Crescimento microbiano

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25/11/2015
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Crescimento microbiano
Introdução
• Fatores necessários para o crescimento 
microbiano
– Físicos: pH, pressão osmótica, temperatura
– Químicos: fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, 
fósforo, oxigênio 
Fatores físicos - Temperatura
• Temperatura
– Psicrófilos
– Psicrotróficos
– Mesófilos
– Termófilos
– Hipertermófilos
Classificação Variação de 
temperatura (°C)
Temperatura ótima 
(°C)
Psicrófilos -10 a 20 10
Psicrotróficos 5 a 30 25
Mesófilos 10 a 45 37
Termófilos 40 a 75 55
Hipertermófilos 65 a 120 90-100
Fatores físicos - Temperatura
• Psicrófilos: temperatura ótima 15 °C –
profundezas dos oceanos, regiões polares, 
geralmente não causam problemas na 
conservação de alimentos
• Psicrotróficos: temperatura ótima de 
crescimento entre 20 e 30 °C. Responsável 
pela deterioração ou pelas enfermidades 
transmitidas pelos alimentos 
Fatores físicos - Temperatura
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• Mesófilos: temperatura ótima de crescimento 
entre 25 e 40 °C. Responsável pela maior 
parte da deterioração ou pelas enfermidades 
transmitidas pelos alimentos 
• Termófilos: temperatura ótima de crescimento 
entre 50 e 60°C 
Fatores físicos - Temperatura
• Hipertermófilas: temperatura ótima de 80 °C. 
Ex: archaea
Fatores físicos - Temperatura
Fatores físicos - pH
• Acidez ou alcalinidade de uma solução
• Classificação dos alimentos
– pH > 4,5 = pouco ácidos mais sujeitos ao 
crescimento microbiano
– pH entre 4,0 e 4,5 = ácidos crescimento de 
bolores e leveduras e poucas bactérias (láticas e 
espécies de Bacillus)
– pH < 4,0 = muito ácidos crescimento de bolores e 
leveduras e multiplicação de bactérias acidófilas
Fatores físicos - pH
• Importância da elaboração do meio de cultura
– Neutralização dos ácidos produzidos pelas 
bactérias
• Peptona, aminoácidos, fosfatos
Fatores físicos – Pressão osmótica
• Importância da água para os microrganismos
• Dependendo da solução:
– Isotônica
– Hipotônica
– Hipertônica
Fatores físicos – Pressão osmótica
• Halofílicos extremos – altas concentrações de 
sal
• Halofílicos obrigatórios – sal necessário para o 
desenvolvimento
• Halofílicos facultativos – não necessitam de 
altas concentrações de sal (2%)
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Fatores físicos – Pressão osmótica
Fatores químicos
• Carbono
– Síntese de todos os compostos orgânicos necessários 
para a viabilidade celular
– Metade do peso seco de uma bactéria é composta de 
carbono
• Nitrogênio, enxofre e fósforo
– Síntese de proteína (grupos amino dos aminoácidos): 
N e S
– Síntese de DNA e RNA: N e P
– Peso seco da bactéria: 14% N e 4% S e P
Fatores químicos
• Nitrogênio, enxofre e fósforo
– Formas de obtenção de N: decomposição de 
proteínas, amônia, nitrato, nitrogênio gasoso 
(fixação do nitrogênio)
– Enxofre: síntese de aminoácidos contendo enxofre 
e vitaminas (tiamina e biotina)
• Fontes de enxofre: sulfato, sulfito de hidrogênio e 
aminoácidos
– Fósforo: síntese de ácidos nucléicos e de 
fosfolipídeos 
• Fontes de fósforo: ligações de ATP, fosfato
Fatores químicos
• Oligoelementos ou elementos traços
– Elementos minerais: ferro, cobre, molibdênio e 
zinco
– Essenciais para a atividade de algumas enzimas 
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Fatores químicos
• Oxigênio
– Aeróbios estritos ou obrigatórios: necessitam de 
oxigênio
– Anaeróbios facultativos: utilizam oxigênio quando 
disponível, mas na ausência continuam o 
metabolismo por respiração anaeróbia ou 
fermentação
Fatores químicos
• Oxigênio
– Anaeróbios estritos: não utilizam oxigênio 
molecular para as reações de produção de energia
• Oxigênio singlet: altamente reativo
• Radicais superóxidos livres (O2
-): extremamente tóxico, 
pois é muito instável
– Necessidade da enzima: superóxido dismutase (SOD) –
neutralizar esses radicais livres
O2
- + O2
- + 2H+ H2O2 + O2
Fatores químicos
• Oxigênio
– Anaeróbios estritos: não utilizam oxigênio 
molecular para as reações de produção de energia
• Ânion peróxido (O2
2-) produzido durante respiração 
aeróbica
– Necessidade da enzima catalase ou peroxidase
2 H2O2 2H2O + O2
H2O2 + 2H
+ 2H2O 
Fatores químicos
• Oxigênio
– Anaeróbios estritos: não utilizam oxigênio 
molecular para as reações de produção de energia
• Radical hidroxila (OH): forma intermediária do oxigênio, 
sendo provavelmente o mais reativo
Microrganismos anaeróbios estritos não 
produzem SOD nem catalase
Fatores químicos
• Oxigênio
– Anaeróbios aerotolerantes: toleram a presença de 
oxigênio, mas não utilizam para a sua 
multiplicação
• Fermentam carboidratos ácido lático
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Fatores químicos
• Oxigênio
– Microaerófilas: são aeróbicas e necessitam de 
oxigênio (quantidade inferior a presente no ar 
atmosférico)
Fatores orgânicos de crescimento
• Orgânicos essenciais que o organismo não é 
capaz de sintetizar
– Vitaminas
– Aminoácidos
– Purinas
– Pirimidinas
Meio de cultura
• Material preparado em laboratório para a 
multiplicação ou crescimento de 
microrganismos
• Inóculo: microrganismos que iniciam sua 
multiplicação em meio de cultura
• Cultura: microrganismos que crescem e se 
multiplicam nos meios de cultura
Meio de cultura
• O que deve ser considerado para preparar um 
meio de cultura para um microrganismo?
– Nutrientes corretos para a multiplicação do 
microrganismo
– Quantidade de água necessária
– pH ajustado
– Quantidade específica de oxigênio, ou mesmo a 
ausência
– Estéril
– Tempo e temperatura adequada durante incubação
Meio de cultura
• Sólidos – adição de agar (polissacarídeo)
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Meio de cultura – meio 
quimicamente definido
• Meio quimicamente definido
– Composição química exata é conhecida 
– Fonte de C, N, S, P
– (Ex: meio para E. coli)
Componentes quantidades
Glicose 5 g
Fosfato de amônia monobásico (NH4H2PO4) 1 g
Cloreto de sódio (NaCl) 5 g
Sulfato de magnésio (MgSO4. 7 H2O) 0,2 g
Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) 1 g
Água 1 L
Meio de cultura – meio 
quimicamente definido
• Organismos que necessitam de muitos fatores 
de crescimento = fastidiosos ou muito 
exigentes em termos nutricionais
Componentes Quantidade
Glicose 9,1 g
Amido 9,1 g
Acetato de sódio 1,8 g
Citrato de sódio 1,4 g
Oxalacetato 0,3 g
Fosfato de potássio dibásico 12,7 g
Cloreto de sódio 6,4 g
Fosfato de potássio monobásico 5,5 g
Bicarbonato de sódio 1,1 g
Sulfato de potássio 0,9 g
Sulfato de sódio 1,1 g
Cloreto de magnésio 0,3 g
Cloreto de amônio 0,8 g
Nitrato férrico 0,006 g
Biotina 0,005 g
Água 1 L
Meios de cultura – meio complexo
• Meio complexos: composto de nutrientes 
como extrato de levedura, extrato de carne ou 
de plantas ou produtos da digestão protéica 
dessas ou de outras fontes 
– Principal fornecedor de energia, carbono, 
nitrogênio e enxofre é o componente protéico
Meios de cultura – meio complexo
• Principal fornecedor de energia: componente 
protéico
– Peptonas (pequenas cadeias de aminiácidos )
– Extrato de carne e de levedura – vitaminas e 
outros fatores de crescimento orgânico
Meios de cultura – meio complexo
• Ágar nutriente
Componentes quantidades
Agar 15 g
Extrato de carne 3 g
Cloreto de sódio 8 g
Peptona (proteína parcialmente 
digerida)
5 g
Água 1 L
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Meio para microrganismos 
anaeróbios
• Meios redutores: possuem reagentes como 
tioglicolato de sódio (combina-se com o 
oxigênio dissolvido eliminando ele do meio de 
cultura)
• Tubos com tampas seladoras
• Para eliminação do oxigênio, os tubos são 
aquecidos imediatamente antes da utilização
• Para placas de Petri são utilizadas jarras 
especiais + sachês de bicarbonato de sódio ou 
de boroidreto de sódio = H2 e CO2
Câmara de anaerobiose
Microrganismos 
capnofílicos
Meio cultivo seletivo 
• Meios seletivos: favorecer a multiplicação de 
bactéria de interesse e impedir multiplicação 
de outras
– Ágar sulfeto de bismuto (BS): Salmonella Typhi, 
sulfeto de bismuto inibe o crescimento de 
bactérias Gram-positivas e outras Gram-negativas
– Ágarverde-brilhante: Salmonella, corante verde 
brilhante inibe o crescimento de bactérias Gram-
positivas
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Meio cultivo seletivo 
A: Salmonella sp.
B: Klebsiella pneumoniae
C: Pseudomonas aeruginosa
Meio diferencial
• Meio diferencial: fácil identificação da colônia 
da bactéria quando existem outras bactérias 
na mesma placa
– Meio ágar sangue: bactérias que provocam a lise 
das células sanguíneas apresentando um halo 
(beta-hemólise) 
Meio seletivo e diferencial
• Meio seletivo e diferencial: 
– Ágar MacConkey: sais biliares, cristal violeta 
(inibidores de Gram-positivas); lactose (fermentar 
a lactose)
1 - Enterobacter 
aerogenes
2 - E. coli
3 - Staphylococcus 
epidermidis
4 - Salmonella 
Typhimurium
Meio seletivo e diferencial
• Meio seletivo e diferencial: 
– Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB): eosina e azul 
de metileno (inibidores de Gram-positivas); 
lactose (fermentar a lactose)
1 – E. coli
2 – Pseudomonas 
aeruginosa
3 – Enterobacter 
aerogenes
4 – Staphylococcus 
aureus
Meio seletivo e diferencial
• Meio seletivo e diferencial: 
– Ágar Sal Manitol : 7,5% de NaCl (impede o 
crescimento de outros microrganismos) e o 
manitol (fermenta o manitol)
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Meio de enriquecimento
• Meio de enriquecimento: para o isolamento 
de bactérias presentes em pequeno número 
juntas com outras que estão em grande 
número
– Normalmente líquido e contém todos os 
nutrientes necessários
– Pode ser seletivo, mas aumenta o número de 
bactéria tornando-a detectável
Obtenção de culturas puras
• Origem da colônia: 
– Uma única célula vegetativa
– Um único esporo
– Grupo de microrganismos em grumos ou em 
cadeias
• Método do esgotamento – permitir a 
visualização de colônias individualizadas na 
placa
Multiplicação de microrganismo
• Divisão binária: as bactérias normalmente de 
reproduzem por fissão binária, outras podem 
se reproduzir por brotamento
• Tempo de geração: somente por fissão binária, 
é o tempo para uma célula se dividir e sua 
população dobrar de tamanho
• Expressão matemática do crescimento 
– progressão geométrica do número 2:
• 1 2 4 8 16 32 ......... X
• 2º 21 22 23 24 25 ......... 2n
Multiplicação de microrganismo
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• Tempo de geração é influenciado por fatores 
ambientais como temperatura
– E coli: tempo de geração de 20 minutos
• 20 gerações (~7 horas) = 220 = 1.048.576 células
• 30 gerações (10 horas) = 230 = 1.073.741.824 células
• 24 horas = número com 21 zeros
– Como representar isso graficamente?
Multiplicação de microrganismo
Fases de crescimento
• Multiplicação das células durante um período 
de tempo
Curva de crescimento
• Demonstra o crescimento (multiplicação) das 
células durante um intervalo de tempo
• Existem 4 fases
– Fase lag
– Fase log
– Fase estacionária
– Fase de morte celular 
Fases de crescimento
• Fase lag
– Não se reproduzem imediatamente quando são 
colocadas em um meio de cultura
– Ocorre ausência ou pouca divisão celular
– As células se encontram em fase de latência
– Intensa atividade metabólica (síntese de enzimas 
e moléculas variadas)
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• Fase log
– Início do processo de divisão celular (aumento 
logarítmico)
– Tempo de geração atinge valor constante
– Período de maior atividade metabólica da célula
– Período onde as células são mais sensíveis às 
mudanças ambientais (radiação, antibióticos)
• Fase estacionária
– Velocidade de crescimento diminui 
– Número de morte celular equivalente ao número 
de células novas
– Atividade metabólica decresce
– Motivos: término de nutrientes, acúmulo de 
produtos de degradação, mudança de pH
• Quimiostato: equipamento que troca o meio de 
cultura, mantendo a população na fase exponencial 
indefinidamente
• Fase de morte celular
– Nº de células mortes é superior ao de células 
novas
– Algumas espécies fazem esse ciclo em poucos 
dias, outras podem permanecer com poucas 
células vivas indefinidamente
Métodos para quantificar diretamente o 
crescimento microbiano
• Alguns métodos determinam o número de 
células, outros analisam a massa total da 
população
• Deve-se considerar o número de células em 
1mL ou g
Contagem em placa
• Técnica mais utilizada na determinação do 
tamanho da população
• Células viáveis são quantificadas
• Desvantagem: tempo (pelo menos 24 horas) X 
CQ
• Colônia = cadeia ou grumo de bactérias
• Unidades Formadoras de Colônias: UFC
Contagem em placa
• Realizar contagens em placas que tenham 
entre 25-250 UFC ou 30-300 UFC
• Utilizar método de Diluição Seriada para 
garantir números de colônias na faixa 
desejada 
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Diluição seriada Método pour plate ou profundidade
Espalhamento em placa
Filtração 
• Número de bactérias pequenos, p.e. lagos e 
fontes
• Bactéria é concentrada sobre uma superfície 
de uma membrana de filtro após passagem de 
100 mL de água
Filtração 
• Filtro transferido para uma placa de Petri com 
meio e as bactérias se desenvolvem sobre a 
membrana de filtro
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Número Mais Provável (NMP)
• Técnica estatística
– Quanto maior o número de bactérias em uma 
amostra, maior o número de diluições
– Fornece somente uma estimativa de 95% de 
probabilidade de uma população bacteriana 
conter um número de bactéria e que o NMP da 
tabela é estatisticamente o número mais provável
Tabela 2: NMP por grama e intervalo de confiança (95%), para séries de 3 tubos 
com 0,1, 0,01 e 0,001 g/mL de inóculo. 
Pos. tubes Conf. lim. Pos. tubes Conf. lim. 
0.10 0.01 0.001 
MPN/g 
Low High 0.10 0.01 0.001 
MPN/g 
Low High 
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42 
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000 
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000 
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000 
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100 
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 -- 
 
Contagem direta no miscroscópio
• Volume conhecido de uma suspensão 
bacteriana é colocado em uma área definida 
de uma lâmina
Contagem direta no miscroscópio Contagem direta no miscroscópio
• Dificuldades:
– Células mortas acabam sendo contadas como 
vivas
– Necessidade de grande número de células para 
permitir contagem satisfatória
• Vantagem
– Não é necessário tempo de incubação
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Métodos indiretos para determinação 
do número de bactérias
• Turbdimetria
– Crescimento bacteriano através da turbidez da 
cultura
– Utiliza-se o espectrofotômetro 
Métodos indiretos para determinação 
do número de bactérias
• Turbdimetria