Aula 02_Métodos de análise em Bioquímica Clínica

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Métodos de análise em Bioquímica Clínica
Apresentação
Nesta Unidade de Aprendizagem vamos aprender alguns métodos de Análise em Bioquímica 
Clínica. Veremos a importância dos testes de laboratório remoto (TLRs) e da escolha de aparelhos 
em laboratórios de pequeno e grande porte, além da avaliação da qualidade dos equipamentos. 
Além disso, conheceremos os princípios básicos de instrumentação de alguns aparelhos utilizados 
nos testes de Bioquímica Clínica.
Bons estudos.
Ao final desta Unidade de Aprendizagem, você deve apresentar os seguintes aprendizados:
Identificar as principais diferenças entre os tipos de equipamentos presentes em grandes e 
pequenos laboratórios.
•
Reconhecer a importância dos TLRs no diagnóstico clínico.•
Diferenciar os princípios básicos de instrumentação utilizados em algumas análises 
bioquímicas.
•
Desafio
O paciente J.R. foi encontrado desmaiado perto de um bar que costuma frequentar todos os dias 
por 25 anos. J.R. é um músico muito talentoso, entretanto, devido ao seu problema com o álcool, 
não alcançou o sucesso. O indivíduo apresentava escoriações pelo corpo, vômito ao seu redor e 
sinais de desidratação. Ele foi socorrido e levado imediatamente para a emergência do Hospital 
Pronto Socorro (HPS). Em um laboratório clínico, a análise de testes bioquímicos é essencial para o 
diagnóstico, prognóstico e tratamento do paciente. O médico plantonista solicitou os seguintes 
exames: intervalo de ânions, gasometria arterial, perfil hepático, glicose e eletrólitos.
Partindo deste contexto, responda:
a) Como você espera que esteja os níveis séricos de glicose de J.R.? Justifique sua resposta. 
b) O intervalo de ânions pode ser realizado através da subtração dos níveis de sódio da soma dos 
resultados de cloreto e bicarbonato. Um intervalo de ânions elevado pode indicar o que em um 
paciente com alcoolismo? 
c) Quais os testes bioquímicos que auxiliam o médico a diagnosticar alterações hepáticas? 
d) O que pode ser iniciado imediatamente como tratamento de J.R?
Infográfico
O infográfico mostra o esquema de alguns equipamentos utilizados no laboratório clínico na área 
de bioquímica.
Conteúdo do livro
Com o advento de novas tecnologias laboratoriais e de diagnóstico, a automação em laboratórios 
de análises clínicas tornou-se uma realidade. Exames que anteriormente poderiam levar horas para 
serem executados com determinados equipamentos passaram a ser feitos em minutos. Dessa 
forma, para se assegurar o fluxo ideal dentro da rotina laboratorial, é essencial que o profissional 
compreenda as rotinas de um laboratório no contexto da automação Laboratorial. Diferentes 
equipamentos entregam rotinas diferenciadas e de acordo com a realidade local. Conhecer os 
equipamentos e sua funcionalidade garantem o cumprimento dos prazos na rotina bem como 
segurança e confiabilidade nos resultados. 
Nessa Unidade de Aprendizagem você verá como a automação auxilia na prática bem como sua 
base teórica na utilização da automação laboratorial. 
Boa leitura. 
 
BIOQUÍMICA 
CLÍNICA
Ana Daniela Coutinho Vieira
Métodos de análise 
em bioquímica 
clínica
OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM
 > Identificar as principais diferenças entre os tipos de equipamentos presentes 
em grandes e pequenos laboratórios.
 > Reconhecer a importância dos TLRs no diagnóstico clínico.
 > Diferenciar os princípios básicos de instrumentação utilizados em algumas 
análises bioquímicas.
Introdução
A automação laboratorial deixou de ser apenas uma tendência distante e restrita 
em grandes laboratórios e passou a fazer parte dos estabelecimentos de análises 
clínicas em diversos níveis. Por isso, é imprescindível que os analistas conheçam os 
princípios e os fundamentos das principais metodologias utilizadas e os processos 
gerais envolvidos nesses equipamentos.
Neste capítulo, você vai aprender sobre os métodos laboratoriais mais utilizados 
na bioquímica clínica, explorando seus diferenciais e suas bases teóricas. Além 
disso, será possível compreender que as diferentes necessidades e os contextos 
laboratoriais influenciam diretamente a escolha do equipamento mais adequado 
para o laboratório, levando em conta, principalmente, sua capacidade técnica e 
financeira. Por fim, vai entender o que são os testes laboratoriais remotos (TLRs), 
de que forma estão inseridos na medicina diagnóstica e se eles se correlacionam 
com as demais funções laboratoriais.
Automação bioquímica em laboratórios 
de pequeno e grande porte
Atualmente, os laboratórios de análises clínicas abrangem estabeleci-
mentos de variados tamanhos/portes, desde os que realizam apenas 
testes mais básicos e com pouca automação (assegurados pelo enca-
minhamento de amostras mais complexas para centros de referência) 
até aqueles altamente automatizados (com capacidade para executar 
um leque maior de exames, em diferentes níveis de complexidade). Em 
qualquer um desses cenários, a necessidade de realizar testes com 
resultados cada vez mais rápidos e com menores taxas de erros exige 
uma constante modernização dos protocolos e equipamentos utilizados 
no laboratório (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; MCPHERSON; PINCUS, 2012; 
RECOMENDAÇÕES..., 2019).
Por abranger um fluxo bastante considerável de exames e testes por 
dia, o setor de bioquímica foi um dos primeiros a receber automação e 
tem se modernizado constantemente. Essa atualização permite uma maior 
interação entre os diferentes setores laboratoriais por meio do comparti-
lhamento de tecnologias, como os equipamentos que são úteis tanto para 
testes de bioquímica quanto de imunologia, por exemplo. Esse sistema 
de plataformas unificadas é uma tendência cada vez mais presente. Tais 
mudanças são possíveis, em parte, pelo progresso na triagem e nos cuida-
dos da etapa pré-analítica, por intermédio de protocolos e de automações 
que possibilitam um maior rastreamento e uma melhor setorização das 
amostras, bem como pela integração de diferentes analisadores analíticos 
em um mesmo sistema laboratorial, com interfaceamento automático de 
resultados e informações geradas pelo laboratório, incorporando as fases 
pré-analítica, analítica e pós-analítica (MCPHERSON; PINCUS, 2012; XAVIER; 
DORA; BARROS, 2016).
A Figura 1 apresenta o fluxo da rotina laboratorial, desde a necessidade 
da solicitação médica de um exame, passando por todas as suas fases 
de execução, até gerar um resultado que irá guiar uma conduta clínica. 
É possível notar que esse processo é bastante minucioso e exige a inte-
gração de diferentes etapas, profissionais e tecnologias (MCPHERSON; 
PINCUS, 2012).
Métodos de análise em bioquímica clínica2
A ALT não é uma realidade na maioria dos estabelecimentos devido 
ao seu alto custo de investimento e à necessidade de haver espaço 
estrutural para a instalação dos equipamentos (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; 
MCPHERSON; PINCUS, 2012). Apesar disso, é importante saber que já existem 
variadas plataformas disponíveis para a integração e a automação do processo 
laboratorial em sua quase totalidade, como é o caso do Sistema Aptio, da 
Siemens®. Para saber mais, assista ao vídeo “Siemens Aptio Automation” no 
canal Alaa Aljehani/ Laboratory Tech no YouTube.
Cada vez mais os laboratórios investem em analisadores automatizados 
individuais, em sistemas de processamento de informações (SIL — sistema de 
informações laboratoriais) e, em alguns casos, em processadores pré-analíticos. 
O grau de automação de um laboratório tem a influência direta das necessi-
dades locais relacionadas à complexidade dos exames solicitados, ao público 
atendido (ambulatorial, hospitalar) e, principalmente, à realidade financeira 
da empresa. Por isso, laboratórios de menor porte ou que não comportam tais 
tecnologias muitas vezes se limitam ao SIL e a analisadores automatizados ou 
semiautomatizados de acordo com a sua rotina e fluxo de exames (BISHOP; 
FODY; SCHOEFF, 2009; MCPHERSON; PINCUS, 2012; RECOMENDAÇÕES..., 2019).
Figura 1. Fluxo laboratorial de produção de resultados. ALT:Automação Laboratorial Total.
Fonte: McPherson e Pincus (2012, p. 15).
Métodos de análise em bioquímica clínica 3
A utilização de automação na etapa analítica já gera um enorme ganho em 
questão de tempo de execução e padronização, pois a maioria dos analisadores 
bioquímicos executa a análise desde a etapa de leitura de códigos de barra 
nos tubos de amostra, passando por pipetagem, manipulação de reagentes, 
incubação, leitura de reação, cálculos e transmissão de resultados (MCPHER-
SON; PINCUS, 2012). É importante salientar que os processos automatizados 
não estão livres de falhas e erros e, portanto, juntamente com a utilização 
desses analisadores, é necessário que os laboratórios conduzam rigorosos 
processos internos e externos de controle de qualidade. Uma das principais 
formas de verificação dos processos é a utilização de soros controle, ou 
seja, usam-se amostras com valores de analitos já conhecidas, por meio das 
quais o analista pode acompanhar o desempenho dos testes executados no 
laboratório. Além disso, outros dois pontos focais para a continuidade dos 
padrões de qualidade dos exames realizados são as manutenções corretivas 
e preventivas e a correção de possíveis falhas analíticas pela calibração dos 
equipamentos (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; MCPHERSON; PINCUS, 2012).
Testes laboratoriais remotos
Os TLRs (ou POCTs — point-of-care testing) são exames realizados fora do 
ambiente físico laboratorial. Trata-se de testes rápidos que fazem uso de 
metodologias simples e de fácil execução. Esses testes são realizados pró-
ximos ao paciente, muitas vezes em casa ou em estabelecimentos de saúde, 
como hospitais, unidades emergenciais, farmácias, clínicas especializadas e 
consultórios médicos ou em campanhas de saúde (ANDRIOLO, 2019; RECOMEN-
DAÇÕES..., 2019). O desenvolvimento de TLRs teve como objetivos principais: 
atender às necessidades de atendimento do paciente em unidades de saúde 
móveis ou distantes, possibilitar o diagnóstico em estudos de levantamento 
epidemiológicos, proporcionar a realização de triagens e atender às aspirações 
de automonitoração de pacientes com doenças crônicas. A grande vantagem 
desse tipo de teste é a possibilidade de usar uma pequena quantidade de 
amostra, geralmente sangue total ou urina, sem a necessidade de tratamentos 
prévios, como a centrifugação. Isso permite que os resultados sejam gerados 
rapidamente, diminuindo, assim, o turnaround time, ou seja, o tempo de 
retorno. Esses testes utilizam variadas metodologias, como reações enzimá-
ticas, imunológicas e eletroquímicas, e podem ser realizados em aparelhos 
portáteis, dispositivos imunocromatográficos, tiras reagentes, com cartões 
ou até mesmo sistemas eletrônicos (ANDRIOLO, 2019).
Métodos de análise em bioquímica clínica4
Um exemplo clássico de TLR são os testes de glicemia capilar que uti-
lizam uma pequena quantidade de sangue total para mensurar os níveis 
de glicose sérica e são muito úteis aos pacientes diabéticos que realizam 
o monitoramento desses níveis. Recentemente foram criados dispositivos 
mais modernos que têm a possibilidade de mensurar os níveis glicêmicos por 
meio de sensores subcutâneos conectados a dispositivos capazes de injetar 
insulina, em caso de necessidade. Esse tipo de produto, porém, ainda não é 
tão difundido quanto os clássicos glicosímetros (RECOMENDAÇÕES..., 2019).
Outra aplicação bastante útil dos TLRs é na mensuração dos gases sanguí-
neos e do pH em unidades hospitalares de terapia intensiva ou de emergência. 
Tais testes, assim como os demais TLRs, devem ser vinculados à supervisão 
de um laboratório clínico responsável e precisam manter os mesmos critérios 
de qualidade que os exames realizados no ambiente laboratorial, mantidas as 
suas proporções. Essa exigência é vinculada aos direcionamentos da RDC 302, 
de 13 de outubro de 2005, da Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), 
que regula o funcionamento de laboratórios clínicos. Para atender a essas 
demandas, alguns dispositivos portáteis têm sistemas de análise automática de 
controle de qualidade, com bloqueio do aparelho em caso de inconformidades, 
mas esta não é uma realidade em todos os TLRs (RECOMENDAÇÕES..., 2019).
Princípios básicos de instrumentação 
analítica
Na bioquímica clínica existe uma variedade de metodologias capazes de mensu-
rar os analitos-alvo, tais como técnicas fotométricas, eletroquímicas, eletroforé-
ticas, cromatográficas, imunoensaios e espectrometria de massa. Com o avanço 
das automações, alguns equipamentos oferecem a integração de mais de uma 
metodologia para resultados mais sensíveis e/ou específicos (XAVIER; DORA; 
BARROS, 2016). É essencial que todo profissional responsável pela manipulação 
de equipamentos analíticos conheça seus princípios e seu funcionamento, 
tanto para uma melhor interpretação dos resultados, quanto para eventuais 
necessidades de manutenção e calibração (MCPHERSON; PINCUS, 2012). 
Métodos fotométricos
Nas análises bioquímicas, a predominância abrange os testes que se baseiam 
em princípios de medida de energia radiante. Para tal mensuração, a energia 
que pode ser refletida, dispersa, emitida ou absorvida é detectada por um 
Métodos de análise em bioquímica clínica 5
sensor dentro do equipamento analítico. Quando essa energia é absorvida ou 
transmitida em forma de luz (energia luminosa), as metodologias são chamadas 
de fotométricas e avaliam as reações químicas por meio da interação da luz 
(visível ou não) com os substratos consumidos ou com os produtos formados na 
reação (MCPHERSON; PINCUS, 2012; XAVIER; DORA; BARROS, 2016, ANDRIOLO, 2019).
Uma das principais técnicas fotométricas é a espectrofotometria. Nela, 
a determinação da concentração de um analito em uma amostra é feita com 
base na absorção de luz monocromática por uma solução. Nessa metodo-
logia, a intensidade da luz emitida diminui ao passar por uma solução, pois 
ela é absorvida pelo produto gerado em uma reação química. A quantidade 
de luz absorvida é chamada de absorbância. Nesse método também é men-
surada a quantidade de luz que consegue passar sem ser absorvida pela 
solução (chamada de transmitância). Quanto maior for a concentração da 
solução, maior será a absorbância e menor será a transmitância, por outro 
lado, quanto menor for a concentração, menor será a absorbância e maior 
será a transmitância (Figura 2) (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; MCPHERSON; 
PINCUS, 2012; XAVIER; DORA; BARROS, 2016; ANDRIOLO, 2019).
Figura 2. (a) Um feixe de luz incide em uma solução (I) e parte da luz é absor-
vida. A fração de luz que não é absorvida, é transmitida (T) e detectada por um 
sensor. Caso a solução não absorva luz (branco), haverá uma transmitância de 
100% e (b) a avaliação da % de transmitância de uma solução é determinada 
relacionando a transmitância da amostra e do branco.
Fonte: Bishop, Fody e Schoeff (2009, p. 100).
Métodos de análise em bioquímica clínica6
A concentração da solução, por sua vez, está relacionada à quantidade de 
produto formado a partir de uma reação química específica que é utilizada 
para quantificar um analito. Para a dosagem de glicose em amostras bioló-
gicas, por exemplo, utiliza-se uma pequena quantidade de amostra (soro/
plasma) e são adicionados reagentes específicos que irão permitir a ocorrência 
de uma reação de oxidação da glicose a partir da ação das enzimas glicose 
oxidase e peroxidase, formando, assim, um produto chamado de antipiril-
quinonimina. Esse produto tem uma coloração vermelha, cuja intensidade é 
proporcional à concentração de glicose na amostra (LABTEST, [2011?]).
A espectrofotometria surgiu no início do século XVIII por intermé-
dio dos princípios de absorção criados por Bouguer. Ela permitiu a 
dosagem qualitativa e quantitativa de diversos analitos em amostras clínicas. 
Mais tarde, Lambert e Beer desenvolveram mais princípios de transformação 
de luz em medida de concentração, criando a lei de Lambert-Beer, ou lei de 
Beer, que afirma que a quantidade de luz absorvida (absorbância),ou a cor de 
uma solução, é proporcional à concentração da substância corada em solução 
(MCPHERSON; PINCUS, 2012; XAVIER; DORA; BARROS, 2016).
Um espectrofotômetro, portanto, deve ser capaz de utilizar a energia 
luminosa para gerar informações sobre a concentração de uma solução e, 
para isso, é composto basicamente por seis elementos: fonte, seletor de 
comprimento de onda, cuvet holder ou cubeta, fotodetector, processador 
de sinal e dispositivo de leitura (Figura 3) (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; 
MCPHERSON; PINCUS, 2012).
Fonte: uma lâmpada, geralmente de tungstênio ou tungstênio-halogênio, 
serve como fonte estável de energia radiante. Essa fonte luminosa fornece 
a energia que será absorvida pela solução. É importante notar que, nesse 
momento, todos os comprimentos de onda do espectro estão disponíveis, 
pois a luz é policromática. Diferentes tipos de fontes podem ser utilizados, 
dependendo da especificidade de cada equipamento e dos comprimentos de 
onda desejados. Por exemplo: lâmpadas de deutério para radiação ultravio-
leta (UV), lâmpadas de descarga de xenônio de alta pressão para emissões 
atômicas ou fontes laser que fornecem elevadas intensidades.
Métodos de análise em bioquímica clínica 7
Seletor de comprimento de onda: é um componente crítico para o funcionamento 
do espectrofotômetro, pois o seletor deve ser capaz de isolar uma região espe-
cífica do comprimento de onda emitido pela fonte (lâmpada) e focá-lo sobre a 
solução. Para esse fim, podem ser utilizados filtros, prismas e monocromadores.
Cuvet holder ou cubeta: é o recipiente em que a solução é inserida e irá 
absorver a fração de luz direcionada pelo seletor de comprimento de onda. 
Esses recipientes devem ser transparentes e seus tamanhos podem variar de 
acordo com os comprimentos de trajeto requisitados pelo equipamento. Nessa 
etapa do processo, parte da luz será absorvida pela solução (absorbância) e 
o restante será transmitido (transmitância).
Fotodetector: para determinar a quantidade de luz que foi capaz de passar 
pela amostra, o fotodetector irá receber a luz transmitida por meio de um 
cátodo e transformará essa informação em um sinal elétrico.
Processador de sinal: irá processar e transformar o sinal elétrico recebido 
em uma informação quantitativa.
Dispositivo de leitura: após o processamento do sinal elétrico, a informação 
gerada é disponibilizada em medidor ou dispositivo de leitura (BISHOP; FODY; 
SCHOEFF, 2009; MCPHERSON; PINCUS, 2012).
Figura 3. Representação gráfica do espectrofotômetro. (a) Lâmpada excitante, (b) fenda de en-
trada, (c) monocromador, (d) fenda de saída, (e) cubeta de amostra, (f) fotodetector e (g) display.
Fonte: McPherson e Pincus (2012, p. 40).
Métodos de análise em bioquímica clínica8
A partir de tais estruturas, podem ser medidas, na espectrofotometria, as 
absorbâncias da luz em uma solução. Mas, afinal, o que é a luz? Em resumo, a 
luz consiste em uma forma de radiação eletromagnética que forma movimen-
tos ondulatórios. A determinação do ponto em que a luz é detectável dentro do 
espectro leva em consideração o comprimento de onda eletromagnética que 
ela forma, sendo que esse comprimento é a distância linear entre duas cristas 
da onda. Tais conceitos são importantes para a compreensão das diferentes 
formas de leitura da luz em um espectrofotômetro, pois, dependendo do 
analito e do método escolhido, a leitura pode ser feita em diferentes pontos 
do espectro: luz visível, UV ou infravermelho (Figura 4). O que não muda 
entre esses métodos, porém, é o princípio de que quanto mais concentrada 
for a solução, maior será a absorbância de luz (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; 
MCPHERSON; PINCUS, 2012).
Figura 4. Demonstração do espectro de radiação eletromagnética com os diferentes tipos 
de luz originados em diferentes comprimentos de onda.
Fonte: McPherson e Pincus (2012, p. 39).
Métodos de análise em bioquímica clínica 9
Diferentes métodos podem ser analisados em um espectrofotômetro. 
Os mais utilizados são os colorimétricos, nos quais o produto da reação forma 
uma coloração no espectro de luz visível, e os UVs — nestes, as moléculas 
absorvem a energia luminosa no espectro UV. A metodologia colorimétrica 
é a mais frequente nas análises bioquímicas e se baseia na intensidade da 
cor e, consequentemente, da reação química. Ela é utilizada na mensuração 
de diversos analitos, como nas dosagens de glicose do exemplo citado an-
teriormente, e pode ser associada a técnicas enzimáticas, ou seja, técnicas 
que medem a atividade de uma enzima por intermédio da sua interação com 
um substrato, gerando, portanto, um produto colorido. Já a metodologia UV 
é independente da formação de compostos de cor, pois seus espectros de 
leitura atuam em uma faixa diferente de comprimento de onda. Nesse caso, 
a reação é avaliada pela quantidade de luz absorvida pelos substratos nico-
tinamida adenina dinucleotídeo e NADP nicotinamida adenina dinucleotídeo 
fosfato em uma reação (XAVIER; DORA; BARROS, 2016).
Esses métodos podem ser avaliados com diferentes formas de leitura. 
As leituras de ponto final são aquelas em que a atividade da enzima é men-
surada levando em consideração a medida do produto ao final da reação e 
esse produto se mantém estável durante um determinado tempo (durante 
o qual se realiza a leitura espectrofotométrica). Já nas leituras cinéticas, a 
atividade enzimática é mensurada em diferentes intervalos de tempo durante 
a formação do produto, sendo esta a mais precisa (PINTO, 2017).
Alguns pontos-chave devem ser levados em consideração para garantir o 
adequado funcionamento do espectrofotômetro e, por consequência, leituras 
fidedignas. É necessário, por exemplo, que se utilizem soluções como branco 
da amostra, branco do reagente, solução padrão e calibradores (BISHOP; 
FODY; SCHOEFF, 2009).
O branco do reagente é a leitura do reagente sem a adição da amostra. 
Ele deve ser utilizado sempre que a absorbância do reagente for diferente 
da absorbância da água. Nesse caso, o valor encontrado na absorbância do 
branco do reagente será equivalente à absorbância zero, ou inicial. De forma 
semelhante, o branco da amostra deve ser utilizado quando há possibilidade 
de interferência da amostra na leitura da absorbância, utilizando uma solução 
neutra de referência no lugar do reagente com a adição da amostra. A utili-
zação do branco da amostra é eficaz, principalmente em casos de amostras 
lipêmicas, ictéricas ou hemolisadas, pois a presença de lipídios, bilirrubina e 
hemoglobina em excesso interfere na leitura da absorbância, especialmente 
Métodos de análise em bioquímica clínica10
em se tratando de métodos colorimétricos e turbidimétricos. A utilização dos 
brancos minimiza os efeitos de interferentes que podem fazer com que parte 
da luz emitida possa ser refletida, dispersa ou absorvida, alterando, assim, a 
leitura real da solução de interesse (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; BASQUES, 
2016; RECOMENDAÇÕES..., 2018). Já a solução padrão e os calibradores são mais 
utilizados para a calibração do espectrofotômetro. Trata-se de soluções com 
uma concentração conhecida do analito em questão que podem ser utilizadas 
para a garantia da exatidão do comprimento de onda selecionado e da leitura 
do aparelho (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009).
Para uma aplicação prática dos termos abordados, utilizaremos 
uma reação de dosagem de glicose por metodologia enzimática-
-colorimétrica, com leitura de ponto final, em um aparelho manual (com ne-
cessidade de cálculo da reação pelo analista). Nesse caso, a faixa de leitura 
capaz de medir precisamente a absorbância indicada pelo fabricante é de 490 
a 520nm. Portanto, o espectrofotômetro deve ser configurado para a leitura 
neste comprimento de onda.
Para a execução do teste, serão necessárias três cubetas, as quais são 
chamadas de branco, padrão e teste.
 � Branco: com apenas o reagente.
 � Padrão: com o reagente e a solução padrão (concentração conhecida de 
100mg/dL de glicose).
 � Teste: com o reagente euma alíquota da amostra (soro/plasma do paciente).
A cubeta contendo o branco deve ser analisada primeiramente para zerar o 
equipamento, pois a leitura da sua absorbância será considerada zero, evitando, 
assim, a interferência do reagente na leitura. Em seguida, devem ser realizadas as 
leituras das cubetas Padrão e Teste. Após as leituras, o seguinte cálculo deverá ser 
realizado para a determinação da concentração de glicose (mg/gL) na amostra (Teste):
Sendo que o número 100, nessa equação, refere-se à concentração da solução 
padrão.
Supondo que a absorbância do padrão foi de 0,450 e a do teste foi de 0,380, 
tem-se a seguinte equação:
Métodos de análise em bioquímica clínica 11
Para facilitar a execução dos testes no dia a dia, devido à alta reproduti-
bilidade da técnica, pode ser utilizado o fator de calibração, que consiste na 
relação determinada entre a absorbância e a concentração da solução. Sendo, 
neste exemplo, obtido a partir da seguinte equação:
O valor da concentração da glicose no exemplo poderia ser obtido, mais 
facilmente, a partir do seguinte cálculo:
Glicose (mg/dL) = absorbância do teste × fator de calibração
Glicose (mg/dL) = 0,380 X 222 = 84 mg/dL
Dessa forma, conclui-se que a concentração de glicose na amostra do paciente 
é igual a 84 mg/dL. Em aparelhos automatizados e semiautomatizados, esse 
cálculo é gerado automaticamente.
Ainda no sentido de acurácia do teste, outro ponto crítico é a linearidade. 
Segundo a Lei de Beer, a quantidade de energia capaz de ser transmitida pela 
solução diminui exponencialmente de acordo com a espessura da solução que 
precisa atravessar, ou seja, a transmitância será inversamente proporcional 
à concentração da solução. Na prática laboratorial, uma forma de avaliar a 
linearidade é utilizar calibradores com concentrações conhecidas (em diferen-
tes concentrações) e medir as suas absorbâncias. Com isso, torna-se possível 
criar um gráfico com uma curva padrão do teste. Nesse gráfico, geralmente 
o valor de absorbância inicial é próximo de zero, pois se utiliza o branco 
como o primeiro calibrador. Em seguida, são lançados os valores dos demais 
calibradores e é gerado o gráfico (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; MCPHERSON; 
PINCUS, 2012). Se o teste executado estiver em concordância com a Lei de 
Beer, ocorrerá a formação de uma reação linear que servirá de base para que 
o equipamento faça a conversão dos valores de absorbâncias encontradas 
em soluções posteriores e a referida concentração das amostras. Porém, a 
linearidade só obedece a esses princípios até uma determinada concentração, 
que varia de teste para teste, e acima disso causa um desvio na curva. Esse 
ponto é chamado de limite de linearidade. Acima dele, a amostra deve ser 
diluída e ter seu valor posteriormente corrigido para garantir a acurácia da 
análise (Figura 5) (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; MCPHERSON; PINCUS, 2012).
Métodos de análise em bioquímica clínica12
A espectrofotometria utiliza essencialmente química úmida (reagentes 
líquidos) para as análises. Já reflectometria, ou fotometria de reflectância, 
é bastante semelhante à espectrofotometria, com a diferença básica de que 
utiliza química seca, e por isso a mensuração se baseia na luz refletida e não 
na absorvida. Os reflectômetros são bastante semelhantes aos fotômetros 
em questão de composição, diferindo pela presença de suportes sólidos 
secos (granulosos ou fibrosos) para a reflexão da luz. Esses equipamentos são 
muito utilizados em automações para análises de leitura das tiras reagentes 
de urina, por exemplo, ou para dosagens colorimétricas de glicose, colesterol, 
triglicérides, entre outros analitos bioquímicos (BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; 
MCPHERSON; PINCUS, 2012; ANDRIOLO, 2019).
Outra variação de teste fotométrico é a luminescência. Essa metodologia 
se baseia na troca de energia gerada a partir da absorção de radiação eletro-
magnética pelos compostos. Tal absorção gera uma agitação que pode ser 
quantificada pela emissão de luz fluorescente que é detectável por fluorômetros 
e espectrofluorômetros. A luminescência tem sensibilidade e especificidade 
bastante altas, mas que foram melhoradas ainda mais na quimiolumines-
cência, uma variação da técnica que utiliza substâncias químicas ou reações 
eletroquímicas para a produção de compostos excitados. Essa metodologia é 
Figura 5. O gráfico demonstra a correlação entre concentração da amostra 
e absorbância da solução. A curva gerada consegue ser linear até uma 
determinada concentração, depois desse ponto, há um desvio na Lei de Beer.
Fonte: McPherson e Pincus (2012, p. 40).
Métodos de análise em bioquímica clínica 13
muito utilizada em imunoensaios (MCPHERSON; PINCUS, 2012; ANDRIOLO, 2019). 
Já na fotometria de chama é analisada a emissão de luz a partir da excitação 
dos átomos da solução contendo a amostra do paciente pela exposição a uma 
chama. Os átomos emitem luz quando retornam do estado excitado para o de 
repouso e, a partir de comprimentos de onda específicos, a luz emitida pode 
ser quantificada. Essa técnica é bastante útil na dosagem de íons como sódio, 
potássio e lítio por exemplo (XAVIER; DORA; BARROS, 2016).
Outras metodologias com base na excitação de átomos são a espec-
trometria de emissão atômica e espectrometria de absorção atômica. 
A espectrometria de emissão atômica se baseia na capacidade de os átomos 
ou íons emitirem radiações com comprimento de onda específicos quando 
excitados, sendo a intensidade dessa radiação luminosa proporcional ao 
conteúdo de metal na amostra. Já a espectrometria de absorção atômica 
consiste na medida da absorção de luz por átomos metálicos em repouso. 
Trata-se de metodologias usadas para a detecção de íons e metais em fluídos 
biológicos (XAVIER; DORA; BARROS, 2016; ANDRIOLO, 2019).
Por fim, a turbidimetria e a nefelometria são utilizadas para a mensuração 
de compostos que não podem ser avaliados por métodos de absorção, pois são 
partículas grandes (p.ex., proteínas). Nessas técnicas, avalia-se a dispersão 
da luz após atingir os compostos em suspensão na solução, visto que essas 
partículas dispersam a luz de forma proporcional à sua concentração na 
amostra biológica. Esse tipo de metodologia é principalmente utilizada nas do-
sagens de proteínas em urina e fluidos biológicos (cerebrospinal, pulmonares, 
ascético, etc.), como transferrina, proteína C reativa ou microalbuminúria. Os 
nefelômetros detectam a luz dispersa em vários ângulos, já os turbidímetros 
quantificam a diminuição da transmissão de luz em decorrência da formação 
de partículas na solução (MCPHERSON; PINCUS, 2012; XAVIER; DORA; BARROS, 
2016; ANDRIOLO, 2019).
Métodos eletroquímicos
Os métodos eletroquímicos também podem ser bastante úteis na bioquímica 
clínica, com destaque para as técnicas de potenciometria e eletrodos íons 
seletivos (ISE). Tais métodos realizam a mensuração da voltagem entre dois 
eletrodos em uma solução. Essa voltagem é o potencial e deve ser compa-
rado entre os eletrodos, pois um deles deve ser o teste e o outro o eletrodo 
referência. Sua aplicação é útil na detecção de íons, pois estes são capazes 
de causar alterações entre esses potenciais. A gasometria, por exemplo, 
pode ser executada por meio dessa técnica para a quantificação de CO2, O2 
Métodos de análise em bioquímica clínica14
e pH no sangue, porém, outros metabólitos e eletrólitos também podem 
ser dosados por essa metodologia, como cálcio ionizado, chumbo e cloro 
(BISHOP; FODY; SCHOEFF, 2009; MCPHERSON; PINCUS, 2012; XAVIER, DORA; 
BARROS, 2016; ANDRIOLO, 2019).
Outros métodos utilizados em bioquímica clínica
A eletroforese utiliza uma corrente elétrica para gerar um fluxo que separa os 
compostos de uma solução iônica de acordo com a carga elétrica e o tamanho 
dos seus compostos. Nesse fluxo, os cátions, carregados positivamente (+), 
migram para o polo negativo enquanto os ânions, carregados negativamente 
(–), migram para o polo positivo. Essa separação forma bandas que podem ser 
identificadase quantificadas, possibilitando, com isso, a análise de proteínas 
plasmáticas, macromoléculas, íons inorgânicos e drogas (MCPHERSON; PINCUS, 
2012; XAVIER; DORA; BARROS, 2016; ANDRIOLO, 2019).
A cromatografia é a separação de uma solução com base nas interações 
físicas e químicas dos compostos com uma fase móvel e uma fase estacionária. 
A fase móvel é responsável por transportar a amostras pela fase estacionária. 
Diversos tipos de cromatografia foram desenvolvidos e, em alguns casos, 
associam outras técnicas analíticas para a detecção dos compostos, como 
é o caso da cromatografia líquida de alta resolução, que pode realizar a 
quantificação por fotometria, potenciometria, entre outras técnicas (BISHOP; 
FODY; SCHOEFF, 2009; XAVIER; DORA; BARROS, 2016; ANDRIOLO, 2019).
 � Cromatografia em camada delgada: detecção qualitativa de aminoá-
cidos, fosfolipídios e rastreamento toxicológico.
 � Cromatografia líquida de alta resolução: detecção quantitativa de 
aminoácidos, hemoglobinas, vitaminas, entre outros.
 � Cromatografia gasosa: detecção de ácidos orgânicos e fármacos, prin-
cipalmente (XAVIER; DORA; BARROS, 2016).
Os métodos que se baseiam em imunoensaios utilizam as reações de 
antígeno-anticorpo para detectar imunocomplexos, anticorpos ou antígenos. 
Apesar de terem sido utilizados primariamente para o diagnóstico de doenças 
infecciosas, a técnica foi adaptada e hoje em dia é amplamente usada na detec-
ção de marcadores tumorais e medicamentos e na quantificação de hormônios. 
Para facilitar a detecção dos imunocomplexos e aumentar a sensibilidade dessa 
metodologia, muitas vezes são utilizados reagentes marcadores enzimáticos, 
fluorescentes ou quimioluminescentes (XAVIER; DORA; BARROS, 2016).
Métodos de análise em bioquímica clínica 15
A espectrometria de massas, por sua vez, baseia-se na fragmentação 
e na ionização de moléculas, sendo que a abundância relativa de cada íon 
produz um espectro de massa característico. Nesse tipo de equipamento, 
há a ionização da molécula-alvo de análise, que a separa das demais subs-
tâncias presentes na amostra e possibilita a identificação e a quantificação 
do composto com base na sua relação massa/carga (MCPHERSON; PINCUS, 
2012; ANDRIOLO, 2019).
Em geral, a maioria dos analisadores automatizados utiliza, de forma 
predominante, as técnicas de espectroscopia de absorbância (espectrofoto-
metria), porém, cada vez mais a fotometria de reflectância, os imunoensaios 
e a eletro e quimioluminescência vêm sendo incorporados às plataformas. 
Da mesma forma, os ISEs são cada vez mais utilizados para as dosagens de 
eletrólitos, sendo a fotometria de chama deixada em desuso. Um exemplo 
bastante conhecido no âmbito laboratorial é a plataforma COBAS®, a qual 
incorpora fotômetro, ISE, óptica turbidimétrica e fluorescência polarizada 
em um mesmo sistema, embora haja várias outras disponíveis no mercado 
laboratorial (MCPHERSON; PINCUS, 2012).
Referências
ANDRIOLO, A. (ed.). Manual da residência de medicina laboratorial. Barueri: Manole, 2019.
BASQUES, C. J. Fotometria e padronização. Lagoa Santa: Labtest, 2016.
BISHOP, M. L.; FODY, E. P.; SCHOEFF, L. E. Química clínica: princípios, procedimentos, 
correlações. 5. ed. Barueri: Manole, 2009.
LABTEST. Glicose Liquiform: instruções de uso. [Lagoa Santa]: Labtest, [2011?].
MCPHERSON, R. A.; PINCUS, R. M. Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos 
laboratoriais. 21. ed. Barueri: Manole, 2012.
PINTO, W. J. Bioquímica clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017.
RECOMENDAÇÕES da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial 
(SBPC/ML): fatores pré-analíticos e interferentes em ensaios laboratoriais. Barueri: 
Manole, 2018.
RECOMENDAÇÕES da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial 
(SBPC/ML): inovação no laboratório clínico Barueri: Manole, 2019.
XAVIER, R. M.; DORA, J. M.; BARROS, E. (org.). Laboratório na prática clínica. 3. ed. Porto 
Alegre: Artmed, 2016. (Consulta Rápida).
Métodos de análise em bioquímica clínica16
Leitura recomendada
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Reso-
lução de Diretoria Colegiada – RDC nº 302, de 13 de outubro de 2005. Dispõe 
sobre Regulamento Técnico para funcionamento de Laboratórios Clínicos. 
Brasília, DF: Ministério da Saúde, 2005. Disponível em: http://portal.anvisa.
gov.br/documents/10181/2718376/RDC_302_2005_COMP.pdf/7038e853-afae-
4729-948b-ef6eb3931b19. Acesso em: 2 set. 2020.
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Métodos de análise em bioquímica clínica 17
Dica do professor
O vídeo demonstra alguns instrumentos e métodos utilizados no laboratório clínico. Além disso, 
está listado a importância do monitoramento sobre os equipamentos e os princípios básicos das 
técnicas.
Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.
Exercícios
1) 
Quais das seguintes alternativas não é um fator importante na escolha dos equipamentos 
para o laboratório?
A) a) Número de testes que serão realizados.
B) b) Custo do teste unitário.
C) c) Qualidade do resultado.
D) d) Marca do aparelho.
E) e) Preço e manutenção do aparelho.
2) 
Quais das seguintes metodologias pode ser utilizada para análise da bioquímica urinária?
A) a) Eletroquímica.
B) b) Amperometria.
C) c) Fotometria.
D) d) Eletro íon-seletivos.
E) e) Fotometria de reflectância de fase sólida.
3) 
Alguns analitos podem ser solicitados pelos médicos com menos frequência. Cite qual 
analito abaixo é útil para a investigação de sintomas de estresse.
A) a) Hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e cortisol.
B) b) Insulina.
C) c) Hormônio do crescimento (GH).
D) d) Glucagon.
E) e) Hormônio folículo-estimulante (FSH).
4) 
Assinale a alternativa que não segue um princípio básico de instrumentação no laboratório 
clínico do setor de Bioquímica.
A) a) Fotometria.
B) b) Citometria de fluxo.
C) c) Tecnologia eletroquímica.
D) d) Fotometria de reflectância.
E) e) Eletrodo íons-seletivos.
5) 
Quais das partes internas do espectrofotômetro que dispersa a luz em um espectro?
A) a) Cubeta da amostra.
B) b) Detector óptico.
C) c) Monocromador.
D) d) Mostrador digital.
E) e) Fonte de luz.
Na prática
Diagnóstico na beira do leito. Como funciona o teste laboratorial remoto?
 
 
 
Para manter a acurácia dos resultados e sua confiabilidade, os aparelhos são calibrados e utilizados 
por uma equipe bem treinada pelo pessoal do laboratório. Um controle de qualidade é realizado e o 
coordenador do TLR é o responsável por manter as exigências e ter a aprovação de acreditação. 
Portanto, as TLRs são ferramentas importantes no controle e cuidado da saúde, mas devem ser 
monitoradas com muito rigor a fim de manter a qualidades dos exames.
Saiba +
Para ampliar o seu conhecimento a respeito desse assunto, veja abaixo as sugestões do professor:
Introdução à espectrofotometria
Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.
Aparelho COBAS
Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.
NELSON DAVID L, COX MICHAEL M, Princípios de 
Bioquímica de LEHNINGER. 6. ed. Porto Alegre: Grupo A, 
2014.
Conteúdo interativo disponível na plataforma de ensino!