Genômica - Genética Animal - Genética Veterinária

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O que é Genômica? 
 
 “Um monte de genética” 
 (Kowalchuk) 
O estudo sistemático de todas as seqüências de 
nucleotídeos, 
incluindo genes estruturais, seqüências regulatórias 
e segmentos de DNA não codificante, nos 
cromossomos de um organismo 
A evolução da biologia molecular na biologia dos 
sistemas 
A revolução genômica catapultou a biologia molecular para o domínio 
da biologia de sistemas 
Como estudar isto? 
• Novos métodos de seqüenciamento 
• Inovações comerciais 
• 454 pyro-sequencing 
• Illumina/SOLEXA technology 
• SOLiD plattform 
• HeliScope single molecule sequencer 
technology 
Molecular Structure of Nucleic Acids – A Structure 
for Deoxyribose Nucleic Acid 
(Nature, v.171, p.737, 25/04/1953) 
“Nós descobrimos o segredo da vida”. 
(Francis Crick) 
“A coisa mais importante que um gene poderia 
fazer, seria direcionar a síntese de uma proteína, 
provavelmente por meio de um RNA 
intermediário” 
(Francis Crick) 
1957: Francis Crick e George Gamow propõem o 
Dogma Central; 
O estudo integrado de 
complexos sistemas 
biológicos, incluindo 
genômica (DNA), 
transcriptômica (RNA), 
proteômica (proteínas) e 
metabolômica (moléculas 
pequenas) 
O que são -ômicas? 
Biologia de sistemas 
O alto grau de 
interações entre os 
componentes 
genotípico e 
fenotípico de um 
sistema torna 
mandatório o uso de 
técnicas 
sistemáticas para 
seu estudo e 
compreensão. 
• Automação 
• Equipamentos Robotizados de alta resolução e última 
geração 
• Custo elevado 
• Volume de dados é gigantesco 
• Fortemente dependente da Bioinformática 
• Softwares 
• Banco de Dados 
• Descrição de interações complexas 
• Geralmente é o caso em amostras ambientais 
• Modelos matemáticos (algoritmos sofisticados) 
• Organização hierárquica da modularidade em redes 
complexas 
Conjunto de análises holísticas e ainda detalhadas 
Modelo de utilização de galactose em levedura, na biologia de sistemas 
Integra os dados de expressão de 6000 genes 
Mas, ..... 
Por onde começar?! 
Uma das primeiras etapas em caracterizar um genoma é 
preparar mapas genéticos e físicos de seus cromossomos 
O termo “físico” é 
usado no sentido de 
que o mapa é 
composto de objetos 
reais (segmentos de 
DNA) que podem ser 
isolados e estudados 
em um tubo de 
ensaio 
As localizações cromossômicas de genes e outros marcadores moleculares 
podem ser mapeadas com base em frequências de recombinação, posições 
relativas de características citológicas ou distâncias físicas 
A genômica estrutural determina as seqüências de DNA de genomas 
inteiros 
Diz respeito à organização e seqüência da informação genética contida dentro 
de um genoma 
 
A caracterização de genomas inteiros é importante para uma compreensão 
fundamental dos princípios que funcionam em organismos vivos, e para a 
descoberta de novos genes, tais como os que têm papéis nas doenças 
humanas. 
Qual a lógica para criar um mapa de seqüência do genoma ? 
1. Cortar muitas cópias do genoma em fragmentos aleatórios; 
 
2. Fazer biblioteca de fragmentos clonados; 
 
3. Sequenciar cada clone; 
 
4. Superpor leituras de sequencias; 
 
5. Superpor contigs para sequencia completa. 
Etapas da Clonagem 
Molecular 
Requerimentos: 
 
•DNA de interesse 
 
•Vetores 
 
•Microrganismos/ Célula hospedeira 
 
•Enzimas 
Projetos genomas dependem da 
construção de bibliotecas de DNA 
Baseado na clonagem molecular 
Biblioteca de DNA 
Sequenciamento automático de DNA 
Identificar a sequência de nucleotídeos que compõem a molécula de DNA 
•A possibilidade de sequenciar uma amostra desconhecida de DNA permitiu um ímpeto 
enorme na biologia molecular; 
 
•Atualmente, as técnicas usadas são rápidas, altamente confiáveis e automatizadas; 
 
•A técnica de PCR dá suporte ao processo de sequenciamento de DNA; 
 
•A técnica atual mais popular envolve o uso de dideoxiribonucleotídeos trifosfatos, 
marcados fluorescentemente, para bloquear a síntese de DNA em pontos específicos. 
DNA polimerase precisa de 
um grupo OH-3’ livre 
Método de terminação da cadeia ou 
método dideoxi (Sanger) 
Sequenciamento automático de DNA 
Sequenciamento automático de DNA 
Base calling - softwares 
Etapas de um projeto genoma 
Preparação das bibliotecas 
Sequenciamento em larga escala de clones 
Montagem do genoma e fechamento dos gaps 
Anotação 
O sequenciamento genômico hoje é automatizado 
Anotação 
Finalizando um Projeto Genoma 
1º Nível: Nucleotídeos 
2º Nível: Proteínas 
3º Nível: Vias Metabólicas 
Aquisição e processamento das informações 
 Volume de dados é gigantesco; 
 
 Automação: Equipamentos Robotizados de alta 
resolução e última geração; 
 
 Bioinformática: 
 Softwares; 
 Banco de Dados. 
Os dois enfoques básicos para o seqüenciamento do 
genoma são o seqüenciamento shotgun de todo o 
genoma e o seqüenciamento de clone ordenado de 
mapas físicos 
Sequenciamento aleatório das sequencias de 
DNA, seguido de montagem do genoma 
Ordenamento dos clones (montagem de mapas físicos), 
seguido do sequenciamento do DNA dos clones 
O sequenciamento shotgun de genoma inteiro é particularmente bom para 
produzir sequencias com qualidade de rascunho de genomas complexos com 
muitas sequencias repetitivas 
 
Inicia com o sequenciamento de bibliotecas de clones genomicos de tamanhos 
diferentes 
 
As leituras de sequencias são obtidas para ambas as pontas dos insertos de 
clones e alinhadas 
 
As sequencias homologas superpostas são identificadas e os clones colocados 
em ordem, produzindo sequencias consenso para trechos de cópias únicas do 
genoma 
 
Dificuldade: Montagem na presença de várias classes de DNA repetitivo em 
genomas eucarioticos complexos. 
Seqüenciamento shotgun de todo o genoma 
Cria uma sequencia-rascunho de um genoma complexo 
Criando o mapa 
de seqüência de 
um genoma 
A lógica do sequenciamento de clone ordenado é o oposto do enfoque shotgun 
do genoma inteiro 
 
Os insertos clonados individuais de uma biblioteca genômica são triados quanto a 
similaridade em, por exemplo, sítios de reconhecimento de enzimas de restrição, 
indicando que dois insertos se superpõem para formar um clone contig 
 
A superposição nos diz que os insertos são contínuos no genoma 
 
Esse procedimento resulta em um conjunto de clones ordenados e orientados 
que, juntos, cobrem o genoma 
 
Tal conjunto ordenado e orientado de clones cobrindo todo o genoma é chamado 
de mapa físico do genoma 
 
O mapeamento físico continua ordenando os clones em grupos superpostos 
chamados de clones contigs. À medida que mais dados se acumulam, esses 
clones contigs se estendem ao longo de todos os cromossomos 
Seqüenciamento de clone ordenado de mapas físicos 
Mapear primeiro, sequenciar depois 
Quando o mapa físico de um genoma está completo, cada cromossomo será 
representado por um único mapa de contig 
Alinhamento de sequencias de DNA de contigs do 
cromossomo 2 humano 
O alinhamento de todos os contigs de um determinado cromossomo resultaria 
na reconstituição do cromossomo completamente sequenciado 
Estratégia de 
sequenciamento 
genômico clone-por-
clone (ou com base em 
mapeamento) 
Cromossomo 11 humano 
A bioinformática é um campo interdisciplinar que combina Biologia Molecular e 
Ciência da Computação. Ela desenvolve bancos de dados do DNA e sequencias 
de proteínas, bem como ferramentas para análise dessas sequencias 
 
A função de um gene desconhecido pode, as vezes, ser determinada 
encontrando genes com sequencia similar cuja função é conhecida. A função de 
um gene também pode ser determinada identificando os domínios funcionais na 
proteína que ele codifica. 
 
Previsões do mRNA e estrutura de polipeptídeos da sequencia de DNA 
genômico dependem da integração da informação da sequencia de cDNA, 
previsões de ligação, similaridades de polipeptídeose tendenciosidade de 
códons. 
Bioinformática 
Significado da sequencia genômica 
Identificação de ORFs 
Programa Wisconsin GCG Map 
Características de um gene que podem ser usadas durante a anotação 
Muitas formas de evidência são integradas para fazer previsões 
Little-boy e Fat-man 
Agosto de 1945 – Hiroshima e 
Nagasaki 
EUA promoviam o primeiro ataque 
nuclear da História 
100 mil mortes instantâneas 
 300 mil mortes após cinco anos 
 Dezenas de milhares em uma década 
Quais os efeitos da radiação sobre 
o DNA humano? 
 
Qual o efeito da exposição a 
elevadas doses de radioatividade 
sobre as taxas de mutações no 
DNA de sobreviventes deste 
ataque? 
 
Qual o efeito destas mutações 
sobre as gerações seguintes? 
As origens do projeto genoma humano
Departamento de Energia Norte-americano (DOE)
Dezembro de 1984 
1ª Reunião oficial co-patrocinada pelo 
DOE 
permitiu vislumbrar a possibilidade de seqüenciar o 
genoma humano 
Para responder às questões levantadas desde os 
ataque nucleares, precisávamos decifrar o genoma 
humano 
Anos 80: Avanço tecnológico e grande 
fertilidade intelectual 
HUGO – Human Genome Organization 
1988 
A partir do nosso genoma, nossa receita, conhecer toda 
a biologia humana, compreender completamente a 
nossa formação e o nosso funcionamento 
Coordenar os esforços de seqüenciamento do genoma humano 
internacionalmente 
Plano de execução em 15 anos 
Consórcio público internacional de pesquisadores: 
Projeto Genoma Humano (PGH) - 1990. 
US$ 200 milhões / ano 
Objetivos específicos do PGH 
• Determinar a seqüência bruta completa do genoma humano (~ 3 bilhões de 
bases) 
• Identificar os na época estimados 50 mil a 100 mil genes 
• Colocar toda essa informação em banco de dados para acesso público 
• Desenvolver instrumentos para análise desses dados 
• Discutir as questões éticas, legais e sociais que surgiram a partir do projeto 
• Realizar análises similares em organismos-modelo 
• Estabelecer relações evolutivas 
• Determinar mecanismos de regulação gênica 
• Determinar as bases de doenças genéticas e suas suscetibilidades 
Surge um competidor 
Celera Genomics Corporation - 1998 
J. Craig Venter declara que faria o 
seqüenciamento do genoma humano terminando 
a tarefa antes do consórcio público 
Conflito ético 
Concorrência fomentou o trabalho incentivando 
ambos os grupos a terminarem o projeto 
genoma em um prazo menor 
Patente de genes 
As duas estratégias de seqüenciamento acabaram sendo 
complementares, determinando a seqüência completa do 
genoma humano (Fevereiro, 2001) 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/ 
ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/H_sapiens/Assembled_chromosom
es/ 
O genoma humano é de domínio público 
Artigos 1 e 2 – http://www.unesco.org/human_rights/hrbc.htm 
Declaração Universal do Genoma Humano e dos 
Direitos Humanos (1997) 
“O genoma humano é base da unidade fundamental de 
todos os membros da família humana, assim como o 
reconhecimento de sua dignidade e diversidade 
herdadas. Em um sentido simbólico, é a herança da 
humanidade”. 
 
“Qualquer pessoa tem direito a ser respeitado por sua 
dignidade e seus direitos, independente de suas 
características genéticas”. 
“Esta dignidade torna imperativo não reduzir os 
indivíduos à suas características genéticas e respeitar 
suas singularidades e diversidades.” 
~ 44% 
Outros 
~ 45% 
Transposons 
~ 7% 
Heterocromatina 
~ 2% 
~ 30.000 genes 
 ~ 27.000 genes codificadores de 
proteína 
 
 ~ 3.000 genes codificadores de 
RNA 
DNA codificante 
DNA não-codificante 
Organização do genoma nuclear humano 
Categorias funcionais em que os genes do genoma humano foram 
classificados preliminarmente 
Com base na similaridade com proteínas de função conhecida 
● Testes genéticos preditivos estarão disponíveis para um dúzia de 
problemas 
● Intervenções para reduzir os riscos serão possíveis para vários 
destas doenças 
● Muitas clínicas vão começar a praticar a medicina genética 
● O diagnóstico genético pré-implantacional será amplamente 
disponível, e seus limites serão ferozmente debatidos 
● A proibição da discriminação genética estará em vigor nos Estados 
Unidos 
● Acesso a medicina genética permanecerá injusto, especialmente 
nos países em desenvolvimento 
(Francis Collins, 26/06/2000) 
Predições para 2010 
A genética fracassou? 
Edição 282 
setembro/2010 
Cura de doenças 
graves, vida mais 
longa e muito melhor 
– era isso que a 
medicina anunciava 
ao decifrar o DNA. 
Dez anos se 
passaram e muito 
pouco aconteceu. 
Aqueles que de alguma forma 
dramática esperavam os 
resultados da noite para o dia 
podem ficar desapontados, mas 
devem lembrar-se que a 
genômica obedece a Primeira 
Lei da Tecnologia: 
Nós invariavelmente 
superestimamos o 
impacto a curto prazo das 
novas tecnologias e 
subestimamos seus 
efeitos a longo prazo 
(Francis Collins, Abril de 2010) 
Quais áreas têm se beneficiado 
significativamente a partir do 
seqüenciamento do genoma humano? 
O projeto genoma fez o que as descobertas biológicas têm feito por décadas 
Ele abriu a porta de um vasto labirinto de novas questões 
Um único gene pode codificar a informação para mais de uma proteína 
(Ex. ± 25.000 genes →  100.000 proteínas no homem) 
Onde estão os 100.000 genes codificadores 
de proteínas? 
“Splicing” 
alternativo de RNA 
(padrões complexos 
de recomposição 
eucariótica de 
mRNA) 
Canadá, China, Japão, Nigéria, Reino Unido e Estados 
Unidos 
 Ajudar os pesquisadores a encontrar os genes 
associados com doenças humanas e na resposta aos 
fármacos 
Projeto Internacional HapMap 
Catálogo de variação 
comum no genoma 
 
> 100.000 indivíduos cujos 
ancestrais originaram-se 
da Europa, Ásia e África 
Enciclopédia dos Elementos do DNA para identificar todos 
 os elementos funcionais na seqüência do genoma 
humano 
Projeto ENCODE 
Identificação da localização 
dos genes 
 
Padrões de determinação de 
ativação e inativação de 
genes 
Acelerar a nossa compreensão da genética do câncer, 
utilizando tecnologias inovadoras de análise do 
genoma 
Projeto Altas do Genoma do Câncer 
Identificar fatores genéticos comuns que influenciam a saúde 
e a doença 
 
 Têm revelado um número de variação de DNA comum 
para doenças cardíacas, diabetes, câncer e doenças 
autoimunes 
Estudos de associação ampla do genoma 
Único parâmetro genômico flexível que pode alterar a função 
do genoma sob a influência exógena (controle do meio 
ambiente) 
 
 Constitui o elo principal e até agora ausente entre a 
genética, a doença e o ambiente, que desempenha um papel 
determinante na origem de praticamente todas as patologias 
humanas 
Projeto Epigenoma Humano 
Identificar, catalogar e interpretar 
padrões de metilação do DNA dos 
genes humanos em todos os 
principais tecidos 
A quantidade crescente de dados da seqüência do 
genoma é a base para a compreensão da vida como um 
sistema molecular e para o desenvolvimento de produtos 
médicos, farmacêuticos e outras aplicações práticas 
Enciclopédia Kyoto de Genes e Genomas 
http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html 
Mapa Global de Vias Metabólicas Humanas 
Em quanto tempo você espera que a medicina 
personalizada torne-se comum? ( a partir de 2010) 
Quanto ao futuro, a sua tarefa não é de 
prever, mas de habilitá-lo 
 
A sabedoria das areias (Antoine Saint-Exupéry)