Prática Extraccao_de_DNA_Genet Protocolo

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Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra 
Departamento de Ciências da Vida 
Genética 
 
 
Protocolo: Extracção de DNA em Tecidos Vegetais 
 
 
 
A principal etapa da análise genética de populações de plantas, através 
de fragmentos de DNA, é o isolamento e a purificação de quantidades 
suficientes de DNA de boa qualidade ou seja, o DNA obtido deve estar 
intacto, livre de impurezas, e ser passível de amplificação. 
O método de extração de DNA mais utilizado para diferentes espécies 
vegetais é baseado no uso do detergente CTAB - Cationic hexadecyl trimethyl 
ammonium bromide, um detergente que solubiliza as membranas celulares e 
forma um complexo com o DNA (Kidwell & Osborn, 1992). Existem hoje em 
dia, kits de extracção de DNA, com todos os reagentes adequados, já nas 
concentrações correctas, para que se possa realizar a extracção de forma 
mais simples e segura. 
Uma das importantes considerações em qualquer procedimento de extracção de DNA de plantas é a 
maneira como se recolhe e preserva o tecido vegetal, pois a quantidade e a qualidade do DNA são 
afectadas significativamente pela condição do tecido antes da extracção. Os tecidos onde normalmente se 
obtêm melhores resultados na extracção de DNA de tecidos vegetais são: folhas ou pétalas jovens e frutos 
maduros (material recolhido na fase activa de crescimento). 
 
Principais etapas da extracção de DNA: 
 
Quebra da parede celular 
 
 
Lise celular 
 
 
Extracção de DNA 
 
 
Precipitação de DNA 
 
 
Lavagem de DNA 
2 
 
Material: 
 
 Tecido vegetal fresco 
 Balança 
 Almofariz e pilão 
 Espátula 
 Tubos de centrifugação de polipropileno 
 Misturador rotativo 
 Centrifuga 
 Pipetas 
 Banho de água 
 
Reagentes: 
 Clorofórmio 
 Isopropanol 
 Etanol 
 Nitrogénio líquido 
 Tampão TE (Tris-EDTA) 
 
 
Reagentes do kit : 
 
 Reagente 1 
 Reagente 2 
 Resina de extracção 
Nota: Ver em anexo as quantidades recomendadas. 
 
Procedimentos: 
 
A – Rompimento da parede celular 
1. Pesar 0,1 g de material vegetal (peso fresco) colocando-o de seguida no almofariz. 
2. Adicionar 3 volumes de nitrogénio líquido e moer bem o material, com a ajuda do 
pilão até produzir um pó. 
3. Transferir esse pó para um tubo de centrifugação de polipropileno, com o auxílio de 
uma espátula. 
 
B – Lise celular 
 
1. Adicionar 600µl do Reagente 1, certificando-se de que todos os ingredientes do 
reagente são totalmente dissolvidos, misturando muito bem de seguida. 
3 
 
2. Adicionar 200µl do Reagente 2. 
3. Misturar tudo muito bem, até obter uma mistura homogénea. 
4. Incubar em “banho-maria” a 65oC durante 10 minutos, agitando regularmente. 
5. Colocar as amostras em gelo durante 20 minutos. 
 
C – Extracção de DNA 
1. Remover as amostras do gelo, e adicionar 500µl de clorofórmio previamente 
armazenado a -20oC. 
2. Adicionar 100µl de resina de extracção (Nucleon PhytoPure DNA). 
3. Agitar durante 10 minutos à temperatura ambiente. 
4. Centrifugar a 1300 g (gravidade) durante 10 minutos. 
5. Sem “perturbar” a camada de resina em suspensão, transferir, com a ajuda de uma 
pipeta, o DNA, contido na fase acima da camada castanha, para um novo tubo. 
 
 
D – Precipitação do DNA 
1. Adicionar um volume igual (ao do sobrenadante) de isopropanol. 
2. Inverter cuidadosamente o tubo até que o DNA precipite. 
3. Centrifugar a um mínimo de 4000 g durante 5 minutos para o pellet de DNA. 
4. Lavar o pellet de DNA com etanol a 70%. 
5. Centrifugar novamente a um mínimo de 4000 g durante 5 minutos para o pellet de 
DNA. 
6. Deitar fora o sobrenadante. 
7. Secar ao ar o pellet de DNA durante 10 minutos, e remover todos os restantes 
resíduos de etanol remanescentes do tubo. 
8. Voltar a suspender o DNA em tampão TE ou água. 
 
 
Anexo: 
Tabela 1- Proporções dos reagentes para as amostras. 
 
 0,1 g de 
amostra 
1,0 g de 
amostra 
Componente 
Reagente 1 31 ml 245 ml 
Reagente 2 11 ml 85 ml 
Resina 
“Phytopure” 
6 ml 12 ml 
 
4 
 
Referencias: 
 
 BECKMANN, J.S.; OSBORN, T.C. Plant genomes: methods for genetic and physical mapping. London: 
Kluwer Academic Publ., 1992. p.1-13. 
 http://www.uefs.br/disciplinas/bot859/extra.pdf 
 http://www.sembio.com.br/arquivos/CD/Mini-
cursos%20e%20Oficinas/MC18%20%96%20Extra%E7%E3o,%20An%E1lise%20e%20Amplifica%E7%E3o%20
de%20DNA%20Vegetal/Extra%E7ao%20DNA.pdf 
 
 
 
Questões: 
 
1. Porque devemos macerar bem o material vegetal? 
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2. Porque é que o clorofórmio deve ser armazenado a -20oC? 
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3. Para que serve o aquecimento da solução? 
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4. Qual e função da adição do isopropanol? E do etanol? 
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