Clonagem

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12/08/2022

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DOCÊNCIA EM
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CLONAGEM

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Triagem Organização LTDA ME
Bibliotecário responsável: Rodrigo Pereira CRB 1/2167
Portal Educação
P842c Clonagem/ Portal Educação. - Campo Grande: Portal Educação, 2012.
103p. : il.

Inclui bibliografia
ISBN 978-85-8241-436-1
1. Clonagem. 2. DNA - Estrutura. 3. Clonagem molecular. I. Portal
Educação. II. Título.
CDD 660.65

SUMÁRIO

1 CLONAGEM ............................................................................................................................... 5
1.1 Estrutura do DNA ..................................................................................................................... 5
1.2 Estrutura do RNA..................................................................................................................... 12
1.3 Mecanismo de replicação do DNA ......................................................................................... 15
1.4 Transcrição ............................................................................................................................. 21
1.5 Tradução .................................................................................................................................. 25
1.6 Tecnologia do DNA recombinante ......................................................................................... 29
2 CLONAGEM MOLECULAR ...................................................................................................... 30
2.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ................................................................................ 30
2.2 Enzimas de Restrição .............................................................................................................. 34
2.3 Vetores de clonagem molecular ............................................................................................. 37
2.4 Ligação ..................................................................................................................................... 45
2.5 Transformação bacteriana ...................................................................................................... 47
2.6 Transfecção ............................................................................................................................. 48
2.7 Seqüenciamento manual ....................................................................................................... 51
2.8 Seqüenciamento automático ................................................................................................. 53
3 CONSTRUÇÃO E USO DE BIBLIOTECA DE CDNA RECOMBINANTE ................................. 56

3.1 Biblioteca genômica ................................................................................................................ 60
3.2 Clonagem ................................................................................................................................ 63
3.2.1 Os Prós da Clonagem Humana ................................................................................................ 73
3.2.2 Os Contras da Clonagem .......................................................................................................... 74
3.3 Clonagem "Reprodutiva" ....................................................................................................... 75
4 CLONAGEM TERAPÊUTICA ................................................................................................... 78
4.1 Terapia celular ......................................................................................................................... 89
4.1.1 Terapia celular com células-tronco de indivíduos adultos. ........................................................ 90
4.1.2 Terapia celular com cordão umbilical e placenta ....................................................................... 91
4.1.3 Terapia celular com células embrionárias ................................................................................. 92
4.1.4 Tratamentos em potencial com terapia celular .......................................................................... 92
4.1.5 O custo ...................................................................................................................................... 93
4.2 Protocolos para clonagem molecular .................................................................................... 94
4.2.1 Reação de PCR ......................................................................................................................... 94
4.2.2 Enzimas de restrição ................................................................................................................. 96
4.2.3 Reação de ligação ..................................................................................................................... 98
4.2.4 Preparo de bactérias e transformação por choque térmico ....................................................... 99
4.2.5 Seqüenciamento ....................................................................................................................... 100
4.2.6 Seleção dos clones .................................................................................................................. 100

REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 102

1 CLONAGEM

1.1 Estrutura do DNA

As informações genéticas estão armazenadas nos ácidos nucléicos, sendo estes de
dois tipos: ácido desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucléico (RNA).
O DNA é uma molécula orgânica encontrada principalmente nos cromossomos no
núcleo das células, que armazena as informações necessárias para a síntese de proteinas e
RNAs. O modelo tridimensional da estrutura dupla hélice do DNA foi postulada em 1953, por
James Watson e Francis Crick, baseados em estudos de difração de raio-X:

“Há na estrutura do DNA uma elegância e simplicidade profundamente
surpreendentes quando se considera a atordoante variedade de vida na terra"
James Watson

“A dupla hélice é realmente uma molécula extraordinária. O homem moderno tem
talvez 50 mil anos, a civilização existe há apenas 10 mil anos. Mas o DNA e o RNA
existem há pelo menos vários bilhões de anos. Durante todo esse tempo, a dupla
hélice esteve por aí, ativa. No entanto, somos as primeiras criaturas sobre a Terra a
nos tornarmos conscientes da sua existência.” Francis Crick.

Figura 1. Modelo original da estrutura dupla hélice do DNA. Fonte: Cold Spring Harbor
Laboratory Archives

O DNA é formado por duas cadeias helicoidais, enroladas ao longo de um mesmo eixo,
formando uma dupla hélice e é constituído por uma seqüência de nucleotídeos. Na figura 2
podemos observar a constituição dos nucleotídeos:
 Um açúcar (pentose), no caso do DNA esse açúcar é uma desoxirribose;
 Um grupo fosfato;
 Uma base nitrogenada.


Figura 2. Nucleotídeo.

Podemos encontrar no DNA quatro bases nitrogenadas distintas: adenina (A), timina (T),
citosina (C) e guanina (G) (Figura3). Adenina e guanina são chamadas bases púricas ou purinas
e contém um anel aromático duplo em sua estrutura. Já citosina e timina são denominadas
bases pirimídicas e possuem um anel aromático simples em sua estrutura.

Figura 3. Bases nitrogenadas encontradas no DNA.

O pareamento das bases de cada fita do DNA acontece de maneira específica:
adenina pareando com timina e citosina pareando com guanina. Este pareamento resulta na
formação de pontes de hidrogênio entre as fitas. A adenina forma duas pontes de hidrogênio
com a timina e a citosina forma três pontes com a guanina (Figura 4).

Figura 4. Pareamento específico entre as bases nitrogenadas de cada fita do DNA e a
formação das pontes de hidrogênio. Pontilhado indica as pontes de hidrogênio. Em nm a
distância da ligação.

Como dito anteriormente, a molécula de DNA é formada por uma seqüência de
nucleotídeos, sendo que estes estão ligados entre si por uma ligação fosfodiéster. Esta ligação
ocorre entre o grupo hidroxila do carbono-3 da pentose do primeiro nucleotídeo e o grupo fosfato
ligado à hidroxila do carbono-5 da pentose do segundo nucleotídeo através de uma ligação
fosfodiéster (Figura 5).

Figura 5. Ligação do tipo fosfodiéster entre os nucleotídeos de uma mesma fita.

As ligações do tipo fosfodiéster ligam covalentemente o DNA e conferem uma
polaridade química ao DNA: uma extremidade livre 3' com um grupo hidroxila e uma extremidade
5´ livre com um grupo fosfato. A estrutura dupla hélice do DNA é formada por duas cadeias
antiparalelas complementares (com sentidos opostos, uma por 3’-5’ e a outra por 5’-3’), ligadas
pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio entre as bases complementares das duas cadeias
(Figura 6).

Figura 6. Ilustração da molécula de DNA, demonstrando a sua polaridade química,
cadeias antiparalelas complementares.
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Cada par de bases apresenta uma largura semelhante mantendo o esqueleto fosfato-
açúcar uma mesma distância ao longo da molécula de DNA. As fendas maiores e menores são
geradas pela rotação das bases em torno do eixo da hélice (Figura7).

Figura 7. Ilustração do DNA demonstrando largura fixa entre os pares de bases. Adaptado
de:
http://www.dbbm.fiocruz.br

Em altas temperaturas ou pH extremo o DNA sofre desnaturação, porque ocorre a
ruptura das pontes de hidrogênio entre os pares de bases, não ocorrendo rompimento de
nenhuma ligação covalente. Quando o pH e a temperatura voltam ao normal, as duas fitas de
DNA formam novamente a estrutura dupla fita (Figura 8).

Figura 8. Estrutura Nativa, estado desnaturado e estado renaturado do DNA. Adaptado
de http://www.dbbm.fiocruz.br

1.2 Estrutura do RNA

Comparando a estrutura do RNA (Figura 9) com a estrutura do DNA, algumas
diferenças importantes são encontradas:
 Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotídica simples,
 Não encontramos a base nitrogenada timina na estrutura do RNA, e
encontramos a base nitrogenada uracila,
 A pentose do RNA é a ribose,
 O RNA apresenta uma molécula curta.


Figura 9. Estrutura do RNA.

De acordo com características estruturais e funcionais peculiares, podemos dividir as
moléculas de RNA em:

RNA Ribossômico (rRNA)

É sintetizado pela RNA polimerase I e encontrado na estrutura dos ribossomos. Sua
função é prover mecanismos para a decodificação do RNA mensageiro em aminoácido e
interagir com tRNA durante a tradução. Corresponde a até 80% do total de RNA da célula.

RNA Mensageiro (mRNA)

É transcrito a partir de um molde de DNA e transporta esta informação genética ao
ribossomo. Corresponde a apenas 5% do total de RNA da célula e é usado como molde na
biossíntese protéica.

Código genético

Atualmente definimos uma seqüência de três nucleotídeos no mRNA capaz de
codificar um aminoácido como códon.

Figura 10. Código genético degenerado e universal.
Fonte: http://www.ufv.br

O código genético (Figura 10) é representado por 64 códons de mRNA, sendo que 61
codificam para aminoácidos e 3 para terminação em cadeia (chamados trincas sem sentido ou
terminalizadoras).
Devido ao fato de existir para um determinado aminoácido, mais de uma trinca capaz
de codificá-lo, o código genético é degenerado. Apenas a metionina e o triptofano são
codificados por um único códon, representados por AUG e UGG, respectivamente. Além de
degenerado o código genético é dito universal, uma vez que uma mesma trinca codifica o
mesmo aminoácido em qualquer organismo. Em alguns casos certas trincas são mais
eficientemente utilizadas.
RNA de Transferência (tRNA)
Também chamado de RNA transportador, possui uma cadeia de 73-93 nucleotídeos e
sua função é transferir um aminoácido específico a uma cadeia polipeptídica durante a síntese
protéica. Possui um sítio terminal 3’ para ligação de aminoácido e uma região com três bases:
chamada anticódon que é capaz de parear com o códon do mRNA.
Corresponde a 15% do RNA total da célula, as moléculas tRNA são sintetizadas no
núcleo pela ação da RNA polimerase III e o seu processamento envolve a adição de uma
seqüência CCA no terminal 3’ de todas as moléculas. Ocorre ainda a metilação enzimática,
através da S-adenosilmetionina, em aproximadamente 1% das unidades ribose. Por outro lado, é
também efetuada a modificação de algumas bases que facilitam o estabelecimento da sua
estrutura. Todas as moléculas de tRNA podem assumir uma estrutura secundária em folha de
trevo (Figura 11), apresentando 4 zonas de emparelhamento entre bases complementares e 4
alças, uma das quais inclui um anticódon, determinante na incorporação correta do aminoácido
na proteína.

Figura 11. Ilustração do RNAt.
Adaptado de http://www.med.unibs.it

1.3 Mecanismo de replicação do DNA

A replicação do DNA é semiconservativa, ou seja, um dos filamentos de cada molécula
filha de DNA é recém sintetizado, enquanto o outro é passado inalterado vindo da molécula
original de DNA. Esta distribuição de átomos parentais é chamada de semiconservativa.

Figura 12. Replicação semiconservativa do DNA. Adaptado de
http://138.192.68.68/bio/Courses/biochem2/GeneIntro/DNAandRNAIntro.html

Para que a replicação aconteça existe a ação de diferentes enzimas, algumas estão
listadas na tabela I.

TABELA I. Enzimas envolvidas na replicação do DNA.
Proteína Ação
Proteínas DN A Ligam-se à seqüência de
nucleotídeos específicos na origem da
replicação, fazendo com que as fitas de DNA
se separem.
Helicases Ligam-se à fita simples de DNA,
próximo a zona de replicação, e se movem na
direção da fita dupla, forçando as fitas se
separarem e provocando um desenrolamento.
Proteínas de ligação de DNA de fita
simples – SSB
Ligam-se a
fita simples de DNA,
mantendo-as separadas
Topoisomerase Um problema de superdobramento
ocorre à medida que as fitas se separam. As
enzimas DNA topoisomerase são
responsáveis pelo mecanismo para remover o
superdobramento,
Primase Sintetizar primer
DNA polimerases São as enzimas responsáveis por
catalisar o alongamento da cadeia
adicionando nucleotídeos um de cada vez,
complementar a seqüência das bases
nitrogenadas da fita molde
DNA ligase É a enzima responsável por realizar
a junção entre os fragmentos de DNA
(fragmentos de Okazaki) sintetizados na fita
atrasada
Baseado em: www.enq.ufsc.br

Proteínas DnaA se ligam a origem de replicação e facilitam a separação das fitas de
DNA. Helicases se ligam à fita e se movem separando as fitas de DNA, através da hidrólise de
ATP. As proteínas SSB se ligam a fita simples, impossibilitando que estas se anelem novamente
(Figura 13).

Figura 13. Replicação do DNA.
Adaptado de homepages.strath.ac.uk

As DNA polimerases necessitam de um oligonucleotídeo iniciador (primer), uma região
de aproximadamente 10 nucleotídeos com um grupo hidroxila livre no carbono-3’, que serve
como primeiro aceptor de um nucleotídeo. Na natureza os primers são feitos de RNA e a enzima
que catalisa a síntese do primer é a primase.

Figura 14. Replicação de DNA, Ilustração para demonstrar a separação das duas fitas
de DNA, ligação das proteínas SSB, ação das helicases e a necessidade dos primers (setas)
para a ação da DNA polimerase. A fita recém sintetizada é indicada pelos traços descontínuos.

Assim que a forquilha de replicação se abre o suficiente (ação da helicase), um primer
é colocado (ação da primase) e começa a síntese das fitas (um na extremidade da fita molde
que servirá para dirigir a síntese da fita contínua. E, outro mais para o interior da forquilha de
replicação, pareado com a fita que servirá de molde para a síntese da fita descontínua).
A DNA polimerase somente consegue ler os nucleotídeos da fita de DNA parental na
direção 3’ a 5’ e sintetizar novas fitas na direção 5’ a 3’. Desta maneira, os alongamentos das
fitas são em sentidos opostos, porém, o mecanismo não é o mesmo para as duas fitas. A fita que
cresce na direção da zona de replicação é sintetizada continuamente, denominada fita líder. A
fita que cresce na direção oposta à zona de replicação é sintetizada descontinuamente, copiando
pequenos fragmentos de DNA perto da zona de replicação, denominados fragmentos de
Okazaki. A esta fita é denominada de fita atrasada.

Figura 15. Replicação do DNA. Ilustração para demonstrar os fragmentos de
OKASAKI na fita descontínua (3´-5´).

Para cada fragmento de Okazaki a ser gerado será necessária a adição de um primer.
E, assim como o DNA, o primer também tem um sentido 5’-3’ bem definido.
Heterohíbridos RNA-DNA não são estáveis e enzima ligase não é capaz de unir RNA a
DNA, portanto os primers de RNA têm que ser retirados do DNA maduro. Isto é possível devido

à atividade corretora da DNA polimerase. Esta enzima reconhece erros no DNA, inclusive a
presença de RNA, mesmo que pareado ao DNA e através de uma atividade exonucleotídica 3-5´
é capaz de retirar o primer. Ao mesmo tempo em que retira o primer, ressintetiza outra cópia da
mesma molécula no espaço deixado, desta vez com DNA. Por fim a DNA ligase liga estes aos
fragmentos.
Se imaginarmos a replicação da fita descontínua, veremos que chegará um momento
(nas pontas dos cromossomos) que não será possível adicionar um primer e não seria possível
replicá-las, ficando assim as pontas dos cromossomos encurtadas. Os eucariotos (que têm
cromossomos lineares) possuem uma enzima, chamada telomerase, que adiciona uma
seqüência de bases definidas, repetindo muitas vezes esta operação, cada vez que detecta um
encurtamento significativo da extremidade de um cromossomo. Neste processo a integridade do
cromossomo é garantida. Por isso também as extremidades de todos os cromossomos de uma
mesma espécie dos eucariotos são iguais e formados pelos telômeros.

Figura 16: Replicação telomérica: a figura identifica as reações envolvidas na
formação de seqüências que formam as extremidades dos cromossomos (telômeros). A
telomerase é um complexo RNA - proteína que têm um molde de RNA para a síntese de uma
seqüência de DNA rica em G.

1.4 Transcrição
A síntese de uma proteína a partir de um gene envolve dois processos: transcrição e
tradução (Figura 17).

Figura 17. Ilustração esquemática da síntese protéica.

O gene não é um molde direto para a síntese de proteínas, quem exerce essa função é
a molécula de RNA. A transcrição consiste na síntese de moléculas de RNA mensageiro
(mRNA), RNA ribossômico (rRNA) e RNA de transferência (tRNA), a partir da molécula de DNA.
Nas células eucarióticas existem quatro RNA polimerases (cujas moléculas originadas
pela transcrição estão descritas entre parênteses): polimerase I (rRNA), II (mRNA), e III (tRNA e
snRNA - pequenas RNA nucleares) e IV (transcrição dos genes do DNA mitocondrial).

A enzima RNA polimerase tem as seguintes funções:

 Reconhecimento das bases do DNA.
 Seleção dos ribonucleotídeos apropriados.
 Catálise da formação de ligações entre os ribonucleotídeos.
 Escolha do filamento correto a ser transcrito.
O processo de transcrição ocorre em três etapas: iniciação, elongação e terminação da
cadeia polinucleotídica de RNA sintetizado.
Iniciação
Na síntese do mRNA, a RNA polimerase II liga-se ao DNA em regiões específicas
chamadas regiões promotoras. Estas regiões estão localizadas no DNA a montante do local de
iniciação da transcrição. Após ligação, a cadeia do DNA sofre desenrolamento e desnaturação,
formando duas cadeias simples de DNA, uma das quais servirá de molde para a síntese do
mRNA (Figura 18).

Figura 18. Iniciação do processo de transcrição do RNA. Região promotora, operadora
e transcrita de um gene.

Existem situações que a presença de proteínas denominadas repressores na região
operadora inibe a transcrição do gene (Figura 19).

Figura 19. Presença de uma proteína repressora na região operadora do gene acima.
A presença desta proteína reprime a expressão do transcrito e consequentemente a síntese
protéica. Este é um dos mecanismos de controle da expressão gênica.

Elongação
A enzima RNA polimerase II catalisa a ligação dos nucleotídeos precursores livres por
complementaridade à seqüência nucleotídica da cadeia simples de DNA molde. Dessa forma a
fita de RNA sintetizada tem seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de DNA
molde.

Figura 20. Elongação do processo de transcrição. A RNA reconhece o sítio de início
da transcrição e catalisa a síntese da fita de RNA.

Terminação
O processo termina quando a enzima RNA polimerase II reconhece uma seqüência de
terminação específica.
Em eucariotos, o mRNA é sintetizado primeiramente na forma de um transcrito primário
e então processado para originar o mRNA maduro. Este processamento inclui:
1. Modificação da extremidade 5’ pela adição de 7 metilguanosina (Cap);
2. Adição na extremidade 3’ de uma cauda de adeninas (poliadenilação);
3. Remoção das regiões não codificantes (íntrons) do mRNA precursor e união das
regiões codificantes: éxons.
Após o processamento o mRNA maduro é transportado do núcleo para o citoplasma da
célula, onde ocorre a tradução da informação genética nele contida.

Figura 21. Processamento do transcrito primário
a mRNA maduro. Adição do CAP 5´,
cauda poli A, excisão dos íntrons e união dos éxons.

1.5 Tradução

A tradução é um processo que ocorre no citoplasma da célula e a mensagem trazida
pela fita de mRNA é traduzida em uma seqüência de aminoácidos.
O ribossomo possui duas subunidades: nos procariotos o ribossomo é dito 70 s e é
formado pelas subunidades 50 s e 30 s, e nos eucariotos é 80 s formado pelas subunidades 50 s
e 40 s. Estas subunidades são denominadas de acordo com sua velocidade de sedimentação.
Polissomos é a denominação que se dá à complexação de vários ribossomos a uma mesma fita
de mRNA.
O processo de tradução em procariotos acontece da seguinte forma:
A síntese protéica em bactérias inicia-se com a ligação da subunidade 30 s com dois
fatores de iniciação: IF-1 e IF-3. IF-3 previne que as duas subunidades ribossomais se
complexem prematuramente. O mRNA e a seqüência inicial 5´AUG se liga no sítio exato para o
início da tradução (Figura 22). Nos procariotos, em geral, a primeira trinca a ser lida (fator de
inicialização) é a trinca AUG, que corresponde a uma metionina formilada, enquanto que nos
eucariotos o primeiro aminoácido é também a metionina, mas não formilada.

Figura 22. Iniciação do processo de tradução de proteínas. Ligação da subunidade 30
s com dois fatores de iniciação: IF-1 e IF-3. mRNA e a seqüência inicial 5´AUG se liga no sítio
exato para o início da tradução.

Os ribossomos possuem três sítios que se ligam a aminoacil-tRNAs, o sítio aminoacil
(sítio A), sítio peptidil (sítio P) e sítio de saída (sítio E). Em seguida, o fMet-tRNA se liga ao
códon AUG posicionado no sítio P (Figura 23). Nesta etapa ocorrem também a complexação da
proteína IF-2 ao complexo. O fMet-tRNA é o único aminoacil-tRNA que se liga primeiramente ao
sítio P, os demais tRNAs se ligam primeiro ao sítio A, e subseqüentemente ao sítio P e sítio E.

Figura 23. Processo de tradução de proteínas. Ligação do fMet-tRNA ao códon AUG
posicionado no sítio P

Ocorre a ligação da subunidade 50S e a liberação dos fatores de iniciação (IF-1, IF2,
IF3) (Figura 24).

Figura 24. Processo de tradução de proteínas. Ligação da subunidade 50 s e liberação
dos fatores de iniciação.

Na fase de elongação, o aminoacil-tRNA apropriado se liga ao sítio A (Figura 25).

Figura 25. Processo de tradução de proteínas. Ligação de aminoacil-tRNA no sítio A.

Após esta ligação é preciso formar a ligação peptídica entre os dois aminoácidos que
estão ligados aos tRNAs presentes nos sítio A e P. Pela ação da enzima peptidil transferase o
aminoácido que pertence ao tRNA do sítio peptidil é transferido e ligado ao aminoácido acoplado
ao tRNA do sítio aminoacil (Figura 26).

Figura 26. Processo de tradução de proteínas. Ligação do aminoácido que estava
ligado ao tRNA situado no sítio peptidil ao aminoácido acoplado ao tRNA do sítio aminoacil.

Na fase de translocação, o ribossomo “pula” um códon em direção à extremidade 3´do
RNA. O tRNA desativado (sem aminoácido), que ocupa o sítio peptidil passa a ocupar o sítio E e
deixa o complexo ribossomo-mRNA, podendo ser novamente ativado quando se fizer
necessário. O tRNA que está no sítio aminoacil passam para o sítio peptidil, permitindo a leitura
de uma nova trinca (Figura 27).

Figura 27. Processo de tradução de proteínas. Etapa de translocação.
O processo é continuado até que todos os aminoácidos necessários para a confecção
da proteína estejam ligados. A última trinca lida na fita de mRNA deverá ser um fator de
terminalização (UAA, UAG ou UGA) que não codifica nenhum aminoácido mas indica o término
da síntese protéica.
A síntese protéica termina com a desativação do complexo ribossomo-mRNA, a
desativação do tRNA e a síntese da proteína. Durante ou após a sua síntese, o polipeptídio
assume sua conformação nativa, com a formação das interações de hidrogênio, Van der Walls,
iônica e hidrofóbica. Algumas proteínas tanto de procariotos ou eucariotos não possuem a sua
atividade biológica até serem alteradas por algumas (uma ou mais) reações de processamento
chamadas modificações pós-traducionais.
Em eucariotos o mecanismo de tradução é basicamente o mesmo, tendo modificações
nas proteínas iniciadoras e fatores de terminação envolvidos.

1.6 Tecnologia do DNA recombinante

Novas tecnologias desenvolvidas a partir da década de 70 permitiram a análise do
DNA de maneira simples. Hoje é possível o isolamento e a purificação de genes específicos num
processo chamado de clonagem gênica.
O termo clonagem vem da Genética Bacteriana que considera uma colônia de
bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria
inicial.
Diversas metodologias são empregadas para que a seqüência nucleotídica seja
isolada e propagada em moléculas idênticas. Ao conjunto destas técnicas chamamos tecnologia
do DNA recombinante.
Estas metodologias podem ser usadas para estudar mecanismos de replicação e
expressão gênica, na determinação da seqüência de um gene e conseqüentemente da proteína
que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir
substâncias úteis tais como a vacinas, insulina humana, hormônio de crescimento, dentre outros.

2 CLONAGEM MOLECULAR

A clonagem molecular é à base da maioria de todos os procedimentos da engenharia
genética. O objetivo da engenharia genética é isolar uma grande quantidade de genes
específicos ou fragmentos cromossômicos.
A estratégia básica da clonagem molecular é mover o gene de interesse ou a região de
interesse de um genoma complexo para um mais simples. Para isso são empregadas diversas
técnicas para “quebrar” e “ligar” o DNA in vitro.
A clonagem molecular pode ser dividida em etapas:
- Isolamento e fragmentação da “fonte” de DNA. Esta “fonte” pode ser de um genoma
total de um organismo, uma seqüência de DNA sintetizada a partir de um molde de DNA
utilizando–se a enzima transcriptase reversa, uma seqüência de DNA sintetizada por uma
reação em cadeia da polimerase, etc.
- Ligar os fragmentos de DNA em um vetor de clonagem com a enzima DNA ligase.
- Introduzir e manter o novo vetor em um organismo hospedeiro. A molécula de DNA
recombinante é introduzida em um organismo hospedeiro, por exemplo, por transformação de
DNA.
A seguir, estas etapas serão tratadas mais profundamente para a sua melhor
compreensão.

2.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A reação de PCR baseia-se no processo de replicação do DNA (descrito no módulo I)
e seu objetivo final é a amplificação exponencial do DNA. Foi desenvolvida em 1983 por Kary
Mullis, e atualmente é uma técnica usual nos laboratórios de pesquisas médicas e biológicas.
Para a realização de uma reação de PCR são necessários:

 DNA polimerase (DNA pol) termoestável,

 Um par de oligonucleotídeo para iniciar a síntese de DNA,
 Desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs),
 Cátion divalente: toda DNA pol. requer para sua atividade cátion divalente,
usualmente Mg2+,
 Tampão para manter o pH,
 Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl),
 Molde de DNA.
Virtualmente qualquer seqüência de DNA pode ser amplificada para isso são
necessários dois iniciadores complementares às seqüências que flanqueiam o fragmento de
DNA que se deseja amplificar (Figura 28).

Figura 28. Para amplificar uma região de interesse através de uma PCR é necessário
o desenho de oligonucleotídeos
(em vermelho) complementares ao inicio e fim da região que se
deseja amplificar.

Podemos separar a reação de PCR em três etapas:

1) Desnaturação

2) Anelamento
3) Elongação

Trataremos especificamente de cada uma separadamente nas seguintes linhas.

Desnaturação

Na etapa de desnaturação são utilizadas elevadas temperaturas para separar as
moléculas de DNA em duas cadeias simples (Figura 29).

Figura 29. Desnaturação de DNA.
Adaptado de http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/denature.gif

Anelamento

É utilizada uma temperatura por volta de 60ºC para que os oligonucleotídeos
iniciadores pareiem com a seqüência do DNA complementar (Figura 30). Esta temperatura está
relacionada com a constituição dos oligonucleotídeos (porcentagem de bases G e C).

Figura 30. Anelamento dos iniciadores na fita de DNA previamente desnaturada.

Elongação

 Nas reações de PCR utiliza-se DNAs polimerases termoestáveis, estas DNAs
polimerases mantêm sua atividade a altas temperaturas e requerem para seu funcionamento:
o Molécula de DNA - molde
o “Primer” de oligonucleotídeo (iniciador)
o Magnésio
o dNTPs

Por isso estes itens são constituintes da “mistura” para reação de PCR.

Estas etapas: desnaturação  anelamento  elongação são repetidas durante ciclos
existentes na reação de PCR. Usualmente utilizamos por volta de 35 ciclos de amplificação.
Durante estes ciclos o número de fragmentos é amplificado exponencialmente, como observado
na figura 31.

Figura 31. Amplificação exponencial numa reação de PCR
Adaptado de http://users.ugent.be

2.2 Enzimas de Restrição

Determinadas linhagens bacterianas possuem a capacidade de defesa à invasão de
DNA exógeno como, por exemplo, invasão por bacteriófagos (vírus de bactérias). Estas

linhagens clivam o DNA exógeno através de nucleases altamente específicas. A bactéria
protege-se desta clivagem metilando o seu DNA e o diferenciando da molécula exógena.
Estas nucleases são também chamadas de enzimas de restrição ou endonucleases de
restrição e são divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios
de reconhecimento e clivagem. As enzimas do tipo II são as mais importantes na tecnologia do
DNA recombinante e clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento.
O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma seqüência
palindrômica, isto é, ela tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de uma fita é a mesma
da fita complementar, quando lida na direção oposta (Figura 32).

Figura 32. Seqüência palindrômica: seqüência de bases de uma fita é a mesma da fita
complementar quando lida na direção oposta.

As endonucleases de restrição do tipo II reconhecem seqüências específicas e fazem
dois cortes (um em cada fita de DNA). As clivagens podem gerar extremidades abruptas na
seqüência de DNA, quando os dois cortes ocorrem no mesmo eixo de simetria ou extremidades
coesivas quando não são feitos no mesmo eixo de simetria (Figura 33)

Figura 33. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restrição. As setas indicam os
sítios de clivagem.

A nomenclatura para as enzimas de restrição é realizada baseada na abreviação do
nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gênero e as
outras duas letras representam a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que
indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de
restrição denominada de NcoI é isolada de Nocardia corallina, enquanto que a BamHI é isolada
de Bacillus amyloliquefaciens H.
Estas enzimas são utilizadas nas técnicas de tecnologia do DNA recombinante, pois
podem clivar o DNA, deixando extremidades de fita simples e possibilitando a ligação destes
fragmentos. Por exemplo, se desejamos fazer a clonagem de um determinado gene em uma
bactéria podemos usar as enzimas de restrição da seguinte forma:
Ao desenharmos os oligonucleotídeos iniciadores para a amplificação por PCR,
podemos incluir nas suas extremidades sítios para a clivagem por enzimas de restrição. Desta
forma, ao amplificarmos nossa seqüência ela estará flanqueada por um sítio de nosso
conhecimento. Para a ligação deste fragmento num vetor de clonagem, podemos clivar o vetor
com estas enzimas o que vai facilitar e permitir a posterior ligação do fragmento a este vetor.
A digestão com enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes
fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em função de seus
pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 34).

Figura 34. Eletroforese da digestão do gene calmP (GI:94541069) com a enzima PstI.
A digestão gerou dois fragmentos de DNA com tamanhos diferentes que podem ser visualizados
após a corrida em gel de agarose.

2.3 Vetores de clonagem molecular

É possível isolar uma seqüência de DNA tanto por amplificação por PCR quanto por
digestão com enzimas de restrição. Após o isolamento deste fragmento, ele deverá ser
inserido numa outra molécula de DNA que chamamos de vetor.
Um vetor de clonagem é capaz de amplificar a informação genética em centenas de
cópias. Existem diversos tipos de vetores: plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos, YACs etc.
Iremos detalhar um pouco sobre estes vetores nas próximas linhas.

Plasmídeos

São moléculas de DNA extracromossomais que se replicam independente do
cromossomo do hospedeiro. A grande maioria dos plasmídeos conhecidos é dupla fita e circular
(Figura 35), sendo encontrado também plasmídeos lineares. Os plasmídeos que ocorrem
naturalmente variam em tamanho de 1 a mais de 1000 Kbp (1 Kbp = 1000 pares de base). Um
plasmídeo típico é uma molécula circular dupla fita com menos de 1/20 do tamanho do
cromossomo da célula que se encontra. Já foram isolados mais de 300 plasmídeos que
naturalmente ocorrem em cepas de Eschechia coli. Estes plasmídeos podem conferir
características especiais às cepas que o carregam como, por exemplo, resistência a antibiótico,
características de virulências, produção de toxinas.

Figura 35. Plasmídeos
Fonte: http://www.dbio.uevora.pt

Com as técnicas de engenharia genética tornou-se possível a construção de
plasmídeos artificiais e assim transferir material genético a uma nova célula hospedeira.
Os plasmídeos são muito úteis como vetores de clonagem e para isso apresentam
algumas características (Figura 36):
- são pequenos e de fácil manipulação (5 a 400 Kbp),
- possuem uma origem de replicação (O): seqüência de DNA que permita que o vetor
seja replicado na célula hospedeira,
- sítios únicos de clivagem para enzimas de restrição. O conjunto destes sítios é
denominado de Sítio Múltiplo de Clonagem (SMC) e é o local onde o inserto é incorporado ao
vetor de clonagem,
- marca de seleção: possui um gene que codifica um produto que distingue a célula
com plasmídeo da célula sem plasmídeo. Como por exemplo, um gene que confere resistência a
um antibiótico. As células que recebem tais vetores são capazes de crescer em meio contendo o
antibiótico, enquanto que as células que não o receberam acabam morrendo.
- número múltiplo de cópias: podem estar presentes em numerosas cópias tornando
possível a amplificação do DNA.

Figura 36. Esquema de um plasmídeo típico usado em clonagem molecular. O: origem
de replicação, MCS: sítio
múltiplo de clonagem, Resistência a antibiótico.

Bacteriófagos
Durante a transfecção especializada de fagos algumas vezes genes do hospedeiro
podem ser incorporados no genoma do bacteriófago. Os bacteriófagos ou fagos são vírus que
infectam especificamente as bactérias.
Fagos podem então ser utilizados como vetor de clonagem e são de particular
interesse porque podem suportar seqüências maiores que os plasmídeos e podem ser
eficientemente empacotado em partículas de fagos:

Os fagos possuem uma estrutura bastante simples:
- uma molécula de DNA (ou ocasionalmente RNA),
- Envelope protetor,
- Capsídio composto por moléculas protéicas.

O bacteriófago lambda possui uma genética molecular bastante conhecida, possui um
mapa gênico complexo e um grande número de genes. A figura 37 mostra as características
essenciais do genoma do fago lambda “selvagem” e as modificações realizadas para seu uso
como vetor de clonagem.

Figura 37. Clonagem molecular com lambda. Mapa genético abreviado do bacteriófago
lambda. Charon 4 é um vetor derivado de lambda. Uma substituição é o gene beta-gal que
codifica para a enzima beta-galactosidase que permite a seleção de clones contendo este fago.
As setas indicam sítios de restrição reconhecidos pela enzima EcoRI. Baseado em Brock Biology
of microorganisms, 2003.

Uma clonagem típica em bacteriófago lambda ocorre como mostrada na figura 38.

Figura 38. Clonagem em bacteriófago. Adaptado de Brock Biology of microorganisms,
2003

A maioria dos organismos vivos é infectada por vírus e como tal, estuda-se a
possibilidade de os vírus poderem ser utilizados como veículos de clonagem para organismos
superiores. Isto é especialmente importante quando se sabe que apenas as bactérias possuem
plasmídeos.
O potencial dos vírus como vetores de clonagem para células animais é enorme, e a
quantidade de vírus estudados para este fim tem vindo a aumentar consideravelmente nos
últimos anos, tendo, no entanto recebido mais atenção alguns vírus de mamíferos tais como o
Simian vírus 40 (SV40), o Adenovirus e o Baculovirus.
Cosmídeos
São vetores resultantes da hibridação entre uma molécula de DNA de um fago e um
plasmídeo bacteriano. Devem esta designação ao fato de possuir apenas o sítio cos
(extremidades coesivas) do genoma do bacteriófago lambda. Esse sítio é necessário para o
empacotamento do cosmídeo em virions lambda e para serem transfectados em E. coli.
Um cosmídeo é basicamente um plasmídeo que contém um local cos. Precisa de um
marcador selecionável, tal como o gene de resistência à ampicilina e uma origem de replicação
plasmídica.

Figura 39. Cosmídeo. Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br

Podem ser utilizados para clonar grandes fragmentos de DNA e permite o
armazenamento desta informação em fagos que são mais estáveis que plasmídeos, portanto o
DNA recombinante pode ser armazenado por longos períodos.

YAC (Cromossomo artificial de levedura)
YAC pode ser considerado um cromossomo artificial e inclui três seqüências
específicas de DNA que permitem a sua propagação de uma célula para a sua prole. O
desenvolvimento dos YACs foi uma conseqüência da pesquisa feita em torno da estrutura dos
cromossomos eucarióticos. Graças a esse trabalho foi possível identificar os comportamentos-
chave de um cromossomo como sendo:
1. Centrômero, que é necessário para a distribuição correta do cromossomo
para as células filhas durante a divisão celular,
2. Dois telômeros, as estruturas nas extremidades de um cromossomo, que
são necessários para que as extremidades sejam replicadas de forma correta e que também
previnem que o cromossomo seja "clivado" pelas exonucleases,
3. As origens de replicação, que são os locais ao longo do cromossomo onde
a replicação do DNA se inicia e que são semelhantes às origens de replicação dos plasmídeos.
Um YAC, além de conter estas três regiões contém ainda uma marca de seleção e sítio
para enzimas de restrição.

Figura 40. Clonagem em YAC. Fonte: www.accessexcellence.org

Enquanto a clonagem em plasmídeos permite a inserção de fragmentos de
aproximadamente 10 Kbp, a clonagem em YAC permite a inserção de fragmentos com mais de
1Mbp.
O estímulo inicial no desenvolvimento de cromossomos artificiais veio dos geneticistas
de leveduras que queriam utilizá-los para estudar vários aspectos da estrutura e do
comportamento dos cromossomos. Um exemplo foi o estudo da segregação dos cromossomos
durante a meiose. Estas experiências determinaram que os cromossomos artificiais podem ser
propagados de forma estável em células de leveduras e, aumentaram a possibilidade deles
poderem ser utilizados como veículos para genes demasiadamente grandes para serem
clonados como um fragmento único num vetor de E. coli. Muitos genes importantes de
mamíferos têm um comprimento superior a 100 Kb, ultrapassando assim a capacidade da
maioria dos sistemas de clonagem de E. coli, mas bem dentro do raio de um vetor YAC.

Os YACs abriram deste modo o caminho a estudos das funções e modos de expressão
de genes que antes não eram possíveis de serem analisados pelas técnicas de DNA
recombinante. Foi recentemente proporcionada uma nova dimensão para estas experiências
com a descoberta de que, sob certas circunstâncias, os YACs podem ser propagados em células
de mamíferos, permitindo assim a análise funcional no organismo onde o gene normalmente
reside.

2.4 Ligação

No módulo I vimos que in vivo a enzima DNA ligase catalisa a ligação fosfodiéster
entre dois nucleotídeos e requer um grupo OH livre na extremidade 3´de uma das cadeias de
DNA e um grupo fosfato na extremidade 5´da outra cadeia.
Vimos neste módulo que é possível digerir um fragmento e um vetor de clonagem com
a mesma enzima de restrição, desta forma as extremidades destes serão complementares. O
que falta agora para que tenhamos o vetor de clonagem que desejamos é a ligação entre o
fragmento e do vetor.
Como dissemos existem enzimas de restrição que são capazes de gerar fragmentos
com extremidades coesivas e outras com extremidades abruptas.
A ligação de fragmentos com extremidades coesivas permite que dois fragmentos se
liguem facilmente através das pontes de hidrogênio formadas pelas bases complementares.
Já a ligação de extremidades abruptas é menos eficiente que a ligação entre
extremidades coesivas. É necessária uma concentração maior de DNA ligase e dos fragmentos
que se deseja ligar.
Para aumentar a eficiência da ligação pode se utilizar alguns processos:
1) Adição de polidesoxi(A) na extremidade 3´de um fragmento de DNA e
polidesoxi(T) na extremidade 3´do outro fragmento de DNA, através da enzima desoxinucleotidil
transferase terminal (Figura 41).

Figura 41. Métodos para auxiliar a ligação de extremidades abruptas.
Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/apostila/apost2.htm

2) Adição de adaptadores às extremidades coesivas: os adaptadores são
oligonucleotídeos sintéticos e complementares que contém sítios de clivagem para uma ou mais
enzimas de restrição. Eles são unidos ao DNA com o auxílio da DNA ligase (Figura 42).

Figura 42. Métodos para auxiliar a ligação de extremidades abruptas.
Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/apostila/apost2.htm

2.5 Transformação bacteriana

Transformação genética é
um processo em que uma molécula livre de DNA é
incorporada em uma célula receptora e causa uma mudança genética. Existe um número de
procariotos que são naturalmente transformáveis.
Uma célula que é capaz de adquirir uma molécula de DNA e ser transformada é dita
competente. A competência em bactérias naturalmente transformáveis é regulada por algumas
proteínas que têm papel importante em adquirir e processar o DNA.
Em laboratório, a transformação também pode ser realizada e é uma importante
ferramenta para clonagem molecular. Basicamente, existem dois procedimentos para realizar a
transformação bacteriana em um laboratório de biologia molecular: a eletroporação e a
transformação por choque térmico.

A eletroporação é uma técnica na qual se misturam bactérias e o vetor em um único
tubo e aplica-se um choque elétrico na mistura, com o objetivo de desestabilizar a membrana e
permitir a entrada do vetor na bactéria. Ela é então rapidamente transferida para meio de cultura
e incubada a 37ºC para que possa se recuperar após o choque.
A transformação por choque térmico tem o mesmo objetivo. As bactérias utilizadas em
laboratório não são naturalmente competentes e se tornam competentes quando tratadas em
soluções contendo íons de carga positiva (cloreto de cálcio, cloreto de rubídio). Os íons de carga
positiva têm a função de neutralizar as cargas negativas do DNA e da membrana bacteriana,
facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do choque térmico.
Para o choque térmico, o vetor e a bactéria competente são incubados e sofrem um
choque térmico. Após a transformação, as bactérias são incubadas em condições adequadas
para que possam se multiplicar e, a seguir, plaqueadas em meio sólido, para que colônias
possam ser isoladas.

2.6 Transfecção

A transfecção é um processo onde o DNA é transferido de uma célula para outra
através a ação de vírus.
O padrão geral de infecção/contaminação é constituído de três etapas:
1. O fago liga-se ao exterior da bactéria e injeta o seu DNA cromossômico
para o interior desta.
2. A molécula de DNA do fago é replicada, normalmente por ação de enzimas
codificadas pelos genes presentes no cromossomo do fago.
3. Outros genes do fago orientam a síntese dos componentes protéicos do
capsídio, levando à montagem de novos fagos e posterior libertação da bactéria.

Em alguns tipos de fagos um ciclo completo de infecção decorre muito rapidamente,
possivelmente em menos de 20 minutos. Este tipo de infecção rápida é chamada de ciclo lítico,
pois a libertação dos novos fagos está associada à lise da célula bacteriana. A característica
principal de um ciclo lítico de infecção é que a replicação do DNA do fago é seguida
imediatamente pela síntese de proteínas do capsídio, e a molécula de DNA do fago nunca se
mantém numa condição estável na célula hospedeira.
Em contraste com o ciclo lítico, a infecção lisogênica é caracterizada pela retenção da
molécula de DNA do fago na bactéria hospedeira, possivelmente durante milhares de divisões
celulares. Com a presença de muitos fagos lisogênicos o DNA do fago é inserido no genoma da
bactéria de uma forma similar á inserção epissômica.
A forma integrada do DNA do fago (chamado o profago) é quiescente e a bactéria que
transporta o profago não se consegue normalmente distinguir, em termos fisiológicos de uma
célula não infectada. Contudo, o profago é eventualmente libertado do genoma hospedeiro e o
fago volta ao modo lítico e provoca a lise da célula. O ciclo de infecção de fago lambda, um fago
lisogênico típico é mostrado na figura 43.

Figura 43. Ciclo lisogênico de infecção de um bacteriófago lambda.

Após a inserção do vetor desejado na célula hospedeira, seja por eletroporação,
choque térmico ou transfecção. Colônias crescerão e serão selecionadas para a extração do
vetor e posterior seqüenciamento do DNA do vetor para verificar se a seqüência clonada neste
vetor está correta. Para garantir que não há nenhuma mutação que acarrete numa falha na
tradução da proteína desejada.
Nos próximos itens, os métodos de seqüenciamento manual e automático de DNA
serão discutidos. O protocolo de extração de DNA plasmidial (DNA do vetor) será descrito no
módulo IV.

2.7 Seqüenciamento manual

Dois procedimentos distintos para o seqüenciamento de DNA foram desenvolvidos em
meados da década de 70: o método desenvolvido por Maxin e Gilbert e o método desenvolvido
por Sanger e colaboradores.
O método de Maxin e Gilberto utiliza reagentes químicos que clivam o DNA
preferencialmente em uma das bases nitrogenadas. No entanto, o método mais utilizado no
momento é o método desenvolvido por Sanger e colaboradores, também conhecido por método
dideoxi.
Neste método a seqüência é determinada através da cópia de uma fita simples de DNA
a partir de um iniciador utilizando a enzima DNA polimerase.
Para a reação de seqüenciamento utiliza-se: DNA molde (DNA a ser seqüenciado), um
oligonucleotídeo iniciador, Klenow da DNA polimerase I e uma mistura de desoxinucleotídeos
trifosfatos (dNTP), sendo um deles marcado com 32P ou 35S.
A reação de seqüenciamento se difere de uma reação de PCR, dentre os motivos pelo
fato de que no processo são realizadas quatro reações independentes, sendo que em cada uma
delas é adicionado um tipo de dideoxinucleotídeo (ddNTP). O ddNTP não possui o resíduo

3´hidroxil e o crescimento da cadeia é interrompido quando um ddNTP é adicionado ao invés de
um dNTP.
Em cada reação, um número muito grande de moléculas de fita complementar está
sendo copiado simultaneamente. No entanto, em um dado momento da extensão, uma pequena
porcentagem de moléculas irá incorporar um ddNTP e neste caso a reação de alongamento da
cadeia será automaticamente interrompida naquele sítio, devido à ausência do grupamento 3'OH
do ddNTP. Por outro lado, em outras moléculas a reação de extensão continua a ocorrer até que
um ddNTP seja incorporado.
Sendo assim, em cada uma das quatro reações, haverá fragmentos de todos os
tamanhos sendo que todos eles têm início comum, ou seja, adjacente ao iniciador.
Os fragmentos são separados por eletroforese e a posição das bandas radioativas
determinadas por auto-radiografia. Sabendo o tamanho do fragmento e qual o nucleotídeo foi
que incorporado na sua extremidade 3, é capaz determinar a seqüência de DNA.

Figura 44. Seqüenciamento de nucleotídeos pelo método dideoxi.
Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br

2.8 Seqüenciamento automático

A demanda de projetos envolvendo seqüenciamento de genomas inteiros levou ao
desenvolvimento de sistemas automáticos de seqüenciamento. O desenvolvimento e utilização
de seqüenciadores automáticos tornam mais eficientes e rápidos o seqüenciamento de DNA na
medida em que as etapas de leitura do gel e o processamento de seqüências são realizados
através de computadores.
A reação de seqüenciamento automático também é baseada no método que utiliza ddNTPs, no
entanto ao invés de marcá-los radioativamente e ser necessário quatro tubos de reação distintos,

os nucleotídeos estão marcados com fluorocromos (substâncias fluorescentes). Quatro
diferentes fluorocromos são empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz
em diferentes comprimentos de onda. Assim, uma vez que em cada uma das reações (A, T, C,
G) foi empregado um fluorocromo diferente é possível juntar estes produtos e realizar a corrida
em uma única
raia do gel de seqüenciamento. Os produtos da reação de seqüenciamento,
marcados com os fluorocromos, ao serem submetidos à eletroforese passam pelo feixe de laser,
que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos é detectada por um
fotomultiplicador e a informação é processada através de um computador (Figura 45).

Figura 45. Seqüenciamento automático de DNA. As reações com os diferentes
dideoxinucleotídeos são realizadas, sendo que cada ddNTP está marcado com um fluorocromo
diferente. Os produtos de reação são agrupados e submetidos à eletroforese em uma única raia
de gel de seqüenciamento, no seqüenciador automático. À medida que os fragmentos passam
pelo feixe de laser, os fluorocromos são excitados e a luz emitida é detectada por um
fotomultiplicador. Esta informação é traduzida na forma de seqüência através de um computador.
Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br

A construção de bibliotecas tem como objetivo a busca por um gene específico,
desenvolvimento dos projetos genomas e etc. Para a construção das bibliotecas são necessários
o inserto e o vetor. Os vetores utilizados podem ser, por exemplo, plasmídeos, fagos, YACs e
cosmídeos.
O passo inicial para a construção de uma biblioteca é a clonagem molecular. Portanto,
a construção de uma biblioteca empregará inicialmente todas as técnicas vistas no módulo II.
Nos itens 3.1 e 3.2 iremos discutir a construção e o uso de biblioteca de cDNA e
biblioteca genômica.

3 CONSTRUÇÃO E USO DE BIBLIOTECA DE CDNA RECOMBINANTE

DNA complementar (cDNA) é uma molécula de DNA sintetizado a partir de um molde
de mRNA maduro. A reação de síntese do cDNA é catalisada pela enzima transcriptase reversa,
uma DNA polimerase dependente de RNA (Figura 35). A descoberta desta enzima encontrada
predominantemente em vírus de RNA de tumor, tornou possível a síntese in vitro de DNA
usando mRNA como molde.

Figura 35. Síntese de cDNA.

Essa enzima reconhece uma fita simples de RNA e gera uma seqüência de DNA
complementar. Diversos métodos foram descritos para síntese de cDNA, a seguir iremos
apresentar um destes métodos que é amplamente usado:
1) In vivo ocorre o processo de transcrição (Figura 36).

Figura 36. Processo de transcrição de DNA.

2) Em eucariotos ocorre o processamento do transcrito primário com adição do CAP,
excisão dos íntrons e poliadelinação (Figura 37).

Figura 37. Processamento do transcrito primário a mRNA maduro. Adição do CAP, cauda poliA,
excisão dos íntrons e união dos éxons.

3) É realizada a extração de mRNA maduro da célula.
4) É feita a reação para a síntese de cDNA tendo como molde os mRNA extraídos da
célula. Um primer (oligonucleotídeo iniciador) poliT é hibridado com a cauda poliA do mRNA
maduro. A transcriptase reversa é adicionada junto com os dNTP´s (A, T, G, C) (Figura 38).

Figura 38. Síntese de cDNA utilizando a enzima transcriptase reversa.

5) Após a reação de síntese de cDNA, a mistura é incubada com a enzima Rnase H. Esta
enzima digere a fita de RNA hibridada com DNA (Figura 39).

Figura 39. Digestão com a enzima Rnase H.

6) A DNA polimerase utiliza como "primer" os fragmentos de RNA não digeridos pela
Rnase H para a síntese de uma nova fita de DNA, resultando em uma molécula de cDNA de fita
dupla (Figura 40).

Figura 40. Síntese cDNA fita dupla.

7) O cDNA fita dupla é tratado com T4 polimerase. A atividade 3'-5' exonuclease dessa
enzima é usada para remover possíveis nucleotídeos extras nas extremidades 3' do cDNA.
Ao final destas reações temos uma molécula fita dupla oriunda de um molde de
RNA.
Com a síntese de cDNA tornou-se prático estudar os genes expressos pelas células
num dado momento ou sob uma certa condição.
Vimos no módulo I que a tradução do mRNA leva a síntese de uma proteína. Então se
conseguirmos isolar o mRNA de uma célula e sintetizarmos o seu cDNA, ao analisarmos estas
seqüências saberemos quais proteínas poderiam estar sendo sintetizadas em determinado
momento ou condição. Para isto são construídas as bibliotecas de cDNA que contém apenas os
genes expressos pelas células empregadas na extração de mRNA.
A síntese e clonagem de cDNA é amplamente utilizada pela industria farmacêutica e
de alimentos para:
- isolar mRNA de células ou tecidos de interesse para estudo,

- transcrição e tradução de proteínas de eucariotos superiores em bactérias e outros
microorganismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídios importantes,
- determinação da seqüência do mRNA e dedução da seqüência de aminoácidos da
proteína por ele codificada. Isso tem resultado na identificação da seqüência de uma enorme
quantidade de proteínas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas genética ou
bioquimicamente.
A construção de bibliotecas de cDNA envolve as seguintes etapas:
1) Síntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros isolados do
tecido de interesse.
2) Preparo dos cDNAs para a ligação com o vetor escolhido. O fago lambda tem sido o
vetor de escolha para a construção de bibliotecas de cDNA, devido a sua eficiência em
comparação com os plasmídeos.e por serem mais fáceis de serem manipuladas do que
bibliotecas em plasmídeos. Entretanto, uma desvantagem dos vetores lambda é que não são
favoráveis para procedimentos de sequenciamento do DNA e de mutagênese dirigida.
3) Introdução dos cDNA recombinantes nas células hospedeiras, onde serão
replicados. Isto resultará na amplificação dos organismos recombinantes e dependendo do vetor
utilizado, na expressão das proteínas codificadas pelas mensagens que deram origem aos
cDNAs.
Após a infecção da bactéria com os cDNA recombinantes temos como produto uma
biblioteca de cDNA, que deve conter cópias de toda as seqüências de mRNA da população
original. Essa biblioteca pode ser estocada na geladeira, ou submetida a uma triagem em busca
de um clone de interesse.

3.1 Biblioteca genômica

Uma biblioteca genômica deve conter clones, portando fragmentos de DNA
representantes de todo genoma do organismo em questão. O objetivo de sua construção é a
obtenção de informações sobre a estrutura molecular de um gene.
A estrutura molecular de um gene em eucariotos (Figura 41) é composta por:
- Unidade de transcrição
- regiões flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expressão
desse gene.

Figura 41. Estrutura de um gene.

No caso das bibliotecas de cDNA apenas a unidade de transcrição é clonada, nas
bibliotecas genômicas as regiões flanqueadoras também o são.
A estratégia básica na construção de bibliotecas genômicas busca clonar fragmentos
de maior tamanho possível para ser necessário um número menor de clones para representar o
genoma inteiro de um organismo, e maximizar a eficiência da clonagem, através da utilização de
vetores baseados no fago.
Basicamente, a construção da biblioteca genômica envolve os seguintes passos:
1) Isolamento de DNA de alto peso molecular, que é posteriormente quebrado de modo
a produzir fragmentos de tamanho compatível com o vetor de clonagem.
2) Ligação desses fragmentos no vetor e introdução dos recombinantes obtidos nas
células hospedeiras.

Para que uma biblioteca genômica seja representativa é necessário que ela tenha um
dado número de clones (ou seja, que tenha todos os
genes daquele organismo) e que seja
construída com geração aleatória dos fragmentos, para que não haja exclusão sistemática de
nenhuma seqüência.
A digestão parcial do DNA é uma maneira de conseguir a fragmentação aleatória do
DNA e produz fragmentos com pontas coesivas e que, portanto, podem ser diretamente ligados
ao vetor.
Para garantir que a digestão atinja todo o genoma são utilizadas enzimas de restrição
que cortam frequentemente o DNA e que não apresentam desvios de preferência de sítios.
Após a digestão parcial do DNA este será ligado no vetor previamente digerido com a
mesma enzima de restrição.

Figura 42. Resumo da construção de bibliotecas genômicas.

Fagos lambda e cosmídeos são os dois tipos de vetores comumente usados na
construção de bibliotecas genômicas. Nos dois casos, fragmentos grandes de DNA gerados por
fragmentação aleatória são ligados com o DNA do vetor para formar concatâmeros que podem
então ser empacotados em partículas de fago lambda.

3.2 Clonagem

A palavra clone foi introduzida na língua inglesa no início do século XX e tem origem
da palavra grega klon, que quer dizer broto de um vegetal. De acordo com Webber (1903), um
clone é definido como uma população de moléculas, células ou organismos que se originaram de
uma única célula e que são idênticas à célula original e entre elas.
As bactérias têm uma estrutura mais simples do que os eucariontes (A) e seu processo
de reprodução também é mais simples. As bactérias que se dividem por bipartição, se
reproduzem da seguinte forma (ver figura 43):
1) O filamento de DNA começa por fixar-se a uma invaginação da membrana
plasmática e duplica-se (B).
2) A membrana plasmática distende-se, acompanhando o alongamento da célula e
separando os filamentos de DNA (C).
3) Duplicação do tamanho celular e separação dos filamentos de DNA.
4) Invaginação da membrana plasmática para isolar as duas novas células (D).
5) Formação de uma nova parede celular e os dois indivíduos separam-se (E).

Figura 43. Reprodução assexuada por bipartição.
Fonte: http://www.cientic.com

Neste tipo de reprodução assexuada temos a origem de dois organismos que são
clones um do outro. Nos animais ocorre naturalmente quando surgem gêmeos univitelinos.
Neste caso ambos os novos indivíduos gerados tem o mesmo patrimônio genético, pois são
originados da fecundação de um mesmo óvulo e espermatozóide.

Figura 44. Fecundação e desenvolvimento de gêmeos univitelinos. Verificar que apenas um
óvulo e um espermatozóide originam dois seres vivos que são idênticos. Fonte:
www.mombaby.org/UserFiles/File/TTTS.html

Nos módulos anteriores falamos sobre clonagem molecular. Nesta técnica há a
transformação de hospedeiros (como bactérias) com vetores que contêm seqüências de DNA
que vão produzir alguma característica desejada. Por exemplo, se clonarmos a seqüência de
nucleotídeos que codifica para a enzima insulina e transformarmos uma linhagem de E. coli com
este vetor. Obteremos linhagens de E. coli que são capazes de produzir insulina. Como as

bactérias se reproduzem assexuadamente e rapidamente, há a produção em larga escala de
insulina recombinante.
Em humanos e animais, no entanto, o processo de clonagem é mais complexo e será
tratado nas próximas linhas.
Os gametas ou células sexuais são as células dos seres vivos que, na reprodução
sexual, se fundem no momento da fecundação para formar um ovo ou zigoto, que dará origem
ao embrião, cujo desenvolvimento produzirá um novo ser da mesma espécie.
Os gametas são células haplóides, ou seja, têm apenas um conjunto de cromossomos,
uma vez que são produzidos por meiose, enquanto que o zigoto é diplóide.

Figura 45. Formação das células sexuais em humanos. Sexo masculino (esquerda) e sexo
feminino (direita). Fonte: http://www.rincon.com.br/

A partir da fertilização do óvulo, começa um processo para a formação do embrião a
partir do zigoto. Este processo é chamado embriogênese.
Logo após a fecundação, a primeira célula resultante da fusao do óvulo e do
espermatozóide começa a se dividir (Figura 45).

Figura 45. Embriogênese – divisão celular.

Pelo menos até a fase de oito células, cada uma delas é capaz de se desenvolver em
um ser humano completo e são chamadas de totipotentes.
Na fase de 8 a 16 células, as células do embrião se diferenciam em dois grupos: um
grupo de células externas e outro de celular internas. As células externas irão originar a placenta
e anexos embrionários, e as células internas irão originar o embrião propriamente dito.
Após 72 horas, este embrião agora com cerca de 100 células é chamado de blastocisto
(Figura 46). É nesta fase que ocorre a implantação do embrião na cavidade uterina. As células
internas do blastocisto vão originar as centenas de tecidos que compõem o corpo humano. São
chamadas de células-tronco embrionárias pluripotentes.

Figura 46. Blastocisto. Adaptado de www.departments.weber.edu/.../blastocyst.html

A partir de um determinado momento, essas células, que são chamadas de células
somáticas começam a diferenciar-se nos vários tecidos que vão compor o organismo: sangue,
fígado, músculos, cérebro, ossos, etc. O mecanismo de controle desta diferenciação ainda não é
conhecido.
As células somáticas perdem a capacidade originar qualquer tecido a partir do
momento que se diferenciam. A partir de então elas irão ser capazes de originar apenas células
iguais as que a elas. Células de fígado vão originar células de fígado, células musculares vão
originar células musculares e assim por diante.
As células somáticas se dividem apenas por mitose. Na mitose, uma célula mãe origina
duas células filhas, cada uma das quais é uma cópia exata da progenitora.

Figura 47. Mitose.
Baseado em http://www.iq.unesp.br

Estas células chamadas somáticas diferem das células sexuais (espermatozóide e
óvulo) ao possuírem 46 cromossomos. As nossas células sexuais possuem 23 cromossomos.
Apesar do número de genes ser igual em todas as células do nosso corpo, os genes nas células
somáticas diferenciadas se expressam de maneiras diferentes em cada tecido, isto é, a
expressão gênica é específica para cada tecido. Exceto para os genes responsáveis pela
manutenção do metabolismo celular (housekeeping genes) que se mantêm ativos em todas as
células do organismo, só irão funcionar em cada tecido ou órgão os genes importantes para a
manutenção deste. Os outros se mantêm "silenciados" ou inativos.
A clonagem é um método científico artificial de reprodução que utiliza células
somáticas no lugar do óvulo e do espermatozóide.

Na natureza, os seres vivos se reproduzem através de células sexuais e não por
células somáticas. As exceções deste tipo de reprodução são os vírus, as bactérias e diversos
seres unicelulares.
A clonagem em laboratório pode ser feita, basicamente, de duas formas:
1) separando-se as células de um embrião em seu estágio inicial de multiplicação
celular,
2) substituindo o núcleo de um óvulo por outro proveniente de uma célula de um
indivíduo já existente.
A primeira forma, separação das novas células de um embrião, produzirá novos
indivíduos exatamente iguais, quanto ao patrimônio genético, porém diferentes de qualquer outro
já existente. É um processo semelhante ao que ocorre na natureza na geração de gêmeos
univitelinos.
Em 1902, Hans Spermann realizou a primeira tentativa de clonagem utilizando este
tipo
de procedimento utilizando a salamandra como modelo animal. Em 1935, ganhou o prêmio
Nobel pelas suas pesquisas sobre o efeito organizador no desenvolvimento embrionário.
A segunda forma de clonagem é a que reproduz assexuadamente um indivíduo igual a
outro pré-existente, pela substituição do material nuclear e foi proposta teoricamente por Hans
Spemann, em 1938. O primeiro experimento com sucesso foi realizado em 1952, pelos Drs.
Robert Briggs e Thomas J. King, do Instituto Carnegie/Washington-EEUU. Eles obtiveram os
primeiros clones de rãs, por substituição de núcleos celulares.
A transferência nuclear da célula somática inicia-se com a remoção do núcleo do óvulo
de uma doadora. Uma célula contendo DNA é então retirada da pessoa que está sendo clonada.
O óvulo sem núcleo é fundido com a célula contendo do DNA do ser clonado por meio de
eletricidade. Forma-se então um embrião, que é implantado na mãe de aluguel, aquela que
forneceu o óvulo. Caso o procedimento seja bem-sucedido, a mãe de aluguel dará à luz a uma
cópia exata da pessoa clonada (de quem foi retirado a célula com DNA) ao fim de um período
normal de gestação.

A figura abaixo explica como funciona a transferência nuclear da célula somática no
processo de clonagem em humanos:

Figura 48. Clonagem de humanos utilizando a técnica de substituição de núcleo.
Fonte:http://www.10emtudo.com.br

Em 1996, o Prof. Ian Wilmut e seus colaboradores, do Roslin Institute, de
Edimburgo/Escócia, associados à empresa PPL, realizaram uma substituição de núcleo de um
óvulo pelo de uma célula mamária proveniente de uma ovelha adulta. O resultado foi o
nascimento da ovelha Dolly.

A clonagem utilizando este procedimento é muito difícil, para a clonagem da ovelha
Dolly, foram utilizados 834 núcleos de células de animais adultos e de fetos e feitas 276
tentativas. De todos os 156 óvulos implantados, somente 21 se desenvolveram e apenas 8
animais nasceram. Destes, apenas um único (Dolly) era oriundo de um núcleo de uma célula de
um animal adulto.
Para a criação da Dolly, pesquisadores transplantaram o núcleo de uma glândula
mamária de uma ovelha Finn Dorsett num óvulo desprovido de núcleo de uma ovelha blackface
escocesa. A fusão do núcleo ao óvulo foi realizada por meio de eletricidade e a nova célula foi
implantada no útero de uma ovelha blackface. Alguns meses depois nasceu a ovelha Dolly. Ela é
geneticamente idêntica à ovelha Finn Dorsett e não à blackface (mãe de aluguel).

Figura 49. Clonagem da ovelha Dolly.
Fonte: www.ghente.org

A ovelha Dolly herdou da ovelha Backface o DNA mitocondrial e da ovelha branca o
DNA contido nos cromossomos do núcleo da célula mamária, portanto não era tão idêntica a
ovelha doadora.

Figura 50. À esquerda ovelha da raça Finn Dorsett e a direita ovelha da raça Scottish Blackface.
Fonte: www.ghente.org

A ovelha Dolly foi sacrificada com seis anos de idade após diagnosticar problemas
pulmonares progressivos. Os problemas de artrite e pulmão que a ovelha Dolly sofreu nos seus
últimos meses de vida levantaram novas questões na discussão da clonagem.
Uma ovelha pode viver de 11 a 12 anos, infecções como a verificada na Dolly são
comuns em animais mais velhos, de acordo com o instituto Roslim, na Escócia. O telômero (ver
módulo I) pode ter sido a causa do envelhecimento precoce do animal. Por isso, diversas
pesquisas estão sendo feitas em cima deste tema.
Entre os diferentes defeitos observados nos pouquíssimos animais que nasceram vivos
após inúmeras tentativas, observa-se: telômeros encurtados; placentas anormais; gigantismo em
ovelhas e gado; defeitos cardíacos em porcos; problemas pulmonares em vacas, ovelhas e

porcos; problemas imunológicos; falha na produção de leucócitos; defeitos musculares em
carneiros.
É interessante que dentre todos os mamíferos que já foram clonados, a eficiência é um
pouco maior em bezerros (cerca de 10% a 15%). Por outro lado, ainda não se tem notícias de
clonagem de macaco ou cachorro. Talvez seja por isto que a cientista inglesa Ann McLaren
afirme que as falhas na reprogramação do núcleo somático podem se constituir em uma barreira
intransponível para a clonagem humana.
Mesmo assim, pessoas como o médico italiano Antinori ou a seita dos raelianos
defendem a clonagem humana, um procedimento que tem sido proibido em vários países.
Mesmo com o avanço das técnicas de clonagem, a clonagem de seres humanos ainda
está muito longe de acontecer. Tanto devido a alguns limites científicos quanto a questão ética e
religiosa. As religiões, principalmente cristãs, colocam-se radicalmente contra qualquer
experiência neste sentido e os governos de vários países proíbem por considerar um desrespeito
a ética do ser humano.
O fato é que apenas a possibilidade de obtenção de clones humanos já levanta
questões como:
Por que clonar?
Quem deveria ser clonado?
Quem iria decidir?
Quem será o pai ou a mãe do clone?
O que fazer com os clones que nascerem defeituosos?

3.2.1 Os Prós da Clonagem Humana

O processo de clonagem pode ser usado para ajudar pessoas com sérios problemas
médicos. Por exemplo, cientistas poderiam clonar as células de uma pessoa e consertar genes
mutantes que causam doenças. Em janeiro de 2001, o governo britânico sancionou leis

permitindo a duplicação de embriões humanos com fins específicos na pesquisa de doenças,
Parkinson e Alzheimer.
Um dos propósitos da clonagem humana é a clonagem terapêutica (ver módulo IV).
Este caso visa a produção de células-tronco que são capazes de evoluir para diversos tipos de
células do corpo. A produção de células usando células-tronco do próprio paciente acaba com os
riscos de rejeição do transplante pelo corpo da pessoa.
A clonagem humana pode também ser utilizada por casais que não conseguem ter
filhos, mas que desejam ter filhos que possuam atributos biológicos de pelo menos um dos pais.
O propósito mais polêmico de clonagem humana é o de replicar pessoas que já
faleceram.

3.3.2 Os Contras da Clonagem

Quase 98% das tentativas de clones não obtêm sucesso. Os embriões geralmente não
são adequados para serem implantados no útero, ou morrem durante a gestação ou pouco antes
do nascimento. E ainda os que sobrevivem geralmente não têm uma vida longa ou saudável.
Normalmente têm problemas com órgãos tais como o coração, sofrem de sistema imunológico
fraco e morrem pouco após o nascimento. E por que o mesmo não poderia acontecer com os
clones humanos? As crianças poderiam morrer no parto, nascer com deficiências físicas, e
provavelmente faleceriam prematuramente.
A seguir a tabela II resume alguns pontos positivos e negativos da clonagem:
TABELA II. Prós e contras da clonagem humana
Pontos positivos Pontos negativos

Utilização da técnica de clonagem para
obtenção de células tronco a fim de
restaurar a função de um órgãos ou
Técnica de baixa eficiência.
Vários fetos morrem durante a gestação

75
tecido.
A clonagem "terapêutica" teria a vantagem
de não oferecer riscos de rejeição se o
doador fosse a própria pessoa.
Diminuição ou fim do tráfico clandestino
de órgãos
Ajudar casais inférteis que não podem ter
filhos, mesmo após anos de tratamento de
infertilidade.
Melhoramento animal, resgate de material
genético, maximização do potencial
genético de uma raça.

ou logo após o nascimento.
Grande número de anomalias
Envelhecimento Precoce
Os clones seriam maiores do que o
normal, denominado de síndrome