Apostila de aulas práticas Microbiologia geral(1)

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CENTRO UNIVERSITÁRIO DE LAVRAS 
CURSO DE GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Apostila das Aulas Práticas 
 
Microbiologia Geral 
 
Professora responsável: 
Adrielle Pieve de Castro (adriellepieve@unilavras.edu.br) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 LAVRAS 
 AGOSTO 2022
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SUMÁRIO 
 
1 NORMAS GERAIS A SEREM SEGUIDAS DURANTE AS AULAS ................... 3 
2 PRÁTICA 1: COLORAÇÃO DE GRAM .............................................................. 5 
3 PRÁTICA 2: Tipos de meios de cultura, semeaduras e contagem de microrganismos
…………………………………………………………………………………………...9 
4 PRÁTICA 3: Identificação bacteriana………………………………………………15 
5 PRÁTICA 4: Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos .............................. 20 
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NORMAS A SEREM SEGUIDAS NO LABORATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS 
 
 
1. O uso de AVENTAL branco, comprido e abotoado, é OBRIGATÓRIO no 
laboratório de aulas práticas, a fim de proteger a roupa de possível 
contaminação. 
2. As bolsas, pacotes, livros etc., deverão ser colocados em locais 
apropriados e nunca sobre as bancadas de trabalho. 
3. Não comer no laboratório. Não beber água das torneiras. PROIBIDO USO 
DE CELULAR. 
4. Manter as mãos, canetas, lápis e quaisquer outros objetos sem contato 
com a boca ou a face. 
5. Antes de cada aula prática serão dadas as instruções sobre a maneira de 
executar os trabalhos. Não iniciar um trabalho prático sem haver lido, 
cuidadosamente, as instruções e compreendido o modo de execução da 
experiência e seu objetivo. 
6. Consultar o professor se encontrar dificuldades para entender ou para 
executar os trabalhos práticos. Verificar se o material está completo; no 
caso de falta de algum, dirija-se imediatamente ao professor ou técnico. 
7. Durante o curso serão utilizados microrganismos que devem ser 
manipulados cuidadosamente. 
8. Em caso de qualquer acidente (derramamento de cultura, por exemplo), 
comunicar imediatamente o professor ou pessoal técnico do laboratório, 
para que sejam tomadas as providências necessárias. 
9. Todo o material contaminado (pipetas, bastões, lâminas, lamínulas etc.) 
deverá ser colocado em recipientes adequados (provetas, cubas com 
desinfetantes etc.) para ser esterilizado. Nunca deixá-lo sobre a bancada de 
trabalho ou na pia. 
10. A alça de platina usada para semeadura ou repique de bactérias ou fungos 
deve ser aquecida até o rubro, tanto antes do uso como depois dele. Antes 
de tocar o material ou meio de cultura, deve-se esperar que a alça esfrie, 
mantendo-a próxima à chama. 
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11. Os tubos de cultura deverão ser colocados nas estantes ou suportes 
adequados e nunca nos bolsos do avental. 
12. O estudante é responsável pelo equipamento com que trabalha. Os 
microscópios devem ser manuseados cuidadosamente e não devem ser 
arrastados ou manipulados sem autorização prévia. Qualquer dano ou 
defeito deve ser imediatamente comunicado ao professor. Após o uso do 
microscópio, limpar a objetiva de imersão, usando lenço de papel, voltar as 
objetivas e nunca deixar com óleo de imersão e com a lente em objetiva de 
100x. 
13. Após término dos trabalhos práticos, verificar se as torneiras de água e de 
gás estão fechadas, as lâmpadas desligadas e os microscópios limpos. 
Deixar o local de trabalho sempre limpo. 
14. LAVAR SEMPRE AS MÃOS, APÓS O TRABALHO PRÁTICO.
5 
Prática 1. Coloração de Gram 
 
1. Princípio 
 
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884, por Hans Christian Gram. É um 
dos procedimentos de coloração mais utilizados dividindo as bactérias em dois 
grandes grupos: as bactérias Gram positivas, ou Gram (+), e as bactérias Gram 
negativas, ou Gram (-). Nesse procedimento, o esfregaço fixado pelo calor é 
coberto por um corante básico violeta, geralmente, o cristal violeta. O corante 
confere cor violeta a todas as células e é denominado corante primário. Após um 
curto período de tempo, o corante violeta é removido e o esfregaço coberto com 
lugol (I2+ KI), um mordente que fixa o corante aos componentes celulares. 
Quando o mordente é lavado os dois tipos de bactérias, Gram (+) e Gram (-), 
aparecem com uma cor violeta escura ou roxa. Em seguida, a lâmina é lavada 
com etanol ou com solução etanol-acetona. Esta solução, chamada de solução de 
descoloração, remove a cor violeta de algumas espécies de bactéria, mas não de 
outras. Após a remoção do excesso do álcool, a lâmina é recoberta com um 
segundo corante básico (fucsina com cor rósea). O esfregaço é lavado novamente 
e, depois de retirado o excesso de água com um papel de filtro, observado ao 
microscópio. 
Na primeira coloração, todas as células coram-se em violeta ou roxo. As bactérias 
que retém a cor violeta após o tratamento com álcool são classificadas como 
Gram (+) e as bactérias que perdem a coloração violeta são classificadas como 
Gram (-). Como essas últimas perdem a coloração violeta com o tratamento com 
álcool, elas não poderão ser facilmente observadas. Por isso a fucsina (um 
corante básico) é aplicada ao esfregaço, corando essas bactérias com coloração 
rósea. Surge daí o nome de contra corante para o segundo corante (fucsina). 
Como as bactérias Gram + retêm a cor violeta, elas não são afetadas pela 
coloração rósea da fucsina. Diferenças estruturais na parede celular das bactérias 
Gram (+) e Gram (-) afetam a retenção ou a liberação do complexo cristal Violeta-
mordente. Entre essas diferenças destaca-se a espessa camada de 
peptídeglicanano, parede celular das bactérias Gram (+). Ao contrário, a parede 
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das bactérias Gram (-) mostra-se delgada e inclui a membrana externa rica em 
lipopolissacarídeos (LPS), não encontrado na parede das bactérias Gram (+). 
 
Soluções: 
-Violeta de Genciana: Cristal violeta (1 g), Ácido Fênico (2g), Álcool Absoluto (10 
ml) e 
Água Destilada (100 ml). 
- Lugol: Iodo (1 g), Iodeto de Potássio (2 g) e Água destilada (300 ml). 
- Álcool-acetona: Álcool etílico (800 ml) e acetona (200 ml) 
- Fucsina Diluída: Fucsina (0,25 g em 10 ml álcool etílico) e Água destilada (90 
ml). 
 
Prática 
1. a. Esterilizar a alça de platina na parte mais quente da chama do bico de 
Bunsen (limite da chama azul) até incandescer, formando um ângulo de 45 ºC. 
b. Preparo do esfregaço de culturas de bactérias: Colocar uma gota (ou colônia) 
de cada uma das culturas bacterianas (disponíveis nas bancadas) sobre uma 
lâmina de vidro, misturar gentilmente com o auxílio da alça (um microrganismo 
para cada lâmina). 
Esperar secar o esfregaço. Fixar o esfregaço pelo calor flambando rapidamente a 
lâmina. Esperar esfriar a lâmina para não ocorrer a cristalização do corante. 
 
2. Técnica da coloração de Gram: 
1. Colocar o corante Violeta de Genciana (Cristal violeta) sobre o esfregaço e 
deixar em repouso por 1 minuto. 
2. Escorrer o corante da lâmina. Adicionar a solução de lugol em quantidade 
suficiente para cobrir todo o esfregaço. Esperar por 1 minuto. 
3. Escorrer o lugol da lâmina e em seguida lavar com água corrente (fio de água). 
4. Descorar o esfregaço gota a gota com álcool-acetona por 15 segundos. Não 
gotejar diretamente sobre o esfregaço. 
5. Corar o esfregaço com fucsina diluída e esperar por 1 minuto. 
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6. Lavar a lâmina com água corrente e secar com papel de filtro. Não esfregar a 
lâmina com o papel. 
d. Visualizar o material utilizando o microscópio ótico (Ler: “Como utilizar o 
microscópio ótico”, a seguir). 
e. Observe e anote a coloração e morfologia das bactérias. 
 
3. Como utilizar o microscópio ótico 
 
Primeiro conhecer o microscópio (Ver Figura). 
- Descer a platina e colocar na objetiva de menor aumento, caso não esteja. 
- Colocar a lâmina sobre a platina. 
- Aproximar a lâmina da lente objetiva de 10X com o auxilio do macrométrico até 
focalizar a imagem. Tome cuidado para que a objetiva não toque a lâmina. 
- Após a focagem naobjetiva de menor aumento, girar o revólver para a próxima 
objetiva (40X). Ao mudar de objetiva, ajuste novamente a focagem, utilizando o 
micrométrico. 
- Definido o campo, colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e 
observar ao microscópio com a lente objetiva de imersão (100X). 
- Usar óleo de imersão somente na objetiva de 100X. Após a utilização limpar a 
objetiva com papel macio. 
 
 
 
Figura 1. Microscópio óptico 
8 
 
 
4. Observação e descrição dos resultados: 
 
Analise as estruturas no microscópio e descreva e desenhe abaixo o que foi 
visualizado, comparando as estruturas observadas e diferenciando-as em Gram (-) 
e Gram (+). 
 
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QUESTÕES: 
 
1. Descreva a estrutura e composição da parede celular das bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas. 
2. Explique o fundamento da técnica da coloração de Gram. Qual a etapa crucial 
na execução da coloração de Gram? 
3. Qual a importância da coloração de Gram para as diferentes áreas da 
Morfologia 1: 
______________________
______________________
______________________ 
Morfologia 2: 
______________________
______________________
______________________ 
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Microbiologia? 
 
Prática 2. Tipos de meios de cultura, semeaduras e contagem de 
microrganismos 
 
Esta prática será composta por diferentes atividades: 
 
1- Preparo de meios de cultura; 
2- Método da estria em placa ou esgotamento e; 
3- Método do Espalhamento com alça de Drigalsky. 
 
 
1. Introdução 
Para o cultivo e identificação de microrganismos, usam-se soluções e substâncias 
nutritivas chamadas meios de cultura, que devem atender às exigências 
nutricionais das espécies a serem cultivadas. 
 
2. Prática- Preparo meios de cultura 
Para o preparo dos meios de cultura são necessários o meio em pó e água 
destilada. 
1.Verifique no rótulo do meio de cultura as instruções para seu preparo e faça os 
cálculos da quantidade de pó de meio de cultura necessária para o preparo das 
quantidades de meio abaixo: 
 
Meio de cultura 1: _____________________________________________ 
a. Qual a massa necessária para preparar 350 mL do meio de cultura? 
b. Qual a massa necessária para preparar 480 mL do meio de cultura? 
 
Meio de cultura 2: ____________________________________________ 
a. Qual a massa necessária para preparar 230 mL do meio de cultura? 
b. Qual a massa necessária para preparar 740 mL do meio de cultura? 
 
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Após pesagem das quantidades adequadas para o preparo do volume necessário, 
seguem-se os passos: 
Ferver em micro-ondas ou placa aquecida agitando sempre para dissolver na 
água por 1 minuto; 
Verificar o pH final para cada meio de cultura; 
Autoclavar em erlenmeyer a meia rosca por 15 minutos a 121 º C/1 atm; 
Distribuir em placas ainda quente, antes de solidificar; 
Após solidificar, armazenar as placas em geladeira (8 ºC) e realizar os testes de 
qualidade do meio de cultura antes do uso. 
 
QUESTÕES: 
 
1.Cite 03 meios de cultura (rico, seletivo e diferencial) e explique a diferença entre 
eles e suas principais aplicações. 
2.Como é realizado o controle de qualidade dos meios de cultura produzidos no 
laboratório? 
 
3. Prática -Semeadura de cultura bacteriana 
 
Normas: Toda vez que se fizer uma semeadura os seguintes procedimentos 
deverão ser observados: 
A. As alças de vidro (Drigalsky) e de platina deverão ser flambadas antes e depois 
de qualquer operação de semeadura. A alça de Drigalsky deverá ser esterilizada 
mergulhando a mesma em uma placa de Petri ou Becker com álcool e, em 
seguida, levada rapidamente à chama do bico de Bunsen por tempo suficiente 
para iniciar a combustão do álcool. 
Cuidado! Não manter a alça sobre o fogo para que não se quebre. 
B. A alça de platina, por sua vez, deverá permanecer na chama do bico de 
Bunsen, formando um ângulo de 45º C, até incandescer. 
C. A alça de platina deverá ser esfriada na parede interna do tubo ou, se for o 
caso, no meio da placa de Petri ainda não inoculada. A alça de Drigalsky deve ser 
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esfriada na face interna da tampa da placa de Petri antes de entrar em contato 
com a amostra. 
D. Toda vez que se fizer uma semeadura em tubos de ensaio, deve-se flambar a 
boca dos mesmos, imediatamente após a retirada das tampas ou do algodão. A 
tampa deverá ser retirada com o dedo mínimo da mão que estiver segurando a 
alça de platina ou a pipeta. Após a retirada da amostra com as células, flambar 
novamente a boca do tubo, antes de recolocar a tampa. 
E. Não esquecer de identificar as culturas com o número do grupo de trabalho, 
seja no fundo da placa ou nas paredes dos tubos. Não marcar as tampas, pois 
elas podem ser trocadas acidentalmente, o que dificultará a posterior identificação 
do material. 
F. As placas de Petri e os tubos de ensaio deverão ser abertos e semeados 
próximo ao bico de Bunsen, para evitar contaminações com microrganismos 
presentes no ar. Em seguida, colocar o material na estufa a 37 ºC com a parte 
semeada voltada para baixo (no caso de placas), para evitar que a água que irá se 
condensar na tampa caia sobre as colônias. 
 
Princípio 
 
Estudos envolvendo a análise de materiais, como materiais biológicos, alimentos, 
leite, água e em alguns casos o ar, requerem o conhecimento da quantidade de 
microrganismos presentes nesses materiais. Diferentes métodos foram 
desenvolvidos para a quantificação de bactérias, como a contagem direta das 
bactérias em microscópio ou contadores eletrônicos. Outras abordagens incluem 
medição da massa celular; medida da turbidimetria da cultura e método da diluição 
seriada de uma cultura celular, seguida de semeadura em meio sólido (contagem 
de células viáveis ou unidades formadoras de colônias - U.F.C.). 
 
3.1 Técnica de Isolamento de Culturas Puras 
Na natureza, as populações microbianas não são homogêneas, porém contêm 
misturas de várias espécies de bactérias e demais microrganismos. No 
12 
laboratório, tais culturas mistas podem ser separadas em culturas puras. Estas 
últimas, contendo um só tipo de bactéria, são indispensáveis para a identificação e 
o estudo das propriedades morfológicas, genéticas e bioquímicas da espécie 
estudada. No presente experimento, utilizaremos uma técnica com a finalidade de 
produzir colônias individuais. Estas colônias, visíveis macroscopicamente, são 
massas de bactérias, que resultaram da multiplicação de uma única bactéria 
depositada na superfície do meio sólido no momento da semeadura. Uma vez que 
as colônias foram individualizadas e identificadas, elas podem ser transferidas 
assepticamente para outra placa com meio sólido e assim, obtermos uma colônia 
ou uma cultura pura. Nesta aula, serão empregados dois métodos de isolamento 
de bactérias. 
 
3.2 Método da estria em placa ou esgotamento 
O método da estria é rápido. Trata-se de um método de diluição que envolve o 
espalhamento por meio de estrias, a partir de um inóculo da cultura numa placa 
contendo meio de cultura sólido. 
 
Procedimento: 
Mergulhar a alça de platina, depois de devidamente flambada e resfriada, no meio 
de cultura com as bactérias. Note-se que dentro da alça fica uma leve camada de 
líquido (contendo bactérias). Levar esta alça até a placa de Petri contendo o meio 
de cultura e fazer uma estria da amostra bem junto à borda da placa. Fazer um 
pequeno traço na parte superior da placa. Flambar a alça e esfriá-la, para iniciaruma nova estria a partir do canto da primeira estria. Flambar novamente a alça, 
esfriá-la e ir fazendo esgotamentos sucessivos até o centro da placa. Incubar as 
placas a 37 º C por 24 h, para poder observar as colônias isoladas. A seguir tem 
uma figura que ilustra de forma simplificada o processo de estria em placa para 
obtenção de colônias isoladas. 
 
 
 
13 
 
 
 
Figura 2. Método de estria em placa ou esgotamento 
 
Figura 3. Esquema representativo do método de estria em placa ou esgotamento a partir de caldo. 
 
3.3 Método do Espalhamento com alça de Drigalsky. 
Este método requer uma diluição da cultura antes da semeadura na placa, para 
que se possam obter colônias isoladas. Este método é utilizado quando se deseja 
determinar o número de células viáveis (vivas) em uma suspensão de bactérias. O 
procedimento envolve duas etapas importantes: 
1. A diluição seriada da cultura de bactérias em condições de esterilidade. 
2. A semeadura de amostras das suspensões diluídas em placas de Petri 
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contendo meio de cultura sólido. 
 
3.3.1 Diluição seriada (macrodiluição) 
Retirar, com o auxílio de uma pipeta, uma amostra de 100 µL da cultura bacteriana 
não diluída e transferi-la para o eppendorf 1, contendo 900 µL de solução salina 
(diluição de 10-1 ). Homogeneizar bem. 
Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 1 e transferi-la para o eppendorf 2, 
de modo a obter uma diluição de 10-2 . Homogeneizar bem. 
Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 2 e transferi-la para o eppendorf 3, 
de modo a obter uma diluição de 10-3 . Homogeneizar bem. 
Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 3 e transferi-la para o eppendorf 4, 
de modo a obter uma diluição de 10-4 . Homogeneizar bem. 
Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 4 e transferi-la para o eppendorf 5, 
de modo a obter uma diluição de 10-5 . Homogeneizar bem. 
Retirar uma amostra de 100 µL do eppendorf 5 e transferi-la para o eppendorf 6, 
de modo a obter uma diluição de 10-6 . Homogeneizar bem. 
 
1.Semear 100 µL das diluições 10-4, 10-5 e 10-6 no centro das placas de Petri 
contendo o meio sólido, previamente marcadas com caneta de retroprojetor. 
2.Com o auxílio da alça de Drigalsky, previamente mergulhada em álcool, 
flambada e resfriada, espalhar a gota uniformemente na superfície da placa. 
3.Incubar as placas a 37 ºC por 24 h. 
 
Na próxima aula, serão contadas as colônias crescidas nas diferentes placas, para 
quantificar o número de células viáveis presentes na cultura original. 
 
QUESTÕES: 
1.Que vantagens os meios de cultura sólidos apresentam para o estudo dos 
microrganismos? 
 2.Quais as diferenças entre a microdiluição e macrodiuição seriada na 
microbiologia? Cite aplicações dessas técnicas na prática clínica. 
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Prática 3. Identificação bacteriana com testes bioquímicos 
 
Analisar distintas reações bioquímicas e sua utilização como método diagnóstico 
para enterobactérias. 
 
Introdução 
A família Enterobacteriales é a maior e mais heterogênea família de importância 
médica. São considerados atualmente 27 gêneros, 102 espécies e 8 grupos 
indefinidos. São bacilos Gram negativos, não esporulados, com motilidade 
variável, oxidase negativos, e que crescem em meios básicos, meios ricos e 
seletivos. São anaeróbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose), 
fermentam a glicose com ou sem produção de gás, catalase positivos e reduzem 
nitrato a nitrito. A maioria das enterobactérias é encontrada no trato 
gastrointestinal de humanos, no reino animal, na água, solo e vegetais. Alguns 
também são considerados enteropatógenos por causarem preferencialmente 
infecções gastrointestinais como a Salmonella typhi, outras espécies de 
Salmonella, Shigella spp., Yersinia enterocolitica e alguns sorotipos de Escherichia 
coli, embora possam também causar infecção em outros locais. As 
enterobactérias representam 80% ou mais de todos os gram negativos de 
importância clínica isolados na rotina microbiológica. São responsáveis por de 
cerca de 70% das infecções urinárias e 50% das septicemias. As enterobactérias 
que atualmente predominam em infecções hospitalares são Escherichia coli, 
Klebsiella spp., Enterobacter spp. (90%) seguidos de Proteus spp., Providencia 
spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia 
spp. As enterobactérias menos isoladas são Edwarsiella spp., Hafnia spp., 
Yersinia spp. Baseado em dados de prevalência e importância clínica, considera-
se necessário que os laboratórios de microbiologia utilizem metodologia que 
permita discriminar com ≥80% de acerto. O meio proposto por Rugai & Araújo 
16 
(1968) tinha por objetivo a identificação presuntiva de bacilos intestinais Gram-
negativos. Este meio que era composto por um conjunto de provas foi modificado 
por Pessoa & Silva (1972) onde foram incorporadas mais provas bioquímicas. 
Com o conjunto destas provas agrupadas em um único tubo, analisam-se 
diferentes reações enzimáticas, produção de gás e motilidade. O objetivo do meio 
de Rugai com lisina é o de triar bioquimicamente as colônias suspeitas que, se 
encontradas, devem ser identificadas por um sistema mais sensível e apropriado. 
O meio de Rugai com Lisina apresenta uma série bioquímica contendo nove 
provas que são agrupados em um único tubo, sendo elas: reação de indol (IND), 
desaminação do aminoácido L-triptofano (LTD), fermentação da sacarose (SAC), 
produção de sulfeto de hidrogênio (H2S), produção de gás (GAS), hidrólise da 
ureia (URE), fermentação da glicose (GLI), descarboxilação da lisina (LIS) e 
motilidade (MOT). 
 
Prática 
a- Retirar da embalagem a quantidade de tubos a serem usados e colocar os 
mesmos em estufa bacteriológica a 35 ± 2°C até adquirirem esta temperatura; 
b- Retirar os tubos da estufa e identificar cada um seguindo os critérios adotados 
pelo laboratório; 
c- Usando a agulha bacteriológica estéril, encostar na superfície de uma colônia. 
d- Inocular através de uma picada central, passando pela fase intermediária, 
atingindo o meio LMI, sem tocar o fundo do tubo de vidro. 
e- Retornar a agulha em direção à superfície, percorrendo o mesmo caminho e ao 
atingir a superfície fazer o estriamento em todo o ápice do meio; 
f- Incubar em estufa bacteriológica a 35 ± 2°C por 18 a 24 horas com a tampa 
frouxa. 
g- Realizar leitura das provas nos meios. 
 
 
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Figura 4. Meio RUGAI 
 
Leitura: 
LEITURA REALIZADA NA BASE 
- Fermentação da Glicose OBS: esta prova deve ser obrigatoriamente positiva 
para todas as enterobactérias, devendo-se atentar para o fato de que, nos casos 
de bactérias que produzem H2S ou hidrolisam a ureia, a cor amarela é 
mascarada. 
Reação positiva: meio amarelo 
Reação negativa: meio inalterado 
- Produção de Gás: Reação positiva: Formação de bolhas ou rachaduras 
Reação negativa: meio inalterado 
- Produção de Sulfeto de Hidrogênio (H2S) 
Reação positiva: presença de pigmento negro 
Reação negativa: ausência de pigmento negro. 
- Hidrólise da Ureia Reação positiva: coloração azul esverdeada 
Reação negativa: meio inalterado 
 
 
18 
LEITURA REALIZADA NO ÁPICE 
- Desaminação do L-Triptofano: Reação positiva: meio verde escuro ou 
acastanhado Reação negativa: meio inalterado 
- Fermentação da Sacarose: Reação positiva: meio amarelo 
Reação negativa: meio inalterado 
-Meio de Lisina - Descarboxilação da Lisina Reação positiva: meio com coloração 
púrpura Reação negativa: meio com coloração amarelo 
- Motilidade Reação positiva: turvação do meio 
Reação negativa: crescimento do micro-organismo apenas na picada central 
Prova do Indol - Realizar a leitura imediata, após pingar 1 a 2 gotas do Reativo de 
Kovacs. Reação positiva: viragem da cor do reativo para rosa 
Reação negativa: reativo com coloração inalterada (amarela). 
Após realizar leitura dos resultados das provas, consultar tabelas para 
identificaçãopresuntiva. 
A qualidade dos resultados de análises microbiológicas está intimamente ligada à 
qualidade da amostra, as melhores práticas pré-analíticas, como cuidados 
extremos com a assepsia do processo ou paciente, assim como a utilização de 
meios de cultura indicados e de boa qualidade garantem um melhor resultado. 
 
Resultados esperados: 
 
Figura 5 . Resultados esperados de acordo com cada microrganismo 
 
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Tabela 1. Reações bioquímicas para identificação presuntiva das principais 
espécies da família Enterobacterales: 
 
 
QUESTÕES: 
1. Os ensaios feitos na aula prática demonstraram alguns princípios empregados na 
identificação/diagnóstico de bactérias de interesse médico. Pesquise sobre as técnicas 
empregadas para o diagnóstico de bactérias em laboratórios de análise clínica e as 
compare com o que foi feito em sala de aula. 
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Prática 4. Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (antibiograma) 
 
Antibiograma: Método de Disco-difusçao em ágar (Kirby-Bauer) 
 
O antibiograma é um teste que permite a verificação da sensibilidade de uma 
bactéria aos antimicrobianos. O perfil de sensibilidade é demonstrada através da 
formação de uma zona ou halo de inibição de crescimento que se forma ao redor 
do disco de papel contendo antimicrobiano. De acordo com o diâmetro formado do 
halo de inibição e com a interpretação determinada por protocolos (BrCast/ CLSI), 
diz-se que a bactéria é sensível ou resistente àquele antimicrobiano testado. 
 
Procedimento: 
 
1. Preparar o inóculo bacteriano a partir do crescimento bacteriano em 
placa de ágar: selecionar 4-6 colônias puras e colocar em caldo TSB/TSA 
ou solução salina 0,9% até atingir a turvação de acordo com a escala de 
McFarland; 
2. Umedecer o swab na suspensão bacteriana, retirando o excesso ao 
aperta-lo contra a parede interna do tubo; 
3. Espalhar a suspensão bacteriana em toda a superfície do meio de 
cultura, de modo homogêneo, inclusive nas bordas; 
4. Colocar os discos de antimicrobianos com auxílio da pinça sobre a 
superfície do meio e de modo equidistante; 
5. Incubar as placas a 37 º C por 18-24 horas. 
 
Resultados Leitura e interpretação: Verificar a presença ou ausência de halo de 
inibição ao redor dos discos. Medir o DIÂMETRO dos halos, vide figura a seguir, e 
verificar se o microrganismo é resistente, parcialmente resistente ou sensível. A 
seguir tem uma tabela que mostra alguns halos de inibição de crescimento para 
alguns antimicrobianos testados em aula. 
 
 
 
 
 
 
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Tabela 2. Interpretação do halo de inibição para alguns antimicrobianos. 
 
 
Preencha a tabela abaixo de acordo com os resultados obtidos na aula prática: 
 
Antimicrobiano Concentração Sigla Perfil 
 
 
 
 
 
 
 
QUESTÕES: 
1. Quais procedimentos deveriam ser tomados para a determinação da concentração 
inibitória mínima (MIC) dos antimicrobianos testados? 
2. Quais fatores podem interferir no perfil de sensibilidade a antibióticos em uma linhagem 
bacteriana.
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