introdução a bioquímica

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Bioquímic�
↪ pH, pKa e sistemas Tampão
ph = -log[H+]
ácido = doador de prótons
base = aceptor de prótons
- a força de um ácido está relacionada a
sua capacidade de dissociação. Ácidos
fortes dissociam completamente em água.
- pKa (constante de dissociação:
Ka = [H+] [A-] → pKa = -logKa
[HA]
ácidos fortes tem pka < 1
Ex.: pka = 5, [HA] = 0.1 M
HA ⇄ H+ + A-
0,1 - x x x
10-5 = -log [x]2 = 10-3
[0.1 - x] (arredondar x para 0)
EX.: pka = 5, HA = 0.1 M, adição de 0.1 M de
sal de base conjugada
HA ⇄ H+ + A-
0,1 - x x x
NaA ⇄ Na+ + A-
0,1 0.1 0.1
Ka = [H+][A-] = x (x+0.1) (0.1 é a adição de sal)
[HA] 0.1 - x (arredondar o x para 0)
Ka = x (x+0.1) = x (0.1) = x
0.1 - x 0.1
Ka = x = 10-5
ph = 5
- Tampão: solução resistente a mudança de
pH (capacidade de tamponamento),
formada por um ácido fraco e sua base
conjugada.
HA ⇄ H+ + A-
NaA ⇄ Na+ + A-
pH = pKa + log [A=]
[HA]
a solução tampão é mais eficiente quando
o pH = pka ± 1
aminoácidos podem agir como tampões
↪ Aminoácidos::
- monômeros formam as proteínas
- 20 conhecidos
- compostos por um grupo amino
(-NH3) e um grupo carboxila (-COOH)
↪ a prolina possui um grupo
imino (-NH-) no lugar da amina
↪ encontrados na forma iônica
- fórmula básica: os grupos amino e
carboxila ligados ao carbono α, qual
se liga a um átomo de hidrogênio e
um grupo variável (cadeia lateral ou
grupo R)
- Cadeia lateral: As propriedades
desse grupo, principalmente a
afinidade pela água, são
importantes para a conformação
das proteínas, definindo sua função.
Segundo a polaridade são
classificados em:
↪ apolares (hidrofóbicos) →
característica de
hidrocarboneto, geralmente
localizam-se no interior da
proteína
□ glicina, alanina, valina,
leucina, isoleucina,
metionina, prolina,
fenilalanina e triptofano.
↪ polares (hidrofílicos), sem
carga (serina, treonina e
tirosina), com carga negativa
(ácidos - aspartato e
glutamato) ou com carga
positiva (básicos - lisina,
arginina e histidina). São
geralmente encontrados na
superfície.
- O carbono α de todos os
aminoácidos, com exceção da
glicina, é quiral, já que está ligado a
quatro grupos diferentes
↪ Todas as proteínas
encontradas nos seres vivos
são formadas por L -
aminoácidos. Os
D-aminoácidos aparecem
somente em certos
antibióticos e em peptídios
componentes da parede de
algumas bactérias e açúcares.
- os aminoácidos podem ser
encontrados de 3 formas,
dependendo do pH do meio:
- Quando o aminoácido tem apenas
dois grupos ionizáveis, a sua curva
de titulação assemelha se à
composição das curvas de titulação
de dois ácidos fracos com valores de
pKa muito diferentes
↪ carboxila = pka1; amino = pka2
- A curva de titulação de aminoácidos
com cadeias laterais ionizáveis
apresenta uma terceira região de
tamponamento, correspondente ao
seu terceiro pKa. Isto ocorre com os
aminoácidos ácidos, básicos,
cisteína e tirosina.
- A carga elétrica total da molécula de
um aminoácido resulta da soma
algébrica das cargas apresentadas
pelos seus grupos ionizáveis, que
dependem do pKa e do pH do meio
- A curva de titulação de um
aminoácido monoamínico e
monocarboxílico, inicia-se em pH
muito baixo, menor do que o pKa do
grupo carboxila. Assim, tanto a
carboxila quanto o grupo amino
estarão protonados, conferindo
carga positiva à molécula. À medida
que o valor do pH sobe
gradativamente, aumenta a
dissociação do grupo carboxila e, a
concentração da forma com uma
carga negativa e uma positiva =
forma eletricamente neutra
(zwitteriônica). O valor do pH
continua aumentando, promovendo
a dissociação do grupo amino e o
aumento da concentração da forma
com carga negativa
- A forma eletricamente neutra
predomina nos valores de pH acima
do pKa do grupo carboxila e abaixo
do pKa do grupo amino e é mais
abundante no pH equidistante dos
dois valores de pKa = Ponto
Isoelétrico = os aminoácidos
comportam-se como moléculas
neutras
- Os aminoácidos monoamínicos e
dicarboxílicos (aspartato e
glutamato) possuem um grupamento
que pode apresentar carga positiva
e dois grupamentos que podem
apresentar carga negativa. Neste
caso, a forma com carga igual a zero
será obtida quando um dos grupos
carboxila estiver protonado (sem
carga) e o outro desprotonado (com
carga negativa. A carga negativa do
grupo carboxila desprotonado será
compensada pela carga positiva do
grupamento amino protonado.
- ponto isoelétrico (pI) é a média
aritmética de dois valores de pKa
↪ Para os que não contêm
grupamentos ionizáveis na
cadeia lateral, utilizam se os
valores de pKa dos grupos
amino e carboxila; para
aminoácidos com três
grupamentos ionizáveis, usam
se os valores de pKa dos
grupos com mesmo sinal de
carga.
- Os aminoácidos podem formar
polímeros lineares pela ligação do
grupo α carboxila de um aminoácido
com o grupo α amino de outro =
ligação peptídica. É obtida por
exclusão de uma molécula de água
↪ ligação peptídica não é feita
por reação direta entre os
aminoácidos, mas por uma
sequência de etapas,
envolvendo gasto de ATP.
- A ligação peptídica impede a
rotação, deixando a ligação em um
plano rígido. Apesar de ser
representada por um único traço de
ligação, ela tem características
intermediárias entre uma ligação
simples e uma dupla ligação, devido
à ressonância entre duas formas:
- Mas o carbono α possui ligações
que sofrem torções.
- oligopeptídeos = até 30
aminoácidos; polipeptídeos = maior
que 30
Lista 3
1) Verdadeiro ou falso (justificar 3
alternativas falsas):
a. A proteínas são constituídas de
D-aminoácidos F, As proteínas são
constituídas de L-aminoácidos.
b. A cadeia lateral determina as
características químicas dos aminoácidos
V
c. A cadeia lateral dos aminoácidos
prolina, valina e metionina é hidrofílica V
d. Os aminoácidos prolina, fenilalanina e
triptofano são aromáticos F, a prolina não
é aromática
e. O glutamato possui 3 pKas V
f. Ponto isoelétrico é o pH onde a soma das
cargas do zwitterion é igual a zero V
g. Um aminoácido na forma zwitteriônica
não tem carga V
h. A curva de titulação de um aminoácido
que não tem um grupo ionizável na cadeia
lateral é similar a curva de titulação de um
ácido fraco V
i. A ligação peptídica tem caráter de
ligação dupla devido a ressonância entre o
oxigênio da carbonila e o nitrogênio da
ligação peptídica. V
j. A ligação peptídica é bastante flexível F, a
ligação dupla impede torções
l. Aminoácidos em cadeias polipeptídicas
são chamados de resíduos porque
perderam H2O na formação da ligação
peptídica V
2) Explique por que a seguinte forma
não-iônica de um aminoácido não pode
ser encontrada em solução aquosa.
Em pH, a carboxila está desprotona, sendo
impossível encontrar a forma não-iônica
acima.
3) Esquematize a curva de titulação de
uma solução 0,1M de glicina (pKa1 2,35,
pKa2 9,78) com NaOH a partir de pH=1.
Desenhe as formas predominantes e seu
estado de protonação em pHs 1; 2,35; 5; 9,78
e 11. Coloque o pH na ordenada e, na
abscissa, a quantidade de equivalentes de
base forte.
5) a) Quais os pontos isoelétricos de: ácido
aspártico (pKa=2,5; 4,0 e 9,5) e lisina
(pKa=2,5; 9,5 e 10)?
Para aminoácidos com três grupamentos
ionizáveis, usam se os valores de pKa dos
grupos com mesmo sinal de carga.
Portanto:
ác. aspártico: pI = 4+2,5/2 = 3,25
lisina: pI = 10+9,5/2=9.75
6) Escolher e desenhar 2 aminoácidos em
termos da natureza química dos seus
grupos radicais: a) ionizáveis; b) não
ionizáveis; c) ácidos; d) básicos, e) polares;
f) apolares; g) aromáticos; h) lineares; i)
ramificados. Caso haja intersecção entre a
natureza dos grupos R, desenhar somente
uma vez, e indicar no desenho.
7) Desenhar o peptídeo: Ala-Asp-Tyr-Lys-Val.
Indique as extremidades amino-terminal e
carboxi-terminal. Em que tipos de
interações as cadeias laterais desses
aminoácidos poderiam participar? Calcule
o seu ponto isoelétrico. Os valores de pKa
podem ser obtidos em qualquer livro de
bioquímica ou na internet.
↪ Proteínas:
- biomoléculas que desempenham
funções estruturais e dinâmicas
- presentes em processos biológicos
como enzimas, catalizadores e
reguladores do metabolismo
(insulina eglucagon), realizam
transporte e funções de defesa
(imunoglobulinas), além de
mecanismos contráteis (miosina e
actina)
- Cadeias polipeptídicas associadas a
uma função
- podem ser modificadas após a
tradução por fosforilação
(metabolismo) ou metilação
(enovelamento da proteína)
- são classificadas como:
↪ globulares: apresentam uma
ou mais cadeias polipeptídicas
organizadas em uma forma
final aproximadamente
esférica; geralmente solúveis
(núcleo hidrofóbico + van der
waals - estabilidade) e
desempenham funções
dinâmicas (enzimas,
transporte, imunoglobulinas).
Fenômeno “salting in” =
Proteínas globulares pouco
solúveis em água tornam-se
mais solúveis à medida que
aumenta a concentração de
sal da solução. “Salting out” =
concentração de sal muito
alta, deixa as proteínas
insolúveis, e aumenta as
interações proteína-proteína,
ocorrendo a precipitação -
técnica usada em purificação
de proteínas. Contêm diversos
tipos de estruturas
secundárias = diversidade
↪ Fibrosas: têm forma alongada,
geralmente insolúveis e
desempenham um papel
basicamente estrutural nos
sistemas biológicos.
Abundantes pontes dissulfeto
que conferem resistência às
fibras. Formadas por um único
tipo de estrutura secundária,
↪ e sua estrutura terciária é
relativamente simples
- estrutura primária: é a sequência de
aminoácidos da cadeia
polipeptídica, determinada
geneticamente e específica para
cada proteína.
- secundária: descreve as estruturas
tridimensionais regulares,
enovelamento. α - hélice e folha β
pregueada
⤷ a prolina não tem estrutura
secundária devido a ausência
do hidrogênio na ligação
peptídica
- terciária: dobramento final da cadeia
polipeptídica por interação de
regiões com estrutura regular
(α-hélice ou folha β pregueada) ou
de regiões sem estrutura definida
por ligações de hidrogênio,
interações hidrofóbicas, ligações
iônicas ou salinas e forças de van
der Waals.
⤷ A estrutura proteica pode ser
estabilizada por uma ponte
dissulfeto (– S – S –), formada
entre dois resíduos de cisteína
por uma reação de oxidação
catalisada por enzimas
específicas
⤷ Pode apresentar padrões de
elementos estruturais, que se
repetem em proteínas
diferentes, chamados de
domínios → regiões
diferenciadas da molécula
proteica, com organização
espacial compacta; cada
domínio é um conjunto
estrutural definido, formado
por dobramentos da cadeia
polipeptídica. → Os domínios
tem ações específicas; em
inúmeras reações do
metabolismo, o substrato
ligase a um dos domínios da
enzima e a coenzima a outro
motivos → diferentes formas
de organização de elementos
da estrutura secundária de
proteínas globulares, cada um
com um padrão de
dobramento característico,
constituídos de 𝛂-hélice, folha
β ou ambos.
- quaternária: associação de duas ou
mais cadeias polipeptídicas
(subunidades), para compor uma
proteína funcional, mantida
geralmente por ligações não
covalentes entre as subunidades,
dos mesmos tipos que mantêm a
estrutura terciária.
- grupos prostéticos = moléculas
orgânicas não protéicas, ligadas à
cadeia polipeptídica e as proteínas,
neste caso, são chamadas proteínas
conjugadas
- Loops - regiões desorganizadas
- Glicoproteínas são encontradas em
todos os compartimentos celulares,
mas constituem, principalmente, as
proteínas secretadas pelas células e
aquelas localizadas na sua
superfície externa
- A solubilidade das proteínas é
determinada pela estrutura primária,
que define a relação espacial entre
os aminoácidos na estrutura
tridimensional e sua interação com a
água
- Chaperonina - auxílio no
enovelamento de proteínas
Lista - aula 4
1) Assinale verdadeiro ou falso:
F a. A estrutura terciária de uma proteína é
determinada majoritariamente por
ligações covalentes
F b. As ligações de hidrogênio não são
essenciais para a estrutura secundária de
proteínas
V c. As cadeias laterais dos aminoácidos
participam das ligações hidrogênio
intramoleculares da alfa-hélice
V d. A estrutura primária é importante na
determinação da estrutura espacial
(terciária) da proteína.
F e. A ponte dissulfeto é um tipo de ligação
fraca.
V f. Na folha-beta as cadeias laterais dos
aminoácidos se encontram
alternadamente para cima e para baixo do
plano da folha.
F g. Na folha-beta as pontes de hidrogênio
entre a carbonila e a amina da ligação
peptídica ocorre lateralmente.
F h. Na alfa-hélice as pontes de hidrogênio
entre a carbonila e a amina da ligação
peptídica ocorrem entre resíduos de
aminoácidos consecutivos ( Elas ocorrem
entre 4 aminoácidos de distância).
2- Há duas estruturas secundárias
principais: 𝛂-hélice e folha β pregueada,
que são estruturas organizacionais
regulares e repetitivas.
a- Descreva brevemente como são estas
estruturas.
A alfa helice é uma estrutura muito comum
das proteínas, e se assemelha a uma
escada em espiral, os grupos R estão
projetados para fora do esqueleto e a
estabilização ocorre por meio das ligações
de hidrogênio entre os grupamentos NH e
CO. O sentido de giro de uma α-hélice
pode ser para a direita (hélice dextrorsa)
ou para a esquerda (hélice sinistrorsa)
A folha pregueada é um padrão estrutural
de algumas proteínas e se sustenta pelas
ligações de hidrogênio resultando em uma
estrutura rígida e achatada, nessa
estrutura os grupos R projetam-se para
cima e para baixo e as pontes de
hidrogênio são perpendiculares ao plano.
b- Qual a posição relativa dos grupos R em
cada uma delas?
Na folha β pregueada eles estão para fora
do plano e projetam-se para cima e para
baixo.
Na 𝛂 hélice eles estão fora do esqueleto
helicoidal.
c –Por que polilisina não poderia formar
α-hélice em pH 7? Em qual pH poderia
formar essa estrutura e por qual motivo?
A polilisina em solução a pH 7 não
forma alfa hélice, pois apresenta as
cadeias laterais carregadas positivamente
(repulsão); Em pH 12, contudo, a maioria
das cadeias laterais está desprotonada e
a polilisina forma α hélice
espontaneamente.
3) Explique brevemente as características
de proteínas globulares e fibrosas
As globulares apresentam uma ou mais
cadeias polipeptídicas organizadas em
uma forma final aproximadamente esférica;
geralmente solúveis e desempenham
funções dinâmicas (enzimas, transporte,
imunoglobulinas). Já as fibrosas são
estruturalmente simples e alongadas, e
geralmente insolúveis em água, a grande
maioria das proteínas que pertencem a
essa classe possui um único tipo de
estrutura secundária e desempenham um
papel basicamente estrutural nos sistemas
biológicos. Assim, elas adquirem a forma de
longos filamentos, geralmente entrelaçados
como uma corda, gerando fibras altamente
resistentes.
4- Duas proteínas, apesar de terem
diferenças quanto a alguns de seus
aminoácidos, são capazes de
desempenhar a mesma função. Explique
como isto é possível.
Isso pode acontecer, porque algumas
proteínas apesar de terem a sequência de
seus aminoácidos diferentes, podem ter
uma estrutura terciária semelhante, o que
promove ciclos catalíticos com a mesma
função.
5) O que é um grupo prostético? Cite dois
exemplos de proteínas que o contenham e
quais são eles.
Um grupo prostético é um componente de
natureza não-proteica de proteínas
conjugadas que é essencial para a
atividade biológica dessas proteínas. Os
grupos prostéticos podem ser orgânicos
ou inorgânicos e encontram-se ligados de
forma firme à cadeia polipeptídica, muitas
vezes através de ligações covalentes.
A hemoglobina possui um grupo heme com
um íon metálico (Fe2+). E o magnésio
presente em algumas quinases.
6) Leia o texto ao fim dessa lista para
responder essa questão. Descreva
brevemente a experiência clássica de
Anfinsen com a enzima ribonuclease A,
indicando sua conclusão principal. Qual o
papel das pontes de dissulfeto na
manutenção da estrutura nativa (terciária)
da ribonuclease? Conceitue estrutura
nativa e desnaturação de proteínas,
explicando o que isso tem a ver com a
atividade enzimática da ribonuclease.
As proteínas tendem a encontrar a
conformação de menor energia, que
depende da sequência de aminoácidos.
Assim, a estrutura terciária é dependente
da estrutura primária.
As pontes dissulfeto auxiliamna
manutenção da estrutura terciária,
estabilizando os resíduos de uma mesma
cadeia (intra-proteicamente).
Desnaturação = é o processo de quebra
das interações de estruturas terciárias de
proteínas, fazendo com que a proteína
perca sua função.
Nativas = proteínas funcionais e que estão
ativas dentro das funções que estas
exercem
↪ Função de Proteínas: Mioglobina e
Hemoglobina
As proteínas podem realizar funções como
de:
- transporte. Ex.: hemoglobina que
transporta O2, lactose permease que
transporta a lactose através da
membrana
- catalítica. Ex.: Hexoquinase (via
glicolítica); DNA polimerase
(replicação de DNA)
- estrutura. Ex: colágeno (tecido
conectivo), queratina (cabelos, unhas,
penas)
- mobilidade. Ex: miosina e actina
- Transdução de sinal e regulação. Ex:
Hormônios, receptores, quinases,
fatores de transcrição
Para realizar tais funções, as proteínas
realizam uma ligação reversível com outras
moléculas, por interações não covalentes
ou covalentes transitórias
↪ ligantes: Moléculas pequenas ou
outras macromoléculas
↪ Sítio de ligação: região da proteína
onde o ligante interage
A ligação proteína-ligante pode ser
descrita quantitativamente:
Ka (Constante de associação) = mede a
afinidade de L pela proteína. medida em M-1
Ka = [ PL ] = ka
[P] [L] kd
ka = reação de segunda ordem = M-1 s-1
kd reação de primeira ordem = s-1
Kd (constante de dissociação) que tem
como unidade M (concentração molar
Kd = [P] [L] = kd = 1
[PL] ka Ka
ba���� va����s �e K� c����s�o�d�� ��ta �fi���ad� ��
li���t� �e�� p���eína
Representação gráfica:
θ = fração de sítios de ligação ocupados
θ = [ L ]
[L] + Kd
Kd é eq���a��n�� a ��n���t�ação m���� do ����n�e ��
qu�� � �et��� �os �íti�� �� in����ção �s�ão �c��a��s
ligação reversível → a mioglobina e a
hemoglobina são proteínas com funções
parecidas que apresentam afinidade pelo
O2
↪ A hemoglobina é o transportador do
O2 pelo sistema sanguíneo, formada
por 4 cadeias polipeptídica. Uma
molécula de hemoglobina totalmente
oxigenada contém quatro moléculas
de O2 e é denominada
oxihemoblobina (oxiHb ou HbO2), em
contraposição à forma desprovida
de oxigênio, chamada
desoxihemoglobina (desoxiHb ou Hb).
A ligação do oxigênio ao grupo heme
altera a cor da hemoglobina, que
passa de azulada (sangue venoso) a
vermelha (sangue arterial).
↪ mioglobina sequestra o O2 em nível
do tecido muscular. Servindo como
“depósito” para a contração do
músculo em aerobiose, formada por
uma cadeia
Ambas apresentam Fe2+ incorporado em
um grupo prostético chamado de Heme
grupo heme
O grupo heme localiza se dentro de uma
cavidade hidrofóbica, delimitada por
aminoácidos apolares, que estabelecem
interações hidrofóbicas com o anel
porfirínico. Este ambiente apolar torna
possível a ligação do oxigênio ao
ferro (Fe2+), sem que ele seja oxidado ao
estado férrico (Fe3+)
Cooperatividade → a ligação com a
primeira molécula de oxigênio facilita as
próximas interações. Isso proporciona uma
resposta mais sensível a variações na
concentração de
oxigênio
A li��ção d� ��a�t� ���écu�� �� O2 na ����g�o��n� é
300 ve��� m�i� �fi��en�� ��e � p���e�r�.
→ A mioglobina seria um transportador
bem menos eficiente, pois menos de 10% do
seu oxigênio seria liberado. Todavia, sua
alta afinidade por oxigênio, mesmo em
baixa pO2, permite que ela desempenhe
eficientemente a função de reservatório de
oxigênio nos músculos de mamíferos. A
mioglobina tem afinidade por oxigênio
maior que a hemoglobina em qualquer
pO2, o que permite que ele seja transferido
do sangue para o músculo
A afinidade da hemoglobina pelo oxigênio
varia com o pH, mesmo dentro do estreito
limite fisiológico de variação do
pH: a afinidade é tanto menor quanto
menor o pH
→ Nos tecidos o pH é ligeiramente mais
ácido
Nos tecidos, a hemoglobina se liga a H+ e
CO2 , diminuindo sua afinidade por O2 e
atuando como uma base tamponando o
sangue, liberando O2
→ Nos pulmões o pH é ligeiramente mais
alcalino
Nos pulmões, e hemoglobina libera H+ e
CO2 , aumentando sua afinidade por O2 e
atuando como uma ácido tamponando o
sangue, “prendendo” o O2
→ Efeito Bohr = efeito do pH e da pressão
parcial de CO2 sobre a união entre Hb e
O2
Em pH alto, há maior afinidade por O2
(libera H + conforme se oxigena = ácido de
Bronsted).
Em pH baixo, menor afinidade por O2
(liga-se preferencialmente a H+ conforme
perde oxigênio = base de Bronsted)
→ O aumento da temperatura, a presença
de determinados compostos orgânicos
fosforilados, o aumento da pressão parcial
de CO2 e a diminuição de pH são fatores
que provocam a redução da afinidade da
hemoglobina pelo oxigênio
→ papel fundamental desempenhado pela
hemoglobina na
manutenção do pH plasmático: à medida
que a pO2 diminui e a concentração de H+
aumenta, a hemoglobina libera O2 e
capta H+. Quando a pO2 aumenta e a
concentração de H+ diminui, ela se liga a
O2 e libera H+.
↪ hemoglobina fetal (HbF) = estrutura
da HbF é α2 γ2, em contraposição à
estrutura α2 β2 da HbA. Além disso, possui
maior afinidade pelo O2, o que permite o
feto obter O2 através da placenta. A
diferença de afinidade é devida à força de
ligação de BPG. Nas cadeias γ, um
aminoácido com carga positiva foi
substituído por um polar
sem carga, assim, na molécula de HbF
existe um par a menos de grupos positivos
na cavidade onde se insere o BPG, por isto,
liga se mais fracamente que na HbA. Como
a concentração de BPG é igual nas
hemácias da mãe e do feto, e a HbF ligase
menos eficientemente ao BPG, a forma
desoxigenada desta hemoglobina fica
menos estável e a sua afinidade por
oxigênio aumenta: o oxigênio flui da oxiHb
da mãe para a desoxiHb do feto.
CO2 é transportado
- 90% na forma de HCO3
- 5% carbamino-hemoglobina
- 5% dissolvido no sangue
→ A ligação do BPG (2,3-bisfofoglicerato)
estabiliza o estado T (baixa afinidade) da
hemoglobina
- Sítio de ligação da BPG - cavidade
entre subunidades no estado T
- Cavidade revestida por aa com
cargas positivas
- Liga- se fortemente à desoxiHb, que
apresenta a cavidade entre as
subunidades β suficientemente
grande para alojá-lo.
- 1 BPG por tetrâmero
- Está presente em concentrações
relativamente altas em eritrócitos
- diminui a afinidade da hemoglobina
por O2
Im�o�t���� ad����ção fis���ógi�� � �a�x��
co���n���ções �� O2 na� �r����s a���t��e�
O t�a�s���t� �e ���gêni� ��� pu��ões ��� �ec���� é
fe��� �el� ���og����na ���s���e n�� ��máci��. O
CO2 p�o��z��o ��l�� �ec���� é co���r���o � áci��
ca��ôni��, qu� �� i���za �� ��ca���n��o � H+. O
bi���b��a�� é t�a�s���t��o ��l� �a�g�� a�é os
pu��ões, on�� é el����ad� ���o CO2
pa����gi� ���ec���� = a d���ças ����ad�� ��la ����ração
de ��� úni�� �r��eína. As �u��ções �� ��lécu�� ��
he���l��i�� �ca����am � ���s�i���ção d� �� úni��
am���áci��, t�a��n�� �on����ên�i�� v��iáve��, se���d�
su� ���al���ção.
he���l��i�� S (Hb�) = ca��� a ���mi� ���ci���m�
Mut�ções ����an�� ��in�áci��� s��u���s �o ��t��i�� d�
mo�écu�� ��ra���n�� �et����na� � �ín�e�� d�
he���l��i��s �ão f����on���. A pe��� d� �u�ção n����l
po�� ��su���r �� �er���b�ções �� ��t�u��r� �e�c�ári�,
co�� ��on���� qu���� há su��t���ição d� �� a��n�áci��
po� �r����a, qu� ���er���p� u�� αhéli��. Em o����s
ca���, a t���� de ����oáci��� c�� �ad��a ����ra� ���la�
po� ���ro� ��m ���po R ����r a���r� o ���áte�
hi���fóbi�� �� ca����de ���� se ����a � g���o h���,
oc���o��n�� a ���dação d� F�2+ a F�3+.
Tal����mi�� - sín�e�� não �s���u��mét�i�� d��
su����da��� d� �e��g���in�
αta���s��i�� - ca����as ��� d��eção gêni��, a p����ção
da� ��d�i�� α é de���t��a
βta���s��i�� - re���t���es �� �ári�� ��po� �� m��ações,
fa���m �� �ad��a� β. Os �o��z��o��s ���es����m
an���a ��v��a � ��sa
co���ção é de����na�� ��la���m�a ���o�; os
he����zi����s �ão �s���to�áti��� (ta���s��i� ��no�) e,
co�� ��on���� na ����i� f���if����, ap����n�a�
al���� p�o��ção c���r� a ���ári�
he���l��i�� g���ad� (HbA1c) - difi���t� a ����ração d�
ox��êni� ���ad� à he���l��i��, po���d� �o�t����ir
pa�� � �ipóxi� ���ul�� � a �n���lação d� ���ro����op���a
di��éti��
me����mo���b��a (Hb�) - não s� ���a �� ox��êni� ���id�
a �x��ação d� ���ro
Hipóxia:O nível de BPG no organismo pode
variar de acordo com algumas condições
como, por exemplo, altas altitudes, falta de
oxigenação (hipóxia), anemia e
insuficiência respiratória. Níveis
aumentados de BPG no organismo são
parcialmente responsáveis pela adaptação
às grandes altitudes, um processo
fisiológico complexo onde estão envolvidos
dois eventos; o aumento da quantidade de
hemoglobina nos eritrócitos e o aumento
do número de eritrócitos, processo esse
que demora algumas semanas para ser
finalizado.
Lista - aula 5
1. A proteína A tem um sítio de ligação
para o ligante X com uma Kd de 10-6
M. A proteína B tem sítio de ligação
para o mesmo ligante com uma Kd
de 10-9 M. Qual das proteínas tem a
maior afinidade pelo ligante X?
Explique o seu raciocínio. Converta a
Kd em Ka para ambas as proteínas.
Kd é equivalente a concentração
molar do ligante na qual a metade
dos sítios de interação estão
ocupados, o que significa que a
proteína alcançou a metade da
saturação com relação à interação
com o ligante. Quanto maior a força
da interação proteica com o ligante,
mais baixa será a concentração
necessária do ligante para que
metade dos sítios seja
ocupada, logo, baixos valores de Kd
correspondem à alta afinidade do
ligante pela proteína. Dessa forma,
conclui-se que a proteína B, com Kd =
10-9 M, tem maior afinidade com o
ligante X, se comparada a proteína
A, com Kd = 10-6 .
2. Considerando o esquema seguinte,
analisar o pH do plasma nas
situações:
a. pneumonia (redução da eficiência de
trocas gasosas)
não haverá eliminação do
CO2 produzido nos tecidos. O
acúmulo de CO2 resultará na
produção de H2CO3, HCO3
e H+, com acidificação do
sangue.
b. hiperventilação
Haverá liberação aumentada de
CO2, redução dos níveis de
HCO3- e H+ no sangue;
portanto, o sangue estará
alcalinizado.
c. diabetes (produção aumentada de
ácidos orgânicos)
Haverá aumento de H+, acidificando
o sangue.
3. O gráfico mostra a curva de
saturação por oxigênio da
mioglobina e as curvas da saturação
da hemoglobina (Hb) em diferentes
valores de pH
a. Uma solução de hemoglobina,
mantida sob pO2 de 30 torrs,
apresentava pH = 7,4. Em
experimentos separados, foi
adicionado HCl ou NaOH à
solução, até que os valores de
pH fossem, respectivamente,
7,2 e 7,6. Em qual dos
experimentos houve liberação
de O2 pela hemoglobina?
Há liberação de de O2 em pH
mais baixo, logo, essa
liberação ocorreu no
experimento de pH igual a 7,2.
b. Uma solução de hemoglobina
a pH 7,4 estava submetida a
pO2 de 100 torrs. Que
fenômeno deve ocorrer com a
hemoglobina se a pO2 baixar
para 40 torrs? E com a
mioglobina?
Haverá liberação de O2
(diminuição da saturação de
O2 no gráfico). E na
mioglobina , haverá um
desprendimento muito baixo
de O2.
c. O pH plasmático nos alvéolos
pulmonares (pO2 = 100 torrs) é
7,4 e nos tecidos (pO2 = 40
torrs) é 7,2. Que fenômeno
deve ocorrer com a
hemoglobina nos pulmões e
nos tecidos? O que
aconteceria se, em vez de
hemoglobina, houvesse
mioglobina no sangue?
No pulmão, a
hemoglobina ligará
fortemente ao oxigênio,
em condições saturantes;
já nos tecidos, entre
70-‐80% deste oxigênio
será liberado. Se houvesse
mioglobina no sangue o
oxigênio se ligaria a
mioglobina no pulmão,
mas não seria liberada
nos tecidos.
d. A mioglobina, sob uma mesma
pO2, deve doar ou receber
oxigênio da hemoglobina?
Receber
4. Descrever o processo de
manutenção do pH do sangue
através da interação dos sistemas
HHb/HbO2 e CO2/HCO3 nos tecidos
e pulmões. Considerar o efeito Bohr
e as alterações de pKa de radicais
da hemoglobina provocadas pela
ligação, com oxigênio.
Nos tecidos, a pO2 é menor e a
concentração de H+ aumenta, desse
modo, a hemoglobina libera O2 e se
liga a H+, atuando como base.
CO2 + H2O → HCO3- + H+
HbO2 + H+ → HHb + O2
O H+ produzido pela reação de Co2
nos tecidos se liga à hemoglobina, o
que impede uma mudança brusca
no pH. Já nos pulmões, a pO2 é
maior e a concentração de H+
diminui, assim, a hemoglobina se liga
ao O2 e libera H+, que atua como
ácido.
HHb + O2 → HbO2 + H+
H+ + HCO3- → H2CO3 → CO2 + H2O
A mudança da molécula de
hemoglobina conforme o pH se deve
a movimentação das subunidades
da molécula, devido á associação e
dissociação de oxigênio, que
modifica a relação espacial entre
determinados aminoácidos e causa
variações nos valores de pKa de seus
grupos ionizáveis.
5. Após passar 1 dia ou mais em
grandes altitudes (com uma pressão
parcial de oxigênio de 75 torr), a
concentração de 2,3-bifosfoglicerato
(2,3-BPG) nos eritrócitos aumenta.
Que efeito teria um aumento da
concentração de 2,3-BPG sobre a
curva de ligação do oxigênio à
hemoglobina? Por que essa
adaptação seria benéfica para o
bom funcionamento em grandes
altitudes?
A ligação do BPG estabiliza o estado
T da hemoglobina e diminui a
afinidade com O2, facilitando a troca
gasosa em grandes altitudes, já que
a concentração de oxigênio é mais
escassa, tentando, assim, otimizar a
troca gasosa e compensar a falta de
O2.
→ Purificação de proteínas:
inicia se com a liberação da proteína do
material biológico onde ela ocorre pelo
rompimento dessas estruturas
↪ A homogeneização mecânica em
meio isotônico produz o
maceramento dos tecidos e a lise
das células, originando um extrato
celular, que será centrifugado
(fracionamento celular).
↪ Quanto menor for uma
estrutura, maior será a força
centrífuga necessária para
sedimentá-la; como os
componentes celulares
diferem em tamanho, eles
sedimentarão em velocidades
diferentes
↪ o primeiro passo empregado para a
separação de proteínas de extratos
brutos é a precipitação por adição
de sais (sulfato de amônio é o mais
comumente usado) ou solventes
orgânicos miscíveis com água —
separação por diferenças de
solubilidade
↪ depois são empregadas técnicas
mais seletivas, como a eletroforese
→ Cromatografia em coluna: uma amostra
da mistura de proteínas é aplicada no topo
de uma coluna formada por uma matriz
hidratada, que pode ser constituída de
diversos tipos de materiais, denominados
resinas. A coluna é eluída com uma solução
para a separação da proteína de interesse.
As diferentes proteínas migrarão através
da coluna com velocidades diferentes que
dependerão do seu grau de interação com
a matriz, o que permite a separação
analito - moléculas a serem separadas
fase estacionária - fixa, porosa e sólida
(papel ou sílica gel)
f. móvel - tampão, carrega os componentes
a serem separados
eluição - processo de passagem pela
coluna (ocorre a diluição da amostra)
↪ cromatografia de exclusão/por
filtração em gel = separa moléculas
pelo tamanho (massa molecular) - As
moléculas menores do que o
diâmetro dos poros podem penetrar
nas esferas, ao passo que as maiores
são “excluídas”, saindo primeiro
↪ cromatografia de troca iônica =
moléculas com carga de mesmo sinal
que a resina são eluídas primeiro,
seguidas por moléculas com carga
oposta. Possui duas fases móveis,
uma com o tampão e outra com o
tampão + NaCl. A adição do sal
aumenta a competitividade com a
carga da molécula, a fazendo se
desprender da coluna.
↪ c. de afinidade = unir a molécula pela
qual a proteína tem afinidade
(ligante) a uma matriz insolúvel,
sendo a mais utilizada a agarose, a
proteína de interesse fica adsorvida
à coluna, pela interação com o
ligante, e as outras proteínas
passam.
↪ c. de interação hidrofóbica - grupos
apolares, como fenil e butil, estão
ligados a resina da coluna e alta
concentração de de sal inicialmente
favorece a interação do analito com
a resina. A eluição é feita com
diminuição na concentração do sal
○ Usar excesso de sal em um
tampão pode fazer a sua
proteína (ou “contaminantes”)
saírem de solução, sendo
comumente um passo inicial
de purificação. Mantém a
atividade biológica. - efeito
salting in/out
↪ c. em camada delgada (TLC) - os
analitos migram em diferentes taxas
de acordo com a interação
fase móvel - polar, apolar, misturas
f. estacionária - folha de
vidro/plástico revestido com sílica
gel
→ cromatografia líquida de alta
performance (HPLC) - possui alta pressão;
resinas, colunas e sistema mais robustos;
maior capacidade de separação; menorquantidade de amostra
↪ análise de aminoácidos: ocorre por
derivatização = reação química que
muda a sua estrutura para aumentar
sua detectabilidade e/ou
performance cromatográfica, como a
substituição de grupos polares das
cadeias laterais por grupos apolares.
Assim, A partir de padrões com
conhecidos tempos de retenção (RT)
é possível saber o conteúdo da sua
amostra.
↪ Degradação de Edman =
sequenciamento de proteínas, é feito
por espectrometria de massas
quando em larga escala, marca e
remove apenas o resíduo
aminoterminal de um peptídeo,
deixando todas as outras ligações
peptídicas intactas.
Lista - aula 6
1. Definir os termos fase estacionária e fase
móvel. Dar exemplos de fases móvel e
estacionária em casos de a) cromatografia
em camada delgada e b) cromatografia em
coluna.
Fase estacionária pode ser definida como
a fase fixa, porosa e sólida (papel ou sílica
gel) da cromatografia. Já a móvel,
corresponde ao uso do tampão para
carregar as moléculas a serem separadas.
a) c. camada delgada: estacionária =
folha de vidro; móvel = mistura apolar
b) c. coluna: estacionária = sílica gel;
móvel = tampão
2. Explique brevemente os seguintes tipos
de cromatografia:
a) troca iônica: técnica que separa íons
e moléculas polares com base em
sua afinidade com a resina da
coluna trocadora de íons.
b) filtração em gel: consiste na
separação de moléculas de acordo
com seu tamanho e forma, ao passar
o analito pela coluna que possui
poros de tamanho definido.
c) afinidade: método de separação de
moléculas com base em uma
interação de ligação macromolecular
específica entre a moléculas e outra
substância (como um anticorpo)
3. A precipitação de proteínas com sulfato
de amônio é um passo largamente
empregado na purificação de proteínas.
Explique o princípio do método. Seria
melhor trabalhar com a proteína de
interesse na forma precipitada ou solúvel?
Por quê?
O método consiste no princípio de que o
sulfato de amônia saturado altera as
características estruturais das
proteínas, fazendo com que as mesmas
percam a capacidade de se tornarem
solúveis, sendo assim, na presença deste as
proteínas precipitam*, devido ao efeito
salting out. Esse passo é empregado para
obter frações enriquecidas das proteínas
de interesse a serem analisadas. O próximo
passo dessa purificação seria a diálise, que
consiste na separação de moléculas de
acordo com seu tamanho utilizando
membranas semipermeáveis que contêm
poros. Logo, é melhor trabalhar com as
proteínas precipitadas.
*altas concentrações de sais com carga
removem a água de solvatação das
proteínas. Regiões hidrofóbicas entram em
contato e a proteína sai da solução
aquosa e precipita. = salting out
em baixas concentrações a adição de sal
ao meio aquoso neutraliza cargas da
proteína e aumenta a solubilidade = salting
in
4. Leia o texto abaixo (resumo do artigo
colocado como leitura complementar no
moodle):
Validation of a Reversed-Phase HPLC
Method for Quantitative Amino Acid
Analysis: A semi-automated method for
amino acid derivatization and analysis has
been validated for use in analysis of
protein biopharmaceuticals. The method
includes protein hydrolysis,
o-phthalaldehyde derivatization, and
reversed phase high-performance liquid
chromatography analysis in a general
purpose UV-visible high-performance
liquid chromatography system. Aminoacid
derivatization is performed automatically
by the high-performance liquid
chromatography autosampler right before
injection. The required validation
parameters, i.e., specificity, linearity,
accuracy, precision, limit of detection, and
limit of quantification, were studied for
bovine serum albumin and for a
recombinant human Fab fragment. The
method can be employed as an absolute
quantification method for determination of
extinction coe�cients of recombinant
proteins. Responda:
a) Por que a proteína foi hidrolisada*?
A técnica RP-HPLC requer menor
quantidade de amostra (?)
b) Explique os dois termos marcados
em negrito no texto.
amino acid derivatization consiste
em uma reação química que muda a
sua estrutura de moléculas para
aumentar a detectabilidade e/ou
performance cromatográfica;
reversed phase high-performance
liquid chromatography é o método
cromatográfico baseado na
hidrofobicidade, ou seja, a
separação depende da ligação
hidrofóbica da molécula de soluto da
fase móvel aos ligantes hidrofóbicos
imobilizados ligados à fase
estacionária, solvente,.
c) Cite as vantagens do uso de HPLC
para análise de aminoácidos em
contraste à cromatografia de
camada delgada.
*hidrólise proteica = clivagem química ou
enzimática de moléculas de proteínas em
pequenos peptídeos de tamanhos diversos
e, eventualmente, em aminoácidos
5. São dadas as seguintes informações
sobre as proteínas A-F
a) Explicar a relação entre o pI de uma
proteína e seu estado de cargas
dado na tabela
O estado de protonação dos
aminoácidos das proteínas depende
do pH, assim, em pH neutro cada
uma terá uma carga líquida final,
correspondente às suas cadeias
laterais com pKas diferentes. O pI é o
ponto onde as cargas positivas e
negativas dos grupos se anulam
como exemplo da proteína F, na qual
seu π é 7, portanto, em pH neutro sua
carga é neutra. (?)
b) Propor uma marcha de purificação
(sequência de técnicas a serem
utilizadas) para a proteína B.
Utilizando as seguintes técnicas (as
quais julgar necessárias):
- Cromatografia de filtração em
gel (exclusão por tamanho).
- Cromatografia de troca
catiônica (indicar o valor de
pH)
- Cromatografia de troca
aniônica (indicar o valor de
pH)
- Focalização isoelétrica
- Precipitação por salting-out
(indicar a escolha da fração,
precipitado ou sobrenadante)
1º Cromatografia de filtração em gel
(exclusão por tamanho) = exclusão das
proteínas A, C e E.
2º Cromatografia de troca aniônica em pH
7, excluindo as proteínas D e F, pois D é
positiva e F neutra, logo não interagirão
com a coluna positiva.
→ eletroforese: Em um mesmo pH, proteínas
diferentes apresentarão cargas líquidas
diferentes, o que determinará velocidades
de migração diferentes, se as proteínas
forem submetidas a um campo elétrico.
Pode ser usada para achar o ponto
isoelétrico, e estimar a massa molecular.
- O enriquecimento é calculado dividindo o
passo atual pelo anterior.
- atividade específica é a concentração
indireta da proteína de interesse
Lista - aula 7
1. Uma mistura contendo citocromo c (pI =
10,6) e mioglobina (pI = 7,0) foi submetida a
eletroforese, utilizando-se
soluções-tampão com os seguintes valores
de pH: 3; 7; 10,6 e 12. Esquematizar os
eletrodos positivo e negativo e mostrar a
migração das proteínas em cada caso.
2. A mobilidade eletroforética em pH = 8,6
da hemoglobina normal e de
hemoglobinas anormais (que diferem da
hemoglobina normal por substituição de
um aminoácido) está representada a
seguir:
Identificar a posição (A, B, C ou D)
correspondente a cada uma das seguintes
hemoglobinas anormais: pKa das cadeias
HbS -valina (3,9) em lugar de glutamato A
HbJ -aspartato (6) em lugar de glicina C
HbN -glutamato (10.4) em lugar de lisina D
(mais alcalino, + próximo do 8.6)
HbC -lisina (4) em lugar de glutamato B
3. Explique os princípios da técnica de
SDS-PAGE ressaltando qual a sua principal
diferença em relação a uma eletroforese
comum. Explique a função dos géis de
empilhamento e de separação. O que são
as bandas observadas após a coloração e
o que elas significam?
A SDS-PAGE consiste na adição de dodecil
sulfato de sódio, um detergente iônico, ao
gel de poliacrilamida, para a desnaturação
das proteínas.
O gel de empilhamento é usado para
colocar as proteínas no mesmo “ponto de
partida” para começar a eletroforese. Já o
de separação, é o gel onde as proteínas
serão arrastadas.
As bandas observadas são os fragmentos
de diferentes tamanhos.
4. A figura abaixo mostra um experimento
de western blotting. Na raia M encontra-se
o padrão de massa molecular. Em A a
amostra não foi tratada com agente
redutor, e em B houve tratamento com
agente redutor.
a) Explique a técnica brevemente.
Western blotting consiste na separaçãodas proteínas por peso molecular através
de uma eletroforese, seguindo-se da
transferência para uma membrana e a
detecção da proteína de interesse com um
anticorpo específico.
b) Explique as diferenças observadas em A
e B.
possui diferentes pesos moleculares (?)
c) Por que a banda em B é mais larga
(possui maior intensidade na revelação)?
Em A, houve a separação de dímeros,
diferente de B, onde houve coloração de
maior intensidade devido a permanência
da ligação dissulfeto.
d) A proteína é um homodímero ou
heterodímero? Por quê?
Heterodímero. A com bandas diferentes
5. Explique separadamente como funciona
a detecção de antígenos e de anticorpos
no ensaio do ELISA. O que significa a
sigla?
É a técnica utilizada para diagnóstico por
detecção de anticorpos específicos de
patologias.
ELISA = Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay) ou ensaio de imunoabsorção
enzimática