Atividade de compostos complexados a metais em leveduras de Sporothrix schenckii

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68. CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE DE COMPOSTOS COMPLEXADOS A METAIS 
FRENTE A LEVEDURAS DE SPOROTHRIX SCHENCKII. 
 
Reuel Da Silva Torquato Costa1; Thalita Gagini2; Luana Santos2; Sonia Rozental2 
 
1 Escola Superior de Saúde da Universidade Estadual do Amazonas; 
2Laboratório de Biologia Celular dos Fungos da Universidade Federal do Rio de Janeiro. 
 
RESUMO 
 
A esporotricose é uma micose subcutânea causada por espécies do complexo Sporothrix schenckii, este 
complexo é constituído por fungos dimórficos que se diferenciam em micélio (comum em regiões de clima 
quente e úmido) e leveduras (que afetam animais, principalmente gatos e o homem). No homem, a 
esporotricose está relacionada principalmente com o manejo da terra, agricultura e jardinagem. Esse fungo 
encontra-se no solo, vegetais, palhas e madeiras; a infecção também pode ocorrer por arranhadura e 
mordedura de gatos ou também por contado direto da pele lesionada. As manifestações clínicas são 
variadas, entretanto os sinais mais observados são ulceras profundas na pele, que não cicatrizam e evoluem 
rapidamente. O tratamento padrão dura em torno de seis meses e é realizado com antifúngicos como iodeto 
de potássio, itraconazol e anfotericina B (uso tópico), porém estes apresentam muitos efeitos colaterais.Este 
estudo visa buscar uma nova droga para o tratamento da esporotricose. O clotrimazol ja é utilizado no 
tratamento das dermatomicoses como micoses interdigitais e micoses da pele. O clotrimazol é um inibidor 
da síntese de ergosterol, podendo assim ser aplicado em outros tipos de micose. A associação com o zinco 
através do acetato de zinco e cloreto de zinco, ocorre pela tentativa de potencializar o clotrimazol, 
aumentando o seu efeito contra o complexo S. chenckii diminuindo o período de tratamento. 
 
ABSTRACT 
 
Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by species of the complex Sporothrix schenckii, this 
complex consists of dimorphic fungi which differentiate into mycelium (common in hot and humid 
climates) and yeast (affecting animals, especially cats and man).In humans, sporotrichosis is mainly related 
to land management, agriculture and gardening. This fungus is in the soil, plants, straw and woods; Infection 
can also occur by scratch and bite cats or also by direct contact of damaged skin.The clinical manifestations 
are varied, but the most frequently observed signs are deep ulcers on the skin that do not heal and evolve 
rapidly.The standard treatment lasts around six months and is done with antifungal as potassium iodide, 
itraconazole and amphotericin B (topical), but they have many side effects.This study aims to find a new 
drug for the treatment of sporotrichosis. The clotrimazole is already used to treat dermatomycoses as fungal 
infections of the skin. Clotrimazole is an inhibitor of ergosterol synthesis and can therefore be applied to 
other types of ringworm. The combination with zinc by zinc acetate and zinc chloride occurs by trying to 
maximize clotrimazole, increasing their effect against S. complex chenckii reducing the treatment period. 
 
INTRODUÇÃO 
 
Esporotricose 
A esporotricose conhecida também como “doença da roseira” é uma micose crônica causada pelo complexo 
Sporothrix schenkii, expressa-se sobre a forma cutâneolinfático-nodular com alguns sinais como: úlceras 
profundas na pele que não cicatrizam e evoluem rapidamente, podendo também estender-se para as 
vísceras, mucosas, ossos e sistema nervoso central. 
Forma cutânea localizada 
Nessa forma, encontra-se lesão única sem nódulos no trajeto linfático e raramente se vê adenopatia regional. 
Inúmeros tipos de lesões foram descritas: pápulas que pustulizam e ulceram, placas achatadas, lesões 
eritemato- escamosas, cujo diagnóstico é dificultado. (SIDRIM 2010) 
Forma cutânea disseminada 
Essa forma está associada à imunodepressão. Após inoculação, ocorre a disseminação por via hematogênica, 
com lesões inicialmente subcutâneas, amolecidas, que após semanas, podem ulcerar-se. De modo geral, as 
lesões são assintomáticas, não afetando a saúde geral do paciente. (SIDRIM 2010) 
Formas extracutâneas 
Está sempre associada a imunodepressão, ela pode envolver qualquer tecido ou órgão, as lesões são resultados 
da disseminação hematogênica. Os sintomas são relacionados com o órgão envolvido. Depois da pele o 
tecido mais frequente é o ósseo, os ossos mais afetados são: tíbia, ossos pequenos das mãos, rádio, ulna e 
ossos do crânio e da face. As lesões assumem formas variadas, como pequenos granulomas solitários ou 
grandes lesões gomosas com intensa destruição óssea, lesões semelhantes à osteomielite e à peristite. 
(SIDRIM 2010) 
O complexo Sporothrix schenkii apresenta-se de duas formas: micélio, encontrados na natureza em 
regiões de clima quente e úmido a 27°C cuja forma é infectante para o homem e levedura, forma 
parasitaria do homem a 37°C. 
A esporotricose está relacionada principalmente com o manejo dos agricultores com o solo, vegetais e 
madeiras, entretanto a infecção pode ocorrer por arranhaduras e mordeduras de animais principalmente 
gatos e até mesmo por contato direto da pele lesionada. 
Apesar da esporotricose ser uma micose bastante comum em regiões de clima quente e úmido, ela é 
negligenciada pelo governo portanto, existem poucas drogas no mercado para o tratamento desta patogenia. 
Assim torna-se importante o estudo de outras drogas para o tratamento desta doença, aperfeiçoando o 
tratamento e diminuindo os efeitos colaterais causados pelos medicamentos do tratamento padrão. 
Objetivo geral: caracterizar, por meio das técnicas de microdiluição em caldo, citometria e microscopia 
eletrônica; o efeito causado sobre as leveduras de Sporothrix schenckii submetidas ao tratamento com 
compostos complexados a metais. Objetivos Específicos: determinar o efeito inibitório dos compostos 
complexados a metais, sobre leveduras de Sporothrix schenckii, comparando a efetividade destes com seus 
sais de partida e também com o tratamento padrão (itraconazol); identificar as alterações nas proporções de 
lipídios neutros de membrana e nas mitocôndrias das leveduras por meio de marcação para ensaio de 
citometria; observar, por meio de microscopia eletrônica de transmissão e varredura, as alterações 
morfológicas e estruturais que ocorrerem causadas pelos tratamentos com compostos complexados a 
metais, em comparação com o controle não tratado; correlacionar os resultados obtidos por citometria com 
os resultados da microscopia eletrônica de transmissão. 
 
Figura 1. Sporothrix schenkii a esquerda em forma de micélio (encontrados em ambientes quentes, 
úmidos e ricos em material orgânico) e a direta em forma de levedura (parasitas do homem e animais). 
 
MATERIAIS E MÉTODOS 
 
Cultivo in vitro 
O fungo utilizado nessa pesquisa foi coletado de pacientes do hospital universitário do rio de janeiro e 
armazenado em microtúbo à temperatura de 4°C na forma filamentosa. 10 µL dessa amostra serão 
colocados em 100 mL de meio de cultura Brain Heart Infusion (BHI) em elermeyer à temperatura de 36°C 
sobre agitação no agitador innova 42, durante sete dias (primeira passagem) e quatroze dias (segunda 
passagem). O meio BHI utilizado é composto por infusão de cérebro de bezerro 200 g/L, protease peptona 
10 g/L, cloreto de sódio 5 g/L, infusão de coração bovino 250 g/L, dextrose 2 g/L, fosfato dissódico 2,5 
g/L, o pH é ajustado para 7,4 e posteriormente autoclavado. O fungo será filtrado com gazes e armazenado 
em tubo falcon. 
 
Contagem de células e determinação da concentração 
Os fungos filtrados serão diluídos em água destilada na proporção de 1:10 portanto, 100µL de fungo em 
900µL de água destilada, essa diluição será pipetada e colocada na câmara de neubauer para contagem de 
células, a contagem será realizada pela visualização em microscópio ótico das células de leveduras nos 
quadrados maiores das extremidades superiores e inferiores e no centro dosquadrados, após a contagem 
será ajustado a concentração para 105 células/mL de acordo com a quantidade de meio Roswell Park 
Memorial Institute (RPMI) utilizado nas placas de 96 poços. O meio RPMI é composto por Nitrato de Cálcio 
4H2O 100 mg/L, Sulfato de Magnésio (anidro) 48,84 mg/L, Cloreto de Potássio 400 mg/L, Cloreto de Sódio 
6000 mg/L, Fosfato de Sódio, dibásico, anidro 800 mg/L, Glicina 10 mg/L, Hidrocloreto de L-Arginina 241 
mg/L, L-Asparagina 50 mg/L, Ácido L-Aspártico 20 mg/L, Diidrocloreto de L-Cistina 65,20 mg/L, Acido 
L-Glutâmico 20 mg/L, L-Glutamina 300 mg/L, Hidrocloreto de L-Histidina H2O 20,96 mg/L, L-
Hidroxiprolina 20 mg/L, L-Isoleucina 50 mg/L, L-Leucina 50 mg/L, Hidrocloreto de L-Lisina 40 mg/L, L- 
Metionina 15 mg/L, L-Fenilalanina 15 mg/L, L-Prolina 20 mg/L, L-Serina 30 mg/L, L-Treonina 20 mg/L, 
L- Triptofano 5 mg/L, L-Tirosina (Sal Sódico) 28,83 mg/L, L-Valina 20,00 mg/L, Cloreto de Colina 3 
mg/L, D-Biotina 0,20 mg/L, D-Ca-Pantotenato 0,25 mg/L, Ácido Fólico 1 mg/L, Niacinamida 1 mg/L, 
Hidrocloreto de Piridoxina 1 mg/L, Riboflavina 0,20 mg/L, Hidrocloreto de Tiamina 1 mg/L, Vitamina B12 
0,005 mg/L, i-Inositol 35 mg/L, Acido P-Amino Benzóico (PABA) 1 mg/L, D-Glicose 2000 mg/L, 
Glutationa reduzida 1 mg/L, Vermelho de fenol 5,30 mg/L, pH a 25°C será ajustado para 7,2 a 7,8. 
 
Método de diluição em caldo 
As drogas com concentração de 1,6 mg/mL a serem trabalhadas serão utilizadas em duplicata em placa de 
96 poços, serão diluídas da seguinte forma: 100 µL de meio RPMI serão adicionados em todos os poços da 
placa de 96 poços através da pipeta automática eppendorf de 15 - 300 µL, em seguida será adicionado 12 
µL das drogas até os poços de número dez, seguidamente será adicionado mais 100 µL de meio RPMI nos 
poços de número um, as diluições dos poços de número um serão ressuspensos cinco vezes, será pipetado 
100 µL dos poços de número um e despejados nos poços de número dois, o procedimento anterior será 
repetido até os poços de número dez, os 100 µL que sobrarão dos poços de número dez serão descartados, 
o próximo passo será adicionar o fungo de primeira ou de segunda passagem de modo que a concentração 
seja de 105 células/mL, até os poços de número onze, estes últimos serão os controles pois estarão livres de 
drogas, os poços de número doze serão o branco, pois terão somente meio RPMI. As concentrações de 
drogas serão de 16 µg/mL - 0,03 µg/mL. A placa será incubada na estufa a 35°C durante 48 horas. 
 
Concentração inibitória mínima 
A concentração inibitória mínima de 90% será determinada através da leitura das placas de 96 poços em 
microscópio invertido através da comparação das amostradas tratadas com o controle, será aproveitado a 
concentração da droga em que houver inibição de 90% do crescimento, as concentrações em que houver 
redução no crescimento fúngico será denominado fungicida. 
Concentração fungicida mínima 
A concentração fungicida mínima será determinada pela visualização da inibição total do crescimento das 
colônias fúngicas através da análise em microscópio invertido, a menor concentração das drogas em que 
houver inibição total do crescimento fúngico será a concentração fungicida mínima, as concentrações de 
drogas em que houver inibição total do crescimento será denominada fungistático. 
 
Teste da resazurina 
O teste da resazurina será realizado após a determinação da concentração inibitória mínima e da concentração 
fungicida mínima, 15 µL de resazurina serão pipetados em todos os 96 poços da placa, a placa será incubada 
na estufa por 6 horas, passando-se o período de incubação, a placa será lida no citômetro BD Accuri C6 e 
determinado a concentração inibitória mínima de 90% através de cálculos no excell. 
 
Citometria de fluxo 
As leveduras do isolado ATCC MYA 4821 tratadas e não tratadas por 48 horas com concentrações sub- 
inibitórias (CIM/2) dos sais de zinco combinados ao clotrimazol serão lavadas em PBS, e 105 leveduras/mL 
serão incubadas com 50 µM de BODIPY 493/503 (Molecular Probes®, lipídios neutros) e com 10 µM de 
MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes®, atividade mitocondrial), por 30 min à temperatura 
ambiente, no escuro. Após incubação com os marcadores, as leveduras serão lavadas em PBS, fixadas com 
1% de formaldeído por 30 minutos e lavadas novamente. Serão detectados 2000 eventos utilizando o 
citômetro de fluxo BD AccuriTM C6 e os dados serão analisados pelo BD Accuri C6 Software. 
 
Microscopia eletrônica de varredura 
Os fungos tratados e não tratados serão coletados após a centrifugação e serão fixados com paraformaldeído 
4%, glutaraldeído 2,5% diluídos em tampão cacodilato 0,1M durante uma hora em temperatura ambiente, 
após a fixação as amostras serão lavadas três vezes com tampão cacodilato 0,1M e serão aderidas sobre 
uma lamínula de vidro com Poli-L-lisina durante 20 minutos, em seguida serão pós-fixadas com ósmio 1%, 
ferrocianeto de potássio 1,25%, cloreto de cálcio 5mM em tampão cacodilato 0,1M por uma hora no escuro 
e serão lavadas três vezes com tampão cacodilato 0,1M ou água miliq, em seguida será iniciado a 
desidratação com etanol a 30, 50, 70, 90 e 100% sendo 30 minutos para cada concentração, após a 
desidratação será usado o ponto crítico da marca Laicon de dióxido de carbono em média por uma hora, 
após a secagem do material as lamínulas serão aderidas em suporte metálico para serem metalizadas com 
ouro através do metalizador Balzers Union Fl-9400 e serem visualizadas no microscópio eletrônico de 
varredura. 
 
 
 
RESULTADOS PRELIMINARES 
 
Cultivo in vitro 
Os fungos apresentaram poucas células de leveduras na primeira passagem, entretanto mais de 80% de 
conversão foi adquirida na segunda passagem. 
 
Figura 2. Sporothrix schenckii em tubos falcon, 0 dias (esquerda), 7 dias (meio) e 10 dias (direita), nota-se 
a turbidez do tubo da direita, indicando assim um crescimento e conversão maior que os outros dois 
tubos. 
 
 
 
 
Contagem de células e determinação da concentração 
As contagens das amostras de primeira e segunda passagem foram 17 e 24 células/mL. Primeira 
passagem Segunda passagem 
17x5=85 24x5=120 
85x104x102=850x105 120x104x102=1200x105 
 
 
 
Figura 3. Câmara de neubauer (esquerda), câmara de neubauer vista através do microscópio ótico, as 
células foram 
contadas nos quadrados com a letra L e também no centro. 
 
Método de diluição em caldo 
Através da fórmula das diluições foi possível determinar a concentração fúngica e de drogas a serem 
utilizada se no preparo da metodologia da diluição em caldo. 
 
Primeira passagem Segunda passagem Concentração das drogas 
C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 C1V1=C2V2 
850x105xV1=1x105x300 µL 1200x105xV1=1x105x300µL 1600µg/mLxV1=64µg/mLx300µL 
V1=2,8 µL V1=4 µL V1=12µL 
 
Concentração inibitória mínima, teste da resazurina e concentração fungicida mínima. 
CIM DE PRIMEIRA PASSAGEM CIM DE SEGUNDA 
PASSAGEM 
 
Compostos 
CI 90% Leitura 
CI 90% Resazurina CFM 
CI 90% Leitura CI 90% 
CFM
 
visual visual Resazurina 
Clotrimazol 2 0,125 8 1 0,5 4 
Clotrimazol + 
1 0,125 4 2 1 8
 
acetato de zinco 
Clotrimazol + cloreto 
1 2 4 2 0,5 8
 
de zinco 
Acetato de 
zinco >16 >16 >16 >16 >16
 >16 
Cloreto de 
zinco >16 >16 >16 >16 >16
 >16 
Itraconazol 1 2 8 2 1 8 
Tabela 1. Na concentração inibitória mínima de primeira passagem o teste da resazurina revelou que as amostras 
tratadas com clotrimazol complexado ao acetado de zinco obtiveram a mesma eficiência que o clotrimazol, comparado 
também ao itraconazol, o composto complexado apresentou resultados mais satisfatórios, todavia na comparação da 
concentração fungicida mínima o clotrimazol complexado ao acetado de zinco resultou em maior competência 
comparada as drogas comerciais. Na concentração inibitória mínima de segunda passagem o teste da resazurina revelou 
que as amostras tratadas com clotrimazol complexado ao cloreto de zinco apresentaram a mesma capacidade de inibiçãoque o clotrimazol e melhor efetividade comparado ao itraconazol, entretanto na análise da concentração fungicida 
mínima o composto complexado se mostrou menos eficaz que o clotrimazol e na mesma proporção que o itraconazol. 
 
Citometria 
A marcação com BODIPY 493/503 sugere que houve um ligeiro acúmulo de lipídios neutros após 
exposição a ZnAc e ZnCl. 
A marcação com MitoTracker Red CMXRos indica que houve uma ligeira diminuição da atividade 
mitocondrial após o tratamento com Ctz e Ctz-ZnCl. Por outro lado, a exposição aos sais de Zinco induziu 
aumento desta marcação, que pode estar refletindo a hiperpolarização da mitocôndria em resposta ao 
estresse celular ou a presença de mais mitocôndrias nas células. 
Devido ao reduzido número de leveduras obtidas após exposição aos compostos, foi possível adquirir apenas 
2000 eventos, sem que houvesse possibilidade de fazer duplicatas. É necessário que este experimento seja 
repetido para que de fato uma conclusão seja formulada. Sendo assim, esses resultados tratam-se apenas de 
resultados preliminares. Entretanto, já indicam que os compostos promovem alterações na homeostase da 
célula. 
 
 
Compostos Intensidade de fluorescência 
 
BODIPY 493/503 a 
% Células m 
 
MitoTracker 
arcadas 
 
Red CMXRos 
Controle 
157.915,19 ± 1,5 
31,6 
ZnAc 
259.749,78 ± 1,3 
57,1 
ZnCl 
261.652,36 ± 1,2 
42,6 
Ctz 
201.109,24 ± 0,8 
24,8 
Ctz-ZnAc 
170.860,06 ± 0,9 
29,4 
Ctz-ZnCl 
149.959,13 ± 1,7 
21,2 
a Média ± desvio padrão 
Tabela 2. Resultados preliminares utilizando marcações para lipídios neutros (BODIPY 493/503) e 
atividade mitocondrial (MitoTracker Red CMXRos) e análise por citometria, onde 2000 eventos foram 
adquiridos. 
 
Microscopia eletrônica de varredura 
 
Figura 4: Análise dos diferentes tratamentos por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Células controle 
apresentando leveduras e hifas bem preservadas (A e B). Tratamento com Acetato de zinco apresenta leveduras bem 
preservadas, porém com ausência de hifas (C e D). Tratamento com Cloreto de zinco apresenta diminuição de leveduras 
e presença de poucas hifas (E e F). Tratamento com Clotrimazol + Acetato de zinco (G e H) e Clotrimazol + Cloreto de 
zinco (I e J) apresentam alterações estruturais nas leveduras e ausência de hifas. Tratamento com Clotrimazol apresenta 
poucas leveduras e estas com alterações estruturais e ausência de hifas. 
 
CONCLUSÃO 
 
Nossos dados ainda são preliminares e ainda não podemos concluir se os fármacos complexados a metais 
são mais efetivos do que o fármaco comercial, sendo necessários novos experimentos com um maior 
número de isolados clínicos. Entretando, um resultado muito interessante, foi a atividade do clotrimazol tão 
ativo quanto o itraconazol, podendo ser considerado como uma opção para tratamentos de uso tópico. 
 
REFERÊNCIAS 
 
HADDAD, A….(et a1). Técnicas de microscopia eletrônica aplicadas às ciências biológicas. Rio de 
Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia, 2007. 
LACAZ, C. S. PORTO, E, et al. Tratado de micologia médica lacaz. São Paulo: Sarvier. 2002. 
SANTOS. L. P. B. Avaliação de Compostos com Potencial Antigúngico em Sporothrix sckenekii e 
Sporothrix brasiliensis. Dissertação (Mestrado em Ciências Biologicas). Universidade Federal do Rio de 
Janeiro, Rio de Janeiro, 2012. 
SIDRIM, J. J. Moreira, J. L. B. Fundamentos clínicos e laboratoriais da micologia médica. Rio de Janeiro: 
Guanabara, 1999. 
SIDRIM, J. J. C. ROCHA, M, F, G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos. Rio de Janeiro: 
Guanabara, 2010