Estudo de Inibidores de Colinesterases

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ESTUDO DE INIBIDORES DE COLINESTERASES
APLICANDO TÉCNICAS DE QSAR-2D (HQSAR) E
DOCKING MOLECULAR
SIMONE DECEMBRINO DE SOUZA
Orientadores:
Prof. Dr. CARLOS RANGEL RODRIGUES
Prof. Dr. LUCIO MENDES CABRAL
Rio de Janeiro – 2012
ii
SIMONE DECEMBRINO DE SOUZA
ESTUDO DE INIBIDORES DE COLINESTERASES
APLICANDO TÉCNICAS DE QSAR-2D (HQSAR) E
DOCKING MOLECULAR
Orientadores: Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues
Prof. Dr. Lucio Mendes Cabral
Rio de Janeiro
2012
iii
Ficha Catalográfica
iv
SIMONE DECEMBRINO DE SOUZA
ESTUDO DE INIBIDORES DE COLINESTERASES APLICANDO TÉCNICAS
DE QSAR-2D (HQSAR) E DOCKING MOLECULAR.
Aprovada em _____ de ________________ de 2012.
____________________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues - Orientador
Faculdade de Farmácia – UFRJ (Presidente)
____________________________________________________________
Profa. Dra. Suzana Guimarães Leitão
Faculdade de Farmácia – UFRJ
____________________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Mauricio Rabello de Sant'Anna
Instituto de Ciências Exatas – UFFRJ
____________________________________________________________
Profa. Dra. Nuria Cirauqui Diaz
Faculdade de Farmácia – UFRJ
____________________________________________________________
Profa. Dra. Claudia Pinto Figueiredo
Faculdade de Farmácia – UFRJ
____________________________________________________________
Profa. Dra Yraima Moura Lopes Cordeiro
Faculdade de Farmácia – UFRJ
2012
v
vi
AGRADECIMENTOS
A DEUS pelo privilégio de sentir sua presença em minha vida e por todas as
oportunidades de conquistas pessoais. A Ele, toda honra e glória.
À minha irmã, Cristina Lopes de Souza, que me ensinou o valor da paciência e do amor
verdadeiro, sem ela, não seria o que sou hoje.
Ao meu esposo, Marcelo Santos de Souza, pela força, amor, compreensão e paciência
durante todos os momentos da minha vida. Agradeço por me ensinar o valor da
persistência e por não deixar que eu desistisse dos meus sonhos.
Aos meus filhos, Marcella e William, presentes de DEUS pra mim, meus melhores
projetos de vida! Obrigada pela alegria que me dão a cada dia.
Ao Prof. Dr. Carlos Rangel Rodrigues, meu orientador, pelo incentivo constante e por
ter acreditado no meu potencial. Obrigada, por toda a atenção dedicada, por sua amizade
e por tornar meu doutorado possível.
Ao Prof. Dr. Lucio Mendes Cabral, por sempre estar disponível a ouvir, ajudar e
contribuir com meu trabalho.
À Profa. Dra. Alessandra Mendonça Teles de Souza, pela amizade, compreensão,
paciência e sabedoria transmitida. Sua ajuda foi muito importante pra mim.
À Profa. Dra. Ana Carolina Rennó Sodero, pela amizade, atenção e ensinamentos
preciosos pra mim. Sempre presente, sempre disposta a ajudar. Pela a ajuda com os
dockings no Autodock. Meu muito obrigada por sua ajuda!
À aluna de doutorado Bárbara Abrahim Vieira, pela amizade, por sua colaboração
preciosa no meu trabalho de doutorado. Obrigada por domar o Autodock!
Aos membros do laboratório ModMolQSAR pela amizade, ajuda e apoio. Todos foram
importantes nesta conquista. Especialmente à Ana Carolina Corrêa, por sua sinceridade
e carinho e à Riethe por sua ajuda técnica!!!
À Profa. Dra. Magaly Girão Albuquerque, por sua ajuda, amizade e conhecimento nos
momentos importantes deste trabalho. Pelas preciosas correções, meu muito obrigada!
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pelos
ensinamentos necessários à minha formação.
À Banca Examinadora, pelo aceite e pelas contribuições valiosas para este trabalho.
A todas as pessoas que não citei, mas colaboraram direta ou indiretamente para o
desenvolvimento deste trabalho. Obrigada, sem vocês, eu não teria chegado até aqui.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelos
recursos financeiros fornecidos.
vii
RESUMO
A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa associada à
perda de neurônios colinérgicos no cérebro, que acomete mais de 30 milhões de pessoas
por ano no mundo. A diminuição da transmissão colinérgica central está relacionada
com esta patologia, portanto, o aumento desta transmissão pelo uso de inibidores de
acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BChE), tem sido considerado como a
melhor abordagem para a DA. Na primeira parte deste estudo, uma serie de 36
derivados 4-[(dietilamino)-metil]-fenol com atividade inibitória sobre AChE e BChE,
extraída da literatura, foi estudada por QSAR-2D, empregando análise de fragmentos
estruturais HQSAR ("Hologram Quantitative Structure-Activity Relationship”). Foram
construídos e validados modelos de HQSAR para as duas atividades que mostraram
resultados estatísticos significativos (AChE: r2 = 0,974 e q2 = 0,897; BChE: r2 = 0,945 e
q2 = 0,883) e baixos valores residuais entre atividade experimental e calculada. O mapa
de contribuição de atividade, mostrou que unidades estruturais contendo região
aromática e um tamanho maior da cadeia lateral colaboram para o aumento da inibição.
Na segunda parte do trabalho, foram realizados estudos de docking molecular dos
inibidores nas enzimas AChE e BChE. Na ausência da estrutura 3D da BChE de cavalo,
a mesma foi construída por modelagem comparativa usando o programa Modeller. O
melhor modelo 3D foi utilizado nas simulações de docking molecular, empregando os
programas AutoDock e Molegro Virtual Docker (MVD). Os resultados de docking
molecular no sítio ativo da AChE indicaram um modo de ligação preferencial dos
derivados de maior atividade inibitória, ocupando tanto a cavidade catalítica quanto o
sítio aniônico periférico (PAS, do inglês peripheral anionic site). A análise do
complexo do derivado com perfil mais ativo com a AChE revelou uma interação por
ligação hidrogênio com o resíduo Tyr121 e duas interações cátion-π com os resíduos
Trp84 e Trp279. Este padrão não foi observado para os derivados de menor atividade,
que apresentaram, de um modo geral, uma interação por empilhamento π-π com o
resíduo Tyr334, com deslocamento no sítio PAS, devido à cadeia lateral mais curta,
impedindo uma interação com Trp279, descrita na literatura como importante para a
inibição. Os resultados de docking molecular no sítio ativo da BChE indicaram que os
compostos de maior atividade apresentaram interações com os resíduos Trp79, Asp67,
Tyr329 e Leu283. Os compostos de menor perfil inibitório não apresentam interações
com o resíduo Leu283, devido à cadeia lateral mais curta. Esta interação parece ser
importante para a atividade inibitória contra a BChE. A partir das informações obtidas
nestes estudos, novos inibidores de AChE e BChE foram propostos e apresentaram um
melhor perfil inibitório sobre BChE previsto pelo modelo de HQSAR, que foi
corroborado por estudos de docking molecular, apresentando uma proximidade com a
His435 da tríade catalítica.
Palavras-chave: Alzheimer; Acetilcolinesterase, Butirilcolinesterase, Modelagem
Comparativa; Docking Molecular.
viii
ABSTRACT
Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder associated with loss of
cholinergic neurons in the brain, which affects over 30 million people per year
worldwide. The decrease in central cholinergic transmission is related to this pathology,
therefore, the increase of this transmission, through the use of inhibitors of
acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE), has been considered as
best approach to AD. In the first part of this study, a series of 36 4 - [(diethylamino)
methyl] phenol derivatives with potential inhibitory power against AChE and BChE,
was taken from the literature and it's been analyzed through QSAR-2D, using HQSAR
("Hologram Quantitative Structure-Activity Relationship”) structural fragments.
HQSAR models were constructed and validated to both studies that showed significant
statistical results (AChE: r2 = 0.974 and q2 = 0.897; BChE: r2 = 0.945and q2 = 0.883)
and lower residual values between experimental and calculated activities. The activity
contribution map generated by the study showed that the structural units containing the
aromatic region and a larger side chain collaborate to increase inhibition. In the second
part of the work were performed molecular docking studies of cholinesterase inhibitors.
In the absence of 3D structure of BChE from horse, it was constructed by comparative
modeling, using the Modeller program. The best 3D model was utilized in the
simulations of docking molecular, using AutoDock and Molegro Virtual Docker (MVD)
programs. The results of molecular docking in the active site of AChE indicated a
preferred binding mode of derivatives that have higher inhibitory activity, occupying
both the catalytic cavity as the anionic peripheral site (PAS). Analysis of AChE
complex with the most active derivative revealed that it participates in a hydrogen bond
with residue Tyr121, two cation-π interactions with residues Trp84 and Trp279. This
profile was not observed for derivatives of lower activity, that showed, in general, a π-π
stacking interaction with Tyr334 residue, which leads to a shift in the site of PAS,
presumably due to the shorter side chain, preventing interaction with Trp279, which is
reported in the literature as important for inhibition. The results of molecular docking in
the active site of BChE indicated that compounds with higher activity performed
interactions with residues Trp79, Asp67, Tyr329 and Leu283. Those compounds with
low inhibitory profile showed no interaction with Leu283 residues, due to its shorter
side chain, which seems to be important in the set of observed interactions to the
inhibitory activity against BChE. From the information obtained in this study, new
inhibitors of AChE and BChE were proposed and they presented a better inhibitory
profile against BChE, predicted by HQSAR, corroborated by studies of molecular
docking, close to the His435 catalytic triad.
Keywords: Alzheimer's; Acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, Comparative
Modeling, Molecular Docking.
ix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Prevalência da doença de Alzheimer – Aumento exponencial com a idade..... 2
Figura 2. Principais demências na terceira idade no Brasil (adaptado de HERRERA et
al., 2002)................................................................................................................... 3
Figura 3. Clivagem da proteína precursora amiloide (PPA) (1) iniciado pelas enzimas β
e γ secretases (2) gerando peptídeos da família β amilóide e suas isoformas Aβ42 e
Aβ40 (3) (adaptado de WEINER et al., 2012). ........................................................ 4
Figura 4. Formação de oligômeros de proteínas β amilóides (1), agregação dos
oligômeros (2) e formação de placas amilóides com perda da capacidade de
realizar sinapses (3) (adaptado de Kung, 2012) ....................................................... 5
Figura 5. Representação esquemática do sítio ativo da acetilcolinesterase (Araújo,
2010)......................................................................................................................... 9
Figura 6. Representação esquemática do mecanismo de hidrólise da acetilcolina pela
acetilcolinesterase (Araújo, 2010). ......................................................................... 10
Figura 7. Estrutura dos principais fármacos utilizados no tratamento do Alzheimer .... 13
Figura 8. Estrutura geral dos derivados fenólicos (adaptado de Yu et al, 2010) ........... 13
Figura 9. Geração de um holograma molecular (Tong et al., 1998). ............................. 18
Figura 10. Exemplo de representação das contribuições atômicas individuais............. 19
Figura 11. Etapas da construção de um modelo 3D por modelagem
comparativa(Adaptado de Marti-Renom et al, 2000)............................................. 21
Figura 12. Gráfico de Ramachandran exemplificando a estereoquímica de acordo com a
distribuição dos ângulos phi e psi. Em vermelho, regiões mais favoráveis, em
amarelo e creme, regiões permitidas; e em branco, regiões desfavoráveis. ......... 24
Figura 13. Exemplo do gráfico de Z-score (A) e gráfico de energia (B) obtidos pelo
programa PRoSA.................................................................................................... 25
Figura 14. Estrutura 2D do ligante (íon decametônio, DME) extraído da estrutura 3D
da AChE de Torpedo californica (PDB ID 1ACL)................................................ 37
Figura 15. Resultado da análise conformacional. A) Estrutura do confôrmero de menor
energia do composto de menor cadeia lateral (composto 1). B) Conformações
estendida e dobrada do composto 23. C) Seleção do confôrmero do composto mais
ativo para inibição de AChE (composto 26) semelhante ao íon decametônio. ...... 43
Figura 16. Distribuição dos valores de atividade biológica (pIC50, M) dos compostos
dos conjuntos de treinamento (A) e de teste (B) para AChE. ................................ 44
x
Figura 17. Distribuição dos valores de atividade biológica (pIC50, M) dos compostos
dos conjuntos de treinamento (A) e de teste (B) para BChE.................................. 44
Figura 18. Esquema dos diferentes parâmetros de distinção do fragmento. .................. 45
Figura 19. Gráfico do valores de pIC50 experimental versus predito dos conjuntos de
treinamento e teste dos inibidores de AChE e BChE. ........................................... 49
Figura 20. Mapas de contribuição atômica dos compostos 26 (mais ativo) e 1 (menos
ativo) para a inibição da AChE, e 24 (mais ativo) e 2 (menos ativo) para a inibição
da BChE.................................................................................................................. 50
Figura 21. Alinhamento entre as sequências de BChE cavalo e BChE humana.
Alinhamento foi construído com ClustalW (LARKIN et al., 2007), e a estrutura
secundária foi atribuída pelo programa DSSP (KABSCH & SANDER, 1983). Em
azul: folha β; em vermelho: α hélice; em amarelo:hélice 3-10. ............................. 53
Figura 22. Gráfico de Ramachandran para os modelos (A) Swiss-model e (B) Modeller
obtidos pelo programa ProCheck. .......................................................................... 54
Figura 23. Em A) Gráfico de Z-score dos modelos avaliados. Modelo A gerado pelo
SwissModel (Z-score = -10,63); Modelo B gerado pelo Modeller (Z-score = -
10,70), modelo 1P0M (Z-score= -9,69). Em B) Gráfico scores de resíduos dos
modelos gerados. .................................................................................................... 55
Figura 24. Representação do modelo de homologia para butirilcolinesterase cavalo
(BChE) construído pelo programa Modeller (modelo B). Resíduos do sítio ativo
(Glu194, Ser195 e His435) são mostrados em em destaque. ................................. 56
Figura 25. Sobreposição do DME original obtida do cristal (amarelo) e da melhor pose
de docking (roxo) com RMSD= 1,26Å. Principais resíduos de aminoácidos do sitio
catalítico em destaque............................................................................................. 58
Figura 26. Sobreposição do DME original obtida do cristal (amarelo) e da melhor pose
de docking (roxo) com RMSD= 1,51Å. Principais resíduos de aminoácidos do sitio
catalítico em destaque............................................................................................. 59
Figura 27. Sobreposição do BUT original obtida do cristal (amarelo) e da melhor pose
de docking (roxo) com RMSD= 0,96 Å. Principais resíduos de aminoácidos do
sitio catalítico em destaque..................................................................................... 60
Figura 28. Sobreposição do BUT original obtida do cristal (amarelo) e da melhor pose
de docking (roxo) com RMSD= 1,47 Å. Principais resíduos de aminoácidos do
sitio catalítico em destaque.....................................................................................61
xi
Figura 29. A) Representação da estrutura 2D e 3D do derivado 26; B) Representação da
pose de menor energia encontrada no cluster de maior população; C) Clusters
obtidos no docking do derivado 26 e estrutura cristal 1ACL. ................................ 63
Figura 30. Sobreposição das conformações de DME do cristal (amarelo) e derivado 26
(roxo) no sítio ativo de AChE. Principais resíduos do sítio ativo em destaque. Os
átomos de nitrogênio e de oxigênio estão representados pelas cores azul e
vermelho, respectivamente. .................................................................................... 64
Figura 31. A) Representação da estrutura 3D do derivado 26 na pose de menor valor de
MolDock score (MVD); B) Representação da pose de menor valor de Rerank-
score (azul) sobreposta ao DME do cristal original. .............................................. 65
Figura 32. Resultado de docking molecular do derivado 26 empregando o programa
Pymol. A) Sobreposição das melhores poses obtidas pelo AutoDock (roxo) e MVD
(azul); B) Principais interações obtidas pelo AutoDock; C) Principais interações
obtidas pelo MVD. ................................................................................................. 66
Figura 33. Resultado de docking molecular do derivado 24 empregando programa
Pymol A) Sobreposição das melhores poses obtidas pelo AutoDock (rosa) e MVD
(azul); B) Principais interações obtidas pelo AutoDock; C) Principais interações
obtidas pelo MVD. ................................................................................................. 67
Figura 34. Resultado de docking molecular do derivado 1 empregando programa Pymol
A) Sobreposição das melhores poses obtidas pelo AutoDock (azul) e MVD (rosa);
B) Principais interações obtidas pelo AutoDock; C) Principais interações obtidas
pelo MVD............................................................................................................... 69
Figura 35. Resultado de docking molecular do derivado 6 empregando o programa
Pymol A) Sobreposição das melhores poses obtidas pelo AutoDock (amarelo) e
MVD (roxo); B) Principais interações obtidas pelo AutoDock; C) Principais
interações obtidas pelo MVD. ................................................................................ 70
Figura 36. A) Representação da estrutura 3D do composto 24; B) Representação da
pose de menor energia encontrada no cluster de maior população; C) Clusters
obtidos no docking do derivado 24 e estrutura cristal do modelo de BChE gerado
por homologia......................................................................................................... 73
Figura 37. Resultado de docking molecular do derivado 24 empregando programa
Pymol A) Sobreposição das melhores poses obtidas pelo AutoDock (cinza) e MVD
(verde); B) Principais interações obtidas pelo AutoDock; C) Principais interações
obtidas pelo MVD. ................................................................................................. 74
xii
Figura 38. Resultado de docking molecular do derivado 26 empregando programa
Pymol A) Sobreposição das melhores poses obtidas pelo AutoDock (amarelo) e
MVD (rosa); B) Principais interações obtidas pelo AutoDock; C) Principais
interações obtidas pelo MVD. ................................................................................ 75
Figura 39. Resultado de docking molecular do derivado 2 empregando programa Pymol
A) Sobreposição das melhores poses obtidas pelo AutoDock (vinho) e MVD
(amarelo); B) Principais interações obtidas pelo AutoDock; C) Principais
interações obtidas pelo MVD. ................................................................................ 77
Figura 40. Resultado de docking molecular do derivado 1 empregando o programa
Pymol A) Sobreposição das melhores poses obtidas pelo AutoDock (azul) e MVD
(verde); B) Principais interações obtidas pelo AutoDock; C) Principais interações
obtidas pelo MVD. ................................................................................................. 78
Figura 41. Esquema da proposição de novos candidatos a inibidores de colinesterases,
baseado na estrutura geral dos compostos 24 e 26. ................................................ 80
Figura 42. Resultado de docking molecular dos novos derivados e a AChE empregando
programa Pymol. A) Principais interações com o derivado 24a; B) Principais
interações como derivado 24b; C) Principais interações com o derivado 26a; C)
Principais interações com o derivado 26b.............................................................. 84
Figura 43. Resultado de docking molecular dos novos derivados e a BChE empregando
programa Pymol. A) Principais interações com o 24a; B) Principais interações
como derivado 24b; C) Principais interações com o derivado 26a; C) Principais
interações com o derivado 26b............................................................................... 86
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estrutura química e atividade biológica (pIC50, M) dose inibidores de AChE e
BChE. ..................................................................................................................... 32
Tabela 2. Distâncias entre os átomos de nitrogênio protonados, dos compostos e do íon
decametônio............................................................................................................ 42
Tabela 3. Resumo dos índices estatísticos de HQSAR para diversas distinções de
fragmentos (DF), utilizando o tamanho padrão do fragmento (4-7) para os
inibidores da AChE e da BChE. ............................................................................. 46
Tabela 4. Resumo dos índices estatísticos de HQSAR na influência dos vários tamanhos
de fragmentos (TF) utilizando os parâmetros de distinção fragmento B/C e A/B
para inibidores de AChE e BChE, respectivamente. .............................................. 47
Tabela 5. Valores experimentais, preditos e residuais (pIC50Exp - pIC50Pred) de pIC50
(M) de inibidores de AChE e BChE utilizando os melhores modelos de HQSAR.48
Tabela 6. Atividade biológica estimada para os novos derivados fenólicos empregando
modelos de HQSAR. .............................................................................................. 81
xiv
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
1.1. DOENÇA DE ALZHEIMER ................................................................................ 1
1.1.1 HISTÓRICO.................................................................................................... 1
1.1.2 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS................................................................ 1
1.1.3 ETIOPATOGENIA DA DOENÇA DE ALZHEIMER ................................. 3
1.1.3.1 PLACAS SENIS.......................................................................................... 4
1.1.3.2 EMARANHADOS NEUROFIBRILARES ................................................ 5
1.1.3.3 HIPÓTESE COLINÉRGICA ...................................................................... 6
1.1.4 ACETILCOLINESTERASE........................................................................... 8
1.1.5 BUTIRILCOLINESTERASE ....................................................................... 10
1.1.6 TRATAMENTO DA DOENÇA DE ALZHEIMER.................................... 11
1.1.7 INIBIDORES DE SÍTIO DUAL DE COLINESTERASES ..................... 13
1.2. MODELAGEM MOLECULAR ......................................................................... 14
1.2.1. CORRELAÇÃO QUANTITATIVA ENTRE ESTRUTURA QUÍMICA E
ATIVIDADE BIOLÓGICA. .................................................................................. 15
1.2.1.1. CORRELAÇÃO QUANTITATIVA ENTRE A ESTRUTURA QUÍMICA
E A ATIVIDADE BIOLÓGICA UTILIZANDO FRAGMENTOS
ESTRUTURAIS ..................................................................................................... 16
1.3. MODELAGEMCOMPARATIVA..................................................................... 19
1.4. DOCKING MOLECULAR................................................................................. 25
1.4.1 ALGORÍTMOS GENÉTICOS...................................................................... 27
1.4.2 AUTODOCK................................................................................................. 27
1.4.2 MOLEGRO VIRTUAL DOCKER ............................................................... 28
2.JUSTIFICATIVA.......................................................................................................28
3. OBJETIVOS ............................................................................................................. 29
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................. 30
4. MÉTODOS................................................................................................................ 31
4.1 CONSTRUÇÃO, OTIMIZAÇÃO E ANÁLISE CONFORMACIONAL DA
SÉRIE DE COMPOSTOS EM ESTUDO .............................................................. 31
4.2 QSAR 2D (HQSAR) ............................................................................................ 31
4.2.1. Banco de dados............................................................................................. 31
4.2.2. Construção dos modelos de HQSAR para AChE e BChE ........................... 33
4.2.3 Parâmetros estatísticos usados para avaliar os modelos de QSAR ............... 34
4.3 CONSTRUÇÃO DO MODELO DE BCHE POR MODELAGEM
COMPARATIVA ..................................................................................................... 34
4.3.1 Identificação e seleção de proteínas moldes.................................................. 35
xv
4.3.2 Alinhamento das seqüências primárias ......................................................... 35
4.3.3 Construção do modelo 3D ............................................................................. 35
4.3.4 Validação dos modelos e seleção do melhor modelo. ................................... 35
4.4 DOCKING MOLECULAR ............................................................................... 36
4.4.1 Obtenção das estruturas 3D das enzimas alvo............................................... 36
4.4.1.1 Acetilcolinsterase........................................................................................ 36
4.4.1.2 Butirilcolinesterase ..................................................................................... 37
4.4.2 AUTODOCK................................................................................................ 37
4.4.3.1 Preparação das enzimas .............................................................................. 37
4.4.3.2 Preparação dos ligantes .............................................................................. 38
4.4.3.3 Parâmetros de docking................................................................................ 38
4.4.4 MOLEGRO VIRTUAL DOCKER ............................................................... 39
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 41
5.1 Construção otimização e análise conformacional dos compostos....................... 41
5.2 QSAR-2D (HQSAR) ........................................................................................... 43
5.3 MODELAGEM POR HOMOLOGIA DA BChE ................................................ 51
5.3.1 Identificação e seleção de proteínas moldes.................................................. 52
5.3.3 Construção do modelo ................................................................................... 53
5.3.4 Validação do modelo ..................................................................................... 54
5.4 DOCKING MOLECULAR.................................................................................. 56
5.4.1 VALIDAÇÃO DOS PROTOCOLOS DE DOCKING POR RE-DOCKING 56
5.4.1.1 ACETILCOLINESTERASE...................................................................... 57
5.4.1.1.1 AUTODOCK........................................................................................... 57
5.4.1.1.2 MOLEGRO ............................................................................................. 58
5.4.1.2 BUTIRILCOLINESTERASE .................................................................... 59
5.4.1.2.1.AUTODOCK........................................................................................... 59
5.4.1.2.2 MOLEGRO ............................................................................................. 60
5.4.2 DOCKING MOLECULAR DOS DERIVADOS FENÓLICOS................... 61
5.4.2.1 ACETILCOLINESTERASE...................................................................... 62
5.4.2.1.1. DOCKING MOLECULAR ENTRE OS DERIVADOS 26, 24, 1, 6 E
ACHE ..................................................................................................................... 62
5.4.2.2 BUTIRILCOLINESTERASE .................................................................... 72
5.4.2.2.1. DOCKING MOLECULAR ENTRE OS DERIVADO 24, 26, 1, 2 E
BCHE ..................................................................................................................... 72
5.5 PLANEJAMETO RACIONAL DE NOVOS DERIVADOS FENÓLICOS........ 79
5.5.1 ESTUDOS DE QSAR-2D (HQSAR) DOS NOVOS DERIVADOS
FENÓLICOS .......................................................................................................... 81
5.5.2 ESTUDOS DE DOCKING MOLECULAR DOS NOVOS DERIVADOS
FENÓLICOS .......................................................................................................... 82
xvi
5.5.2.1 Acetilcolinesterase...................................................................................... 82
5.5.2.2 BUTIRILCOLINESTERASE .................................................................... 84
6. CONCLUSÕES......................................................................................................... 87
7. REFERÊNCIAS.........................................................................................................88
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. DOENÇA DE ALZHEIMER
1.1.1 Histórico
Em 1907 o neuropatologista alemão Alois Alzheimer (1864-1915) publicou o
histórico clínico de uma mulher que apresentava alterações de comportamento e
deterioração cognitiva progressiva, referente a um quadro de demência que não podia
ser classificado em nenhuma doença conhecida na época. Após o falecimento da
paciente, em exame anatomopatológico, Alzheimer detectou dois tipos de lesões no
tecido cerebral, conhecidos, atualmente, como placas senis (PS) e emaranhados
neurofibrilares (ENF). No ano seguinte, outro pesquisador chamado Kraepelin começou
a referir-se a essa condição como doença de Alzheimer (DA), alcunha pela qual é
conhecida até hoje (MESULAM, 2000).
Estudos neuropatológicos da década de 1970 mostraram que os substratos
neuropatológicos da DA e da demência senil eram iguais e estas doenças passaram a ser
consideradas formas do mesmo processo (TERRY, 1976)
O significado do termo DA, descrito pela primeira vez como um demência pré-
senil, tem mudado ao longo dos anos, abrangendo, agora, demência pré-senil, demência
senil, comprometimento cognitivo leve e DA pré-clínica; todos estes dentro do contexto
da patologia relacionada à DA (FERRER, 2012).
Com o envelhecimento da população mundial, a DA passou de uma forma
relativamente rara de demência para níveis epidêmicos, dando origem a uma enorme
carga social e econômica, gerando interesse crescente tanto na população quanto a
comunidade cientifica (NITRINI, 1999)
1.1.2 Aspectos Epidemiológicos
A DA é uma doença neurodegenerativa progressiva, que causa perda de
memória e altera as funções intelectuais superiores (ALCALA MDEL et al., 2003) ,
sendo a forma mais comum de demência em idosos, acometendo cerca de 50–60% detodos os casos entre as pessoas com mais de 65 anos de idade (MCDOWELL, 2001).
A DA está associada a fatores de risco, como, idade avançada (BERTRAM et al.,
2
1998) diabetes (MARTINS et al., 2006) hipertensão (KIVIPELTO et al., 2002),
elevados níveis de colesterol (KIVIPELTO & SOLOMON, 2006) e fumo (ANSTEY
et al., 2007). Geralmente, o quadro evolui para morte em torno de 8 a 10 anos após o
início da doença (MOHS, 2005), onde a prevalência da DA cresce, exponencialmente,
com o aumento da idade (Figura 1) (MEBANE-SIMS, 2009).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO, World Health Organization;
OMS, 2012), estima-se que existam, atualmente, cerca de 18 milhões de pessoas no
mundo com DA e, numa projeção desse quadro para 2025, estima-se um aumento de 34
milhões casos. Grande parte deste aumento se dará nos países em desenvolvimento,
devido ao envelhecimento da população. Atualmente, mais de 50% das pessoas com
DA vivem em países em desenvolvimento e, em 2025, seria mais de 70%.
Figura 1. Prevalência da doença de Alzheimer – Aumento exponencial com a idade.
(WHO http://www.searo.who.intSection1823_8066.htm, em 21 de outubro de 2012)
Aproximadamente 7,1% da população brasileira com 65 anos de idade ou mais
tem alguma forma de demência (Figura 2), onde a DA é responsável por 55,1% dos
casos; a demência vascular, por 9,3%, e a doença cérebro-vascular, por 14,4%
(HERRERA et al., 2002).
1,45%
2,80%
6,60%
11,10%
23,60%
0,0%
5,0%
10,0%
15,0%
20,0%
25,0%
65 70 75 80 85 90
Ta
xa
 d
e 
pr
ed
om
ín
io
 %
Idade
3
Figura 2. Principais demências na terceira idade no Brasil (adaptado de HERRERA et al., 2002).
1.1.3 Etiopatogenia da doença de Alzheimer
Demência é um termo geral que descreve uma variedade de doenças e condições
que se desenvolvem quando as células nervosas do cérebro morrem ou deixam de
funcionar normalmente. A morte ou o mau funcionamento dos neurônios provoca
mudanças na memória, no comportamento e na capacidade de pensar com clareza. Na
DA, estas alterações cerebrais prejudicam a capacidade do paciente de realizar funções
básicas, como andar e engolir (ALZHEIMER'S-ASSOCIATION, 2012)
A DA é descrita como uma síndrome multifacetada que surge como
conseqüência de danos neuronais causados por múltiplas e distintas alterações
biológicas, que se apresentam como características histopatológicas. Estas alterações
são a deposição de substância amilóide na forma de placas senis (PS) nos vasos
cerebrais e a perda neuronal associada a acúmulo intracelular de emaranhados
neurofibrilares (ENF) nos neurônios (CUTLER & SRAMEK, 2001; WINBLAD et al.,
2008). Além destas características, observa-se, também, a perda de sinapses e a
depleção da inervação colinérgica cortical (CARAMELLI, 2000). As PS e os ENF
podem estar presentes em cérebros normais senis, porém, em menor quantidade
(RICHARD & AMOUYEL, 2001). Na DA, além dos ENF e das PS, pode-se observar
perda de sinapses e depleção da inervação colinérgica cortical (CARAMELLI, 2000).
Alzheimer
55,1%
3
Figura 2. Principais demências na terceira idade no Brasil (adaptado de HERRERA et al., 2002).
1.1.3 Etiopatogenia da doença de Alzheimer
Demência é um termo geral que descreve uma variedade de doenças e condições
que se desenvolvem quando as células nervosas do cérebro morrem ou deixam de
funcionar normalmente. A morte ou o mau funcionamento dos neurônios provoca
mudanças na memória, no comportamento e na capacidade de pensar com clareza. Na
DA, estas alterações cerebrais prejudicam a capacidade do paciente de realizar funções
básicas, como andar e engolir (ALZHEIMER'S-ASSOCIATION, 2012)
A DA é descrita como uma síndrome multifacetada que surge como
conseqüência de danos neuronais causados por múltiplas e distintas alterações
biológicas, que se apresentam como características histopatológicas. Estas alterações
são a deposição de substância amilóide na forma de placas senis (PS) nos vasos
cerebrais e a perda neuronal associada a acúmulo intracelular de emaranhados
neurofibrilares (ENF) nos neurônios (CUTLER & SRAMEK, 2001; WINBLAD et al.,
2008). Além destas características, observa-se, também, a perda de sinapses e a
depleção da inervação colinérgica cortical (CARAMELLI, 2000). As PS e os ENF
podem estar presentes em cérebros normais senis, porém, em menor quantidade
(RICHARD & AMOUYEL, 2001). Na DA, além dos ENF e das PS, pode-se observar
perda de sinapses e depleção da inervação colinérgica cortical (CARAMELLI, 2000).
Outros
21,2%
Demência Vascular
9,3%
Doença Cérebro-
Vascular
14,4%
3
Figura 2. Principais demências na terceira idade no Brasil (adaptado de HERRERA et al., 2002).
1.1.3 Etiopatogenia da doença de Alzheimer
Demência é um termo geral que descreve uma variedade de doenças e condições
que se desenvolvem quando as células nervosas do cérebro morrem ou deixam de
funcionar normalmente. A morte ou o mau funcionamento dos neurônios provoca
mudanças na memória, no comportamento e na capacidade de pensar com clareza. Na
DA, estas alterações cerebrais prejudicam a capacidade do paciente de realizar funções
básicas, como andar e engolir (ALZHEIMER'S-ASSOCIATION, 2012)
A DA é descrita como uma síndrome multifacetada que surge como
conseqüência de danos neuronais causados por múltiplas e distintas alterações
biológicas, que se apresentam como características histopatológicas. Estas alterações
são a deposição de substância amilóide na forma de placas senis (PS) nos vasos
cerebrais e a perda neuronal associada a acúmulo intracelular de emaranhados
neurofibrilares (ENF) nos neurônios (CUTLER & SRAMEK, 2001; WINBLAD et al.,
2008). Além destas características, observa-se, também, a perda de sinapses e a
depleção da inervação colinérgica cortical (CARAMELLI, 2000). As PS e os ENF
podem estar presentes em cérebros normais senis, porém, em menor quantidade
(RICHARD & AMOUYEL, 2001). Na DA, além dos ENF e das PS, pode-se observar
perda de sinapses e depleção da inervação colinérgica cortical (CARAMELLI, 2000).
Demência Vascular
9,3%
Doença Cérebro-
Vascular
14,4%
4
1.1.3.1 Placas Senis
As placas senis (PS), ou placas amilóides, são estruturas resultantes da deposição
ou agregação que ocorre após a clivagem anormal da proteína precursora amilóide
(PPA), uma glicoproteína com domínio extracelular extenso e domínio citoplasmático
curto, encontrada em quase todas as células de mamíferos, presente em concentração
elevada nos neurônios (ARAÚJO, 2010). As enzimas responsáveis pela clivagem da
PPA são as α, β e γ secretases. Na DA, a PPA sofre clivagem amiloidogênica, dando
origem a concentrações elevadas de uma família de peptídeos de folhas β (Figura 3). O
principal componente proteico PS os peptideos β amilóides (βA), porém, observa-se a
presença freqüente das isoformas Aβ42 e Aβ40 (WEINER et al., 2012).
Figura 3. Clivagem da proteína precursora amiloide (PPA) (1) iniciado pelas enzimas β e γ secretases (2)
gerando peptídeos da família β amilóide e suas isoformas Aβ42 e Aβ40 (3) (adaptado de WEINER et al.,
2012).
O acúmulo de proteínas βA promove a sua precipitação e agregação em forma
de placas que provocam um processo inflamatório e/ou oxidativo que leva à perda da
função neuronal (Figura 4) (CARAMELLI, 2000).
4
1.1.3.1 Placas Senis
As placas senis (PS), ou placas amilóides, são estruturas resultantes da deposição
ou agregação que ocorre após a clivagem anormal da proteína precursora amilóide
(PPA), uma glicoproteína com domínio extracelular extenso e domínio citoplasmático
curto, encontrada em quase todas as células de mamíferos, presente em concentração
elevada nos neurônios (ARAÚJO, 2010). As enzimas responsáveis pela clivagem da
PPA são as α, β e γ secretases. Na DA, a PPA sofre clivagem amiloidogênica, dando
origem a concentrações elevadas de uma família de peptídeos de folhas β (Figura 3). O
principal componente proteico PS os peptideos β amilóides (βA), porém, observa-se a
presença freqüente das isoformas Aβ42 e Aβ40 (WEINER et al., 2012).Figura 3. Clivagem da proteína precursora amiloide (PPA) (1) iniciado pelas enzimas β e γ secretases (2)
gerando peptídeos da família β amilóide e suas isoformas Aβ42 e Aβ40 (3) (adaptado de WEINER et al.,
2012).
O acúmulo de proteínas βA promove a sua precipitação e agregação em forma
de placas que provocam um processo inflamatório e/ou oxidativo que leva à perda da
função neuronal (Figura 4) (CARAMELLI, 2000).
4
1.1.3.1 Placas Senis
As placas senis (PS), ou placas amilóides, são estruturas resultantes da deposição
ou agregação que ocorre após a clivagem anormal da proteína precursora amilóide
(PPA), uma glicoproteína com domínio extracelular extenso e domínio citoplasmático
curto, encontrada em quase todas as células de mamíferos, presente em concentração
elevada nos neurônios (ARAÚJO, 2010). As enzimas responsáveis pela clivagem da
PPA são as α, β e γ secretases. Na DA, a PPA sofre clivagem amiloidogênica, dando
origem a concentrações elevadas de uma família de peptídeos de folhas β (Figura 3). O
principal componente proteico PS os peptideos β amilóides (βA), porém, observa-se a
presença freqüente das isoformas Aβ42 e Aβ40 (WEINER et al., 2012).
Figura 3. Clivagem da proteína precursora amiloide (PPA) (1) iniciado pelas enzimas β e γ secretases (2)
gerando peptídeos da família β amilóide e suas isoformas Aβ42 e Aβ40 (3) (adaptado de WEINER et al.,
2012).
O acúmulo de proteínas βA promove a sua precipitação e agregação em forma
de placas que provocam um processo inflamatório e/ou oxidativo que leva à perda da
função neuronal (Figura 4) (CARAMELLI, 2000).
5
Figura 4. Formação de oligômeros de proteínas β amilóides (1), agregação dos oligômeros (2) e formação
de placas amilóides com perda da capacidade de realizar sinapses (3) (adaptado de KUNG, 2012)
1.1.3.2 Emaranhados Neurofibrilares
Os emaranhados neurofibrilares (ENF) são filamentos intraneuronais helicoidais
de proteína tau que, normalmente, fazem parte do citoesqueleto e têm papel importante
na manutenção da estabilidade dos microtúbulos, mas que são fosforilados de maneira
anormal. O cérebro humano começa a produzir uma forma anormal da proteína tau
fosforilada, que não se liga aos microtúbulos e encontra-se em concentrações elevadas
no citosol. Sob tais condições, a proteína tau anormal tende a formar agregados não
biodegradáveis. Não se sabe ainda o porquê das células não eliminarem o material
anormal (BRAAK & DEL TREDICI, 2012). O acúmulo dos ENF no interior dos
neurônios prejudica o transporte axoplasmático e leva à morte celular. Esses ENF estão
presentes em todos os pacientes com DA. Contudo, isso não é uma característica
distintiva da DA, uma vez que esses ENF também são encontrados em outras doenças,
como síndrome de Down, paralisia supra nuclear progressiva e demência associada à
doença de Parkinson (PETRELLA, COLEMAN & DORAISWAMY, 2003)
A primeira teoria para explicar completamente a formação de ambas as marcas
patológicas (PS e ENF), formulada em 1992, foi a hipótese da cascata amilóide.
No entanto, a remoção das placas amilóides não interrompe a progressão da
5
Figura 4. Formação de oligômeros de proteínas β amilóides (1), agregação dos oligômeros (2) e formação
de placas amilóides com perda da capacidade de realizar sinapses (3) (adaptado de KUNG, 2012)
1.1.3.2 Emaranhados Neurofibrilares
Os emaranhados neurofibrilares (ENF) são filamentos intraneuronais helicoidais
de proteína tau que, normalmente, fazem parte do citoesqueleto e têm papel importante
na manutenção da estabilidade dos microtúbulos, mas que são fosforilados de maneira
anormal. O cérebro humano começa a produzir uma forma anormal da proteína tau
fosforilada, que não se liga aos microtúbulos e encontra-se em concentrações elevadas
no citosol. Sob tais condições, a proteína tau anormal tende a formar agregados não
biodegradáveis. Não se sabe ainda o porquê das células não eliminarem o material
anormal (BRAAK & DEL TREDICI, 2012). O acúmulo dos ENF no interior dos
neurônios prejudica o transporte axoplasmático e leva à morte celular. Esses ENF estão
presentes em todos os pacientes com DA. Contudo, isso não é uma característica
distintiva da DA, uma vez que esses ENF também são encontrados em outras doenças,
como síndrome de Down, paralisia supra nuclear progressiva e demência associada à
doença de Parkinson (PETRELLA, COLEMAN & DORAISWAMY, 2003)
A primeira teoria para explicar completamente a formação de ambas as marcas
patológicas (PS e ENF), formulada em 1992, foi a hipótese da cascata amilóide.
No entanto, a remoção das placas amilóides não interrompe a progressão da
5
Figura 4. Formação de oligômeros de proteínas β amilóides (1), agregação dos oligômeros (2) e formação
de placas amilóides com perda da capacidade de realizar sinapses (3) (adaptado de KUNG, 2012)
1.1.3.2 Emaranhados Neurofibrilares
Os emaranhados neurofibrilares (ENF) são filamentos intraneuronais helicoidais
de proteína tau que, normalmente, fazem parte do citoesqueleto e têm papel importante
na manutenção da estabilidade dos microtúbulos, mas que são fosforilados de maneira
anormal. O cérebro humano começa a produzir uma forma anormal da proteína tau
fosforilada, que não se liga aos microtúbulos e encontra-se em concentrações elevadas
no citosol. Sob tais condições, a proteína tau anormal tende a formar agregados não
biodegradáveis. Não se sabe ainda o porquê das células não eliminarem o material
anormal (BRAAK & DEL TREDICI, 2012). O acúmulo dos ENF no interior dos
neurônios prejudica o transporte axoplasmático e leva à morte celular. Esses ENF estão
presentes em todos os pacientes com DA. Contudo, isso não é uma característica
distintiva da DA, uma vez que esses ENF também são encontrados em outras doenças,
como síndrome de Down, paralisia supra nuclear progressiva e demência associada à
doença de Parkinson (PETRELLA, COLEMAN & DORAISWAMY, 2003)
A primeira teoria para explicar completamente a formação de ambas as marcas
patológicas (PS e ENF), formulada em 1992, foi a hipótese da cascata amilóide.
No entanto, a remoção das placas amilóides não interrompe a progressão da
6
doença,indicando que esta hipótese isolada não é suficiente para explicar esta patologia
(LUAN, ROSALES & LEE, 2012)
A causa da DA ainda é um tema controverso, e não existem tratamentos
disponíveis que possam impedir a progressão desta doença. Os tratamentos atuais só
ajudam a aliviar os sintomas (ROBICHAUD, 2006). Os processos neurodegenerativos
com perda considerável de neurônios colinérgicos, resultando numa falha de
transmissão central colinérgica, conduziram a formulação da “hipótese colinérgica”
(PERRY, 1986) (SCHLIEBS & ARENDT, 2006).
1.1.3.3 Hipótese colinérgica
Diversos sistemas neurotransmissores como colinérgico, noradrenérgico,
serotoninérgico e dopaminérgico estão alterados na DA. Este fato chamou a atenção
para a existência de algumas alterações bioquímicas em pacientes com DA, como a
depleção de neurotransmissores (GUALTIERI et al., 1995).
Apesar de muitos sistemas neurotransmissores estarem alterados na DA, o
sistema colinérgico parece ser o mais comprometido, pois apresenta degeneração das
projeções neuronais; perda dos terminais colinérgicos do córtex cerebral; redução da
atividade da colina acetiltransferase e redução da síntese de acetilcolina; redução da
recaptação de colina; aumento da atividade da acetilcolinesterase (AChE); redução do
número de receptores muscarínicos M2; redução do número de receptores nicotínicos
α4β42 e α7 (GUALTIERI et al., 1995).
A hipótese colinérgica, desenvolvida há pouco mais de 30 anos, pouco antes da
hipótese amilóide, foi até então, o alicerce mais importante para o desenvolvimento de
novos fármacos para a DA.
De acordo com esta hipótese, a degeneração dos neurônios colinérgicos é
caracterizada pelo baixo nível de acetilcolina (ACh) no hipocampo e córtex (TERRY &
BUCCAFUSCO, 2003), provocando declínio cognitivo e perda de memória
(SCHLIEBS & ARENDT, 2006). A AChdesempenha um papel importante no
comportamento e na memória, o que, conseqüentemente, destaca a importância das
enzimas que hidrolisam este neurotransmissor, isto é, a acetilcolinesterase (ACh, EE.C.
3.1.1.7) e a butirilcolinesterase (BChE, E.Cr. 3.1.1.8) (SUSSMAN et al., 1991)
7
No que diz respeito ao mecanismo da DA, ambas as hipóteses, cascata amilóide
e colinérgica, são aceitas. Pesquisas recentes com evidências experimentais in vitro e in
vivo indicam que estas duas hipóteses estão inter-relacionadas (GUPTA et al., 2011).
Recentemente, a gênese das placas da proteína amilóide foi associada à algumas
alterações de ambas as enzimas, AChE e BChE, uma vez que a utilização de inibidores
de ChE (AChEI) levam à diminuição destas placas em pacientes com DA (GREIG,
LAHIRI & GIACOBINI, 2005; MUSIAL, BAJDA & MALAWSKA, 2007).
Adicionalmente, a atividade de AChE diminui progressivamente em certas regiões do
cérebro em pacientes em estágio médio ou avançado de DA, alcançando 10–15% dos
valores normais, enquanto a atividade de BChE está inalterada, ou ainda, com um
aumento de 20%. Assim, o aumento da atividade de BChE é maior no hipocampo e no
lobo temporal em pacientes com DA.
Os depósitos de material amilóide são observados muitos anos antes de ocorrer a
degeneração neuronal e demência; isto sugere que algumas placas podem ser benignas.
Ambas as enzimas, AChE e BChE, estão associadas à presença de material amilóide em
pacientes idosos com ou sem alterações significativas da memória. É importante
salientar que estes fatores podem contribuir para a transformação do amilóide benigno
em patogênicas. Placas amilóides avançadas em cérebros de pacientes com DA tem
87% de reatividade para BChE, comparado com 20% de reatividade em estágios iniciais
da doença, considerados ainda como depósitos benignos. É possível que a BChE
desempenhe um papel importante na transformação de placas benignas em formas
malignas associada à degeneração neuronal e demência clínica (BALLARD, 2002).
Assim, não é vantagem uma inibição seletiva da AChE; ao contrário, é desejável
uma inibição equilibrada da AChE e da BChE, onde uma seletividade para BChE pode
resultar em maior eficácia (GIACOBINI, E. , 2004; TUMIATTI et al., 2010). O
acúmulo da substância β amilóide é considerado como uma característica fundamental
na patogênese da DA. No entanto, outras alterações moleculares e neuroquímicas
também ocorrem, como disfunção colinérgica. A descoberta precoce neste campo foi
importante, impulsionando estratégias nas abordagens de tratamento, com o uso de
inibidores da AChE.
A abordagem terapêutica mais aceita, atualmente, é a inibição da AChE.
Considera-se esta abordagem adequada, pois a inibição desta enzima, além de
8
aumentar a oferta de acetilcolina na fenda sináptica, também impede o surgimento de
complexos neurotóxicos (RECANATINI & VALENTI, 2004)
1.1.4 Acetilcolinesterase
A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima que pertence à classe das serino-
hidrolases e pode se apresentar na forma solúvel ou ligada à membrana. A forma
solúvel é encontrada nas terminações nervosas colinérgicas, onde regula a
concentração de acetilcolina livre. Dessa forma, a concentração desse neurotransmissor
permanece elevada nas sinapses, e os receptores nicotínicos e muscarínicos,
responsáveis pela resposta cognitiva, podem ser ativados. A forma ligada à membrana
ocorre em locais inesperados como o eritrócito (RANG, 2004) .
A primeira estrutura tridimensional (3D) da AChE determinada, em 1991, é de
Torpedo californica (SUSSMAN et al., 1991) e desde então, muitas outras estruturas
3D de AChE livre ou em complexo com diversos inibidores, a partir de diferentes
espécies, foram determinados e depositados no banco de dados PDB (do inglês, Protein
Data Bank ) do RCSB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics).
A estrutura 3D da AChE de T. californica complexada com o íon decametônio,
disponível no banco de dados PDB sob o código 1ACL (HAREL et al., 1993), revela
um aspecto estrutural interessante desta enzima, onde o sítio ativo está localizado no
final de um canal profundo e estreito, com cerca de 20 Å de profundidade, chamado
“garganta aromática”, assim denominada, pois mais de 50% de seus aminoácidos são
resíduos aromáticos conservados (Phe120, Phe288, Phe290, Phe330, Phe331, Trp84,
Trp233, Trp279, Trp432, Tyr70, Tyr121, Try130, Try334 e Tyr442) (XU et al., 2008).
O sítio ativo consiste da tríade catalítica (Ser200, Glu327 e His440), do sítio catalítico
aniônico (Trp84, Glu199 e Phe330), da cavidade do oxiânion (Gly118, Gly119 e
Ala201) e da cavidade do grupo acila (Phe288 e Phe290). Esta enzima possui também
um sítio aniônico periférico (PAS, do inglês peripheral anionic site, Asp72, Tyr70,
Tyr121, Trp279 e Phe290), localizado na entrada da "garganta aromática" (KRYGER,
SILMAN & SUSSMAN, 1998) (Figura 5).
9
Figura 5. Representação esquemática do sítio ativo da acetilcolinesterase com a ACh (ARAÚJO, 2010).
Uma estratégia utilizada para aumentar a potência e a seletividade de um fármaco,
quando existem múltiplos sítios de reconhecimento, como observado na AChE, é o
desenvolvimento de compostos com ação dual, isto é, que permita ligação tanto no sítio
ativo quanto no sítio aniônico periférico (CAMPS et al., 2000). Neste sentido, tem se
feito um grande esforço para desenvolver novos inibidores de AChE mais potentes e
seletivos.
Uma melhor compreensão do sítio catalítico de AChE pode identificar novos
mecanismos de inibição desta enzima que poderiam resultar em compostos
terapeuticamente benéficos. Estudos cinéticos e termodinâmicos têm revelado que os
inibidores podem interagir com um ou ambos os sítios de ligação de AChE
(AULETTA, JOHNSON & ROSENBERRY, 2010). Esta é a abordagem de
desenvolvimento empregada por YU e colaboradores (YU et al., 2010).
Além disso, tem sido demonstrado que compostos capazes de interagir
simultaneamente com os sítios ativo e periférico de AChE (isto é, um inibidor dual,
como o íon decametônio) podem interferir, também, na agregação de β amilóides,
9
Figura 5. Representação esquemática do sítio ativo da acetilcolinesterase com a ACh (ARAÚJO, 2010).
Uma estratégia utilizada para aumentar a potência e a seletividade de um fármaco,
quando existem múltiplos sítios de reconhecimento, como observado na AChE, é o
desenvolvimento de compostos com ação dual, isto é, que permita ligação tanto no sítio
ativo quanto no sítio aniônico periférico (CAMPS et al., 2000). Neste sentido, tem se
feito um grande esforço para desenvolver novos inibidores de AChE mais potentes e
seletivos.
Uma melhor compreensão do sítio catalítico de AChE pode identificar novos
mecanismos de inibição desta enzima que poderiam resultar em compostos
terapeuticamente benéficos. Estudos cinéticos e termodinâmicos têm revelado que os
inibidores podem interagir com um ou ambos os sítios de ligação de AChE
(AULETTA, JOHNSON & ROSENBERRY, 2010). Esta é a abordagem de
desenvolvimento empregada por YU e colaboradores (YU et al., 2010).
Além disso, tem sido demonstrado que compostos capazes de interagir
simultaneamente com os sítios ativo e periférico de AChE (isto é, um inibidor dual,
como o íon decametônio) podem interferir, também, na agregação de β amilóides,
9
Figura 5. Representação esquemática do sítio ativo da acetilcolinesterase com a ACh (ARAÚJO, 2010).
Uma estratégia utilizada para aumentar a potência e a seletividade de um fármaco,
quando existem múltiplos sítios de reconhecimento, como observado na AChE, é o
desenvolvimento de compostos com ação dual, isto é, que permita ligação tanto no sítio
ativo quanto no sítio aniônico periférico (CAMPS et al., 2000). Neste sentido, tem se
feito um grande esforço para desenvolver novos inibidores de AChE mais potentes e
seletivos.
Uma melhor compreensão do sítio catalítico de AChE pode identificar novos
mecanismos de inibição desta enzima que poderiam resultar em compostos
terapeuticamente benéficos.Estudos cinéticos e termodinâmicos têm revelado que os
inibidores podem interagir com um ou ambos os sítios de ligação de AChE
(AULETTA, JOHNSON & ROSENBERRY, 2010). Esta é a abordagem de
desenvolvimento empregada por YU e colaboradores (YU et al., 2010).
Além disso, tem sido demonstrado que compostos capazes de interagir
simultaneamente com os sítios ativo e periférico de AChE (isto é, um inibidor dual,
como o íon decametônio) podem interferir, também, na agregação de β amilóides,
10
desempenhando, assim, uma atividade que vai além da atividade inibitória sobre a
enzima.
O mecanismo de hidrólise da ACh pela AChE (Figura 6) envolve o ataque
nucleofílico da serina ao carbono carbonílico da ACh, gerando um intermediário
tetraédrico estabilizado por ligações hidrogênio, o que produz colina livre e serina
acetilada. Ao final, a hidrólise da serina acetilada regenera o sítio catalítico da enzima
(SILVA, 2002).
Figura 6. Representação esquemática do mecanismo de hidrólise da acetilcolina pela acetilcolinesterase
(ARAÚJO, 2010).
1.1.5 Butirilcolinesterase
Além da AChE, outro tipo de colinesterase é encontrado no sistema nervoso
central, a butirilcolinesterase (BChE) ou pseudocolinesterase. A BChE possui ampla
distribuição, sendo encontrada em tecidos como fígado, pele e músculo liso (RANG,
2004).
Ambas as enzimas são capazes de hidrolisar a acetilcolina (ACh), mas a AChE
tem uma atividade hidrolítica 1013 vezes maior do que a da BChE, à mesma temperatura
e pH. De fato, no cérebro normal, a atividade da AChE predomina sobre a da BChE,
Além disso, é relatado que a AChE pode desempenhar um papel chave na aceleração da
deposição de placas amilóides (PAN et al., 2008).
Entretanto, evidências demonstram que a atividade da AChE diminui
progressivamente em determinadas regiões do cérebro quando a DA chega ao estágio
médio e avançado, alcançando apenas 10-15% dos valores normais, enquanto que a
11
atividade da BChE é inalterada ou, até mesmo, aumentada em 20% com a progressão da
doença. Portanto, uma quantidade de BChE está disponível em neurônios e placas
neuríticas (YU et al., 2010).
As enzimas AChE e BChE humanas possuem 65% de similaridade na seqüência
primária de aminoácidos. A estrutura 3D da BChE, de modo geral, é semelhante a da
AChE, incluindo tríade catalítica, sítio catalítico, aniônico e PAS (PAN et al., 2008). A
principal diferença reside na cavidade do grupo acila, onde três resíduos aromáticos
presentes na AChE são substituídos por resíduos menos volumosos na BChE, o que
resulta numa cavidade maior, permitindo a hidrólise de grupos mais volumosos.
A estrutura 3D da BChE de Homo sapiens complexada com o ácido butanóico,
disponível no PDB sob o código 1P0I (NICOLET et al., 2003), evidencia que o sítio
ativo também está localizado no final de um canal profundo e estreito. O sítio ativo
consiste da tríade catalítica (Ser198, Glu325 e His438), da cavidade do grupo acila
(Leu286 e Val288). O sítio aniônico periférico (PAS) desta enzima é composto e está
localizado na entrada da garganta aromática e pode ter uma função de "guardião
eletrostático". Os resíduos deste sítio PAS são Asp70 e Tyr332 (NAWAZ et al., 2011)
que parecem ser responsáveis pela interação eletrostática inicial com os substratos de
carga positiva e modificam a arquitetura do sítio ativo da BChE.
Algumas evidências sugerem que a inibição da BChE no cérebro pode
representar uma estratégia terapêutica para a DA. É relatado, ainda, que a BChE
desempenha um papel fundamental, que pode, em parte, compensar a ação da AChE.
Por isso, um bom equilíbrio entre os perfis de inibição da AChE e BChE pode resultar
em melhor efeito, na cognição, nas atividades da vida diária e na função global em
pacientes com DA de grau leve a moderado (GIACOBINI, E., 2004).
1.1.6 Tratamento da doença de Alzheimer
Ainda não existe cura para a DA, entretanto, as opções de tratamento
disponíveis aliviam os sintomas e trazem benefícios significativos para os pacientes e
suas famílias.
Os inibidores da acetilcolinesterase (AChEIs) foram os primeiros medicamentos
aprovados e utilizados no tratamento dos sintomas dos pacientes com DA (SMALL &
BULLOCK, 2011). Os AChEIs têm demonstrado eficácia em três grandes domínios:
atividades do cotidiano, comportamento, e função cognitiva. Eles provocam o acúmulo
12
de acetilcolina nos receptores colinérgicos, produzindo efeitos equivalentes aos da
estimulação excessiva dos receptores colinérgicos nos sistemas nervoso central e
periférico.
Historicamente a fisostigmina foi descrita como a primeira substancia inibidora
de colinesterase capaz de atravessar a barreira hemato-encefalico sendo muito útil em
neurologia. A fisostigmina é um alcalóide obtido a partir da fava de Calabar uma planta
perene escalada em tropical da África Ocidental. Esta substância restaura a transmissão
colinérgica no cérebro aliviando os sintomas clínicos de disfunção colinérgica central, é
utilizada no tratamento de glaucoma, em anestesias e em intoxicação por atropina,
escopolamina e outras drogas anticolinérgicas (DWORACEK & RUPREHT, 2002).
Embora tenha demonstrado melhoras significativas da cognição em estudos clínicos
controlados, mostrou efeitos adversos importantes, como a elevação de enzimas
hepáticas (demandando controles periódicos de TGO e TGP), além de requerer várias
tomadas ao dia.
A tacrina foi o primeiro AChEI introduzido na terapia para o tratamento contra a
DA (TUMIATTI et al., 2010). Dentre os AChEIs aprovados para uso na DA, donepezil
e galantamina inibem seletivamente a AChE, enquanto que tacrina e rivastigmina
inibem tanto a AChE quanto a BChE (Figura 7) (MUSIAL, BAJDA &
MALAWSKA, 2007).
A segunda geração de inibidores da acetilcolinesterase, mostrou ter bem menos
toxicidade hepática e maior facilidade posológica. Os efeitos colaterais são, em geral,
gastrointestinais, tipo náuseas, vômitos e diarréia, podendo também afetar o sono. Com
isso o planejamento de novos compostos que possam inibir ambas as colinesterases,
interagindo em ambos os sítios (catalítico e PAS) e que apresentem menos reações
adversas representa uma estratégia inovadora para o tratamento de pacientes com DA
(TUMIATTI et al., 2010).
13
Figura 7. Estrutura dos principais fármacos utilizados no tratamento da doença de Alzheimer.
1.1.7 Inibidores de sítio dual de colinesterases
Com base na estrutura 3D da AChE, uma série de derivados 4-
[(dietilamino)-metil]-fenóxi-alquil-amina (Figura 8) foi planejada e avaliada,
mostrando potente atividade inibitória frente às enzimas AChE e BChE (YU et al.,
2010). Esta série foi desenvolvida baseada no processo de otimização de compostos
anteriormente desenvolvidos por este grupo que indicaram a existencia de uma boa
atividade, devido a forte interação com o sítio ativo. Além disso, também descreveram
que a introdução de um segundo grupamento com o grupo amina melhorava a inibição
de AChE devido a interações electrostáticas com o PAS da enzima, o que é desejável
para uma melhor inibição (YU et al., 2010).
Figura 8. Estrutura geral dos derivados fenólicos (adaptado de Yu et al, 2010)
14
Os compostos sintetizados por Yu e colaboradores (2010) (Tabela 1), foram
testados contra as enzimas AChE de enguia elétrica (Electrophorus electricus) e BChE
de soro de cavalo (Equus caballus), empregando o ensaio de Ellman (ELLMAN et al.,
1961).
A série desenvolvida por Yu e colaboradores foi escolhida para o presente
estudo baseando-se nas características descritas anteriormente e por apresentarem uma
boa quantidade de compostos com boa distribuição de atividade.
1.2. Modelagem Molecular
O processo de descoberta de novos fármacos é dispendioso, tanto em relação a
tempo quanto aos recursos empregados. Em geral, para que um novo fármaco seja
lançado no mercado, são necessários de 12 a 24 anos de desenvolvimento, com um
gasto estimado entre 800 milhões a 1,4 bilhões de dólares (GELDENHUYS et al.,
2006). Dessa forma, é necessária autilização de técnicas que otimizem o planejamento
de novas entidades químicas que possam atuar como fármacos, com o intuito de
minimizar custo e tempo (MEEK et al., 2006).
O planejamento de novos fármacos auxiliado por computador (Computer-Aided
Drug Design, CADD) pode ser empregado para melhorar a eficiência do processo de
descoberta, podendo reduzir em até 50% o custo da pesquisa por um novo agente
terapêutico (GELDENHUYS et al., 2006).
A modelagem molecular reúne um conjunto de técnicas computacionais que
possibilita a construção e geração de modelos moleculares 3D, permitindo a análise de
variações estruturais que auxiliam na interpretação de dados entre a estrutura de uma
série de compostos com a variação da atividade biológica, sendo de grande importância
no planejamento de fármacos (MAGALHÃES, 2009). A modelagem molecular utiliza
química computacional e técnicas de visualização gráfica para a investigação de
estruturas e de propriedades moleculares, sob um dado conjunto de circunstâncias
(SANT’ANNA, 2002)
Estas técnicas computacionais podem ser aplicadas utilizando duas estratégias
conhecidas como planejamento “indireto” e "direto". O primeiro não depende estrutura
3D do receptor e é denominado, também, como "planejamento de fármacos baseado na
estrutura do ligante" (LBDD, do inglês “Ligand-Based Drug Design”) (SODERO,
15
2011). O segundo depende da estrutura 3D do complexo ligante-receptor é conhecido,
também, como "planejamento de fármacos baseado na estrutura do receptor" (SBDD,
do inglês “Structure-Based Drug Design”) (KONTOYIANNI, MCCLELLAN &
SOKOL, 2004). A escolha da melhor estratégia depende das informações disponíveis
relacionadas ao conhecimento das estruturas dos ligantes e do alvo (OOMS, 2000).
A modelagem indireta pode usar métodos estatísticos para relacionar aspectos
estruturais de moléculas pequenas (ligantes) com os valores de atividade biológica
obtidos experimentalmente, identificando características específicas que são necessárias
para interagir com o alvo (SODERO, 2011). De posse dessas informações, um modelo
poderá ser gerado para delinear o planejamento de novos candidatos a fármacos
(JORGENSEN, 2004).
Na abordagem direta, a estrutura 3D do alvo (enzima, DNA ou receptor) é
conhecida. Em geral, as estruturas 3D são obtidas por métodos experimentais, como
difração de raios-X e ressonância magnética nuclear (RMN) (ACHARYA & LLOYD,
2005), ou por métodos teóricos como modelagem comparativa, possibilitando um
melhor entendimento sobre o modo de interação do ligante (KONTOYIANNI,
MCCLELLAN & SOKOL, 2004). Estes dados permitem propor modificações no
ligante para melhorar a afinidade e especificidade com o alvo.
1.2.1. Correlação Quantitativa entre Estrutura Química e Atividade Biológica.
Na década de 1960, Hansch e Fujita propuseram que a variação da atividade
biológica de uma série de moléculas poderia ser correlacionada, quantitativamente,
com a variação de parâmetros físico-químicos obtidos para estas moléculas. Essa
relação ficou conhecida como “Equação de Hansch” (HANSCH & FUJITA, 1964).
Estes estudos estabeleceram, pela primeira vez, a metodologia conhecida como
“Relação Quantitativa entre Estrutura e Atividade” (Quantitative Structure-Activity
Relationship, QSAR).
Nessa mesma época, Free e Wilson correlacionaram variáveis com a atividade
biológica, atribuindo o valor de 1 (um) à presença de um determinado substituinte
(ou característica estrutural) e o valor de 0 (zero) a sua ausência (FREE &
WILSON, 1964).
16
Didaticamente, a metodologia de QSAR pode apresentar de 1 até 6 dimensões.
De acordo com as dimensões dos descritores moleculares, a metodologia de QSAR
pode ser classificada em: i) QSAR-1D ou QSAR clássico ou análise de Hansch
(HANSCH & FUJITA, 1964), onde a atividade biológica é correlacionada com
propriedades de descritores globais, como parâmetros físico-químico (LogP e pKa); ii)
QSAR-2D, onde a estrutura do ligante é representada por padrões estruturais
bidimensionais, surgindo os descritores topológicos, como índice de conectividade
(VEDANI & DOBLER, 2002); iii) QSAR-3D que emprega descritores que
consideram a estrutura 3D do ligante (HOPFINGER, 1980; CRAMER,
PATTERSON & BUNCE, 1988; DEBNATH, 2001); iv) QSAR-4D, em que os
ligantes são representados por um conjunto de conformações em função do tempo de
simulação por dinâmica molecular (HOPFINGER et al., 1997); v) QSAR-5D, onde há
a representação de diferentes modelos de encaixe induzido (ligante-receptor); e vi)
QSAR-6D, com a representação de diferentes cenários de solvatação (LILL, 2007).
Os métodos de QSAR consistem de duas etapas básicas: i) Cálculos de
descritores moleculares; e ii) Geração estatística do modelo de QSAR.
1.2.1.1. Correlação quantitativa entre a estrutura química e a atividade biológica
utilizando fragmentos estruturais
O método de QSAR baseado em hologramas (HQSAR, do inglês Hologram
Quantitative Structure Activity Relationship) emprega hologramas moleculares gerados
por fragmentação da estrutura 2D. Os hologramas definem a quantidade de tipos
diferentes de fragmentos que dão origem aos descritores. Os descritores 2D codificam a
estrutura química que compõem um banco de dados de forma a permitir que a
similaridade molecular possa ser investigada e correlacionada com a atividade biológica
correspondente. Assim, a conectividade 2D das estruturas químicas é codificada em um
arranjo numérico binário, onde cada número é expresso pelo uso de apenas dois dígitos,
0 e 1. A designação desse modo de representar as estruturas químicas é comumente
conhecido como “mapeamento dos fragmentos” (do inglês, fingerprint) de uma
molécula e é um dos métodos mais conhecidos de medir a similaridade química
(BROWN & MARTIN, 1996). O princípio básico desta metodologia é determinar a
presença ou não de determinadas características estruturais de acordo com a notação
descrita a seguir,
17
Nesta notação, Xij é o descritor 2D com a característica i presente ou não no
composto (FRANK, HUEBEL & STREICH, 1985). Muitos esquemas de notação
linear, como SLN (sigla do inglês, Sybyl Line Notation) (ASH et al., 1997) são usados.
No método de QSAR por análise de fragmentos (HQSAR, do inglês Hologram
Quantitative Structure-Activity Relationship), apenas as estruturas 2D e a atividade
biológica são usadas como dados de entrada (HURST & HERITAGE, 1997).
Diferente dos métodos de QSAR- 3D, o HQSAR, como qualquer outro método de
QSAR-2D, não necessita da geração de conformações bioativas nem de alinhamento
molecular. Porém, informações 3D, como hibridização e quiralidade, estão incorporadas
de modo codificado nos hologramas.
Os fragmentos gerados da quebra de estruturas químicas de um banco de dados
são correlacionados aos dados de atividade biológica, utilizando o método estatístico
dos mínimos quadrados parciais (PLS, do inglês Partial Least Squares) associado à
validação cruzada (YE & DAWSON, 2009). Os fragmentos são então, mapeados e
codificados por um número inteiro único, numa faixa de 0 a 231, usando um algoritmo
específico (CRC, do inglês cyclic redundancy check). Cada número é usado para marcar
um fragmento específico que é alocado em uma região específica e numerada de forma
ordenada e de tamanho pré-determinado (holograma molecular) (Figura 8) (YAN et al.,
2009).
xij=
1, característica i está
presente no composto j
0, característica i não está
presente no composto j
18
Figura 9. Geração de um holograma molecular (TONG et al., 1998).
O modelo obtido por HQSAR depende do tamanho do holograma e da
informação contida nos fragmentos gerados. A natureza particular dos fragmentos
estruturais gerados por HQSAR e, conseqüentemente, a informação contida no
holograma molecular podem ser alteradas por dois tipos de parâmetros: Tamanho do
fragmento e distinção do fragmento. O tamanho do fragmento é fixado por valores
mínimo e máximo de átomos que um fragmento específico pode conter. A distinçãodo
fragmento descreve as informações contidas nos fragmentos a partir da molécula
original em termos de átomos, ligações, conectividade, átomos de hidrogênio e
quiralidade.
Uma análise completa de HQSAR envolve a investigação de fragmentos
moleculares diretamente relacionados com a variação da atividade biológica de modo a
que se possa propor modificações estruturais. Assim, os modelos de HQSAR podem ser
representados graficamente como diagramas de códigos de cores. Onde cada cor de
cada átomo reflete a sua contribuição para a variação de potência. As extremidades
vermelha e verde do espectro refletem as contribuições negativas e positivas,
respectivamente, enquanto que átomos com contribuições intermediários são de cor
branca (Figura 10).
O geração de
fragmentos O
Estrutura
Molecular
Fragmentos
algorítmo
12 5 9
1
2 3 4 65 7 8 9 10
3 6 2 0 5 813 0 7
número de identificação
 dos fragmentos
Holograma
Molecular
 número de identificação
 do compartimento do
 holograma
1
19
Figura 10. Exemplo de representação das contribuições atômicas individuais
1.3. Modelagem comparativa
As estruturas 3D de novos alvos moleculares, principalmente proteínas, enzimas
e receptores são de grande importância para a compreensão dos fenômenos biológicos a
nível molecular. Neste contexto, esforços têm sido feitos no sentido de elucidar o maior
número possível de estruturas 3D (SANTOS FILHO & ALENCASTRO, 2003).
O número de estruturas resolvidas experimentalmente aumenta lentamente
quando comparado ao número de novas seqüências primárias depositadas em bancos de
dados, apesar das técnicas de determinação experimental de estrutura 3D de proteínas
estar avançando rapidamente (CAVASOTTO & PHATAK, 2009). A ausência de
estruturas experimentais faz com que a modelagem molecular de proteínas seja a
ferramenta mais bem sucedida para a predição da estrutura 3D (SILVA & SILVA,
2007).
A modelagem comparativa, ou por homologia, é uma metodologia utilizada para
criar modelos de estrutura 3D de uma proteína, baseando-se no conceito de evolução
molecular, onde parte-se do princípio que proteínas com seqüências primárias
semelhantes apresentam estruturas tridimensionais similares (SANTOS FILHO &
ALENCASTRO, 2003; SODERO, 2011). Esta técnica baseia-se nos padrões estruturais
conservados que são observados em proteínas com estruturas primárias similares,
geralmente membros da mesma família (CAVASOTTO & PHATAK, 2009).
Em resumo, os padrões gerais que têm sido observados, em nível molecular, no
processo de evolução biológica são: (i) homologia entre seqüências de aminoácidos
implica em semelhança estrutural e funcional; (ii) proteínas homólogas apresentam
regiões internas conservadas; (iii) as principais diferenças estruturais entre proteínas
homólogas ocorrem nas regiões externas, constituídas principalmente por alças
20
(“loops”), que ligam os elementos de estruturas secundária (SANTOS FILHO &
ALENCASTRO, 2003).
Nesse momento, se faz necessário definir alguns termos, como homologia,
similaridade e identidade. Homologia é o termo usado quando duas ou mais seqüencias
primárias de proteínas derivam da mesma seqüência ancestral. O termo similaridade
refere-se à presença aminoácidos semelhantes na mesma posição em seqüencias
alinhadas. Identidade refere-se à presença do mesmo aminoácido na mesma posição em
duas seqüência alinhadas (GIBAS & JAMBECK, 2001).
O processo de modelagem comparativa consiste, basicamente, em quatro etapas
(Figura 11) (CAVASOTTO & PHATAK, 2009; RAYAN, 2009): (1) Identificação e
seleção de proteínas-molde; (2) Alinhamento das seqüências primárias das proteínas; (3)
Construção do modelo; e (4) Validação do modelo.
21
Figura 11. Etapas da construção de um modelo 3D por modelagem comparativa(Adaptado de MARTI-
RENOM et al, 2000).
(1) Identificação e seleção de proteínas-molde
Esta etapa envolve a identificação de uma (ou mais) proteína de estrutura 3D
conhecida, que servirá de molde (template) para a determinação da estrutura 3D da
proteína-problema. Em geral, modelos confiáveis podem ser obtidos a partir de
proteínas de referência que apresente 30% (ou mais) de identidade (RAYAN, 2009).
(2) Alinhamento das seqüências primárias das proteínas:
A etapa de alinhamento é crucial, pois erros na identificação de domínios geram
modelos de baixa qualidade. O objetivo do alinhamento é alinhar resíduos
estruturalmente equivalentes levando em conta características estruturais comuns, como
elementos de estrutura secundária e resíduos catalíticos (SANTOS FILHO &
21
Figura 11. Etapas da construção de um modelo 3D por modelagem comparativa(Adaptado de MARTI-
RENOM et al, 2000).
(1) Identificação e seleção de proteínas-molde
Esta etapa envolve a identificação de uma (ou mais) proteína de estrutura 3D
conhecida, que servirá de molde (template) para a determinação da estrutura 3D da
proteína-problema. Em geral, modelos confiáveis podem ser obtidos a partir de
proteínas de referência que apresente 30% (ou mais) de identidade (RAYAN, 2009).
(2) Alinhamento das seqüências primárias das proteínas:
A etapa de alinhamento é crucial, pois erros na identificação de domínios geram
modelos de baixa qualidade. O objetivo do alinhamento é alinhar resíduos
estruturalmente equivalentes levando em conta características estruturais comuns, como
elementos de estrutura secundária e resíduos catalíticos (SANTOS FILHO &
21
Figura 11. Etapas da construção de um modelo 3D por modelagem comparativa(Adaptado de MARTI-
RENOM et al, 2000).
(1) Identificação e seleção de proteínas-molde
Esta etapa envolve a identificação de uma (ou mais) proteína de estrutura 3D
conhecida, que servirá de molde (template) para a determinação da estrutura 3D da
proteína-problema. Em geral, modelos confiáveis podem ser obtidos a partir de
proteínas de referência que apresente 30% (ou mais) de identidade (RAYAN, 2009).
(2) Alinhamento das seqüências primárias das proteínas:
A etapa de alinhamento é crucial, pois erros na identificação de domínios geram
modelos de baixa qualidade. O objetivo do alinhamento é alinhar resíduos
estruturalmente equivalentes levando em conta características estruturais comuns, como
elementos de estrutura secundária e resíduos catalíticos (SANTOS FILHO &
22
ALENCASTRO, 2003). Abordagens computacionais para o alinhamento de seqüência
dividem-se, em geral, em duas categorias: locais e globais.
O alinhamento local é usado para comparar apenas algumas regiões de duas
seqüências primárias (geralmente as regiões mais conservadas) de proteínas similares.
O algoritmo mais empregado na busca por seqüências similares em banco de dados é o
BLAST (do inglês, Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL et al., 1990).
O alinhamento global é usado para comparar toda a extensão de duas seqüências
primárias de proteínas resultando em apenas a um alinnhamento (GIBAS &
JAMBECK, 2001).
A qualidade de um alinhamento é determinada pela soma dos pontos obtidos
pela unidade pareada (match) menos as penalidades pela introdução de espaçamentos
(gaps) e posições não pareadas (mismatch). Existem vários programas que realizam
esta tarefa de alinhamento de seqüências (SOUZA, 2011), além, da inspeção visual.
(3) Construção do modelo
A construção da parte interna da proteína-alvo (regiões conservadas),
fundamenta-se na idéia de que a conformação da cadeia principal da estrutura-molde
pode ser transferida. Posteriormente, as conformações das alças são avaliadas, seguida
da adição das cadeias laterais (RAYAN, 2009). Existem muitos métodos de
modelagem das regiões conservadas. Os mais importantes são: a) modelagem por
restrição espacial e b) modelagem por corpos rígidos (DAGA, PATEL &
DOERKSEN, 2010).
A modelagem por restrição espacial assume que diversas características
geométricas são conservadas em proteínas homólogas, ao comparar as posições
equivalentes. O programa Modeller é o mais utilizado, atualmente, para a modelagem
estrutural de