	53
5.4.2.	Actividade antimalárica da do extracto aquoso da L. javánica	55
CAPÍTULO VI	55
6.Conclusão e recomendações	55
6.1.	Conclusão	55
6.2.	Recomendações	56
7.Referências bibliográficas	58
Anexo 1	62
Anexo 2	67
Anexo 3	69
Lista de Figuras	Pág.
Figura 1: Ciclo de vida do Plasmodium.	22
Figura 2: Exemplo de compostos inibidores de hemozoina	23
Figura 4: Estrutura de triterpenos acíclicos e tetracíclicos e ácido ursólico	30
Figura 5: Estrutura básica dos flavonóides.	31
Figura 6: Algumas estruturas isoladas de plantas de interesse da indústria farmacêutica	32
Figura 7:Estrutura de taninos hidrolisáveis	33
Figura 8: Estrutura química de taninos condensados	33
Figura 9: Estrutura de uma saponina triterpênica	34
Figura10: Estrutura de uma saponina esteroidal bidesmosídica de Asparagus officinalis L.	34
Figura 11: Fluxograma das actividades	38
Figura 12: Amostra de L. javánica	41
Figura13: Trituração da amostra	41
Figura 14: Amostra da das folhas trituradas da L.J	42
Figura 15: Pesagem da amostra	42
Figura 16: Adição da água para aquecimento e agitação da amostra	43
Figura 17: Filtração do extracto	43
Figura 18: Imagem de decoto ou filtrado.	44
Figura 19: Liofilização das amostras de L. javánica	45
Figura 20: Evidência dos alcalóides (reacção com Acido pícrico e reactivo de Dragendorff)	50
Figura 21: Evidência da presença dos Taninos no extracto aquoso de L. javánica	50
Figura 22: Imagem de evidência da ausência dos saponinas (sem espuma)	50
Figura 23: Imagem que ilustra a presença dos flavonóides no extracto aquoso de L. javánica	51
Figura 24: Identificação dos triterpenos e esteróides (ausentes).	51
Figura 25: Tubos Eppendorf para teste antimalárico em triplicata	52
Figura 26: Imagem de microplacas com as soluções	52
Figura 27: Leitura de microplacas (µg/ml)………………………………………………52
Lista de tabelas	Pág.
Tabela 1: Medicamentos associados a ACTs utilizados actualmente.	24
Tabela 2: Actividades farmacológicas atribuídas por algumas espécies pertencentes a género Líppia.	27
Tabela 3: Principais subclasses de alcalóides sintetizados pelas plantas	32
Tabela 4: Materiais usados nos ensaios	39
Tabela 5: Soluções usadas nos ensaios	39
Tabela 6: Condições experimentais para a determinação de saponinas	46
Tabela 7: Identificação fitoquímica de metabólitos secundários………………………..49
Tabela 8: Dados do controlo da determinação antimalárica	53
Lista de símbolos, abreviaturas e acrónimos
MA – Mestre Académico 
CIDE – Centro de Investigação e Desenvolvimento em Etnobotânica
L. J/L. javánica – Líppia javánica
P. Falciparum – Plasmodium falciparum 
P. Vivax – Plasmodium ovale 
P. Maláriae – Plasmodium maláriae 
P. Knwolesi – Plasmodium Knwolesi (mais nos macacos) 
PNCM – Programa Nacional de Controlo da Malária
ODM – Objectivo do Desenvolvimento do Milénio
AF – Agregado Familiar
US – Unidades Sanitárias 
MISAU – Ministério da Saúde
Fe(III) PPIX – Ferriprotoporfirina
PABA – P-aminobenzóico
ART – Artemisinina
ACTs – Terapias Combinadas de Artemisina
AMT – Artesunato-melofloquina
LMF – Lumefantrina-melofloquina
ASQ – Artesunato-amodiaquina
AL – Artemeter-Lumefantrina
TIP – Tratamento Internamente Preventivo
UV – Ultra-violeta
Ƞ - Rendimento
mi– massa inicial
mf - massa final
mL – mililitro
mm – milímetros
g – gramas 
nm – nanómetros 
% - Percentagem
CH3OH – Metanol 
CHCl3 – Clorofórmio 
CH3COOH –Ácido acético
C6HN - Piridina 
FeCl3.6H2O –Cloreto de ferro (III)-hexa- hidratado
CH3COONa.3H2O – Acetato de sódio-tri-hidatado
NaOH – Hidróxido de sódio
C2H6OS – (DMSO) Dimetilsulfóxido 
C2H5O – Etanol
º C- Graus célsius 
UEM – Universidade Eduardo Mondlane
Declaração
Declaro que esta monografia é resultado da minha investigação pessoal e das orientações dos meus supervisores, o seu conteúdo é original e todas as fontes consultadas estão devidamente mencionadas no texto, nas notas e na bibliografia final.
Declaro ainda que este trabalho não foi apresentado em nenhuma outra instituição para obtenção de qualquergrau académico.
Assinatura
_______________________________________
(Hélio Aneta Macuácua)
Dedicatória
Dedico este trabalho à minha querida mãe Aneta João Macuácua (in memoriam), que sempre sonhou com esta realização na minha vida, ao meu irmão Custódio Nelson Mussane que incansavelmente fez de tudo para que eu pudesse alcançar este Grau Académico. 
Agradecimentos
· Os profundos agradecimentos são destinados a Deus pelo dom da vida, pois sem ele não estaria respirando;
· À então Universidade Pedagógica que actualmente Universidade Save pelo acolhimento durante a formação e por ter contribuído na criação de uma família académica. Os meus profundos agradecimentos;
· Aos docentes de Química e Biologia meus sinceros agradecimentos, pela força e valores que me ensinaram;
· As minhas profundas gratificações vão para dos docentes: MSc. Agostinho Chambe, MSc. Fernando Comé e MSc. Sérgio Tsembane pela paciência e serenidade durante as aulas até a conclusão da minha formação;
· Ao MSc. Chambe meu Supervisor vão os endereço os agradecimentos mais profundos por aceitar abraçar este cargo tão complicado de guiar-me em todo percurso de pesquisa do presente trabalho;
· Ao MSc. Alfredo Dique, endereço os meus sinceros agradecimentos por aconselhar-me e ajudar como Co-supervisor para seguir esta pesquisa;
· O meu grande obrigado vai para todos os amigos que fiz durante a mnha formação, pois sem eles teria sido impossível trilhar este caminho, em especial: Nicolau Avelino Mambo, Albertina Yolanda, Carlos Machava, Fred Cumbe, Dinis Bembele, mais uma vez meus honestos agradecimentos;
· Aos meus avos (Maria Helena Macuácua e Orlando Tsumbere) e à toda família Tsumberre expresso os meus humildes agradecimentos pelo que representaram para mim durante a minha formação académica.
· À família Mariquel e Boane, minhas humildes gratificações pelo que representaram para mim, quer sejam, de forma directa ou indirecta
· Para o Armando David Simbine Júnior, envio a minha profunda gratidão por indicar-me o Centro de Investigação e Desenvolvimento em Etnobotânica de Namaacha e ainda por me hospedar em sua casa durante o período de pesquisa;
· Óptimos agradecimentos vão para o CIDE e seus trabalhadores por terem-me acolhido e criado um ambiente saudável para que pudesse sentir-me em casa, em especial Alfredo Dique e Sílas que formam os meus principais contactos.
· Meus últimos e profundos ageradecimentos vão para o Salomão Rai Anlima, por ter me ajudado por sua experiência durante o desenvolvimento desta monografia científica.
Resumo
O trabalho intitulado: Avaliação da Actividade antimalárica da Líppia javánica, usada Tradicionalmente no Tratamento da Malária na Província de Maputo distrito de Matutuine, tem como objectivo avaliar a eficiência da actividade antimalárica do extracto aquoso das folhas de Líppia javánica. Para esta avaliação, as amostras formam colectadas no distrito de Matutuine e identificadas no herbário da UEM. Fez-se os testes da avaliação antimalárica, identificando os metabólitos secundários responsáveis pela acção antimalárica, onde foram encontrados os alcalóides, taninos e os flavonóides. A actividade antimalárica da Líppia javánica apresentou elevada actividade contra o plasmodium hemozoina de 1,130 µg/ml em relação ao dado de referencia da a quinina que foi de 0,73 µg/ml.
Palavras-chave: Malária, Líppia javánica, Fitoquímica, Antimalárica.
Abstract
The work entitled: Evaluation of the Antimalarial Activity of Lippia javánica, Traditionally Used in the Treatment of Malaria in Maputo Province Matutuine District, aims to evaluate the efficiency of the antimalarial activity of the aqueous extract of Lippia javánica leaves. For this evaluation, samples were collected in the district of Matutuine and identified in the UEM herbarium. Antimalarial tests were performed, identifying the secondary metabolites responsible for the antimalarial action, where alkaloids, tannins and flavonoids were found. The antimalarial activity of Lippia javanica showed high activity against plasmodium hemozoin of 1.130 µg/ml compared to the reference data for a quinine which was 0.73 µg/ml.
Keywords: Malaria, Javanic Lippia, Phytochemistry, Antimalarial
57
CAPÍTULO I
1. Introdução
A malária é causada por infecção sanguínea por parasitas protozoários do género Plasmodium , que é transmitido de um humano para outro por mosquitos fêmeas Anopheles). Salientar que o parasita da malária é a hemozoína (β-hematina) formado no vacúolo alimentar do parasita (FRANCIS et al, 1997).
Do ponto de vista das ciências biológicas, o estágio intra-eritrocítico parece ser uma parte muito importante da vida do ciclo do plasmódio no corpo humano. Envolve a digestão de hemoglobina que fornece aminoácidos e energia, ambos essenciais para o desenvolvimento e proliferação do parasita (FRANCIS et al, 1997).
A malária representa o principal e complexo problema de Saúde Publica a ressurgir em muitos países. Cerca de metade da população global está exposta a esta doença. O problema tem vindo a aumentar em magnitude e complexidade, e está directamente relacionado com o baixo nível socioeconómico, o que tem tornado as mulheres e as crianças em África particularmente vulneráveis (REQUIXA, 2012).
Em Moçambique, toda a população é considerada como estando em risco de contrair malária e a maioria das comunidades são vulneráveis devido às questões ecológicas, tais como a altitude, humidade, temperatura e condições meteorológicas extremas (PNCM, 2017).
Várias formas de prevenção são adoptadas para atenuar esta epidemia, desde o uso de insecticidas e redes mosquiteiras. Hoje, várias pesquisas são feitas na procura de mais formas de prevenção bem como a cura da malária através dos antimaláricos mais eficazes, baixa toxicidade e baixo custo.
As plantas medicinais são as principais fontes de pesquisa. Pois, as populações usa as como uma alternativa para a cura de diversas doenças. As plantas, actualmente, têm contribuído como fonte principal na pesquisa de vários compostos bioactivos (VIRGÍLIO, 2013).
Em Moçambique, os praticantes da medicina tradicional na Província de Maputo, distrito de Matutuine, usam a L. javánica para o tratamento da malária, a partir do extracto obtido das folhas. Afirmam, ainda que, o chá das folhas é usado para aliviar a tosse, febre, dores de cabeça e problemas de cansaço.
Nesta pesquisa, avaliou-se experimentalmente pelo método in vitro a actividade antimalárica do extracto aquoso das folhas da L. javánica e foi identificada qualitativamente a composição fitoquímica do extracto aquoso de L.J para observar os compostos responsáveis pela acção antimalárica.
1.1. Problematização
A malária é um dos principais problemas de saúde pública em Moçambique e, apesar de todos os esforços que têm sido empreendidos para o seu controlo, a sua prevalência, incidência e mortalidade permanecem elevadas. Existem diversos medicamentos disponíveis para tratar a malária, embora poucos, a maioria das políticas nacionais nomeiam um determinado medicamento como tratamento de primeira linha. Porém, mais de dez porcentos dos casos são resistentes aos medicamentos actualmente utilizados.
Esta resistência de malária aos antimaláricos actualmente utilizados, faz-se sentir a necessidade realizar estudos na busca de medicamentos antimaláricos que o parasita da malária não possa resistir. Na tentativa de procurar estes medicamentos, encontramos a medicina tradicional que é a medicina baseada em uso tradicional de plantas no tratamento de doenças.
Para além da resistência da malária a alguns antimaláricos, as comunidades que usam a medicina tradicional, recorrem a ela como uma alternativa devido à pouca assistência médica, ou seja, à fraca abrangência dos serviços de saúde, tendo visto que as populações das zonas rurais têm percorrido longas distâncias para encontro de uma unidade sanitária ou posto de saúde, a medicina tradicional tem sido um meio alternativo para a população residente. Enquanto estas comunidades usam como uma alternativa, a ciência tomacomo oportunidade em busca de medicamentos mais eficazes e seguros para tratar doenças.
Na Província Maputo, distrito de Matutuine, os praticantes da medicina tradicional usam o extracto das folhas de L. javánica no tratamento da malária. Porém, apesar de ser conhecida cientificamente no Brasil por apresentar agentes antimaláricos, em Moçambique não é conhecida cientificamente para seu uso farmacêutico como antimalárico. Tendo em conta que as propriedades das plantas, podem variar do ponto de vista do clima que cada país apresenta e as suas propriedades toxicológicas são um mistério.
Com tudo, frente a este problema coloca-se à seguinte questão de partida: Até que ponto a Líppia javánica é eficiente para o tratamento da malária?
1.2. Objectivos
1.2.1. Geral
· Avaliar a actividade antimalárica da Líppia javánica, usada tradicionalmente no tratamento da malária no distrito de Matutuine, Província de Maputo,. 
1.2.2. Específicos
· Identificar os fitocompostos presentes no extracto aquoso da Líppia javánica com acção antimalárica;
· Determinar a eficiência da actividade antimalárica do extracto aquoso da Líppia javánica;
· Contribuir na validação do uso do extracto aquoso extraído nas folhas da Líppia javánica no tratamento da malária.
1.3. Questões científicas
· Quais são os compostos fitoquímicos presentes no extracto aquoso da L. javánica que apresentam a acção antimalárica?
· Qual é a actividade antimalárica do extracto aquoso da L. javánica?
· Como o estudo pode contribuir na validação do extracto aquoso das folhas da Líppia javánica no tratamento da malária? 
1.4. Justificativa
A identificação de novas moléculas para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes e seguros para combater doenças é urgentemente necessária.  As plantas medicinais são uma das principais oportunidades na descoberta dessas novas moléculas.  Verbenaceae é um membro da família que é referenciada pela sua actividade farmacológica contra diferentes doenças, incluindo malária (VIRGÍLIO, 2013; SERRAZIN, 2015).  
Em Moçambique, o uso da L. javánica pelos praticantes da medicina tradicional, em particular no distrito de Matutuine para o tratamento da malária, é comum. Porém, o conhecimento é gerado tradicionalmente, o que tornou-se inevitável explorar este conhecimento para confirmar a veracidade sobre sua actividade antimalárica e identificar os compostos responsáveis por esta acção, garantindo a difusão do conhecimento.
Neste contexto, a implantação desta pesquisa realizada no distrito de Matutuine, para a exploração da biodiversidade moçambicana em busca de novos fármacos antimaláricos eficazes, tornou-se um grande avanço na luta contra a malária, uma doença muito letal, bem como contribui para a validação dessa planta e para o avanço da química como ciência dos produtos naturais e medicinais.
A pesquisa sobre, plantas medicinais em particular a Líppia javánica torna-se muito importante em três vertentes ou aspectos. A primeira consiste no fornecimento de novos compostos naturais para a produção de novos fármacos contra a malária para melhorar os já existentes, visto que com estes o parasita tornou-se resistente. Na segunda vertente fornece uma pesquisa de grande valor para o avanço da química como ciência, visto que a química é considerada a ciência dos produtos naturais. E o terceiro e último aspecto estão relacionados com a exploração dos saberes locais. Esta pesquisa mostra a valorização dos conhecimentos da sociedade sobre a medicina tradicional tornando-os científicos bem como ajudar a sociedade no melhoramento das suas formas de preparação dos extractos.
CAPÍTULO II
2. Revisão da literatura 
2.1. Fundamentação teórica 
2.1.1 Uso medicinal das plantas
Desde os tempos longínquos que a civilização humana utiliza os vegetais não só como fonte alimentar, mas também medicinal. As mais diversas enfermidades são e têm sido tratadas com a preparação dos extractos a partir de plantas. Esses extractos têm sido preparados na forma de chás, sucos, tinturas, banhos. Esta prática começou principalmente com os antigos povos da China, Egipto e Roma. Esses povos, que com base nos seus conhecimentos, classificaram as várias espécies vegetais de acordo com o seu uso medicinal. Mais tarde, os povos gregos estabeleceram o uso racional das plantas na medicina, seguidos pelos clínicos da Europa Ocidental. O conhecimento do uso medicinal dos recursos naturais pela humanidade, ao longo dos anos, sustentou a sua sobrevivência e tornou-se por parte das populações um objecto de especial cuidado (RIBEIRO, 2008, PINTO et al, 2005, ALMEIDA, 1993 apud VIRGÍLIO, 2013).
Nos últimos anos, extractos vegetais contendo substâncias bioactivas estão sendo amplamente estudados, uma vez que podem ser usados na formulação de alimentos funcionais, como matéria-prima para a produção de medicamentos e cosméticos ou como substitutos de produtos sintéticos nas indústrias de alimentos (BITENCOURT, 2014).
A história da botânica é, em grande parte, a luta do homem para adaptar-se à natureza, utilizando as plantas na medicina, indústria e agricultura. Com o crescimento da população mundial e, consequentemente, aumento da necessidade de produção de alimentos em maior escala, os agricultores começaram a se especializar, e os monocultivos foram ficando cada vez mais frequentes ocupando maiores áreas, originando um desequilíbrio ambiental cada vez maior, favorecendo o aumento e surgimento de pragas e doenças (SILVA, 2013).
2.1.2. Plantas medicinais no combate a malária
A investigação de plantas utilizadas na medicina tradicional no tratamento de diversas doenças, bem como a identificação e isolamento dos principais componentes químicos, tem se tornado no foco mais importante na busca de novas substâncias farmacologicamente activas (GOMES, 2011).
Medicamentos vegetais, e plantas medicinais são importantes fontes de agentes terapêuticos promissores para doenças infecciosas, distúrbios lipídicos e imunomodulação. O tratamento da malária humana visa, interromper a esquizogonia sanguínea, que é causa da patogênese e dos sintomas clínicos da doença. O tratamento oral previne a progressão da doença para estados severos, ou seja, se os fármacos forem administrados correctamente, ocorre a diminuição da mortalidade causada pela doença (OLIVEIRA, 2009 apud GOMES, 2014).
O primeiro antimalárico obtido dos vegetais é a Quinina, isolada pela primeira vez em 1820 da casca de Chinchona spp. A estrutura da quinina foi estabelecida por Rabe em 1908, e sua síntese foi concluída em 1944 por Wooward e Doering.
Dentre inúmeras espécies vegetais que são utilizados tradicionalmente na Região Amazónica no Brasil, as espécies da família Apocynaceae destacam-se por suas diferentes propriedades medicinais. Elas são ricas em alcalóides indólicos, uma classe química de variada actividade biológica nas quais certa substancia já demonstraram potencial antimalárico (GOMES, 2011).
2.2. Conceitos básicos 
2.2.1. Malária 
A malária é uma doença parasitária infecciosa, causada por protozoários do género Plasmodium que se multiplicam nos eritrócitos (células vermelhas do sangue) do hospedeiro, sendo transmitida pelo mosquito fêmea do género Anopheles (AMARAL, 2015).
2.2.2. Produtos naturais 
Os produtos naturais são pequenas moléculas orgânicas advindas do metabolismo secundário (metabólitos secundários) de organismos vivos. O termo “secundário” é referente ao fato destas substâncias não serem vitais ao funcionamento celular básico, desenvolvimento e funções vitais básicas de organismos vivos (ADRIÃO, 2020).
2.2.3. Metabólitos secundários
Os metabólitos secundários são substâncias produzidas em pequenas quantidades, e, em contraste com os primários, nem sempre estão envolvidos em funções vitais do vegetal (SILVA, 2013).
2.2.4. Extracção 
É um processo ou técnica de separação de compostos por transferência de massa, pois, consiste em transferir uma substância da fase dissolvida ou em suspensão, para outra fase líquida. (SKOOG, 2004). 
2.3. Aspectos Gerais sobre a malária
Cerca de 216 milhõesde pessoas foram diagnosticadas malária e 455 000 morreram a maioria crianças menores de cinco anos de idade segundo o relatório mundial de 2016. Malária é uma doença que se encontra confinada à África, Ásia e América Latina. Os problemas de controlo da malária nestas regiões são agravados pela inadequação das estruturas sanitárias e pobres condições socioeconómicas (PNCM, 2017).
Na região Subsaariana a malária não é mais principal causa de morte entre crianças menores de cinco anos, tendo-se alcançado o Objectivo 4 do Desenvolvimento do Milénio (ODM) que era reduzir a taxa de mortalidade por malária em 2/3 de 1990 a 2015 (PNCM, 2017).
A malária continua a ser o maior problema de saúde pública em Moçambique, sendo responsável (em 2015) por 29% de todas as mortes hospitalares e 42% das mortes de crianças menores de cinco anos. Contudo, foram alcançados progressos importantes, tendo-se registado em 2015 um declínio de 9% nos casos confirmados e não confirmados em relação a 2009, e uma redução de 34% na mortalidade (PNCM, 2018). 
A malária, também conhecida por paludismo, é uma doença infecciosa causada por parasitas do género Plasmodium. A malária é considerada a principal causa da morte nos países subtropicais (PNCM, 2018).
2.3.1. Cinco espécies de Plasmodium podem produzir a doença:
· Plasmodium falciparum 
· Plasmodium vivax 
· Plasmodium ovale 
· Plasmodium malariae 
· Plasmodium knwolesi (mais nos macacos) 
O P. falciparum é a espécie mais comum encontrada por todo o mundo, em áreas tropicais e subtropicais, e é responsável pelas formas mais graves e pela maioria das mortes por malária. No entanto, o P. falciparum não é a única espécie que pode causar morte. O P. vivax, encontrado na Ásia, América Latina e algumas partes de África, como Etiópia e Eritreia, e o P. knowlesi, encontrado no sudoeste Asiático e regiões florestais, podem levar a morte por malária. 
A espécie mais frequente em África é o P. falciparum, sendo responsável por 90% dos casos e associado a níveis significativos de morbilidade e mortalidade. Esta é também a espécie mais comum em Moçambique.
2.3.2. Situação da Malária no País
A malária é endémica em todo o país, nas áreas onde o clima favorece a sua transmissão ao longo de todo o ano, atingindo o seu ponto mais alto após a época chuvosa (Dezembro a Abril) (PNCM, 2017).
Segundo Boletim Estatístico Mensal de Saúde publicado em Maio de 2020, Moçambique registou um total de 1,025,171 casos da malária Em cada 1000 habitantes somando um cumulativo 5,708,937 caso.
2.3.3. Ciclo de vida do plasmodium
A infecção inicia através da inoculação de esporozoítos pelo insecto vector infectado durante o repasto sanguíneo. Estes esporozoítos atingem a corrente sanguínea, que por sua vez, infectam os hepatócitos e se diferenciam em esquizontes teciduais ou hepáticos, que se rompem e libertam merozoítos na corrente sanguínea. Após esta replicação inicial no fígado (esquizogonia pré-eritrocítica), os parasitas invadem os eritrócitos dando início ao ciclo intra-eritrocitário (CORDEIRO, 2014)).
Este ciclo é o mais estudado, pois é o responsável pelas manifestações clínicas mais importantes e pela morbidade e mortalidade da malária e é a fase em que se pode manter em cultura. Além disso, por diferentes abordagens foi mostrado que 20% dos transcritos preditos de P. falciparum são específicos do ciclo intra-eritrocitário o que é um estímulo à compreensão dos mecanismos moleculares desse ciclo. 
Após a invasão dos eritrócitos, os merozoítos infectantes se transformam para os estágios de anel (0-20 h) e trofozoíto (20-36 h), em que não ocorre divisão celular, e em seguida realiza três a quatro ciclos de mitose se transformando no estágio esquizonte multinuclear (36-48 h), etapa 10). O esquizonte se diferencia durante as últimas horas em 16-24 merozoítos que, após a ruptura do eritrócito, são liberados na circulação sanguínea, para iniciar um novo ciclo intra-eritrocitário (CORDEIRO, 2014)).
O ciclo intra-eritrocitário se repete sucessivas vezes, a cada 48 horas, nas infecções por P. falciparum, P. vivax e P. ovale, a cada 72 horas, nas infecções pelo P. malariae e a cada 24 horas para P. knowlesi. Após várias gerações de merozoítos sanguíneos, ocorre a diferenciação em estágios sexuados, os macrogametócitos (masculino) e os macrogametócitos (feminino), que ao serem ingeridos pelo insecto durante o repasto sanguíneo, são capazes de evoluir dando origem ao ciclo sexuado e depois ao ciclo esporogônico (CORDEIRO, 2014)).
Estes gametócitos ao atingirem o estômago do mosquito se transformam em gâmetas extracelulares, macrogametas e microgametas, em um processo denominado de gametogênese, que é estimulado pela diferença de temperatura (inferior a 30°C) e aumento do pH por baixa pressão de dióxido de carbono (CO2). O gametócito masculino dá origem a 8 microgâmetas por um processo denominado exflagelação. Em 20-30 minutos, um microgâmta fecundará um macrogâmeta, formando o ovo ou zigoto. Após a fecundação, o zigoto passa a movimentar-se por contracções do corpo, sendo denominado oocineto. Este atravessa a matriz peritrófica e atinge a parede do intestino médio, onde se encista na camada epitelial do órgão, passando a ser chamado oócito. Então, inicia-se a esporogonia (formação de esporozoítos) até que ocorre a ruptura da parede do oocisto, liberando os esporozoítos, que são disseminados pela hemolinfa até atingirem as células das glândulas salivares e serão inoculados juntamente com a saliva em um hospedeiro humano, durante o repasto sanguíneo, fechando o ciclo estes protozoários causadores da malária (CORDEIRO, 2014)).
Figura 1:ciclo de vida do Plasmodium.
Fonte: (AMARAL, 2015).
2.4. Mecanismo de acção dos fármacos antimaláricos clinicamente usados
A sobrevivência do Plasmodium no hospedeiro depende de várias formas de se adaptar ao meio, as tais formas são susceptíveis aos ataques terapêuticos. Os fármacos frequentemente usados em hospitais actuam em diferentes etapas de reprodução e desenvolvimento do parasita, contudo a maior parte age inibindo a produção da hemozoina ou inibindo a síntese do Ácido fólico (ZIEGLER, 1999; GOMES, 2011). 
2.4.1. Inibidores da produção da hemozoina (β – hematina)
Os compostos antimaláricos quinolínicos, aril-alocois e derivados da artemisina ficam concentrados no vacúolo alimentar. Existem algumas evidências de que a interacção entre esses compostos e o grupo heme (Fe (III) PPIX) esteja envolvida na toxicidade desses fármacos ao parasita. Várias experiências in vitro estabeleceram que fármacos antimaláricos quinolínicos agem por interferência na cristalização da hemozoina. A figura abaixo ilustra algumas estruturas de compostos inibidores de hemozoina, nomeadamente Aminopiroquina (1), Etaquina (2), Hidroxicloroquina (3), plasmoquina (4) e Lumefantrina (5). (MEIRA, 2009) 
Figura 2: Exemplo de compostos inibidores de hemozoina
Fonte: (CUNICO et al, 2008).
2.4.2. Terapia combinada da artemisinina
A terapia combinada de ART baseia-se em associar um derivado da ART com um outro medicamento antimalárico de acção lenta e prolongada, visto que a acção da ART é curta. Porém, incrementando assim a eficácia do tratamento, reduz a possibilidade de desenvolvimento da resistência. Após a concentração plasmática dos derivados da ART cair dos níveis terapêuticos, a droga associada assegura a continuidade da acção antimalárica. As ACTs beneficiam-se da habilidade dos derivados da ART em reduzir rapidamente a biomassa parasitária, o que resulta em poucos parasitas a serem eliminados pela droga associada. (VARGAS, 2016).
Tabela 1: Medicamentos associados a ACTs utilizados actualmente.
	Medicamentos
	ACTs
	Lumefantrina 
	Artemeter-Lumefantrina
	Mefloquina 
	Artesunato-Melofloquina
	Amodiaquina
	Artesunato-Amodiaquina
	Piperaquina
	Dihidroartemisinina-Peraquina
	Pironaridina 
	Artesunato-Pironaridina
Fonte: (VARGAS, 2016).
O Coarctem é um antimalárico formado pela associação de AMT e LMF, conhecidos pelo seu efeito sinérgico contra P. falciparum. Esta combinação foi utilizada pela primeiravez na década de 1980 na China e registada como antimalárico no começo da década de 2000. Destaca-se por sua segurança, eficácia e qualidade, para considerar esta combinação como a primeira ATC, ou seja, antimalárico da primeira linha. (NILZA et al, 2012, apud VARGAS, 2016).
2.4.3. Tratamento da malária em Moçambique 
Definição: Trata-se de um conjunto de recomendações e normas relacionadas com diagnóstico, tratamento e quimioprofilaxia da malária em Moçambique. A norma 2017, embora tenha sido actualizado segundo a 3ͣ edição das normas de tratamento da Organização Mundial da Saúde (OMS) 2015, não é necessariamente uniforme em todos os países. 
a) Objectivo da Norma de Tratamento da Malária 
· Indicar os medicamentos recomendados para tratar malária no país 
· Estabelecer critérios para o uso de meios auxiliares de diagnóstico 
· Reduzir o risco de desenvolvimento de resistência aos medicamentos através do uso racional da terapia combinada (ACT’s) 
· Fornecer orientação para o uso racional de todos os recursos disponíveis para maximizar a redução da morbilidade e mortalidade por malária 
b) Conteúdos de uma Política de Tratamento da malária 
· O conteúdo exacto da Norma de Tratamento da Malária difere de país para país. Contudo, uma norma de tratamento formulada, conterá informação sobre: 
· Decisão da necessidade ou não de tratamento com antimalárico num doente; 
· Antimaláricos da malária não complicada e da malária grave/complicada, indicações e dosagens por idade para o tratamento da malária não complicada e grave/complicada, respectivamente; 
· Quimioprofilaxia para vários grupos em risco ou tratamento intermitente; 
Antimaláricos recomendados para uma norma de tratamento
Os medicamentos que cumprem cumulativamente com a maior parte dos critérios acima referidos podem ser adoptados para uma norma de tratamento. 
Por isso, uma norma de tratamento nunca é um documento acabado, podendo sempre que necessário, ser actualizada. 
Como resultado do surgimento e disseminação de resistência dos plasmódios aos antimaláricos usados no seu tratamento, para proteger os restantes antimaláricos deste mal progressivo, a OMS recomenda a utilização da terapia combinada no tratamento da malária e a monitorização regular (cada 2 anos) da eficácia terapêutica dos medicamentos da malária não complicada.
2.4.4. Malária Não Complicada
· Primeiro trimestre: Quinino oral 
· Segundo e terceiro trimestres: Artemeter-Lumefantrina
2.4.5. Malária Grave/Complicada
· Artesunato injectável em todos os trimestres;
· Artesunato injectável ou Quinino;
· Artesunato rectal para crianças menores de 6 anos.
2.5. Produtos naturais de origem vegetal
Os produtos naturais são pequenas moléculas orgânicas advindas do metabolismo secundário (metabólitos secundários) de organismos vivos. O termo “secundário” é referente ao facto de estas substâncias não serem vitais ao funcionamento celular básico, desenvolvimento e funções vitais básicas de organismos vivos. Entretanto, pesquisas recentes apontam estas moléculas como factores importantes para o mantimento da vida dos mesmos, uma vez que são factores decisivos para a adaptação evolutiva ao ambiente à sua volta. No reino vegetal, os metabólitos secundários são conhecidos por desempenharem um papel importante na adaptação das plantas, o que possibilita a sobrevivência de diversas espécies em condições ambientais adversas, uma vez que estas moléculas possuem as mais diversas propriedades biológicas (ADRIÃO, 2020).
2.5.1. Família Verbenaceae
Segundo Aguiar & Costa (2005), apud Serrazin (2015), a família Verbenaceae compreende aproximadamente 175 géneros e 2.800 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais, principalmente na zona temperada do hemisfério sul. Afirma Santos (2009) apud Serrazin (2015) que, algumas espécies desta família têm seu potencial económico amplamente explorado, sendo utilizadas tanto como espécies ornamentais quanto para fins terapêuticos. 
O género Líppia da família Verbenaceae inclui cerca de 200 espécies entre ervas, arbustos e pequenas árvores, que podem ser encontradas na América do Sul e Central e África Tropical. Grande parte das espécies pertencentes a este género ocorre no Brasil, México, Paraguai e Argentina, com poucas espécies epidémicas na África (SERRAZIN, 2015).
Algumas espécies deste género são utilizadas como tempero de alimentos ou usadas tradicionalmente contra disfunções gastrointestinais e respiratórias. São utilizadas contra estados de excitação, náuseas e hipertensão. Em muitos casos, as partes utilizadas são folhas e flores, as quais são comummente preparadas na forma de infusão ou decocção; administradas oralmente na forma de chá, ou utilizadas como emplastros e lavagens para ferimentos (LORENZI & MATOS, 2002 apud SERRAZIN, 2015).
2.5.2. Actividades biológicas atribuídas ao género Líppia
De acordo com Matos (1998), muitas espécies pertencentes a este género apresentam propriedades medicinais comprovadas e são utilizadas em diversos municípios brasileiros que adoptam Programas de Fitoterapia em atenção primária à saúde. Líppia sidoides, por exemplo, foi introduzida em programas de fitoterapia, após validação científica da sua actividade Antimicrobiana e Antiinflamatória. A tabela seguinte sumariza as actividades farmacológicas atribuídas a espécies pertencentes ao género Líppia no período compreendido entre 1998-2015.
Tabela 2: Actividades farmacológicas atribuídas por algumas espécies pertencentes a género Líppia.
	Actividade biológica
	Espécie
	Gastroprotetora
	L. sidoides; L. citriodora; L. integrifólia
	Antiinflamatória
	L. Sidoides; L. nodiflora; L. geminata; L. gracilis; L. citriodora; L.multiflora; L. javánica
	Antisséptica
	L. Sidoides
	Cicatrizante
	L. Sidoides
	Antimicrobiana
	L. Sidoides; L. turbinata; L. Alba; L. javánica; L. grandis; L.multiflora; L. dulcis; L. formosa; L. gracilis; L. grandifolia; L. microphylla; L. nodiflora; L. palmeri; L. ukambensis; L. graveolens
	Antimalárica
	L. Multiflora; L. chevalieri; L. javánica
Fonte: Adaptado por Serrazin (2015).
2.5.3. Líppia javánica (Burm.F.) Spreng. Família (Verbenaceae)
Figura 3: Líppia javánica
Fonte: Autor/2021
Sinonímias
· Blairia javánica (Burm.F.) Gaertn.
· Lantana galpiniana H. Pearson
· Lantana lavandulacea Willd.
· Líppia asperifolia A. R ich. Ex Marthe
· Líppia capensis (Thunb.) Spreng.
· Líppia indica Moldenke
· Líppia cabra Hochst.
· Líppia whytei Moldenke
· Phyla javánica (Burm.F.) Moldenke
· Líppia lactona 
2.5.4. Descrição botânica
A Líppia javánica apresenta várias classes de fitoquímicos incluindo metabólitos secundários voláteis e não voláteis, tais como alcalóides, aminoácidos, flavonóides, iridoides e triterpenos, bem como vários minerais que já foram identificados (MAROYI, 2017).
Líppia javánica é utilizado como chá de ervas e tem aplicações etnomedicinais, como em resfriados, tosse, febre, malária, feridas, diarreia, dores no peito, bronquite e asma. Os perfis dos óleos essenciais de Líppia javánica são caracterizados por variações de espécies, pois eles são produzidos por diferentes vias metabólicas. Utilizando análise de agrupamento, foram identificados cinco fitocompostos de Líppia javánica na África do Sul e na Suazilândia, nomeadamente mircenona, carvona, pipertenona, ipsdienona e linanool (MAROYI, 2017).
2.5.5. Ocorrência e habitat
Líppia javánica é um arbusto lenhoso encontrado em todo o leste e sul da África, geralmente na borda da floresta, em pastagens, encostas e bancos de córregos. Na África Austral, L. javánica é encontrada do Cabo Oriental até Botswana, especificamente na Suazilândia, Moçambique e Malawi. A espécie é resistente à seca e pode crescer em uma variedade de tipos de solo (MAROYI, 2017).
2.5.6. Usos tradicionais
De acordo com os praticantes da medicina tradicional no distrito de Matutuine, a receita - mistura de folhas frescas de Líppia javánica e Lantana câmara – cerca de 1 kg de folhas de Líppia javánica e 1 kg de folhas de Lantana câmara, ferver durante 10 a 30 minutos. 
Receita-se fazer bafo, é indicado parafebres e calafrios provocados por malária, usar toda a quantidade preparada 2 vezes por dia durante 3 dias. Pode ser usado também para banhos. Não é recomendado para crianças e mulheres grávidas.
2.5.7. Composição fitoquímica do óleo essencial da L. javánica
A maioria dos compostos já descritos na espécie L. javánica são compostos voláteis, pois, trata-se de uma espécie rica em óleo essencial. O óleo essência da L. javánica contém acima de 75% de pipertenona, que já foi descrita como tendo propriedades repelentes contra insectos e possui ainda actividade antimalárica e antibacteriana (ANJARWALLA et al, 2015). 
De acordo com Anjarwalla et al, (2015), foi identificada e isolada da Líppia javánica, a Líppia lactona, que possui uma acentuada actividade antimalárica em especial para o Plasmodium falciparum na Costa de Marfim. 
2.6. Metabólitos Secundários das Plantas
O metabolismo representa o conjunto de reacções químicas que sempre ocorre em cada célula. Os compostos químicos que são formados, degradados ou transformados recebem o nome de metabólitos que, por sua vez, podem ser divididos em metabólitos primários e metabólitos secundários (SIMÕES et al, 2010).
Metabólitos secundários são substâncias produzidas em pequenas quantidades, e, em contraste com os primários, nem sempre estão envolvidos em funções vitais do vegetal ou mesmo presente em todos eles. Além disto, são conhecidos por serem sintetizados em tipos celulares especializados e em distintos estágios de desenvolvimento, tornando seu isolamento e purificação mais trabalhosos. Estes constituintes químicos são extremamente diversos. Cada família, género, e espécie produz uma categoria química característica ou uma mistura delas e por vezes, podem ser utilizadas como caracteres taxonómicos na classificação das plantas (SILVA, 2013).
2.6.1. Tipos Metabólitos secundários
· Triterpenos
Segundo Simões et al (2010), são compostos muito difundidos na natureza, principalmente no reino vegetal e pertencem a uma classe de substâncias químicas conhecidas como terpenóides (terpenos). Estes compostos são todos formados pela união de unidades de isopreno (C5H8) que se unem, formando cadeias maiores.
Figura 4: Estrutura de triterpenos aciclicos e tetraciclicos e ácido ursólico
Fonte: (GROS, 1985).
· Actividades biológicas 
Segundo PASSOS et al, (2009), na medicina popular, assim como na terapêutica, plantas que contêm derivados terpénicos têm sido usadas como sedativas, tranquilizantes e anticonvulsivantes. 
Quanto à pesquisa do potencial anticonvulsivantes desses produtos aromáticos pode ser justificada, considerando-se que as convulsões representam importante manifestação de alguns tipos de epilepsia que para seu controle são empregadas as drogas anticonvulsivante ou antiepilépticas (ALMEIDA et al. 2010).
De acordo com DE ALMEIDA, MOTTA e LEITE (2003), o Linalool em ensaio neuroquímico mostrou actividade anticonvulsivante dose dependente e efeito inibitório do “binding” do glutamato em regiões corticais de ratos. E em estudos electrofisiológicos de “patch clamp” foi verificado que o Linalool mostrou influência na liberação de acetilcolina e no tempo de abertura dos canais de cálcio da junção neuromuscular em Camundongos.
Estudos relatam que, Canabis sativa L .Apresenta no Sistema Nervoso Central algumas actividades terapêuticas que são: analgésica, controle de espamos em pacientes portadores de esclerose múltipla, ansiolítica e anticonvulsivante devido a presença de Terpenóides. No final da década 80, foi descoberto que o THC se liga especificamente a receptores canabinóides acoplados à proteína G no encéfalo, principalmente nas áreas do controle motor, no córtex cerebral e nas vias da dor (PASSOS et al, 2009).
· Flavonóides
Os flavonóides constituem um grupo de pigmentos vegetais de ampla distribuição na natureza e sua presença nos vegetais pode estar relacionado com funções de defesa e de atracção de polinizadores (SIMÕES et al, 2010). Estes compostos apresentam uma estrutura química difenilpropano (C6-C3-C6), que consiste de dois anéis aromáticos (A e B) unidos por um anel heterocíclico oxigenado (C). Substituições dos anéis A e B originam diferentes compostos dentro de cada classe de flavonóides. (ANGELO & JORGE, 2007).
Figura 5: Estrutura básica dos flavonóides.
Fonte: (SIMÕES et. al, 2010)
· Actividade biológica dos flavonóides
O emprego de flavonóides em terapêutica é vasto e empírico. Muitas pesquisas têm enfatizado nos últimos anos os efeitos terapêuticos de vários destes compostos, alguns dos quais, devido à importância foram relatados nesta revisão. Na inflamação, apigenina e luteolina de Chamomilla recutita diminuíram a infiltração leucocitária. Esses flavonóides, em sua forma glucosídica, foram activos antinflamatórios de acção tópica. Nepetrina que possui um efeito antipirético, também foi relatada como um potente antinflamatório, agindo directamente pelo antagonismo de mediadores como a bradiquinina e a angiotensina. Uma outra acção antinflamatória, por inibição da libertação do ácido araquidônico para as membranas foi observada nos flavonóides crisina, naringenina, apigenina, luteolina equercetina (ARGAWAL, 1982; DELLA LOGIA et al, 1986; TONDERA et al, 1994; ZUANAZZI, 1999, apud SILVA, 2001).
· Alcalóides
Os alcalóides são compostos orgânicos cíclicos que possuem pelo menos um átomo de nitrogénio (N2) em um estado de oxidação negativo e cuja distribuição é limitada entre os organismos vivos. São compostos farmacologicamente activos e encontrados predominantemente em angiospermas. Estes produtos naturais de baixo peso molecular são derivados de aminoácidos aromáticos (triptofano, tirosina), os quais são derivados do ácido chiquímico, e também de aminoácidos alifáticos como a ornitina e a lisina podendo ser classificados de acordo com o aminoácido precursor e sua forma estrutural (HENRIQUES et al, 2002; DEWICK, 2002 apud SILVA, 2013). 
Tabela 3: Principais subclasses de alcalóides sintetizados pelas plantas
	Classe 
	Aminoácido precursor 
	Exemplos
	Piperidínicos
	Lisina
	Coniina, cassina, espectalina
	Indólicos
	Triptofano 
	Quinina, cimblastina, vincristina
	Isoquinolínicos
	Tirosina
	Morfina, codeína, mescalina
	Tropânicos 
	Ornitina
	Antropina, hioscina, escopolamina
	Pirrolidínicos
	Ornitina
	Nicotina, higrina
FONTE: Adaptado por Silva (2013)
Figura 6: Algumas estruturam isoladas de plantas de interesse da indústria farmacêutica
Fonte: (CASTEJON, 2011).
· Propriedades Farmacológicas dos alcalóides 
Os alcalóides apresentam inúmeras actividades farmacológicas, estas podem variar de tónicas, anticancerígena, analgésicas, narcóticas, estimulantes, antiasmáticas, expectorantes, anti-hipertensivas, relaxantes musculares, citotóxicas, antimicrobianas, antimaláricas e entre outras (SOUZA, 2008 apud JOÃO, 2015).
· Taninos
Os taninos são divididos de acordo com a estrutura química em dois grandes grupos: taninos hidrolisáveis e taninos condensados. Os taninos hidrolisáveis, estão presentes nas famílias Choripetalae das dicotiledôneas, herbáceas e lenhosas (MELLO & SANTOS, 2001 apud CASTEJON, 2011). 
Algumas árvores desta classe, como o castanheiro e o carvalho são utilizadas como fontes industriais de tanino. Os taninos hidrolisáveis possuem um grupo poliol central (em sua maioria, é β-d- glicose, mas também o ácido quínico, outros fenóis e outros glicósidos); e hidroxilas esterificadas pelo ácido gálico. (CASTEJON, 2011)
Figura 7:Estrutura de taninos hidrolisáveis
Fonte: Adaptado por (CASTEJON, 2011)
· Taninos Condensados
Os taninos condensados ou proantocianidinas são estruturas derivadas dos flavanóis e, de acordo com o número de vezes que esta unidade se repete, podem ser formadas as proantocianidinas diméricas, triméricas e oligoméricas (com até seis unidades). No entanto, nas uvas a maioria é polimérica, sendo que o grau médio de polimerização pode variar de 10 a 30 unidades (HASLAM, 1998 apud OLIVEIRA, 2014).
Figura 8: Estrutura química de taninos condensados
Fonte: Adaptado por (CASTEJON, 2011)
· Actividade biológica dos taninosTêm sido atribuídas aos taninos muitas actividades fisiológicas humanas, como a estimulação das células fagocíticas e a acção tumoral, e actividades antiinfectivas. Em processos de cura de feridas, queimaduras e inflamações, os taninos auxiliam formando uma camada protectora (complexo tanino-proteína e/ou polissacarídeo) sobre tecidos epiteliais lesionados, permitindo que, logo abaixo dessa camada, o processo de reparação tecidual ocorra naturalmente (MELLO & SANTOS, 2001 apud CASTEJON, 2011).
· Saponinas
Saponinas ou saponosídeos são compostos bioactivos geralmente produzidos por plantas para neutralizar agentes patogénicos e herbívoros. Elas são encontradas em mais de 100 famílias de plantas e em algumas espécies marinhas. A palavra saponina é originária do latim sapo (em português: sabão), reflectindo a grande capacidade das saponinas para formar espumas estáveis em soluções aquosas (AUGUSTIN et al, 2011 apud BITENCOURT, 2014).
Figura 9: Estrutura de uma saponina triterpênica
Fonte: Adaptado por Bitencourt (2014)
Figura10: Estrutura de uma saponina esteroidal bidesmosídica de Asparagus officinalis L.
Fonte: Adaptado por (BITENCOURT 2014)
2.7. Métodos de obtenção dos metabólitos secundários
2.7.1. Trituração
A trituração consiste na redução da matéria-prima em fragmentos pequenos, que pode ser feita em moinhos de faca, de martelo ou triturador (FONSECA, 2015).
2.7.2. Extracção
É um processo ou técnica de separação de compostos por transferência de massa ,pois, consisteemtransferirumasubstânciadafasedissolvidaouemsuspensão,para outra fase líquida (SCKOOG, 2004). Os métodos de obtenção de extractos mais destacados são: a maceração, percolação, Soxhelt, infusão, decocção, ultrassom e fluidos supercrítico. (RODRIGUES, 2016),
· Decocção
Na decocção o solvente é adicionado ao soluto e ambos são aquecidos e mantidos em fervura por aproximadamente 15 minutos. Após o resfriamento, filtra-se e a parte líquida é utilizada para o preparo de medicamentos. Utiliza-se esse processo em substâncias termo-resistentes. (Idem). 
2.7.3. Métodos de secagem
Um medicamento fitoterápico deve apresentar estabilidade física, química e microbiológica. A indústria farmacêutica necessita de extractos viáveis para produção em larga escala. Para que isso aconteça, é necessário que seja empregados processo de secagem após o preparo dos extractos. Entre as técnicas de secagem estão: spray-dryer, liofilização e evaporação (SILVA et al, 2012).
· Secagem por Liofilização
O processo de secagem por liofilização divide-se em três etapas: congelamento, sublimação e decocção. No congelamento do extracto, a água do material é convertida em gelo pela alteração brusca da pressão e temperatura, o que influencia na consistência, cor e aroma do produto final. A sublimação baseia-se na remoção do gelo do material, em uma conversão de estados, do sólido para o gasoso. A conversão da água adsorvida passa para o estado de vapor. O produto final apresenta-se poroso, friável, com avidez pela água e assépticos. O processo é oneroso (SILVA et al, 2012). 
CAPÍTULO III
3. Metodologias ou métodos científicos 
Partindo da concepção de que método é um procedimento ou caminho para alcançar determinado fim e que a finalidade da ciência é a busca do conhecimento, podemos dizer que o método científico é um conjunto de procedimentos adoptados com o propósito de atingir o conhecimento (PRADANV &FREITAS, 2013)
3.1. Localização geográfica do local da Colheita das amostras
As folhas de Líppia javánica localmente conhecida de “fungonfana”, foram colhidas em Março de 2021 na localidade de Camassiwana, posto administrativo de Salamanga, distrito de Matutuine, Província de Maputo. O distrito está localizado no extremo sul da Província de Maputo e do País, entre os paralelos 26º e 27º de latitude Sul e entre 32º e 33º da longitude Este. A norte é limitado pela baía e a Cidade do Maputo, a Sul pela República da África do Sul, com a Província se Kuazulu-Natal, a Este é banhado pelo Oceano Índico, e a Oeste confina com os distritos de Namaacha e Boane e com o Reino da Suazilândia. (MAE, 2005). É actualmente composta por uma população de 44 834 habitantes, dos quais 21 924 são homens e 22 910 são mulheres, segundo dados do censo 2017. (INEM, 2017).
3.2. Local da realização de ensaios experimentais
O estudo fitoquímico e antimalárico da L.J foram realizados no laboratório do Centro de Investigação e Desenvolvimento em Etnobotânica (CIDE), no distrito da Namaacha, Província de Maputo – Moçambique.
3.3. Métodos da pesquisa
3.3.1. Quanto ao método científico
· Indutivo
O conhecimento sobre o uso da Líppia javánica no tratamento da malária é exclusivo, sendo usada esta planta no distrito de Matutuine. Estudou-se a eficácia da actividade antimalárica desta planta de modo a tornar o conhecimento amplamente conhecido e aplicado.
3.3.2. Quanto à natureza
· Pesquisa básica
O uso de L. javánica para o tratamento de malária é um conhecimento pouco conhecido, gerado pelos praticantes da medicina tradicional na Província de Maputo, distrito de Matutuine. A partir desta linha de conhecimento fez-se a identificação da planta em referência e foram realizados os estudos laboratoriais, desde os testes fitoquímicos dos metabólitos secundários, a avaliação da sua eficácia através de testes in vitro podendo ser futuramente aplicada como medicamento da malária. 
3.3.3. Quanto aos objectivos
· Pesquisa exploratória
De acordo com Lakatos & Marconi (2017), as investigações de pesquisa empírica são aquelas cujo objectivo em destaque é a familiarização do fenómeno com o pesquisador para a realização de uma pesquisa mais precisa.
Esta pesquisa parte de um conhecimento empírico, onde as comunidades que praticam a medicina tradicional descobriram que as folhas de Líppia javánica curam a malária. Partindo deste conhecimento, levantou-se várias questões que suscitaram esta pesquisa com objectivo de avaliar a actividade antimalárica do extracto obtido das folhas da LJ que é usado pelos praticantes da medicina tradicional na Província de Maputo, distrito de Matutuine, para comprovar as descobertas com testes laboratoriais e permitir a futura aplicação deste extracto na produção de novos fármacos para o tratamento da malária.
3.3.4. Quanto à abordagem
· Pesquisa qualitativa
Esta pesquisa visa qualificar a Líppia javánica, ou seja, o extracto obtido através das folhas da Líppia javánica como antimalárico e indicar as melhores formas do seu uso para o bem-estar da saúde da população. Através desta abordagem foram identificadas qualitativamente os fitoquímicos responsáveis pela actividade antimalárica no extracto aquoso da L. J.
Escolheu esta pesquisa porque o estudo é baseado em testes preliminares sobre quais são os metabólitos secundários que apresenta a actividade antimalárica presentes nas folhas de Líppia javánica e determinar a sua eficiência do ponto de vista da sua eficácia.
3.3.5. (
Preparação
 da
 amostra 
Trituração 
Extracção 
Filtração 
Liofilização 
Realização de testes
 
fitoquímicos
Actividade antimalárica 
Produto final 
)Métodos de procedimentos
· Experimental
Figura 11: Fluxograma das actividades
Fonte: Autor/2021
3.3.6. Técnicas de recolha de dados
Segundo Freixo (2018), a técnica de observação pode ser apresentada de duas formas:
1. Observação do campo: Observação não participante
As actividades sociais relacionadas com o uso tradicional da Líppia javánica, o pesquisador não realizou pessoalmente, tendo obtido as informações do campo pelos investigadores do CIDE. onde, quando investigavam sobre plantas que combatem a covid-19 nos praticantes da medicina tradicional, foram referenciados a L.J como uma planta que usam no tratamento da malária.
2. Observação do laboratório: Observação participante
Neste local de pesquisa o investigador realizou os ensaios e observou, de modo a controlar as variáveis e registar todos os factos ocorridos durante os ensaios laboratoriais.
As imagens de evidência para os experimentos realizados, foram tiradas por um Smartphone de marca Iphone4s pertencente ao MSc. Alfredo Dique.
CAPÍTULO IV
4. Actividades experimentais
4.1. Identificação taxonómica da espécie em estudo
A identificação botânica foi realizada no Herbário do Instituto de Investigação Agronómica de Moçambique LMA voucher 7145 da UEM, Família Verbenaceae.
Família: Verbenaceae 
Espécie: Líppia 
Nome: Líppia javánica
Nome comum: Fungofana 
As tabelas 4 e 5 apresentai os materiais e reagentes que foram usados no processo de extracção do extracto, a identificação fitoquímica dos metabólitos secundários e a determinação da actividade antimalárica.
Tabela 4: Materiais usados nos ensaios
	Materiais
	· Copos de Becker;
· Kitassato
· Agitador orbital
· Moinho de martelos
· Balança analítica
· Frigorífico
· Liofilizador
· Bomba a vácuo
· Funil de separação
· Placa Porosa G4
· Manta Aquecedora 
· Erlenmyer
· Vareta 
· Microplacas com 96 poços de cerca de 300 µl cada;
· Ultrassom;
· Tubos Eppendorf;
	· Estante para tubos Eppendorf;
· Bastão de vidro;
· Incubadora;
· Cronómetro;
· Espátula;
· Micropipetas;
· Pipetas graduadas;
· Microplacas
· Copos de bécker;
· Balão de Erlenmyer;
· Tubos de ensaio;
· Buretas
· Espectrofotómetro de leitura de microplacas-milenia Kinetic Analyzer;
· Balança analítica de precisão;
Fonte: Autor/2021
Tabela 5: Soluções usadas nos ensaios
	Reagentes e soluções 
	Pureza
	Fabricante 
	País de fabrico 
	HEPES 
	99,5%
	SIGMA
	USA
	Etanol (C2H5O)
	99.8%
	SIGMA-ALDRICH
	USA
	Dragendorff 
	Recomendado ATLC
	SIGMA-ALDRICH
	Suíça
	Quinina hemissulfato monohidratado
	98%
	SIGMA
	Alemanha
	Anidrido acético 
	99%
	PanReac-Applichem
	Alemanha 
	Piridina (C6HN)
	-
	MINEMA
	África do Sul
	Ácido sulfúrico (H2SO4)
	98%
	MINEMA
	África do Sul
	Ácido pícrico
	99%
	GLASSWORLD
	África do Sul
	Ácido acético (CH3COOH)
	99%
	L e T Diagnostic
	África do Sul
	Zinco metálico em pó
	-
	L e T Diagnostic
Rasettenville-JHB
	África do sul
	Clorofórmio (CHCl3)
	99,8%
	JT Baker 
	Holanda 
	Metanol (CH3OH) 
	99.9%
	JT Baker
	Holanda 
	Acetato de sódio-tri-hidatado (CH3COONa.3H2O)
	98%
	BDH
	Inglaterra 
	Hidróxido de sódio (NaOH)
	
	OXFORD
	Índia 
	DMSO (C2H6OS)
	99.9%
	Fisher Chemical
	Reino Unido
	Cloreto de ferro (III) -hexa- hidratado (FeCl3.6H2O)
	+99%
	CHEM-LAB D’Ared
	Bélgica 
	Água destilada 
	100% 
	CIDE
	Moçambique (Namaacha)
Fonte: Autor/2021
4.2. Preparação da amostra
As amostras da planta, depois de serem secadas, foram retirada a parte aérea da Líppia javánica (folhas e flores), a parte que foi usada para a extracção. Nete processobaseiou-se atravees do método proposto por (BITENCOURT, 2014).
Figura 12: Amostra de L. javánica
Fonte: Autor/2021
4.3. Trituração
A trituração consistiu na redução da matéria-prima em fragmentos pequenos, que foi no triturador de martelo. A amostra da Líppia javánica foi triturada no moinho de martelo de marca PERRUZO, com o filtro de 0,2 milímetros de poros.
 
Figura13: Trituração da amostra
Fonte: Autor/2021 
 
Figura 14: amostra da das folhas trituradas da L.J
Fonte: Autor/2021
4.4. Extracção
4.4.1. Processo de Extracção
Para e extracção, pesou-se 30 gamas do pó da amostra das folhas de Líppia javánica numa balança analítica aeADAM (Max 6000g d=0,1g) e foi colocado no balão de Erlenmyer 500mL. De seguida, com auxílio da bureta, mediu-se 450 mililitros de água destilada e adicionou-se no balão contendo a amostra.
Figura 15: Pesagem da amostra
Fonte: Autor/2021
4.4.2. Extracção por decocção
A amostra foi aquecida num manto de aquecimento NAHITA BLUE (NB), deixado ferver por 5 minutos e foi retirado para um Agitador Orbital de Massa (AOM) de marca LABCOM que exerce 150 movimentos por minuto e a solução foi agitada por 60 minutos para garantir a maior concentração do soluto.
Figura 16: Adição da água para aquecimento e agitação da amostra
Fonte: Autor/2021
4.4.3. Filtração da amostra
Prosseguiu-se com a filtração da solução, usando o método de filtração a vácuo. Foi usada uma bomba a vácuo que funciona com a circulação da água retirando todo ar existente na solução. A bomba é da marca P-SELECTA de Max-vácum-0.098Mpa (0.98bar), um balão de separação de 500 mL e um filtro de placa porosa G-4 (funil de Buchner).
Figura 17: Filtração do extracto
Fonte: Autor/2021
A solução filtrada da amostra que é ilustrada na figura abaixo, foi dividida em quatro copos de bécker de 50 mL e dois balões de Erlenmyer de 25 mL, onde depois foram selados por papel de alumínio e isolado por parafilm e de seguida fez-se umas pontilhas de poros para permitir a circulação do ar e a retirada de água no liofilizador.
Figura 18:Imagem de decoto ou filtrado.
Fonte: Autor/2021
4.4.4. Liofilização da amostra
O copo contendo o extracto líquido da L.J foi levado para o congelador e esfriado por 24 horas. Depois foi para o liofilizador tipo CHRIST – ALPHA – 1-2 LD Plus, esta máquina retirou a água da amostra e deixar a substância desejada, ou seja, a parte sólida. Foi retirada a água no extracto aquoso das folhas da Líppia javánica, deixando o sólido que foi o produto final da extracção. O processo durou de 48 horas.
Figura 19: Liofilização das amostras de L. javanica
Fonte: Autor/2021
4.5. Identificação fitoquímica dos metabólitos secundários da L. J
Os testes fitoquímicos foram realizados segundo a metodologia de Nascimento et al, (2011).
4.5.1. Testes para a detecção de Alcalóides
· Preparação de extracto – colocou-se 2g de amostra previamente pulverizada em tubo de ensaio, adicionou-se 20 mL de H2SO4 a 1%, ferveu-se por 2 min. O decoto obtido foi filtrado por algodão e resfriado.
· O extracto obtido foi subdividido em 3 tubos de ensaios, onde no primeiro adicionou-se reagente de Dragendorff, o segundo acido pícrico e o terceiro serviram de branco. Resultado positivo → turvação a precipitação.
4.5.2. Testes para a detecção dos taninos
Pesou-se cerca de 2 gramas de amostra previamente pulverizada, adicionou-se 100 ml de água destilada, ferveu-se por 5 minutos. Depois, o substrato obtido foi filtrado e completou-se o volume para 100 ml com água destilada.
a) Colocou-se 1 ml de solução extractiva num tubo de ensaio e adicionou-se 10 ml de água destilada e de seguida gotejou-se uma gota de solução de Cloreto de ferro (III) a 1%. Observou-se o aparecimento de azul violeta que indica a presença dos taninos no extracto.
b) Em outro tudo de ensaio colocou-se 5 ml de extracto e adicionou-se 10 ml de Ácido acético a 10% e adicionou-se a solução de Acetato de chumbo a 10%. Observou-se o aparecimento de um precipitado amarelado o que indica a presença dos taninos.
4.5.3. Testes para a detecção de saponinas
A determinação das saponinas foi pelo método de índice de espuma, que é determinada a maior diluição em que 1g de amostra é capaz de formar 1cm de espuma.
Colocou-se 2 grama da amostra em um bécker, adicionou-se 100 ml de água destilada, ferveu-se por 5 minutos. Filtrou-se em algodão e adicionou-se ao filtrado Na2CO3 até a neutralização do decoto. De seguida completou-se o volume para 200 ml com água destilada.
Tabela 6: Condições experimentais para a determinação de saponinas
	Tubos
	I
	II
	II
	IV
	V
	VI
	VI
	VIII
	IX
	Solução extractiva de L. javánica (mL)
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	Agua destilada (mL)
	9
	8
	7
	6
	5
	4
	3
	2
	1
	Volume total (mL)
	10
	10
	10
	10
	10
	10
	10
	10
	10
Fonte: Autor/2021
4.5.4. Testes para a detecção dos flavonóides
Pesou-se cerca de 2 gramas de amostra em pó de L. J e colocou-se em fervura por 10 minutos num copo de precipitação contendo 40 ml de etanol absoluto (99,8%), em seguida a solução foi esfriada e depois filtrada. O filtrado foi separado em 2 tubos de ensaio com 5 ml de solução extractiva cada.
a) Reacção de Cianidina: no tubo 1 foi adicionado 1 ml de HCl concentrado e uma espátula pequena de Zinco metálico em pó, a reacção decorreu até o término da efervescência. Observou-se a presença dos flavonóides através da fluorescência.
b) Reacção com o FeCl3: adicionamos no segundo tubo uma gota da solução aquosa de Cloreto de ferro (III) a 4,5%. Neste métodonão foi observada a fluorescência que indica a presença dos flavonóides.
4.5.5. Testes para a detecção de triterpenos
Neste teste usou-se o método de Leiberman-Burchard (reacção de Anidrido acético + Ácido sulfúrico concentrado). Tomou-se 2 ml de extracto etanóico de L. J misturando-se com 2 ml de Clorofórmio, em seguida a solução foi filtrada gota-a-gota em um funil com algodão coberto com alguns decigramas de Sulfato de sódio anidro (Na2SO4). Em um tubo de ensaio, adicionou-se 1 ml de anidrido acético, agitando suavemente e acrescentou-se cuidadosamente três gotas de H2SO4 concentrado, agitando suavemente. O desenvolvimento de cores indica a presença de triterpenos bem como esteróides.
4.6. Determinação da actividade antimalárica pela inibição de formação de β-hematina
De acordo Vargas, et al (2011), a determinação da actividade antimalárica é baseada em testes in vitro. No entanto, este método foi aplicado da determinação da actividade antimalárica, no extracto aquoso da Líppia javánica, e fracções.
4.6.1. Amostras
Em um frasco pesou-se 50 mg de amostra e adicionou-se 2ml de solução stock e dissolveu-se se, depois levou-se a mistura ao ultrassom até a dissolução total.
4.6.2. Solução β-hematina
Em um frasco pesou-se 2,8 mg, de hemina depois adicionou-se 4 ml de NaOH a 0.1 M, a mistura foi levada ao ultrassom para a dissolução total, obtendo deste modo a solução Hematina. 
· Análise (solução a)
Adicionou-se 10μl da amostra de LJ em um tubo Eppendorf, adicionou-se 100μl da solução hematina, agitou-se, depois adicionou-se 10μl de HCl a 1 M, agitou-se, adicionou-se 60μl de acetato de sódio saturado, agitou-se e de seguida levou-se a solução para uma estufa a 60º c durante 90 minutos para a incubação. Após a incubação foi adicionada 750μl de piridina a 15%, agitado e deixado em repouso por 60 minutos.
· Análise blanck (solução b)
Adicionou-se 10μl de amostra de LJ em um tubo Eppendorf, adicionou-se 100μl da solução hematina, agitou-se, adicionou-se 10μl de HCl a 1 M, agitou-se, adicionou-se 60μl de acetato de sódio saturado, agitou-se e de seguida levou-se a solução para uma estufa a 60º c durante 90 minutos para incubação. Após a incubação foi adicionada 750μl de HEPES, agitado e deixado em repouso por 60 minutos.
· Controlo blanck (solução c)
Adicionou-se 10μl da amostra de LJ em um tubo Eppendorf, adicionou-se 100μl da solução NaOH a 0,1 M, agitou-se, adicionou-se 10μl de HCl a 1 M, agitou-se, adicionou-se 60μl de acetato de sódio saturado, agitou-se e de seguida levou-se a solução para uma estufa a 60º c durante 90 minutos para a incubação. Após a incubação foi adicionada 750μl de piridina a 15%, agitado e deixado em repouso por 60 minutos.
· Controlo blanck-blanck (solução d)
Adicionou-se 10μl da amostra de LJ em um tubo Eppendorf, adicionou-se 100μl da solução NaOH, agita se, adicionou-se 10μl de HCl a 1 M, agitou-se, adicionou-se 60μl de acetato de sódio saturado, agitou-se e de seguida levou-se a solução para uma estufa a 60º c durante 90 minutos para a incubação. Após a incubação foi adicionada 750μl de HEPES, agitado e deixado em repouso por 60 minutos.
· Padrão
Para o controlo dos resultados foi usada a Quinina como padrão. Pesou-se 19,5 mg de Quinina hemissulfato monohidratado e solubilizou-se em 2ml de solução stock, tomou-se cerca de 10μl para cada um dos tubos Eppendorf (a, b, c, d) adicionou-se 100μl de hematina, 10μl de HCl a 1 M, para os tubos a, b e adicionou-se 60μl de acetato de sódio, a solução foi encubada por 90 minutos a 60º C. 
Para os tubos c, d adicionou-se 100μl de NaOH, 10μl de HCl a 1 M e 60μl de acetato de sódio, encubou-se por 90 minutos a 60º C. De seguida as soluções a e c foram adicionadas 750μl de piridina a 15 % e em b e d adiciona se 750μl de HEPES. Todas foram preparadas em triplicados. Em uma microplaca, foram adicionados 100μl de cada solução e procedeu-se a leitura dos dados em um espectrofotómetro de leitura de microplacas. Os dados das absorções obtidos foram agrupados em tabelas e usados para a determinação da inibição de formação de β-hematina.
CAPÍTULO V
5. Apresentação dos resultados
5.1. Rendimento percentual do extracto da Líppia javánica.
 Rendimento foi determinado para se obter uma percentagem equivalente a 100% do produto necessário para os testes antimaláricos. A massa inicial da amostra de folhas de L.J foi de 30g e a massa final foi de 2,92g, a partir destes dados foi calculado o rendimento teórico percentual.
Dados Fórmula Resolução
mi = 30g 
mf = 2,92g 
Ƞ= ?
R: O rendimento percentual da massa do extracto foi de 9,73%.
Tabela 7: identificação fitoquímica de metabólitos secundários 
	Fitocompostos 
	Reacções 
	Resultados 
	Evidencia 
	Alcalóides 
	Reacção com Ácido pícrico 
	+ 
	Amarelado 
	
	Reagente de Dragendorff 
	++ 
	Alaranjado/vermelho tijolo 
	Taninos 
	Cloreto de ferro (III) FeCl3 a 1% 
	++ 
	Precipitado amarelo 
	
	Ácido acético CH3COOH e Acetato de Chumbo CH3COOPb.H2O 
	++ 
	Azul 
	Flavonóides 
	Ácido clorídrico HCl concentrado e Zinco metálico em pó 
	++ 
	Avermelhado formacao do precipitado preto 
	
	Reacção com Cloreto de ferro (III) FeCl3 
	- 
	Sem mudança de coloração e formacao de precipitado 
	Saponinas 
	Carbonato de sódio N2CO3 
	- 
	Sem espuma 
	Triterpenos 
	Anidrido acético + Ácido sulfúrico concentrado (método de Leiberman-Burchard) 
	Indetectável 
	Azul-violeta 
Fonte: Autor/2021
5.2. Identificação fitoquímica do extracto aquoso da L.J
Os testes fitoquímicos consistiram na identificação dos metabólitos secundários que estão presentes no extracto indicando os responsáveis pela acção antimalárica.
5.2.1. Identificação de Alcalóides
 
Figura 20: Evidencia dos alcalóides (reacção com Acido pícrico e reactivo de Dragendorff)
Fonte: Autor/2021
5.2.2. Identificação dos taninos
 
Figura 21: Evidência da presença dos Taninos no extracto aquosode L. javanica
Fonte: Autor/2021
5.2.3. Identificação de saponinas
Figura 22: Imagem de evidência da ausência dos saponinas (sem espuma)
Fonte: Autor/2021
5.2.4. Identificação dos flavonóides
Figura 23: Imagem que ilustra a presença dos flavonóides no extracto aquoso de L. javanica
Fonte: Autor/2021
5.2.5. Identificação de triterpenos
Figura 24: identificação dos triterpenos e esteróides (ausentes).
Fonte: Autor/2021
5.3. Determinação da actividade antimalárica do extracto da L.J
A avaliação da actividade antimalárica procedeu-se depois de se identificar os metabólitos secundários responsáveis por esta actividade, avaliando a sua eficácia pela inibição do parasita hemozoina (β-hematina), que foi plantado em microplacas usando o soro de boi (hemina).
A determinação da actividade antimalárica foi realizada obedecendo o método proposto por Vargas et al, (2011), cujas fracções dos resultados são ilustradas na tabela que se segue.
Figura 25: Tubos Eppendorf para teste antimalárico em triplicata
Fonte: Autor/2021
Figura 26: Imagem de microplacas com as solucoes
Fonte: Autor/2021
Figura 27: Leitura de microplacas (µg/ml)
Fonte: Autor/2021
Os dados na tabela que se segue, apresentam a leitura de microplacas na determinação da eficiência da actividade antimalárica do extracto da L.J. Onde os dados (a e b), representam a solução da amostra do parasita e do extracto aquoso da L.J (antimalárico) e os tubos (c e d) representam apenas a solução do parasita (β-hematina) e os dados do padrão (Quinina) serviram de controlo ou referência da eficácia.
Tabela 8: Dados do controlo da determinação antimalárica (µg/ml)
	Amostra
	Absorvência
	Média 
(3 leituras)
	Diferença (a-d) e (c-d)
	Resultado
	L.J–a
	1,540
1,864
1,886
	1,7633
	
1,130
	
Positivo
	L.J–b
	0,211
1,066
0,621
	0,6326
	
	
	amostra -c
	0,230
0,228
0,218
	0,2253
	
-0,011
	
Negativo
	amostra-d
	0,261
0,249
0,200
	0,2363
	
	
	PQ-a
	0,910
1,141
0,510
	0,8537
	
0,7357
	
Positivo
	PQ-b
	0,093
0,129
0,132
	0,118
	
	
	PQ- c
	0,052
0,052
0,0540,0527
	
0,7229
	
	PQ-d
	0,039
0,041
0,040
	0,04
	
	
Fonte: Autor/2021
5.4. Discussão dos resultados
5.4.1. Testes fitoquímicos
· Testes de alcalóides
A identificação dos alcalóides pelo método de Dragendorff deu positivo. Pois, segundo Matos (1998), a presença dos alcalóides em extractos vegetais, é observada através da turvação do precipitado apresentando uma coloração vermelho-tijolo ou alaranjado. Com forme descrito na literatura, nos extractos da Líppia javánica ocorreu as colorações referidas, ilustrando a presença dos alcalóides no extracto.
· Testes de Taninos
Na identificação dos taninos no extracto aquoso da Líppia javánica, observou-se, no teste, a formação de um precipitado amarelo na reacção com o Acetato de chumbo e o aparecimento de uma cor azul-violeta que indica a presença dos taninos segundo a literatura do (NASCIMENTO et al, 2011).
· Testes de flavonóides
Os flavonóides foram identificados usando dois tipos de reacção. O teste do extracto usando a reacção de Cianidina deu positivo. No tudo A foi observado neste teste a efervescência da solução com HCl concentrado e Zinco metálico o desenvolvimento de uma coloração rósea-avermelhada. Mas na reacção com o FeCl3 do tubo B deu negativo, pois não houve a mudança de coloração. (COSTA, 2007).
· Testes de Saponinas
Segundo Matos (2003), as Saponinas são identificadas pelo método de índice de espuma, onde evidencia-se a presença das saponinas pelo aparecimento de espuma na superfície da solução em teste que vai persistindo por cerca de 15 a 20 minutos. Porém, no extracto aquoso das folhas e flores da Líppia javánica, não foi verificado o índice de espuma.
· Testes de Triterpenos
Para a identificação de terpenóides, foi usado o método de Leiberman-Burchard nas folhas e flores da L. javánica. O teste deu negativo à presença dos triterpenos no extracto aquoso de Líppia javánica, pois, o resultado é comprovado pelo aparecimento da cor castanho-avermelhada na camada da interface como descrito na literatura (COSTA, 2007).
Os Triterpenos não foram identificados, podendo ser por causa da natureza do solo onde as amostras foram colhidas, bem como pode ter sido problema dos reagentes usados pode ser que sofreram alguma reacção espontânea ou a contaminação das próprias amostras. Mas fundamentalmente a falta de reagentes para a produção do reactivo de Salkowscki.
5.4.2. Actividade antimalárica da do extracto aquoso da L. javánica
Segundo Taiz & Zeiger (2006), estruturas químicas que apresentam os flavonóides, triterpenóides e alcalóides, assemelham-se às estruturas de Quinina, Quinidina, Cinchonidina, Cloroquina entre outros compostos, tomando como exemplo a presença do nitrogénio nas estruturas químicas do Cinchonidina e Cloroquina, que constitui uma característica exclusiva dos alcalóides. Pois, esta semelhança permite que esses metabólitos secundários agem como agentes antimaláricos.
Os alcalóides destacam-se como agentes antimaláricos, pois quando ingeridos, entram na corrente sanguínea impedindo a produção de proteínas dos quais o plasmodium se alimenta, impedindo desta forma o seu crescimento e multiplicação. afirma que os taninos, flavonóides e os triterpenos também contribuem na acção contra o plasmódio (VARGAS et al, 2011; MAROYI, 2017).
A malária é uma doença causada pela parasita do género Plasmodium .  Esse parasita ingere mais de 75% do hospedeiro hemoglobina durante o ciclo intra-eritrocítico; portanto, uma quantidade substancial de heme é gerado como um subproduto tóxico de massivo degradação da hemoglobina (FRANCIS et al, 1997). Posteriormente, o parasita para se proteger do material tóxico autoproduzido, pois, tem desenvolvido um processo de desintoxicação por meio de a cristalização do heme, um pigmento cristalino não tóxico conhecido como hemozoína. Hemozoin é equivalente a β-hematina, que consiste em dímeros de heme cíclicos arranjados em uma estrutura cristalina ordenada através de ligações de hidrogénio intermusculares. 
Ao ingerir o extracto da Líppia javánica, entra no organismo e é levado até a hemoglobina onde vai impedir a formação de Ferriprotoporfirina que é a proteína que dele o parasita se alimenta para o seu desenvolvimento. Quando o extracto impede a formação desta proteína o hospedeiro morre durante o período intra-eritrócito.
CAPÍTULO VI
6. Conclusão e recomendações
6.1. Conclusão
Os resultados deste estudo mostraram que a Líppia javánica possui actividade antimalárica, pois apesar de certas limitações na identificação de fitoquímicos presentes no extracto obtido por falta de reagentes e materiais para, a avaliação quantitativa da acção antimalárica, o extracto apresentou um potencial antimalárico elevado em relação a variável de referência usada que foi a Quinina.
Na identificação fitoquímica dos metabólitos secundários, foram identificados os alcalóides, taninos, flavonóides no extracto aquoso da Líppia javánica. Estes metabólitos apresentam propriedades antimaláricos.
A actividade antimalárica da Líppia javánica foi determinada, e com os resultados encontrados conclui-se que a planta é eficaz no tratamento da malária. Pois, tomando como referencia a Quinina o valor da actividade antimalárica da Líppia javánica foi elevada. 
Este estudo contribui para a validação da Líppia javánica como uma planta que cura a malária, visto que é um pontapé de saída para estudos mais profundo sobre a determinação das dosagens de acordo com a faixa etária, a avaliação dos efeitos colaterais que a planta pode apresentar bem como estudar a variabilidade da planta do ponto de vista de locais onde a planta é encontrada.
6.2. Recomendações
Este estudo apresenta um campo aberto para a sua exploração. Embora as expectativas são de continuar com a linha de estudo até se chegar à determinação de doses recomenda-se:
À comunidade estudantil de e científica da UniSave:
· Estudar as quantidades dos metabólicos presentes no extracto da L.J;
· Investigar outras partes da planta, quer seja, a raiz ou o caule;
· Avaliar o extracto hidro-alcoólico e outras actividades medicinais que a planta pode ainda apresentar;
À comunidade em Geral:
· Ter cuidado com uso das plantas medicinais, pois existem substâncias tóxicas que não pode ser ingerido em maiores quantidades, podendo serem prejudiciais à saúde enquanto a intenção é salvaguardar a mesma;
Limitações:
· Durante a execução desta pesquisa, não foi possível analisar a concentração dos diferentes metabólitos Secundários do extracto aquoso, e a identificação dos fitocompostos usando a cromatografia devido à falta de alguns reagentes.
· Não foi possível, aprofundar o estudo sobre a toxicidade, dosagem e o regime de administração do remédio que pode ser adequado para o uso em cada idade de modo que as comunidades sejam informadas porque o laboratório não dispõe de máquinas e materiais necessários.
7. Referências bibliográficas
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