Genética de Bactérias - Genética Animal veterinária zootecnia

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“Existe mais vida na boca de um homem 
do que homens em todo o reino” 
 
Antony van Leeuwenhoek 
(microscopista do século XVII) 
Organização do DNA bacteriano 
DNA plasmidial isolado pelas turmas nas aulas práticas 
P1 
P2 
Escherichia coli como organismo modelo 
• Assim denominada em homenagem a seu descobridor Theodore Escherich 
(bacteriologista do século XIX); 
• Características adequadas para a pesquisa genética; 
• Um único cromossomo circular pequeno (4,6 Mb); 
• 4000 genes sem íntrons; 
• Ciclo sexual possibilitado pela ação de um 
plasmídeo extragenômico chamado F 
(confere um tipo de masculinidade); 
• Outros plamídeos carregam genes de resistência a drogas e puderam ser adaptados 
como vetores gênicos; 
• Unicelular, simples divisão celular e tamanho pequeno (~1 μm): Cultivo em larga 
escala (grande número) e sujeita a intensa seleção e triagem para raros eventos 
genéticos; 
• Por meio de seleção e análise de mutantes, o funcionamento da maquinaria genética 
podem ser deduzidos; 
• Fenótipos como tamanho da colônia, 
resistência a drogas, uso de fonte de 
 carbono e produção de corantes 
tomaram o lugar de fenótipos visíveis da 
 genética de eucariontes. 
Trabalhando com Microrganismos 
Fenótipos bacterianos podem ser avaliados em suas colônias. Um estoque de células 
bacterianas pode ser cultivado em um meio líquido contendo nutrientes e, então um 
pequeno número de bactérias da suspensão líquida pode ser espalhada em meio 
sólido de ágar. Cada tipo de célula dará origem a uma colônia. Todas as células em 
uma colônia têm o mesmo genótipo e fenótipo. 
Clones bacterianos 
Colônia bacteriana 
Diluição seriada 
Cada diluição varia por um fator de 10; 
Cada colônia se originou de uma única célula bacteriana 
Crescimento Bacteriano 
Típica curva de crescimento 
As bactérias mutam 
espontaneamente e 
se multiplicam em 
uma velocidade 
exponencial 
Pré-requisitos para estudos de Genética 
• Possibilidade de obtenção e detecção de mutantes: 
• mutantes auxotróficos 
• mutantes morfológicos 
• mutantes resistentes a agentes inibidores de crescimento 
• antibióticos 
• bacteriófagos 
 
• Ocorrência de eventos de recombinação: 
• transformação bacteriana 
• conjugação bacteriana 
• sexodução 
• transdução 
• generalizada 
• restrita 
Quatro maneiras pelo qual o DNA bacteriano pode ser transferido de célula para 
célula 
Recombinação genética em bactérias 
• Auxotróficos 
• incapazes de crescimento em meio mínimo; 
• meio mínimo – 1 única fonte de carbono (energia) e sais 
minerais: 
•ex: thr-, lys-, arg-, etc 
 
• Morfológicos 
• coloração de colônias 
• formato das colônias, etc 
 
• Temperatura sensíveis (ts) 
• inativação de enzimas quando expostos a 37º ou 42º C, etc 
 
• Resistentes a agentes inibidores de crescimento 
• antibióticos – Apr, Kanr, Str, Cmr (plasmideos) 
• bacteriófagos - λ, P22, etc 
Mutantes bacterianos: 
Alguns símbolos genotípicos usados em genética de bactérias 
Meio mínimo é o meio sintético básico para crescimento 
de bactérias sem suplementos de nutrientes 
Colônias bacterianas podem ser distinguidas em meio de coloração 
(corante indicador) 
Colônias bacterianas, cada uma derivada de uma única célula 
Tipo selvagem lac+ 
Mutante lac- 
Mecanismo de captação de DNA pela bactéria 
• Uma bactéria sofrendo transformação capta DNA livre liberado de uma bactéria morta 
(por exemplo); 
• À medida que os complexos de ligação ao DNA na superfície da bactéria captam o DNA 
(inserto), as enzimas degradam um filamento em nucleotídeos; 
• Um derivado do outro filamento pode integrar-se ao cromossomo bacteriano. 
As células podem captar fragmentos de DNA do meio ambiente. Dentro da célula, esses 
fragmentos podem se integrar ao cromossomo. 
Micrografia eletrônica do fago T4 e vários estágios do processo 
infeccioso, que inclui a ligação e injeção do DNA 
Ciclo de um fago que lisa as 
células hospedeiras 
A infecção por um único fago 
redireciona a maquinaria da célula 
para fazer fagos de prole, que são 
liberados na lise 
Colônias de Fago (Placas de Lise) 
Uma placa é uma área clara na qual todas as bactérias foram lisadas por fagos 
Por infecção repetida e produção de fagos da prole, um único fago produz uma área 
clara, ou placa, na camada opaca de células. 
Eventos de recombinação envolvendo a transferência de material 
genético entre bactérias via bacteriófagos 
• Alguns fagos são capazes de captar genes bacterianos e levá-los de uma bactéria para 
outra (TRANSDUÇÃO); 
• Fagos virulentos: são os que imediatamente lisam as células e matam o hospedeiro; 
• Fagos temperados: podem permanecer dentro da célula hospedeira por um período 
sem matá-la, como um prófago. 
• Prófago: fago integrado ao genoma bacteriano. Seus hospedeiros sobrevivem como 
bactérias lisogênicas (capaz de ser lisada). 
TIPOS DE TRANSDUÇÃO 
 
• Generalizada: 
• fagos comuns Ex: M13, φX174, etc 
• Restrita ou especializada: 
• fagos específicos Ex; fago λ em E. coli 
• Abortiva: 
• situação anormal em que o cromossomo do fago é impedido de agir normalmente. 
Ciclo de um bacteriófago 
Transdução Generalizada 
Pode transferir qualquer gene do hospedeiro. Ela ocorre quando a embalagem do fago 
acidentalmente incorpora DNA bacteriano ao invés de DNA do fago. 
Transdução Especializada 
É devida a uma alça defeituosa do prófago no cromossomo bacteriano e , assim , o novo 
fago inclui tanto o fago quanto os genes bacterianos. O fago transdutor pode transferir 
apenas genes hospedeiros específicos. 
• O fago λ se insere por um crossing 
em sítios específicos; 
 
• A recombinação recíproca ocorre 
entre um sítio específico de ligação 
no DNA λ circular e uma região 
específica chamada sítio de ligação 
no cromossomo de E. coli, entre os 
genes gal e bio. 
•O crossing no sítio especializado de 
ligação produz uma bactéria lisogênica; 
 
•A bactéria lisogênica pode produzir λ 
normal ou, raramente, λdgal (defeituoso), 
uma partícula transdutora contendo o 
gene gal; 
 
•Transdutantes gal+ podem ser 
produzidos por co-incorporação de λdgal 
e λ (agindo como auxiliar) ou crossings 
flanqueadores do gene gal, um evento 
raro . 
unesp 
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
Campus DE JABOTICABAL 
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS 
Prof. Jackson A. Marcondes de Souza 
• Descoberta de um ciclo sexual incluindo um processo de crossing; 
 
• Organismo de estudo: E. coli. 
 
• Duas culturas auxotróficas foram misturadas gerando tipos selvagens prototróficos (WT). 
Comprovação da transferência de genes por conjugação 
bacteriana 
Joshua Lederberg e Edward Tatum (1940) 
• Células do tipo A ou tipo B não 
podem crescer em um meio não 
suplementado (mínimo), porque A 
e B levam mutações que causam a 
inabilidade em sintetizar 
constituintes necessários para o 
crescimento celular; 
 
• Quando A e B são misturadas por 
algumas horas e então plaqueadas, 
algumas colônias aparecem na 
placa de ágar; 
 
• Essas colônias foram derivadas de 
células únicas nas quais o material 
genético foi trocado; elas são 
portanto capazes de sintetizar 
todos os constituintes necessários 
ao metabolismo. 
Bernard Davis – Tubo em U 
•Exclusão da hipótese de alimentação cruzada (vazamento de substâncias que outras 
células podem absorver e usar para crescer); 
 
•Não são produzidos recombinantes, sem contato celular. 
• As linhagens auxotróficas A e B são 
cultivadas em ambos os lados do tubo 
em U; 
 
• O líquido pode ser passado entre os 
braços aplicando pressão ou sucção, mas 
as células não podem passar pelo filtro; 
 
• Após incubação e plaqueamento, 
nehuma colônia recombinante cresce no 
meio mínimo. 
A transferência de material genético na conjugação de E. coli não é recíproca. Uma célula, 
a doadora, transfere parte de seu genoma para outra célula, que atua como receptora. 
Conjugação Bacteriana usando pili 
Fator de Fertilidade (F) 
Pilus 
(projeção que liga a céluladoadora à célula receptora) 
•Habilidade do doador é em si um 
estado hereditário imposto por um 
fator de fertilidade (F); 
 
•Linhagens doadoras possuem F e 
são designadas F+; 
 
•Linhagens receptoras não 
possuem F e são designadas F-; 
 
•O plasmídeo F dirige a síntese dos 
pili na célula doadora 
Plasmídeo F 
Replicação em círculo rolante 
• O plasmídeo circular “rola” e a medida que gira ele desenrola uma cópia unifilamentar, 
como uma linha de pescar; 
 
• Essa cópia passa por um poro para a célula receptora onde o outro filamento é 
sintetizado, formando uma dupla hélice; 
 
• Uma cópia de F fica na doadora e a outra aparece na receptora (F- sendo convertido em 
F+). 
Linhagens Hfr 
Alta freqüência de recombinação (High frequency) 
• Gera 1000 x mais recombinantes ao ser cruzada com F-; 
• Hfr resulta da integração do fator F ao cromossomo; 
• Durante a conjugação, o fator F inserido no cromossomo ativa eficientemente parte 
desse cromossomo ou todo ele na célula F-; 
 
Conseqüência genética: 
O fragmento cromossômico pode então participar da recombinação com o cromossomo 
receptor. 
Exconjugantes: Uma bactéria fêmea que acabou de estar em conjugação com um macho e que contém um 
fragmento de DNA do macho. 
Crossings integram partes do fragmento doador 
transferido 
Após a conjugação são necessários crossings para integrar genes do fragmento doador 
ao cromossomo receptor e , assim, tornar-se uma parte estável de seu genoma. 
O exconjugante F- recombinante pode permanece F- 
Rastreamento do tempo de entrada do marcador gera um mapa 
cromossômico 
• O cromossomo Hfr, originalmente circular, desenrola uma cópia de si mesmo que é 
transferida para a célula F- de modo linear, com o fator F entrando por último. 
• Experimento de conjugação com reprodução interrompida, mostra o “timing” de 
transferência dos genes. 
Plotagem da freqüência dos alelos doadores em exconjugantes como função 
do tempo após a reprodução 
Atenção: as cores representantes em ambos os gráficos 
são distintas entre si, para cada gene. 
Resumindo - Conjugação 
Podem ocorrer dois tipos de transferência de DNA durante a conjugação 
Processo de Excisão 
Plasmídeos F que levam fragmentos cromossômicos 
• O fator F em linhagens Hfr é geralmente bem estável em sua posição de 
inserção; 
 
• Contudo, ocasionalmente uma reversão do processo de recombinação 
(EXCISÃO) permite a saída do plasmídeo; 
 
• Durante sua saída, o plasmídeo leva com ele uma parte do cromossomo 
bacteriano; 
 
• O processo ocorre por recombinação homóloga de pareamento em regiões 
denominadas seqüências de inserção; 
 
• Um plasmídeo F levando o DNA genômico bacteriano é chamado de plasmídeo 
F’(F primo). 
Outro evento 
de transferência 
de material 
genético 
Merozigoto: A célula é um diplóide parcial 
O DNA de um plasmídeo F’ é parte do fator F (fator de fertilidade) e parte 
do genoma bacteriano. Os plamídeos são transferidos rapidamente por 
conjugação. Eles podem ser usados para estabelecer diplóides parciais para 
estudos de dominância bacteriana e interação de alelos