1 Roteiro aula prática - VHS, DREPANÓCITOS e RETICULÓCITOS (IMPRIMIR)

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Aula Prática – Análises Histológicas e Imunohematológicas
Universidade Anhembi Morumbi 
I. HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS) - Velocidade de sedimentação das hemácias (VHS) 
FINALIDADE 
Avaliação do grau de sedimentação espontânea, em milímetros, dos glóbulos vermelhos em uma 
amostra de sangue durante um período estabelecido de tempo. 
SIGNIFICADO CLÍNICO 
A VHS não traz diagnóstico. É um teste não específico que pode estar aumentado em diversas 
doenças/estados clínicos. Ele fornece informações gerais sobre: 
• a presença ou ausência de inflamação causada por uma ou mais doenças/estados 
clínicos como infecções, tumores ou doenças autoimunes. 
• para auxiliar no diagnóstico e monitoração de doenças/estados clínicos específicos: 
arterite temporal, vasculites sistêmicas, polimialgia reumática ou artrite reumatoide. 
O VHS também tem utilidade muitos especialistas, incluindo cardiologistas, hematologistas, 
infectologistas e clínicos, além daqueles profissionais que estejam atuando em localidades com 
recursos laboratoriais mais precários. Todavia, o exame apresenta à baixa sensibilidade e 
especificidade para o diagnóstico preciso, devendo ser associado a outros parâmetros e exames. 
METODOLOGIA: WESTERGREN modificado 
A hemossedimentação mede a estabilidade da suspensão de hemácias no plasma que, por ser 
menos denso, favorece a sedimentação dos glóbulos pela ação da gravidade, quando colocados 
numa pipeta graduada de 0 a 200mm com 2,5mm de diâmetro interno. 
As hemácias em suspensão no plasma, colocadas na pipeta de Westergren, sofrem 
sedimentação com velocidade variável em função da concentração de fibrinogênio e globulinas, 
tamanho e forma das hemácias e alterações elétricas do plasma e dos glóbulos. Inicialmente 
ocorre a queda individual das hemácias, seguida pela agregação dos glóbulos com formação de 
rouleaux e aumento da velocidade de hemossedimentação, que se torna constante para diminuir 
numa fase final, quando os glóbulos se concentram na porção inferior da pipeta. O aumento de 
fibrinogênio e globulinas é também responsável pela aceleração da hemossedimentação que 
fornece medida grosseira dessas substâncias no plasma. 
PROCEDIMENTO 
1. Amostra de 5 mL de sangue em tubo com EDTA. Obs.: o sangue deve ser coletado em jejum 
de pelo menos 8h. Não apertar demasiadamente o garrote, evitando estase venosa. 
2. Agitar o tubo por inversão; 
3. Com pipeta de Westergren aspirar sangue até exatamente a marca zero. 
4. Colocar a pipeta no suporte de modo a permanecer na posição vertical 
5. Marcar o tempo no cronômetro (60 minutos). 
6. Realizar a leitura em milímetros após o tempo esgotado, ao nível da separação do plasma e 
hemácias. 
 
 
VALORES DE REFERÊNCIA (método de WESTERGREN): 
GRUPOS ETÁRIOS MASCULINO FEMININO 
Recém-nascidos < 2mm < 2mm 
Adultos < 10mm < 20mm 
Idosos < 40mm < 50mm
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II. PESQUISA DE DREPANÓCITOS (hemácias falciformes) 
FINALIDADE 
Verificar a presença de hemácias com formato anormal (drepanócitos – forma de foice). 
Realizado como rotina na triagem de recém-nascidos ou sempre que necessário para determinar 
se uma pessoa é portadora do traço falcêmico ou tem anemia falciforme, especialmente na 
população de origem africana. 
SIGNIFICADO CLÍNICO 
Normalmente, a hemoglobina A constitui a maior parte da hemoglobina encontrada em adultos. 
São encontradas também pequenas quantidades de hemoglobina A2 e de hemoglobina F. 
• Antes do nascimento, os bebês produzem grandes quantidades de hemoglobina F, que é 
substituída após o nascimento pela hemoglobina A. Mutações dos genes que codificam a 
estrutura da hemoglobina podem gerar tipos anormais de hemoglobina. Mutações comuns 
incluem a talassemia beta e as variantes da hemoglobina, como a S e a C. 
A hemoglobina S ocorre em 8% dos negros brasileiros, tornando a sua pesquisa um exame 
bastante solicitado em nosso meio. 
• A demonstração Hb S é feita pro três tipos de exames: a eletroforese de hemoglobina que 
é o método mais eficaz, porém, trabalhoso e caro para ser usado rotineiramente; pelos 
testes de solubilidade para hemoglobina S e pela pesquisa de drepanócitos. 
METODOLOGIA: METABISSULFITO DE SÓDIO 
O fenômeno da falcização trata de uma reorganização das moléculas de hemoglobina em estado 
reduzido, formando longas cadeias denominadas tactóides, isto é, massas cristalinas. 
• In vivo a falcização ocorre pela baixa tensão de oxigênio nos capilares, levando ao 
aparecimento de hemácias falciformes circulantes, o que ocasiona a anemia hemolítica. 
• In vitro o fenômeno é demonstrado pelo uso de agentes redutores: metabissulfito de sódio. 
Preparo da solução redutora (metabissulfito a 2%) - Preparar no momento do uso. 
• Metabissulfito de sódio..............................0,2g 
• Água destilada q.s.p..................................10,0ml 
PROCEDIMENTO 
1. Em um tubo cônico (Eppendorf ®) de plástico colocar 100µl (ou 2 gotas em lâmina) da 
solução redutora e 50µl (ou 1 gota em lâmina) de sangue total homogeneizado. 
2. Homogeneizar a solução sangue-metabissulfito e retirar 20µl da mistura obtida, e depositar 
no centro da lâmina. Cobrir com uma lamínula e vedar com esmalte. 
3. Examinar no microscópio com aumento de 400x, duas horas após a vedação, procurando 
identificar hemácias falciformes, que geralmente apresentam predileção pela área marginal 
da lamínula. 
4. Caso o resultado seja negativo, reexaminar a lâmina após 6, 12 e por fim 24 horas para 
liberar o resultado. 
 
INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO: Reportar o resultado como negativo ou positivo. 
• Quando a concentração de HbS é de 80 a 99%, como acontece na anemia falciforme, os
drepanócitos e formam rapidamente, mesmo com pequena redução na tensão de oxigênio. 
• Quando a concentração é de 20 a 44%, como no traço falciforme, há necessidade de mais 
tempo e de maior redução da tensão de oxigênio para o aparecimento dos drepanócitos. 
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III. CONTAGEM DE RETICULÓCITOS 
FINALIDADE 
Contagem de reticulócitos após coloração supravital. 
SIGNIFICADO CLÍNICO 
A contagem de reticulócitos é usada para se avaliar a capacidade da medula óssea em produzir 
novas células vermelhas, sendo útil no controle terapêutico, no diagnóstico diferencial e na 
classificação das anemias. 
• Valores aumentados: ocorrem em estados hiper-regenerativos da MO, como nas anemias 
hemorrágicas e hemolíticas, e especialmente após a administração de ferro na anemia 
ferropriva ou depois da administração de vit B12 ou ácido fólico na anemia perniciosa. 
Podem ser altos em pessoas que vivem em altitudes elevadas, fumantes, gestantes e RN. 
• Valores diminuídos: ocorrem nas anemias não-regenerativas, como anemias aplásica, 
carenciais (ferropriva não-hemorrágica ou megaloblástica) não tratadas, secundárias a 
processos crônicos (inflamatórios ou neoplásicos) e diseritropoéticas. 
METODOLOGIA: Corante AZUL DE CRESIL BRILHANTE 
O reticulócito é uma célula jovem da série vermelha, sem núcleo e que ainda contém ácido 
ribonucléico (RNA). Os reticulócitos presentes no sangue retirado do organismo sofrem morte 
somática, porém, podem ser corados antes que toda atividade vital seja extinta, mediante o 
emprego de colorações supravitais, tal como o azul de cresil brilhante (ou novo azul de metileno) o 
qual precipita e cora o RNA ribonucléico, aparecendo como um retículo (filamentos) com cor 
púrpura-azulada. O retículo pode ser abundante ou escasso, segundo seu estado evolutivo, e 
apresentar aspecto grosseiro ou fino, dependendo da intensidade do pH da coloração usada. 
PROCEDIMENTO 
1. Preparar a diluição do sangue total homogeneizado em azul de cresil brilhante, usando o 
seguinte critério baseado no hematócrito: 
- p/ hematócrito até 30%: 12 gotas de sangue para 3 gotas de corante; 
- p/ hematócrito entre 30-45%: 9 gotas (450µl) de sangue para 3 gotas de corante (150µl); 
- p/ hematócritosuperior a 45%: 6 gotas de sangue para 3 gotas de corante; o 
2. Homogeneizar e colocar em Banho-Maria a 37 °C por 20 minutos; 
3. Homogeneizar e preparar um esfregaço (da maneira usual) hematológico com a diluição; 
4. Deixar a lâmina secar e realizar a leitura (para uma melhor visualização, recomenda-se 
contra-corar por um método hematológico como panótico, Giemsa etc.). 
5. Observar ao microscópio (óleo de imersão) e contar o número de reticulócitos em 10 
diferentes campos. A partir da média de reticulócitos contados, deve ser calculada a % em 
relação à quantidade total de hemácias no sangue. Para isso, é necessário saber o valor 
do hematócrito (Ht) do paciente e a quantidade de hemácias. 
Expressar o resultado em percentual e em número absoluto em relação a população de 
eritrócitos. 
CÁLCULOS 
 
 
 
 
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IV. Técnica de esfregaço de sangue 
O método de preparação para demonstrar melhor os tipos celulares do sangue periférico é o 
esfregaço de sangue. Uma gota de sangue é colocada diretamente sobre uma lâmina de vidro e 
espalhada em uma camada fina pela sua superfície. Isso é obtido espalhando-se a gota de sangue 
com a borda de uma lâmina histológica ao longo de outra lâmina, com o objetivo de produzir uma 
monocamada de células. 
1. Apoiar a lâmina de microscopia, já com a identificação do paciente, sobre uma superfície limpa. Certificar-se de que a 
lâmina tem boa qualidade e não está suja ou possui vestígios de gordura, o que pode prejudicar o teste. 
2. Colocar uma pequena gota de sangue próxima a uma das extremidades da lâmina. 
3. Com o auxílio de outra lâmina, colocar a gota de sangue em contato com sua borda. Para isso a lâmina extensora deve 
fazer um movimento para trás tocando a gota com o dorso em um ângulo 45°. 
4. O sangue da gota irá se espalhar pela borda da lâmina extensora por capilaridade. 
5. A lâmina deve então deslizar suave e uniformemente sobre a outra, em direção oposta a extremidade em que está a gota 
de sangue. O sangue será “puxado” pela lâmina. 
6. Depois de completamente estendido, o sangue forma uma película sobre a lâmina de vidro. 
7. Deve-se deixar que o esfregaço seque sem nenhuma interferência. 
8. Seguir para o passo de coloração. 
 
Observação da lâmina 
1. Cabeça da lâmina: região imediatamente após o local em que estava a gota sanguínea. Nessa região, com 
frequência, há aumento do número de leucócitos (principalmente de linfócitos). 
2. Corpo da lâmina: região intermediária entre cabeça e cauda. É nessa região que os leucócitos, hemácias e 
plaquetas estão distribuídas de forma mais homogênea. É a área de escolha para a análise qualitativa e 
quantitativa da distensão sanguínea. 
3. Cauda da lâmina: região final da distensão sanguínea. Nessa região, há encontro de alguns esferócitos e 
elevação de monócitos e granulócitos, que podem apresentar maior distorção morfológica. 
 
Lâmina Microscopia: 1 – Cabeça, 2 – Corpo e 3 – Cauda 
 
COLORAÇÃO DOS ESFREGAÇOS: Posteriormente, submete-se a lâmina a colorações para 
facilitar a visualização de diferentes estruturas celulares, onde, normalmente, utiliza-se os 
corantes de Giemsa e de Leishamn, também conhecidos como “derivados de Romanowsky”
(NEVES, 2000). 
• Corantes ácidos (aniônicos: carga -) ex: Eosina → reagem com substratos catiônicos (+):
Citoplasma (grupam/o NH2+) aa básicos (lisina, arginina, histidina): Rosa. 
• Corantes básicos (catiônicos: carga +) ex: Azul de Toluidina, Azul de metileno, 
Hematoxilina → reagem com substratos aniônicos (-) Núcleo (grupam/os fosfatos do DNA 
e RNA) ácidos nucleicos, aa ácidos (aspártico, glutâmico): Azul.