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DNA BARCODE DE ESPÉCIES DE CICHLA INTRODUZIDAS NA BACIA DO RIO
SÃO JOÃO, RIO DE JANEIRO, BRASIL
Nathalia Alves Diamante1, Isabela Gonçalves da Silva 2 , Alessandra Valéria de Oliveira3, Ana Cristina
Petry4, Paula A. Catelani5, Fernando M. Pelicice6
1Doutoranda do Programa de Pós-graduação em Biologia Comparada, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Paraná, Brasil
nathaliadiamante@gmail.com
2Acadêmica de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Maringá - UEM, Maringá, Paraná, Brasil. PIC/UEM
 isabelah_gon@hotmail.com
3Docente do Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular/Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aquicultura (Nupélia),
Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Paraná, Brasil
avoliveira@uem.br
4Núcleo em Ecologia e Desenvolvimento Socioambiental de Macaé, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Macaé, Rio de Janeiro, Brasil
ac_petry@yahoo.com.br
5Núcleo em Ecologia e Desenvolvimento Socioambiental de Macaé, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Macaé, Rio de Janeiro, Brasil/Programa 
de Pós-graduação em Ciências Ambientais e Conservação, Universidade Federal do Rio de Janeiro, campus Macaé, Rio de Janeiro, Brasil
ktelani@gmail.com
6Núcleo de Estudos Ambientais, Universidade Federal do Tocantins, Palmas, Tocantins, Brasil
fmpelicice@gmail.com
RESUMO
O gene mitocondrial citocromo c oxidase subunidade I (COI) tem se mostrado adequado para a identificação molecular
da maioria das espécies animais, incluindo peixes. As espécies são geralmente representadas por uma sequência
particular ou por um grupo de sequências muito similares deste fragmento gênico, o que é conhecido como o “DNA
barcode” daquela espécie. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi analisar a eficiência do DNA barcode em
discriminar diferentes espécies de Cichla introduzidas na bacia do rio São João, estado do Rio de Janeiro, Brasil.
Polimorfismos nas sequências do gene COI do DNA mitocondrial confirmaram a hipótese de introduções distintas e a
ocorrência das espécies de Cichla monoculus e Cichla kelberi na região estudada.
PALAVRAS-CHAVE: COI; DNA mitocondiral; Tucunaré.
1 INTRODUÇÃO
Diversos genes ou regiões do DNA têm sido historicamente empregados como marcadores
moleculares para a identificação de espécies com base em suas divergências genéticas
(HAJIBABAEI et al., 2007). Com o objetivo de propor um sistema unificado de identificação
molecular, Hebert e colaboradores (2003) desenvolveram um marcador padrão para que os dados
obtidos fossem comparáveis dentro e entre espécies. Um fragmento que contém aproximadamente
650 pares de bases da extremidade 5’ do gene mitocondrial citocromo c oxidase subunidade I (COI)
tem se mostrado adequado para a identificação molecular da maioria das espécies animais. 
As espécies são geralmente representadas por uma sequência particular ou por um grupo de
sequências muito similares deste fragmento gênico, o que é conhecido como o “DNA barcode”
daquela espécie. A análise do acúmulo de mutações entre as sequências barcode de duas espécies
fornece a distância genética entre elas. Uma vez que as sequências COI tendem a variar entre
espécies, mas são relativamente constantes entre os indivíduos de uma mesma espécie, um
espécime desconhecido podem ser identificados comparando sua sequência com sequências
disponíveis em um banco de dados.
A partir da proposição deste sistema de identificação global para as espécies animais, a
eficácia do fragmento barcode foi testada em diversos grupos, incluindo peixes (WARD et al., 2005;
ELLEGREN et al., 2008; WARD et al., 2009; STEINKE et al., 2009a)
ANAIS X EPCC
UNICESUMAR – Centro Universitário de Maringá
ISBN 978-85-459-0773-2
Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi analisar a eficiência do DNA barcode em
discriminar diferentes espécies de Cichla introduzidas na bacia do rio São João, estado do Rio de
Janeiro, Brasil.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
Exemplares do gênero Cichla (n = 8) foram coletados no reservatório de Juturnaíba e a
jusante, em diferentes trechos do rio São João, naturais meandrantes e retilinizados. Após a
captura, os exemplares foram eutanasiados com overdose de benzocaína. As amostras de músculo
dos indivíduos foram retiradas, fixadas em álcool etílico comercial, armazenadas a –20º C e
enviadas para o banco de tecidos do laboratório de Genética do Núcleo de Pesquisa em Limnologia,
Ictiologia e Aquicultura (NUPÉLIA), Universidade Estadual de Maringá (UEM). 
O DNA total das amostras foi extraído utilizando-se kit de extração Promega Wizard
Genomics, de acordo com instruções do fabricante. As amostras foram aliquotadas e quantificadas
em gel de agarose 1,0% por comparação com DNA λ de concentração conhecida.
O gene COI do mtDNA foi amplificado de acordo com o protocolo descrito por Steinke et al.
(2009b). As reações de PCR (Polimerase Chain Reaction) foram conduzidas em volume total de 25
μL, contendo tampão Tris-KCl [20mM Tris-HCl (pH 8,4), 50mM KCl], MgCl2 (1,5 mM), primers H7152
e L6448 (2,5 mM cada), dNTPs (0,1mM cada), Taq DNA Polimerase Platinum – Invitrogen (1,0 U) e
10ng de DNA recém extraído. Os produtos do PCR foram purificados seguindo o protocolo de
Rosenthal et al. (1993) e a reação de sequenciamento foi realizada utilizando o kit Big Dye
Terminator. A determinação da sequência dos nucleotídeos foi procedida em sequenciador
automático ABI 3500 seguindo instruções do fabricante. 
As sequências nucleotídicas com confiabilidade superior a 90% foram editadas manualmente
com o programa BioEdit 7.2.0 (HALL, 1999) e alinhadas em Clustal W (THOMPSON et al., 1994)
utilizando o programa Mega 6.0 (TAMURA et al., 2013). As análises filogenéticas foram realizadas
através dos métodos estatísticos neighbor-joining (NJ), com 10,000 reamostragens de bootstrap e
maximum-likelihood (ML), com 1,000 reamostragens de bootstrap. A construção das árvores foi
realizada no programa Mega 6.0 (TAMURA et al., 2013). 
A composição das sequências, as estimativas dos índices de diversidade haplotípica foram
calculados no programa DnaSP 5.1 (LIBRADO e ROZAS, 2009)Os valores de distancia P foram
calculados no programa Mega 6. 0 (TAMURA et al., 2013). 
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram obtidas sequências de COI do DNA mitocondrial com 586 pb de 8 espécimes de
Cichla coletados no reservatório de Juturnaíba e no rio São João. 
Na análise das sequências foram identificados 20 sítios polimórficos. A frequência média dos
quatro nucleotídeos para todas as amostras de Cichla foi C: 29,4%; T: 29,6%; A: 25,1%; G:15,8%.
Foram identificados seis haplótipos, sendo que um espécime do rio São João e um espécime do
reservatório compartilharam o mesmo haplótipo (H4) (Tabela 1). O índice de diversidade haplotípica
(h) para os todos os indivíduos analisados foi de 0,9286.
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Tabela1: Distribuição dos seis haplótipos de Cichla na bacia do rio São João
Haplotype SJ RJ
H1 2 
H2 1 
H3 1 
H4 1 1
H5  1
H6 1 
RJ: Reservatório de Juturnaíba; SJ: Rio São João.
O modelo de substituição nucleotídica selecionado para a reconstrução filogenética foi o HKY.
Ambas as árvores geradas pelos métodos estatísticos de máxima verossimilhança (Figura 1A) e
neighbor-joining (Figura 1B) apresentaram valores altos de bootstrap e foram congruentes ao
gerarem 2 clados, o clado 1 formado exclusivamente por exemplares de Cichla do rio São João e o
clado 2 formado por Cichla tanto do rio São Joao como do reservatório de Juturnaíba (distância
genética de 0,02 entre os dois clados). 
Apesar dos baixos valores de distância genética entre os dois clados os dados confirmam a
introdução de duas espécies de Cichla no rio São João e apenas uma no reservatório de Juturnaíba.
Os resultados obtidos nesse trabalho são similares aos encontrados por Diamante et al. (2017) que
analisando a regiãocontrole do DNA mitocondrial (D-loop) também identificaram duas espécies de
Cichla na Bacia do Rio São João: no reservatório (C. kelberi) e a jusante (C. kelberi e C. monoculus).
 
Figura 1: Árvores filogenéticas construídas a partir de sequências de COI de Cichla do rio São João
(vermelhas) e do reservatório de Juturnaíba (Azul), por máxima verossimilhança (1A), com 1.000 re-
amostragem de bootstrap e neighbor-joining (1B), com 10.000 re-amostragens de bootstrap.
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4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O marcador molecular COI se mostrou eficiente na discriminação de Cichla kelberi e Cichla
monoculus confirmando a hipótese de introdução dessas duas espécies na bacia do rio São João.
REFERÊNCIAS
DIAMANTE, N.A., Oliveira, A.V., Petry, A.C., Catelani, P. A., Pelicice, F.M., Prioli, S.M.A.P., Prioli, 
A.J. Molecular analysis of invasive Cichla (Perciformes: Cichlidae) populations from neotropical 
ecosystems. Biochemical Systematics and Ecology, v. 72, p.15–22, 2017.
ELLEGREN, H.; HUBERT, N.; HANNER, R.; HOLM, E.; MANDRAK, N. E.; TAYLOR, E.;
BURRIDGE, M.; WATKINSON, D.; DUMONT, P.; CURRY, A.; BENTZEN, P.; ZHANG, J.; APRIL, J.;
BERNATCHEZ, L. Identifying canadian freshwater fishes through DNA barcodes. PLoS ONE, v. 3, n.
6, p. e2490, 2008.
HAJIBABAEI, M., SINGER, E.A.C., HEBERT, P.D.N., HICKEY, D. A. DNA barcoding: how it 
complements taxonomy, molecular phylogenetics and population genetics. Trends Genet., v. 23, p. 
167-172, 2007.
HALL, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for 
Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, v. 41, p. 95-98, 1999.
HEBERT, P. D. N.; RATNASINGHAM, S.; WAARD, JR. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase 
subunit 1 divergence among closely related species. Proceedings of the Royal Society B: 
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data. Bioinformatics, v. 25, p.1451-1452, 2009.
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microtitre format PCR. Nucleic Acids Research, v. 21, p. 173-174, 1993.
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species. Philosophical Transactions of the Royal Society B. v. 360, p. 1847-1857, 2005.
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