Amiloidogênese de Pramlintide e Insulina

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
FACULDADE DE FARMÁCIA 
 
 
 
 
 
 
DAYANA CABRAL DA SILVA 
 
AMILOIDOGENESE DE PRAMLINTIDE E O DESENVOLVIMENTO DE UMA 
CO-FORMULAÇÃO COM INSULINA ULTRARRÁPIDA 
 
 
 
 
Orientador: Prof.Luis Mauricio T. R. Lima 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro, 
2018 
 
 
 
Dayana Cabral da Silva 
 
 
 
AMILOIDOGENESE DE PRAMLINTIDE E O DESENVOLVIMENTO DE UMA 
CO-FORMULAÇÃO COM INSULINA ULTRARRÁPIDA 
 
Dissertação apresentada ao 
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas 
da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, 
como parte dos requisitos necessários à obtenção 
do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. 
 
 
 
Orientador: Prof. Luis Maurício T. R. Lima 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro, 
2018. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CIP - Catalogação na Publicação 
 
 
CS587a 
a 
Cabral da Silva, Dayana 
AMILOIDOGENESE DE PRAMLINTIDE E O 
DESENVOLVIMENTO DE UMA CO-FORMULAÇÃO COM INSULINA 
ULTRARRÁPIDA / Dayana Cabral da Silva. -- Rio de 
Janeiro, 2018. 
45 f. 
 
Orientador: Luis Maurício Trambaiolli da Rocha e 
Lima. 
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do 
Rio de Janeiro, Faculdade de Farmácia, Programa de 
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2018. 
 
1. amilina. 2. iapp. 3. pramlintide. 4. 
insulina. 5. diabetes. I. Trambaiolli da Rocha e 
Lima, Luis Maurício , orient. II. Título
Agradecimentos 
Gostaria de agradecer a todos que direta ou indiretamente ajudaram na elaboração 
do presente trabalho: 
Ao professor Luis Mauricio pela oportunidade de realizar este trabalho, por estar 
sempre disponível para discussões, dar sugestões e orientações que foram de 
extrema importância para o desenvolvimento desse projeto. 
Aos meus pais pela dedicação com a minha formação, amor, carinho e estímulo ao 
pensamento crítico. 
À minha irmã, Ana Carolina Cabral, por sempre acreditar no meu potencial e por toda 
a torcida nessa jornada. 
Aos colegas do Laboratório de Biotecnologia Farmacêutica por todo apoio, ajuda e 
incentivo. 
À mestre e amiga Tháyna Sisnande, por sempre me incentivar a continuar e por todas 
as ajudas nas horas de desespero. 
Ao meu namorado e amigo Felipe, por segurar as barras, por toda a paciência, 
companheirismo e amor. 
Às filhas da Beyoncé, pela amizade ao longo de todos esses anos de faculdade, por 
todas as terapias em grupo e por não me deixarem desistir mesmo nos momentos 
mais difíceis, 
Agradeço à Universidade Federal do Rio de Janeiro e ao Curso de Graduação em 
Farmácia por possibilitarem essa graduação. 
Aos órgãos de fomento científico por possibilitarem o desenvolvimento de trabalhos 
como esse em nosso país. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Em algum lugar, algo incrível está esperando para ser descoberto”. 
Carl Sagan 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
 
SILVA, Dayana Cabral da. AMILOIDOGENESE DE PRAMLINTIDE E O 
DESENVOLVIMENTO DE UMA COFORMULAÇÃO COM INSULINA 
ULTRARRÁPIDA. Dissertação – Programa de Pós-Graduação em Ciências 
Farmacêuticas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 
Rio de Janeiro, 2018. 
 
A amilina é um polipeptídeo co-produzido e co-secretado com insulina pelas células 
β-pancreáticas, possuindo várias ações fisiológicas, como modulação do glucagon, 
diminuição do esvaziamento gástrico, aumento da saciedade, entre outros. A amilina 
forma agregados amilóides bem organizados e insolúveis em meio aquoso que se 
encontram nas ilhotas de Langerhans da maioria dos diabéticos do tipo 2. Sua 
agregação ocorre gradualmente com a formação de oligômeros solúveis, fibrilas e 
posteriormente em agregados maiores e mais organizados. Para resolver os 
problemas de solubilidade da amilina humana, o pramlintide, um análogo de prolina 
tripla sintética foi desenvolvido e tem sido utilizado na substituição dos níveis 
hormonais de amilina, especialmente em pacientes diabéticos insulinizados. Estudos 
mostraram a propensão para a agregação de amilina murina rica em prolina, levando 
à hipótese de que outros análogos de amilina ricos em prolina também seriam capazes 
de se organizar em oligômeros e fibras amiloides. A fim de elucidar o processo de 
agregação e a caracterização dos agregados amiloides de pramlintide in vitro, 
realizaram-se experimentos de espectrometria de massas por mobilidade iônica e 
eletrospray, que demonstrou um potencial para a organização do pramlintide em 
espécies oligoméricas. Cinética de agregação devido à responsividade de Tioflavina 
T, sendo dependente do pH, concentração de peptídeo e agente tampão. A análise 
de microscopia eletrônica de transmissão, microscopia de força atômica e difração de 
raios-X confirmou a presença de material amiloide nas amostras. Na espectroscopia 
de infravermelho mostrou um máximo de cerca de 1625 cm-1 na banda de amida I, 
sendo característico da folha-β. Estes dados fornecem evidência de que, apesar do 
efeito de estabilização da prolina e de uma solubilidade em água melhor comparada 
com a amilina humana, o pramlintide pode resultar em material amilóide in vitro em 
determinadas condições. O uso do pramlintide é indicado como adjuvante no 
tratamento de pacientes diabéticos insulinizados, entretanto a aplicação em uma 
mesma seringa é contraindicada. Visando o desenvolvimento de uma co-formulação, 
foram feitos testes de interação oligomérica por espectrometria de massas por 
mobilidade iônica e eletrospray estabilidade por responsividade a Tioflavina T da 
combinação de pramlintide e análogos de insulina em tampões e pHs diferentes. Após 
a identificação da melhor condição a combinação de pramlintide e do análogo de 
insulina ultra-rápido LisPro foi formulado e testado a estabilidade a curto prazo. Esse 
trabalho demonstra a possibilidade da co-formulação que resultaria em avanços 
terapêuticos no tratamento de diabetes. 
 
Palavras-chave: amilina, iapp, pramlintide, amiloide, diabetes, insulina 
 
 
 
ABSTRACT 
 
 
SILVA, Dayana Cabral da. Amyloidogenesis of pramlintide and the development of a 
co-formulation with ultrafast insulin. Master Dissertation – Graduate Program in 
Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Federal University of Rio de Janeiro, 
2018. 
 
Amylin is a polypeptide co-producted and co-secreted with insulin by β-pancreatic 
cells, having several physiological actions, such as modulation of glucagon, decreased 
gastric emptying, increased satiety, among others. The amylin forms amyloid 
aggregates well organized and insoluble in aqueous medium found in the islets of 
Langerhans of most type 2 diabetics. Its aggregation occurs gradually with the 
formation of soluble oligomers, fibrils and later in larger and more organized 
aggregates. To solve the solubility problems of human amylin, pramlintide, a synthetic 
triple proline analogue has been developed and has been used in the replacement of 
hormone levels of amylin, especially in insulinized diabetic patients. Studies have 
shown the propensity for aggregation of proline-rich murine amylin, leading to the 
hypothesis that other proline-rich amylin analogs would also be able to organize into 
oligomers and amyloid fibers. In order to elucidate the aggregation process and the 
characterization of the amyloid aggregates of pramlintide in vitro, mass spectrometry 
experiments were performed by ion mobility and electrospray, which demonstrated a 
potential for the organization of pramlintide in oligomeric species. Kinetics of 
aggregation due to the responsiveness of Thioflavin T, being dependent on the pH, 
concentration of peptide and buffering agent. The analysis of transmission electron 
microscopy, atomic force microscopy and X-ray diffraction confirmed the presence of 
amyloid material in the samples. In infrared spectroscopy showed a maximum of about 
1625 cm -1 in the amide I band, being characteristicof the β-sheet. These data provide 
evidence that, despite the proline stabilizing effect and water solubility better compared 
to human amylin, pramlintide may result in amyloid material in vitro under certain 
conditions. The use of pramlintide is indicated as adjuvant in the treatment of 
insulinized diabetic patients, however the application in the same syringe is 
contraindicated. Aiming the development of a co-formulation, oligomeric interaction 
tests were performed by mass spectrometry by ion mobility and electrospray stability 
by Thioflavin T responsiveness of the combination of pramlintide and insulin analogues 
in different buffers and pHs. After identification of the best condition the combination 
of pramlintide and the ultra-fast insulin analog LisPro was formulated and tested for 
short-term stability. This work demonstrates the possibility of co-formulation that would 
result in therapeutic advances in the treatment of diabetes. 
 
Keywords: amylin, iapp, pramlintide, amyloid, diabetes, insulin 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO ................................................................................... 8 
 
2. OBJETIVOS .......................................................................................24 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................ 25 
 
4. RESULTADOS .................................................................................. 29 
 
5. DISCUSSÃO.......................................................................................30 
 
6. CONCLUSÕES ..................................................................................38 
 
7. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................39 
 
8 
 
1. INTRODUÇÃO 
1.1. Diabetes Mellitus 
Cerca de 425 milhões de pessoas são diagnosticadas com diabetes mundialmente 
e estimativas preveem que esse número pode chegar a 629 milhões de pessoas em 
2045. O Brasil é o 4º país com o maior número de adultos diagnosticados, cerca de 
13 milhões de pessoas, o que representa um gasto de US$24 bilhões na saúde pública 
(IDF, 2017). 
Diabetes mellitus (DM) é um grupo de doenças de caráter metabólico 
caracterizado pelo aumento dos níveis de glicose sanguínea com distúrbios no 
metabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas, consequentes a uma produção 
e/ou ação deficiente da insulina. São doenças que requerem um tratamento contínuo 
com estratégias multifatoriais de redução de risco além do controle glicêmico (ADA, 
2018; IDF, 2017; WHO, 2006). 
Alguns dos sintomas característicos do DM são sede intensa, visão obscura, 
poliúria, glicosúria, fadiga muscular sem causa aparente, perda de peso e dificuldade 
de cicatrização periférica. Pessoas com diabetes possuem um risco maior de 
desenvolverem certos problemas de saúde do que pessoas sem diabetes, como por 
exemplo, cegueira noturna, nefropatia, neuropatias, amputação, disfunções no 
sistema nervoso autônomo e risco aumentado para doenças cardiovasculares, 
vasculares periféricas e cérebro-vasculares. As pessoas com diabetes também estão 
em maior risco de desenvolvimento de infecções (IDF, 2017). 
Os casos de diabetes podem ser divididos em quatro grupos, de acordo com a 
“American Diabetes Association, Classification and Diagnosis of Diabetes. 2018” 
(ADA, 2018): 
1. Diabetes mellitus tipo 1 (DMT1): destruição auto-imune das células beta pacreáticas 
levando a deficiência absoluta de insulina. 
2. Diabetes mellitus tipo 2 (DMT2): perda progressiva da secreção de insulina pelas 
células beta-pancreáticas frequentemente relacionada a uma resistência insulínica. 
3. Diabetes Gestacional: diabetes diagnosticado durante o segundo ou terceiro 
trimestre de gestação, sem sinais de diabetes antes da gestação. 
9 
 
4. Outros tipos específicos de diabetes: incluindo diabetes secundário ou associado a 
outras patologias, como defeitos genéticos na função da célula beta; defeitos 
genéticos na ação da insulina; doenças relacionadas ao pâncreas exócrino; 
endocrinopatias; diabetes induzida por drogas ou agentes químicos; infecções; formas 
incomuns do diabetes imune-mediada; outras síndromes genéticas com associação 
ao diabetes. 
Como demonstrado no quadro 1, o diagnóstico preconizado para diabetes é 
baseado nos níveis de glicose plasmática, seja em jejum ou glicose de 2h após teste 
de tolerância à glicose oral, ou também critérios de hemoglobina glicada (HbA1C) 
(ADA, 2018). 
Quadro 1 – Critérios para Diagnóstico de Diabetes. 
Glicose de jejum ≥126mg/dL (7,0mmol/L) ou 
Glicose de 2h ≥200mg/dL (11,1mmol/L) durante TTG ou 
HbA1C ≥6,5% (48mmol/mol) ou 
Glicose plasmática aleatória ≥200mg/dL (11,1mmol/L) em paciente com sintomas clássicos de 
hiperglicemia ou crises hiperglicêmicas 
Adaptado de ADA 2018. 
O pré-diabetes é um estágio onde os indivíduos possuem a glicose alta para 
serem considerados não diabéticos e baixa para serem considerados diabéticos. Os 
critérios para classificação de pré-diabetes são também baseados nos níveis de 
glicose plasmática, de jejum ou teste de tolerância à glicose oral e hemoglobina 
glicada como visto no quadro 2. (ADA, 2018; IDF, 2017; DIRETRIZES SBD, 2016.) 
 
 
 
 
10 
 
Quadro 2 – Critérios para classificação de pré-diabetes. 
100mg/dL (5,6mmol/L) < Glicose de jejum < 125mg/dL (6,9mmol/L) ou 
140 mg/dL (7.8 mmol/L) < Glicose de 2h durante TTG < 199 mg/dL (11.0 mmol/L) ou 
5,7% (39mmol/mol) < HbA1C < 6,4% (47 mmol/mol) 
Adaptado de ADA 2018. 
 Os métodos diagnósticos atuais preconizados por todas associações e guias 
são baseados em parâmetros glicocêntricos, entretanto, discussão tem sido levantas 
para que outras abordagens sejam sugeridas, como por exemplo a utilização das 
medidas de insulina plasmática. Nesse contexto, o conceito de diabetes subclínica é 
introduzido onde apesar dos níveis glicêmicos considerados dentro dos normais, o 
paciente já possui um aumento da insulina e uma consequente resistência insulínica 
sendo desenvolvida (LIMA, 2017). 
 
1.1.1. DMT1 
Essa forma de diabetes era denominada de diabetes insulino-dependente ou 
diabetes juvenil por se manifestar mais comumente na infância e adolescência, 
entretanto pode ocorrer em qualquer idade. Ela acomete cerca de 5-10% dos 
pacientes diagnosticados e resulta da destruição das células beta pancreáticas por 
um mecanismo autoimune. Os pacientes tornam-se dependentes de insulina exógena 
para sobreviver, gerando o risco de desenvolvimento de cetoacidose devido à 
deficiência de insulina. A destruição autoimune das células beta pancreáticas possui 
diversas predisposições genéticas e também pode estar relacionada a fatores 
ambientais que ainda não são bem descritos (ADA, 2018; IDF, 2017). 
Para diagnóstico de DMT1 é necessário a presença de um ou mais marcadores 
autoimunes, que incluem auto-anticorpos de células de ilhotas e auto-anticorpos à 
insulina, GAD (GAD65), tirosina fosfatases IA-2 e IA-2b e ZnT8 (ADA, 2014). 
11 
 
1.1.2. DMT2 
Essa forma de diabetes era denominada de diabetes não insulino-dependente 
ou diabetes da maturidade por ser mais prevalente em indivíduos idosos, tem como 
característica resistência periférica à insulina e relativa deficiência de insulina (ADA, 
2018). O estado de intolerância à glicose, correspondente à resistência à insulina leva 
a um aumento da secreção da mesma, seguido pela falência das células beta-
pancreáticas. Desse modo podem ser observados níveis elevados de insulina 
juntamente com hiperglicemia. A princípio esses pacientes não necessitam de insulina 
exógena para sua sobrevivência, mas o uso pode ser feito para a correção da 
hiperglicemia de acordo com a evolução do quadro. Esse tipo de diabetes possui 
diversas causas prováveis, embora ainda não se tenha uma etiologia específica 
determinada, a destruição autoimune de células beta não está presente e os pacientes 
não apresentam asoutras causas de diabetes que os enquadrem nos demais grupos. 
A maioria dos pacientes com diabetes tipo 2 são obesos e já foi relatado que a 
obesidade em si provoca algum grau de resistência à insulina ADA, 2014). 
Tanto níveis de glicose plasmática, em jejum ou glicose de 2h após teste de 
tolerância à glicose oral, quanto níveis de HbA1C são adequados para diagnóstico de 
DMT2 (ADA, 2018). 
1.1.3. Tratamento 
Hábitos de vida saudáveis são a base do tratamento do diabetes, sobre a qual 
pode ser acrescido o tratamento farmacológico. Seus elementos fundamentais são 
manter uma alimentação adequada e atividade física regular, evitar o fumo, o excesso 
de álcool e estabelecer metas de controle de peso (GUSSO; LOPES, 2012; ADA, 
2018). 
Para o tratamento de DMT1 as recomendações da American Diabetes 
Association são (CHIANG et al., 2014): 
1. Injeções de insulina de dose múltipla (três a quatro injeções por dia de insulina basal 
e prandial) ou terapia de infusão contínua de insulina subcutânea. 
2. Educação sobre a combinação da dose de insulina prandial com a ingestão de 
carboidratos, glicemia de sangue pré-precoce e atividade antecipada. 
12 
 
3. Para os pacientes com hipoglicemia noturna frequente, hipoglicemia grave 
recorrente, e/ou hipoglicemia com causa desconhecida, deve-se considerar o uso de 
uma bomba infusora com monitor contínuo de glicose. 
Existem hoje vários tipos de insulina disponíveis para o tratamento de diabetes 
e elas se diferenciam pelo tempo em que ficam ativas no corpo, pelo tempo que levam 
para começarem a agir e de acordo com a situação do dia em que elas são mais 
eficientes. O tratamento com insulina deve ser ajustado tanto ao estilo de vida quanto 
às necessidades de controle de glicose (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 
2017). 
 
Figura 1. Perfis de ação dos diferentes tipos de insulina. Retirado de (Sociedade Brasileira de 
Diabetes. Conduta Terapêutica no Diabetes Tipo 2: Algoritmo SBD 2017. Posicionamento Oficial SBD 
nº 02/2017, São Paulo.) - http://www.diabetes.org.br/profissionais/images/2017/POSICIONAMENTO-
OFICIAL-SBD-02-2017-ALGORITMO-SBD-2017.pdf – adaptado a partir de: McMahon GT, et al. 
Intention to Treat — Initiating Insulin and the 4-T Study. N Engl J Med.2007;357(17):1759-6 
Na figura 1 pode-se observar a diferença nos perfis de ação dos diferentes tipos 
de insulina correlacionando o efeito glicêmico relativo as horas, justificando a 
classificação em tempo de ação (SDD, 2017). 
No mercado brasileiro existem disponíveis diversas modalidades de insulina, 
análogos de insulina e pré-misturas, como pode ser observado abaixo no quadro 3. 
 
 
 
http://www.diabetes.org.br/profissionais/images/2017/POSICIONAMENTO-OFICIAL-SBD-02-2017-ALGORITMO-SBD-2017.pdf
http://www.diabetes.org.br/profissionais/images/2017/POSICIONAMENTO-OFICIAL-SBD-02-2017-ALGORITMO-SBD-2017.pdf
13 
 
Quadro 3. Perfil Farmacocinético de Insulinas e Análogos disponíveis no 
mercado Brasileiro. 
Insulina 
Início de 
Ação 
Pico de 
Ação 
Duração do 
Efeito 
Longa Duração 
Glargina – 100UI/mL (Lantus®) 2-4h N/A 20-24h 
Detemir – 100UI/mL (Levemir®) 1-3h 6-8h 18-22h 
Ação Ultra-Longa 
Glargina – 300UI/mL (Toujeo®) 6h N/A 36h 
Degluteca – 100UI/mL (Tresiba®) 21-41min N/A 42h 
Ação Intermediária 
Insulina NPH – 100UI/mL 2-4h 4-10h 10-18h 
Ação Rápida 
Insulina Regular – 100UI/mL (Humulin®; 
Novolin®R) 
0,5-1h 2-3h 5-8h 
Ação Ultra-Rápida 
Asparte – 100UI/mL ( Novorapid®) 5-15min 0,5-2h 3-5h 
LisPro -100UI/mL (Humalog®) 5-15min 0,5-2h 3-5h 
Glusilina - 100UI/mL (Apidra®) 5-15min 0,5-2h 3-5h 
Pré-Misturas 
70%NPH + 30%R (Humulin®70/’30) 0,5-1h 
3-12h 
(duplo) 
10-16h 
75%NPL + 25%LisPro (Humalog®Mix25) 5-15min 1-4h (duplo) 10-16h 
50%NPL + 50%LisPro (Humalog®Mix50) 5-15min 1-4h (duplo) 10-16h 
70%NPA + 30%Asparte (NovoMix®70/30) 5-15min 1-4h (duplo) 10-16h 
NPH=protamina neutra hagedorn; NPL=protamine neutra LisPro; NPA=protamina neutra asparte 
Adaptado de Hahr AJ and Molitch ME. Optimizing Insulin Therapy in Patients with Type 1 and Type 2 
Diabetes Mellitus: Optimal Dosing and Timing in the Outpatient Setting. Disease-a-Month. 2010;56:148-
162; Sociedade Brasileira de Diabetes. Conduta Terapêutica no Diabetes Tipo 2: Algoritmo SBD 2015. 
Posicionamento Oficial SBD nº 02/2015, São Paulo. 
 
Para o tratamento de DMT2 é recomendado (AMERICAN DIABETES 
ASSOCIATION, 2018): 
• A metformina, se não contra-indicada e se tolerada, é o agente farmacológico 
inicial de preferência para o tratamento do diabetes tipo 2. 
• O uso prolongado de metformina pode estar associado à deficiência de 
vitamina B12, é aconselhado a medição periódica dos níveis da mesma, 
especialmente em pacientes com anemia ou neuropatia periférica. 
14 
 
• Considerar iniciar terapia com insulina (com ou sem agentes adicionais) em 
pacientes com diabetes tipo 2 recém-diagnosticado, sintomáticos e/ou 
possuem HbA1C≥10% (86mmol/mol) e/ou níveis de glicose plasmática ≥ 
300mg/dL (16,7mmol/L). 
• Considerar iniciar a terapia dupla em pacientes com diabetes tipo 2 recém-
diagnosticado e que possuam HbA1C≥9% (75mmol/mol). 
• Em pacientes sem doença cardiovascular aterosclerótica, se a monoterapia ou 
terapia dupla não atingir ou manter a meta HbA1C ao longo de 3 meses, 
adicionar outro agente hipoglicemiante. 
• É recomendada a reavaliação contínua e periódica do regime de medicação e 
o ajuste conforme necessário para incorporar os fatores do paciente e a 
complexidade do tratamento. 
A abordagem centrada no paciente deve ser utilizada para orientar a escolha 
de agentes farmacológicos (Quadro 4), as considerações devem incluir eficácia, custo, 
potenciais efeitos colaterais, peso, comorbidades, risco de hipoglicemia, e as 
preferências do paciente. Para pacientes com diabetes tipo 2 que não estão atingindo 
as metas glicêmicas, a terapia com insulina não deve ser adiada ADA, 2018). 
 
Quadro 4 - Classes de fármacos utilizados no tratamento de DMT2. 
Classe Representante(s) da Classe Mecanismo de Ação Efeitos Principais 
Biguanidas Metformina Ativa AMPK 
↓ produção de 
glicose hepática 
 
 
Sulfoniluréias 
Glibenclamida; 
Gliclazida; 
Glimeperida; 
 
Ligação ao canal de K+ 
dependente de ATP 
↑ secreção de 
insulina 
Tiazolidinodionas 
Rosiglitazona; 
Pioglitazona 
Ativação PPAR-γ 
↑ sensibilidade à 
insulina 
Inibidores da α-
glicosidase 
Acarbose 
Miglitol 
Inibição da α-glicosidase 
intestinal 
↓ a absorção de 
carboidratos 
Inibidores da DPP-4 
Sitagliptina; Saxagliptina; 
Linagliptina; Alogliptina 
Inibição da atividade da DPP-
4, ↑ as concentrações de 
incretinas pós-prandiais 
↑ secreção de 
insulina glicose 
dependente 
↓ secreção de 
glucagon glicose 
dependente 
Agonistas de 
Dopamina-2 
Bromocriptina 
Ativação de receptores 
dopaminérgicos 
↑ sensibilidade à 
insulina 
Inibidores de SGLT2 
Canagliflozina; Dapaglifozina; 
Empaglifozina 
Inibição do SGLT2 no túbulo 
proximal 
Bloqueia a 
reabsorção renal de 
glicose 
15 
 
Agonistas do 
Receptor de GLP-1 
Exenatide; Exenatide LAR; 
Liraglutida; Albiglutida; 
Lixisenatide; Dulaglutida 
Ativação do receptor de GLP-
1 
↑ secreção de 
insulina glicose 
dependente 
 
Amilinomiméticos Pramlintide 
Ativação dos receptores de 
amilina 
↓ secreção de 
glucagon 
↓ esvaziamento 
gástrico 
↑ saciedade 
Adaptado de Pharmacologic Approaches to Glycemic Treatment: Standards of Medical Care in 
Diabetes 2018. Diabetes Care 2018;41(Suppl. 1):S73–S85. 
O conceito atual do diabetes como uma desordem multi-hormonal surgiu pela 
complexidade do mecanismo de regulação dos níveis de glicose. Estudos tem 
demonstrado o envolvimento de diversos hormônios (insulina, glucagon, GLP1, 
amilina) e um complexo mecanismo de regulação, o que deixa claro que, mesmo uma 
intensiva terapia com insulina será insuficiente no controle da glicemia. (DEFRONZO 
et al., 2015; EDELMAN, 2008; SCHMIDT, 2018). 
1.2. Amilina 
Dentre esses diversos hormônios, a amilinarecebe um destaque especial visto sua 
co-secreção com insulina pelas mesmas células beta pancreáticas e portanto 
indivíduos deficientes em insulina são também deficientes de amilina (Young, 2005). 
Amilina ou IAPP – polipeptídeo amilóide das ilhotas pancreáticas - é um polipeptídeo 
de trinta e sete resíduos de aminoácidos, com uma ponte dissulfeto C2-7 e amida C-
terminal descoberto em 1987 simultaneamente por dois grupos (COOPER et al., 1987; 
WESTERMARK. et al., 1987a). 
 
Figura 1: Representação esquemática da amilina humana. Adaptado de GRUNBERGER, 2013. 
16 
 
Mesmo não sendo um hormônio com uma descoberta tão recente, ainda há muito 
por se conhecer em sua fisiologia, farmacologia, mecanismos patofisiológicos de 
agregação amiloide e soluções terapêuticas voltadas à diabetes e obesidade. 
 
Figura 2 - Perfil plasmático de insulina e amilina durante 24 horas em humanos saudáveis. Adaptado 
de YOUNG, 2005. 
A amilina é classificada como um hormônio neuroendócrino e tem sua ação 
principal em conjunto da insulina na regulação do metabolismo de carboidratos 
(EDELMAN, 2008). Ela é co-produzida e co-secretada com a insulina nas células β-
pancreáticas (figura 2) e quando há efeitos moduladores na secreção de insulina 
ocorrem em conjunto uma modulação na secreção de amilina (HARTTER et al., 1991). 
Esses dois hormônios agem de maneira sinérgica no controle da concentração 
de glicose plasmática. Em pacientes obesos resistentes à insulina, os níveis de 
amilina se mostram elevados (YOUNG, 2005a). Em pacientes com DMT1 e em 
estágios avançados de DMT2 os níveis de amilina se encontram diminuídos (BUSE; 
WEYER; MAGGS, 2002) como demonstrado na figura 3. 
17 
 
 
Figura 3 - Concentração plasmática de amilina após refeição em indivíduos normais e pacientes com 
DMT1 e DMT2 insulino-dependentes. Adaptado de BUSE; WEYER; MAGGS, 2002. 
Dentre as principais ações da amilina estão inibição da ingesta de alimentos, 
diminuição do esvaziamento gástrico, das secreções de ácidos e enzimas digestivas 
e diminuição da produção de glicose pelo fígado via inibição de glucagon. Essas ações 
demonstram o papel sinérgico da amilina à insulina na manutenção dos níveis 
plasmáticos de glicose (YOUNG, 2005). 
A amilina é degradada pela enzima de degradação de insulina (IDE), a mesma 
enzima que hidrolisa insulina, glucagon, calcitonina, peptídeo natriurético atrial e o 
peptídeo A (BENNETT; DUCKWORTH; HAMEL, 2000; KUROCHKIN, 2001). Essa 
enzima é uma zinco-metaloendopeptidase localizada no citosol, peroxissomas, 
endossomas e na superfície celular (DUCKWORTH; BENNETT; HAMEL, 1998), ela 
cliva proteínas pequenas de sequência variada, muitas das quais partilham uma 
propensão para formar fibras amiloides (BENNETT; DUCKWORTH; HAMEL, 2000; 
KUROCHKIN, 2001). A IDE possui uma afinidade por insulina aproximadamente 
quatro vezes maior do que por amilina, o que pode explicar sua meia-vida maior. Por 
fim, a amilina é eliminada na urina pelos rins (BENNETT; DUCKWORTH; HAMEL, 
2000). 
Acredita-se que a agregação de amilina ocorra de forma gradual, com 
estruturas monoméricas solúveis formando oligômeros, protofibrilas e fibras amilóides, 
que podem ser tóxicos para as células β levando à sua destruição (KODALI; WETZEL, 
2007). 
18 
 
A amilina humana é pouquíssimo solúvel em meio aquoso (BRETHERTON-WATT 
et al., 1992; CHANCE et al., 1991, 1992; GHATEI et al., 1990; KONARKOWSKA et 
al., 2006) por sua vez, amilina murina é hidrossolúvel e apresenta-se bioativa 
(CHANCE et al., 1991, 1992; JAMES et al., 1999; SHERRIF et al, 1992; WANG et al., 
1991; YOUNG et al., 1991). 
1.3. Pramlintide 
Sendo então a amilina um hormônio importante no controle glicêmico, regulando 
via sistema nervoso central o glucagon e corroborando com os efeitos sistêmicos da 
insulina, a reposição da mesma seria interessante para fins terapêuticos. Contudo, o 
uso de amilina humana terapeuticamente não é ideal pela sua baixa solubilidade e 
pronta propensão a formação de agregados amiloides em diversos pHs. 
Visando contornar esse problema de solubilidade da amilina, estudos de 
comparação entre a amilina humana e a murina foram conduzidos, chegando-se a 
conclusão de que substituições por prolinas nas posições 25, 28 e 29 são 
determinantes para a estabilidade e solubilidade do peptídeo (YOUNG et al., 1996). 
Com substituições nessas posições chegou-se ao análogo sintético de amilina que 
originalmente foi chamado de AC137 (KOLTERMAN et al., 1995) e atualmente 
denominado pramlintide (YOUNG et al., 1996). 
O pramlintide é comercializado nos EUA pela Amylin Pharmaceuticals com o nome 
comercial Symlin®, http://www.symlin.com/; Patente US5367052A1 de 1987; Patente 
US 5998367, de 1991. 
Os primeiros estudos clínicos do uso de pramlintide demonstraram que em 
concomitância com insulina houve uma diminuição dos níveis de HbA1C e prevenção 
do ganho de peso quando comparados com somente a reposição de insulina 
(ARONNE et al., 2007; HAYDEN & TYAGI, 2000). O uso de pramlintide como 
adjuvante à insulina também foi capaz de exercer um controle na glicemia pós-
prandial pela diminuição da ingesta de alimentos, diminuição da taxa de esvaziamento 
gástrico e supressão da secreção de glucagon (KLEPPINGER; VIVIAN, 2003). Em 
suma, os resultados encontrados com o uso de pramlintide em tratamentos de maior 
duração foram de melhor controle glicêmico (HAYDEN; TYAGI, 2001), perda de peso 
http://www.symlin.com/
19 
 
e diminuição de apetite (ARONNE et al., 2007; HOLLANDER et al., 2004) e diminuição 
do requerimento de insulina diária (HOLLANDER et al., 2004). 
O pramlintide administrado por infusão parenteral e injeção subcutânea foi 
avaliado em ensaios clínicos e exibe um perfil farmacocinético linear. A 
biodisponibilidade de pramlintide subcutânea é de aproximadamente 30% a 40% 
(FDA, 2001; KLEPPINGER; VIVIAN, 2003). 
Em ensaios clínicos, a administração de pramlintide subcutâneo em doses que 
variam de 30 a 300µg resultando em concentrações plasmáticas dose-dependentes. 
O tempo para atingir a concentração máxima é de aproximadamente 20 minutos e 
diminui ao longo de um período de 3 horas. O pramlintide não se acumula se 
administrado repetidamente em refeições subsequentes. Doses entre 60 e 120µg 
resultam em perfis de concentração plasmáticas que são semelhantes aos que 
resultam da liberação endógena de amilina após a ingestão de uma refeição. 
Pramlintide é eliminado predominantemente pelos rins, com uma meia-vida de 40-50 
minutos e concentrações são aumentadas em pacientes com insuficiência renal (FDA, 
2005; KLEPPINGER; VIVIAN, 2003). 
Ao contrário de insulina, pramlintide não requer ajustes de dose antes das 
refeições devido a sua ampla janela terapêutica, que permite que os pacientes 
permaneçam em uma dose constante, independentemente do tamanho da refeição, 
teor de carboidratos ou concentrações de glicose no sangue. (FDA, 2005; 
KLEPPINGER; VIVIAN, 2003). 
Apesar do grande avanço surgido com o pramlintide, alguns aspectos 
importantes devem ser levantados. O pramlintide é um variante de amilina humana, 
com três aminoácidos diferentes (YOUNG et al., 1996), biofármacos com a sequência 
diferente da sequência nativa das proteínas endógenas podem levar à resposta 
imunogênica (SCHELLEKENS, 2002). Deste modo, pramlintide pode apresentar 
diferenças em respostas metabólicas e imunológicas comparado à amilina endógena 
e, portanto, diversos efeitos colaterais que são já reportados nos estudos de fase 
clínica e no próprio texto de bula. Embora nenhum dos trabalhos revisados tenha 
reportado toxicidade aos principais órgãos ou mudanças clínicas significantes 
(SINGH-FRANCO et al. 2007), efeitos adversos como náusea, vômito e anorexia têm 
20 
 
sido associados a terapia com pramlintide (HOLLANDER et al., 2004; MAGGS et al., 
2003; PULLMAN; DARSOW; FRIAS, 2006; SINGH-FRANCO et al. 2007) que podem 
estar associados as mutações pontuaisna sequência nativa de amilina. 
Variantes ricas em prolina possuem maior solubilidade em meio aquoso do que 
a amilina humana (WESTERMARK et al., 1990), entretanto, evidências foram 
encontradas de que tais análogos de amilina humana são propensos a formação de 
fibras amiloides. Estudos demonstraram que os segmentos 8-20 e 14-20 da amilina 
humana são capazes de formar fibras amiloides (GILEAD; GAZIT, 2008; JAIKARAN 
et al., 2001). O segmento equivalente de amilina murina que abrange os aminoácidos 
8-20 (diferentes de amilina humana somente pela His18) também forma fibras 
amiloides (JAIKARAN et al., 2001). Um peptídeo compreendendo a região 30-37, que 
partilham a mesma sequência em ambas amilina humana e murina, também pode ser 
estruturado de forma amiloide (NILSSON; RALEIGH, 1999). Substituições pontuais 
nos resíduos 18, 23 e 26 de amilina murina, ficando somente a variante com tripla 
prolina em 25, 28 e 29 foram capazes de formar agregados amiloides (GREEN et al., 
2003). 
 
Figura 4 – Sequências das amilinas humana, murina e do pramlintide, destacando os segmentos com 
propensão a agregação. Em vermelho segmento 8-20, em verde segmento 14-23 e em azul segmento 
30-37. 
Em 2013 um estudo do nosso grupo demonstrou a capacidade da amilina 
murina de formar agregados amiloides, o que demonstra o potencial de análogos ricos 
em prolinas ainda deterem propriedades de aglomeração amiloide (PALMIERI et al., 
2013). 
Com a grande semelhança estrutural e de solubilidade existente entre a amilina 
murina e o pramlintide, acreditamos que o pramlintide poderia também possuir a 
capacidade de formar agregados amiloides. Partindo dessa premissa, o objetivo inicial 
desse trabalho foi analisar físico-quimicamente o pramlintide, verificando as condições 
onde ele possivelmente formaria agregados amiloides. 
21 
 
O pramlintide é indicado como tratamento adjuvante para diabetes em conjunto 
com a insulina, entretanto é contra-indicada a junção das duas formulações numa 
mesma seringa (FDA, 2005). 
Estudo comparativo de pré-mistura em uma mesma seringa (30mcg de 
SYMLIN com insulinas diferentes, regular, NPH e 70/30 de formulações pré-
misturadas de insulina humana recombinante) com administradas seringas separadas 
geraram efeitos faramacocinéticos importantes, com uma diminuição máxima de 40% 
na Cmáx de pramlintide e com um aumento máximo de 15% na Cmáx de insulina 
(FDA, 2005). 
Embora a recomendação do guia e uso do medicamento afirme a 
incompatibilidade farmacocinética, outro estudo de curto prazo sugere que a mistura 
das formulações em uma mesma seringa não afete a farmacocinética nem a 
farmacodinâmica da insulina ou do pramlintide (WEYER et al, 2005). 
A baixa adesão ao tratamento com insulina é comum em pacientes diabéticos, 
cerca de 28,7% de persistência com insulina injetável após 12 meses em pacientes 
com DMT2 (COOKE et al., 2010). Essa baixa adesão é decorrente de dificuldades 
relacionadas as injeções múltiplas e a complexidade do tratamento prescrito 
(PEYROT et al., 2010). 
A indicação do uso do pramlintide e a contra-indicação da mistura dele com a 
insulina significa um aumento na quantidade de injeções necessárias para a 
manutenção da glicemia, o que pode levar a uma diminuição da adesão desses 
pacientes. Desse modo, uma co-formulação dos dois medicamentos seria de grande 
valia para o bem estar e melhoria da adesão de pacientes diabéticos insulinizados. A 
partir desses antecedentes, o outro objetivo desse trabalho foi avaliar condições ideais 
para a co-formulação de pramlintide com insulina. 
 
 
22 
 
2. OBJETIVO 
Estudar a estabilidade físico-quimica do pramlintide. 
Desenvolver uma formulação estável dose fixa combinada de pramlintide com 
insulina 
 
 
2.1. Objetivos Específicos 
Estudar a estabilidade fisico-química de pramlintide em função de variáveis de pH, 
tempo e tampão. 
Observar a dependência do mesmo em virtude do tipo de sal contra-íon do 
pramlintide. 
Avaliar a distribuição de estados oligoméricos por técnicas de espectrometria de 
massas. 
Avaliar a distribuição conformacional no produto final por técnicas de 
espectrometria de massas. 
Avaliar morfologicamente o produto de aglomeração de pramlintide por meios de 
microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de força atômica. 
Avaliar a distribuição dos estados oligoméricos de pramlintide e insulina regular. 
aspart e LisPro por técnicas de espectrometria e massas. 
Avaliar a estabilidade da co-formulação de pramlintide e insulina em função de 
variáveis pH, tempo e tampão. 
Avaliar em função do tempo a co-formulação concentrada de pramlintide e insulina 
eleita. 
 
 
 
23 
 
3. MATERIAL E MÉTODOS 
 
Será reportado aqui brevemente a seção de material e metodos referentes aos 
dados desta dissertação. Detalhes do mesmo podem ser obtidos nos dois artigos 
científicos de minha autoria (e co-autores) que fazem parte desta dissertação com 
descrito mais adiante. 
3.1. Materiais 
A amilina humana (sal de TFA, lote # 85190) e pramlintide (sal de TFA, lote # 
89437; sal de acetato, lote # 101083) foram adquiridos da Genemed Biotech Inc. (CA, 
EUA). A identidade (por ESI-MS) e a pureza (cromatografia em fase reversa C-18) 
dos peptideos foram confirmadas por um certificado de controle de qualidade 
fornecido intra-lote e também pelas nossas próprias medições por MALDI ToF-MS e 
ESI-MS. As soluções de peptideo de estoque foram preparadas a 10 mg/mL (2,55 
mM) em DMSO e armazenadas a -20°C até o momento do uso. Todos os outros 
reagentes foram utilizados em grau analítico. 
3.2. Espectrometria de massas por mobilidade iônica e eletrospray (ESI-
IMS-MS) 
Os ensaios de ESI-IMS-MS foram realizados utilizando um espectrômetro de 
massa de onda quadrupolar de alta definição MALDI-Synapt G1 (Waters Brasil) 
(HDMS). Amostras de pramlintide foram diluídas a 50 µM de concentração final (a 
partir de solução estoque 10 mg/mL em DMSO a 100%) em tampão de acetato de 
amônio 100mM pH 5,6 e injetadas a uma taxa de 100nL/min com voltagem capilar de 
2,8 kV e N2g a 0,4 bar. A aquisição dos dados foi conduzida na faixa de m/z 500 a 
4000 durante 15 min com uma acumulação de aquisição de 3s por ponto. A calibração 
da massa do instrumento foi realizada rotineiramente com ácido fosfórico. Os dados 
foram analisados usando o DriftScope 2.1 (WILLIAMS et al., 2009) (Waters 
Corporation, Brasil). 
3.3. Cinética de agregação amilóide 
Todos os experimentos foram feitos a 25°C em placa preta opaca de 96 poços 
de fundo plano (Corning # 3915) contendo Tioflavina T (ThT) 20μM, DMSO a 2% v/v 
24 
 
(concentração final), solução tampão de fosfato de sódio 50mM tamponada ao pH 
desejado ou Tris.Cl 50mM pH 7,4 e utilizando 50μM de concentração final de peptídeo 
(amilina humana, pramlintide TFA ou pramlintide acetato) a partir de estoque a 10 
mg/mL em DMSO a 100%, num volume final de 200μL. A placa foi selada com película 
transparente (Duck Brand Crystal Clear Tape, Avon, OH) e as amostras foram 
excitadas a 440 nm e a emissão coletada a 482 nm com filtro em 475 nm durante 24h 
sob agitação com leitura de topo a cada 3 minutos (Spectramax M5 Molecular 
Devices). 
3.4. Quantificação de peptídeo solúvel 
 
A quantificação da fração solúvel de pramlintide foi realizada em condições 
semelhantes as do ensaio de agregação, solução de tampão de fosfato de sódio 
50mM pH 7,0, concentração final de pramlintide 50μM (de estoque a 10mg/mL em 
DMSO a 100%), num volume final de 200μL a 25°C. Em intervalos de tempo 
determinados, a solução de poços individuais (n = 4 / intervalo de tempo) foi 
amostrada, centrifugada durante 20 min x 4°C x 112,5g e a fração solúvel de 
pramlintide foi quantificada no sobrenadante por ensaio de fluorescamina 
adequadamente calibrado contra uma curva analítica construída com pramlintide não 
agregado ao mesmo tempo que a amostra foi quantificada. A fluorescamina é um 
cromóforoque reage covalentemente com amina primária livre, existindo apenas na 
Lys1 de pramlintide (aminas α e ε) (UDENFRIEND et al., 1972). Em resumo, 
adicionou-se 12,5μL do sobrenadante resultante a 87,5μL de tampão fosfato a pH 7,0 
seguindo-se a adição de 50μL de fluorescamina 0,5mg/mL de DMSO e a fluorescência 
foi medida após 5 a 20 minutos de incubação à temperatura ambiente em 
espectrofluorímetro SpectraMax M5 (Molecular Devices) com excitação ajustada a 
390 nm e emissão a 480nm com um filtro de corte de 475nm. A coleta em tempos 
variados de incubação com fluorescamina teve como intuito assegurar que a reação 
havia sido comletada. 
3.5. Dicroísmo Circular 
Alíquotas da solução de pramlintide em DMSO (10mg/mL) foi liofilizada e o material 
seco foi ressuspenso em tampão 5 mM (fosfato de sódio ou Tris.Cl) pH 7,4 para 10μM 
a 25°C. A solução foi imediatamente medida num espectropolarímetro Jasco J715 
(Jasco, Tóquio, Japão) numa cubeta de quartzo de 5,00mm com 7 varreduras médias 
25 
 
para cada espectro numa velocidade de varrimento de 50nm/min e resolução de 
0,2nm. Os espectros resultantes foram subtraídos da linha de base (somente tampão) 
recolhidos em condições experimentais semelhantes. Espectros adquiridos após 5 
minutos ou 30 minutos de ressuspensão não mostraram diferenças visíveis, sugerindo 
estabilidade da maioria da amostra dentro deste intervalo de tempo. 
3.6. Microscopia Eletrônica de Transmissão 
Após os ensaios de agregação, as amostras foram submetidas à microscopia 
eletrônica de transmissão por contrastação negativa com acetato de uranila. As 
amostras foram suavemente agitadas em vórtice, uma alíquota de 10L depositada 
sobre um Parafilm® e as malhas de cobre revestidas com Formvar de 300 mesh 
(CF300-Cu. Electron Microscopy Sciences) foram colocadas sobre as gotas durante 
cerca de 2 min. A solução em excesso foi removida e contrastada com 2% de acetato 
de uranila a pH 4,8, durante cerca de 2 minutos sob proteção da luz. As amostras 
foram secas ao ar e as imagens foram adquiridas num microscópio electrônico de 
transmissão Zeiss 900 operando a 80 kV, disponível na plataforma multiusuário do 
CENABIO-UFRJ. 
3.7. Microscopia de Força Atômica 
Amostras de amilina humana e pramlintide 50μM foram deixadas para agregar 
durante 4 dias em solução de tampão fosfato de sódio 50mM pH 7,4 a 25°C. As 
amostras (20μL) foram aplicadas sobre mica de moscovita recém-clivada e secas com 
auxílio de corrente de árgon. As medições foram realizadas em um microscópio de 
força atômica (JPK Nanowizard III, JPK I nstruments AG) usando cantilevers 
convencionais de silício (OLTESPA - Bruker Probes) por meio do modo de contato 
intermitente, a 24°C ± 2°C. As amostras foram varridas pelo menos em três regiões 
diferentes para confirmar a homogeneidade. Os exames foram realizados em 
resolução de 512 × 512 pixels, e os dados foram pós-processados usando o software 
NanoScope Analysis (Bruker). Os dados foram coletados pela Dr. Giselle Fontes, 
pesquisadora do INMETRO-XEREM, no equipamento desta mesma instituição. 
3.8. Difração de Raios-X 
A amostra de pramlintide foi agregada em solução de tampão fosfato de sódio 
50mM a 25°C e posteriormente centrifugada durante 15 min x 4°C x 112,5g, o 
26 
 
sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso com água, depositado sobre 
uma lâmina de vidro silanizado e deixado secar ao ar. O material resultante foi 
montado num anel Kapton® (poliimida) MiTeGen MicroGriper (Cat # M7-L18SP-200) 
e submetido a difração de raios X com um phi-scan de 360 ° para um total de 180s 
utilizando a radiação CuK em um difratômetro D8 Venture (Bruker, Alemanha) a 25°C, 
em equipamento disponível na plataforma multiusuário do Laboratório de Difração de 
raios-X (LDRX) do Instituto de Física da UFF, em Niterói-RJ. As imagens foram 
processadas com CrysALisPro (Agilent, EUA). 
3.9. Espectroscopia de infravermelho com transformada de fourier (FTIR) 
Amostras de amilina humana e pramlintide foram deixadas para agregar a 50 uM 
em solução de tampão de fosfato de sódio 50mM pH 7,0 a 25°C durante 3 dias e 
separadas do material solúvel por centrifugação (20 min, 4°C, 112,5g). O precipitado 
foi lavado uma vez com água, centrifugado e o precipitado restante foi congelado 
instantaneamente (por imersão em nitrogênio líquido) e liofilizado. O material 
resultante foi avaliado por espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier 
(FTIR) utilizando um espectrômetro FTIR Nicolet 6700 (Thermo Scientific, WI, EUA) 
acoplado com um acessório de reflectância total atenuado, um cristal de germânio 
trapezoidal e um detector MCT (HgCdTe) refrigerado com nitrogênio líquido. Os 
espectros foram adquiridos com resolução de 4cm-1 e 256 scans, sob atmosfera de 
N2g. A correção da linha de base foi realizada em todo o espectro entre 4000 e 700 
cm-1. As 2ª derivativa foram calculadas a partir dos espectros de linha de base 
corrigidos, usando a rotina derivada de Norris com segmentos de 5 e 5 intervalos entre 
segmentos. A aquisição e o processamento dos dados foram realizados com a suite 
Omnic 8 (Thermo Fisher Sci Inc., EUA). 
 
 
 
 
 
27 
 
4. RESULTADOS 
 
A presente dissertação gerou dois artigos científicos em que são abordados os 
materiais e métodos bem como os resultados do presente trabalho: 
 
Artigo 1: “Amyloidogenesis of the amylin analogue pramlintide” 
Dayana Cabral da Silva, Giselle N.Fontes, Luiza C.S.Erthal and Luís Maurício 
T.R.Lima 
Biophysical Chemistry Volume 219, December 2016, Pages 1-8 
doi: https://doi.org/10.1016/j.bpc.2016.09.007 
 
Artigo 2: “Physico-chemical properties of co-formulation of insulin with 
pramlintide” 
 
Dayana Cabral da Silva and Luís Maurício T. R. Lima 
 
bioRxiv preprint first posted online Nov. 30, 2017; 
doi: https://doi.org/10.1101/227363 
Atualmente submetido para revisão na revista Pharmaceutical Research. 
 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301462216301673?via%3Dihub#!
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301462216301673?via%3Dihub#!
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301462216301673?via%3Dihub#!
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301462216301673?via%3Dihub#!
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301462216301673?via%3Dihub#!
https://www.sciencedirect.com/science/journal/03014622
https://www.sciencedirect.com/science/journal/03014622/219/supp/C
https://doi.org/10.1016/j.bpc.2016.09.007
https://doi.org/10.1101/227363
28 
 
5. DISCUSSÃO 
 O diabetes é um grupo de doenças de caráter global que afeta cerca de 425 
milhões de pessoas (INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION, 2017). Seu caráter 
crônico e complicações que afetam vários tecidos do organismo (SCHMIDT, 2018) 
fazem com que seja uma área que demanda muita pesquisa e investimento. Por ser 
multifatorial, necessita de diversas estratégias para que a manutenção da glicemia 
consiga ser feita de maneira eficiente. As principais recomendações são mudanças 
de hábitos alimentares, atividades físicas e intervenções farmacológicas quando 
necessárias. 
Quando a amilina foi descoberta em 1987 (COOPER et al., 1987; 
WESTERMARK et al., 1987b) abriram-se novas perspectivas para a manutenção 
glicêmica principalmente em pacientes diabéticos tipo 1. Entretanto a amiloidogênese 
(COOPER et al., 1988; WESTERMARK et al., 1987b; WESTERMARK; ANDERSSON; 
WESTERMARK, 2011) e sua baixa solubilidade em meio aquoso (BRETHERTON-
WATT et al., 1992; CHANCE et al., 1991, 1992; GHATEI et al., 1990; 
KONARKOWSKA et al., 2006) impediram o sucesso da aplicação da amilina como 
fármaco para o tratamento de diabetes. 
A partir de estudos comparativos entre amilina murina e humana, a conclusão 
do caráter estabilizador e do aumento da solubilidade devido a presença de prolinas 
na variante murina impulsionou o desenvolvimento do análogo sintético pramlintide 
(YOUNG et al., 1996; KOLTERMAN etal., 1995). O pramlintide foi então formulado e 
testado pela Amylin Pharmaceuticals e é aprovado pelo FDA com o nome comercial 
Symlin®. 
A utilização do pramlintide como adjuvante em pacientes insulinizados 
proporciona diminuição dos níveis de HbA1C, prevenção do ganho de peso, 
diminuição da ingesta de alimentos, diminuição da taxa de esvaziamento gástrico, 
supressão da secreção de glucagon e diminuição do requerimento de insulina diária 
(ARONNE et al., 2007; HAYDEN & TYAGI, 2000; KLEPPINGER; VIVIAN, 2003; 
HOLLANDER et al., 2004). 
O insucesso do pramlintide de maneira geral pode ser devido aos efeitos 
adversos reportados, como náuseas, vômito e anorexia (HOLLANDER et al., 2004; 
29 
 
MAGGS et al., 2003; PULLMAN; DARSOW; FRIAS, 2006; SINGH-FRANCO et al. 
2007) e também pela necessidade de múltiplas injeções, já que a combinação com a 
insulina em uma mesma seringa é desencorajada (FDA, 2005). 
As variantes ricas em prolina, como o pramlintide e a amilina murina, de fato 
possuem maior solubilidade em meio aquoso quando comparadas a amilina humana 
(WESTERMARK et al., 1990). Entretanto, evidências foram encontradas de que 
segmentos de amilina e a amilina murina, mesmo que solúveis em meio aquoso, são 
propensos a formação de fibras amiloides (GILEAD; GAZIT, 2008; JAIKARAN et al., 
2001; NILSSON; RALEIGH, 1999; GREEN et al., 2003; PALMIERI et al., 2013). 
O pramlintide possui semelhança estrutural a amilina humana com alterações 
apenas nos resíduos de aminoácidos alanina 25, serina 28 e serina 29, onde ocorrem 
as substituições por prolina (PUBCHEM CID 16132430 / 70691388). 
A amilina murina possui semelhança estrutural com a humana havendo 
alterações na histidina 18 por arginina, na fenilalanina 23 por leucina, na alanina 25 
por prolina, na isoleucina 26 por valina, na serina 28 por prolina e na serina 29 por 
prolina (PUBCHEM CID 123773280). 
Desse modo, o pramlintide seria um intermediário entre a amilina murina e a 
amilina humana, possuindo 3 das 6 alterações entre as amilinas. Tendo em vista que 
tanto a amilina humana quanto a amilina murina possuem a capacidade de formar 
agregados amiloides, o presente trabalho começou com a investigação das possíveis 
condições amiloidogênicas do pramlintide. 
O primeiro artigo publicado a partir desse trabalho foca em demonstrar por 
diversas técnicas a capacidade do pramlintide de formar agregados amiloides. Essa 
agregação é dependente de pH e aumenta proporcionalmente ao aumento do mesmo, 
é também dependente do tampão. 
O pramlintide apresentou responsividade a Tioflavina T dependente do tampão e 
do pH. Ensaios de detecção de fluorescência de Tioflavina T são bastante utilizados 
para o rastreamento de fibras amiloides (HOBBS; MORGAN, 1963; LEVINE, 1993; 
WONG et al., 2016). A tioflavina T é uma sustância que se liga de maneira específica 
30 
 
e não interage com proteínas nas suas formas monoméricas dobradas, desdobradas 
ou parcialmente dobradas (SULATSKAYA et al., 2010). 
Estudos relataram a falta de agregação amilóide observável de pramlintide 
(WANG et al., 2015), amilina de baiacu (WONG et al., 2016) e amilina murina 
(ERTHAL et al., 2016) utilizando tampão tris.Cl. Comparando a agregação de amilina 
humana e pramlintide a pH 7,4 em Tris.Cl e fosfato de sódio, observou-se que 
enquanto a agregação amilóide de amilina humana é pouco afetada pela escolha do 
agente tampão, a agregação do pramlintide é retardada na presença de tampão 
Tris.Cl. Esta sensibilidade de agregação a componentes tampão específicos tem sido 
observada em outros peptídeos amiloidogênicos (GARVEY et al., 2011; OLSEN et al., 
2012; WONG et al., 2016) e pode ser responsável por uma subestimação sistemática 
do potencial de agregação de análogos de amilina como amilina murina e pramlintide 
(MILTON; HARRIS, 2013; WANG et al., 2015). 
A agregação amilóide é um processo em vários estágios, no qual o mal 
enovelamento é determinante para a geração de espécies propensas a agregação. 
Estes monômeros amiloidogênicos são então incorporados em uma cascata de 
interações proteína-proteína até a formação de um núcleo crítico. Depois, uma 
segunda alteração conformacional faz com que a proteína adote a característica β 
cruzada de amilóide em um processo rápido (KARAMANOS et al., 2015). Assim, a 
montagem amilóide é o resultado de rearranjos conformacionais raros combinados 
com interações proteína-proteína heterogêneas que estão anormalmente interligadas. 
Desse modo, a agregação amiloide por ser um processo cinético de vários 
estágios, pode ter um número considerável de variáveis influenciadoras tanto no 
desencadeamento do processo quanto na manutenção do mesmo. O presente 
trabalho visou demonstrar que o meio é de suma importância para o desenvolvimento 
do processo amiloidogênico e que, como visto com a diversas referências e técnicas 
utilizadas, proteínas que até então não demonstravam organização amiloide podem 
sim se organizar dessa maneira. 
A preocupação em relação a uma possível subestimação da potencialidade 
amiloidogênica de proteínas é a alta toxicidade celular dos oligômeros. Eles são 
pequenos, podem ser solúveis, interagirem com múltiplos alvos, induzirem a mudança 
conformacional de outras proteínas homólogas ou heterólogas gerando uma reação 
31 
 
em cadeia (FARMER; GERSON; KAYED, 2017; KAYED; LASAGNA-REEVES, 2012; 
VERMA; VATS; TANEJA, 2015). 
Mecanismos propostos sobre como a toxicidade oligomérica se dá incluem: 
efeitos inflamatórios na membrana celular; indução de estresse oxidativo; sequestro 
de metais de transição; interações específicas e não-específicas com membranas 
celulares e lipídicas e danos ao DNA (FARMER; GERSON; KAYED, 2017). 
Além da toxicidade celular já descrita, a formação de agregados amiloides 
locais pode ser um problema. Como por exemplo a amiloidose iatrogênica por insulina, 
que é uma massa de agregado amiloide subcutâneo no local de aplicação da insulina. 
O processo pelo qual se desenvolve a amiloidose iatrogênica por insulina ainda é 
pouco compreendido devido à raridade de casos. Mas um fator que pode ser 
importante é o trauma constante devido a necessidade contínua injeções. É 
aumentado o risco de hipoglicemia devido a absorção errática da insulina depositada 
(GUPTA; SINGLA; SINGLA, 2015). 
Produtos biofarmacêuticos podem ter propriedades amiloides e tais 
propriedades podem ser induzidas durante a armazenagem ou condições de stress 
(MAAS et al., 2007). Um dos principais problemas no desenvolvimento da formulação 
é manter a estabilidade da proteína e os fenômenos de agregação são geralmente 
difíceis de prever e evitar (MAAS et al., 2007). Tanto o FDA quanto a ANVISA citam a 
necessidade de dados sobre agregados em produtos biotecnológicos (BRASIL, 2010; 
FDA, 2014). As recomendações são para que sejam avaliadas partículas sub-visíveis 
com cerca de 2-10µm, entretanto oligômeros podem variar na escala nano o que não 
seria detectado pelas técnicas propostas (ABEDINI et al., 2016; NEDUMPULLY-
GOVINDAN et al., 2016; WEI et al., 2011). Para partículas nessa faixa de tamanho, 
poucas técnicas de caracterização podem fornecer detalhes de dimensionamento 
quantitativo. Dessa forma, diferentes abordagens analíticas deveriam ser aplicadas, 
cada uma com seu próprio intervalo de dimensionamento. Isso pode representar um 
grande desafio e uma resistência das indústria pois seriam mais passos necessários 
para o registro. O uso de mais de uma técnica para a caracterização de biofármacos 
é recomendado pelas autoridades reguladoras porque gera uma visão mais completa 
do produto e evita a dependência de tecnologias únicas. 
32 
 
Outro alerta em relação ao uso de biofármacos é o risco da formação de 
anticorpos, essa imunogenicidade pode se dar por diversos fatores como por exemplo 
a procedência da sequência proteica, se é nativa ou não, modificações pós-
traducionais, glicosilações, peguilaçõesdentre outras, que podem levar a alterações 
farmacodinâmicas e desenvolvimento de reações adversas (SCHELLEKENS, 2002). 
Tais problemas de imunogenicidade são motivo de preocupação quanto à eficácia 
terapêutica e segurança do paciente. 
Levantar a discussão sobre as condições de agregação de proteínas, 
principalmente as utilizadas como biofármacos é bastante importante visando 
justamente a criação e implementação de técnicas de rastreamento de espécies 
agregadas em produtos finais acabados. É importante também levar em consideração 
a orientação do uso e armazenamento correto do medicamento pelo paciente, frisando 
a manutenção das condições ideais para que seja garantida a dose e a segurança do 
mesmo. 
O pramlintide em sua formulação Symlin é mantido em um pH por volta de 4,0 
(FDA, 2005) o que é um pH onde não foi encontrado sinal de fluorescência de ThT 
significativo comparativamente com os outros pHs mais altos. Ele é indicado como 
tratamento adjuvante para diabetes em conjunto com a insulina (FDA, 2005), portanto 
uma co-formulação de ambos os fármacos seria de grande valia e avanço no 
tratamento de pacientes diabéticos insulinizados. 
Poucos estudos de análise físico-química entre insulina e pramlintide são 
encontrados, entretanto evidências de incompatibilidade farmacotécnicas são bem 
conhecidas: o symlin é formulado em pH 4,0 enquanto as insulinas são geralmente 
formuladas em pH próximo ao neutro (POULSEN; LANGKJ\A ER; WORSØE, 2005; 
POULSEN; LANGKJÆR; WORSØE, 2007), com excessão da glargina que é também 
formulada em pH 4,0 (FDA, 2000). 
Um estudo avaliou a preparação extemporânea de insulina regular e 
pramlintide comparativamente com os produtos isolados e não encontrou diferenças 
no perfil farmacocinético (WEYER et al, 2005), no entanto vale ressaltar que o uso foi 
imediato e não foram avaliados parâmetros físico químicos da preparação. 
33 
 
A partir do estudo que o nosso grupo fez com o pramlintide e pela a falta de 
estudos com insulina, partimos para a análise conjunta que gerou o segundo artigo 
desse trabalho. 
Como o pramlintide tem um tempo de meia-vida curto, por volta de 30-50 
minutos (MCQUEEN, 2005), faria sentido analisar a co-formulação com a insulina 
regular e com as insulinas de ação ultra-rápida. Desse modo, os análogos de insulinas 
analisados foram insulina regular Humulin R® ou Novolin R®; e os análogos de ação 
ultra-rápida Aspart NovoLog® e LisPro Humalog®. 
Tanto a insulina (NILSSON; DOBSON, 2003; SLUZKY; KLIBANOV; LANGER, 
1992; UVERSKY et al., 2003) quanto o pramlintide são capazes de formar agregados 
isolados em condições específicas. Desse modo partiu-se então para a verificação 
dos meios mais ou menos propensos a agregação tanto isolada quanto conjunta das 
proteínas eleitas. 
Como demonstrado na tabela 1 do segundo artigo, as insulinas são formuladas 
em fosfato de sódio em pH neutro/básico e o pramlintide é formulado em acetato de 
sódio em pH ácido. O ensaio foi conduzido então nos tampões fosfato de sódio, 
acetato de amônio e acetato de sódio tanto em pH 7,0 quanto em pH 5,0 para ver o 
comportamento dos polipeptídeos nessas condições. 
 A condição de fosfato de sódio pH 7,0 se mostrou a menos favorável para a 
manutenção da estabilidade para a maioria das formulações testadas enquanto a 
condição de acetato de sódio pH 5,0 se mostrou a mais favorável. 
 O pramlintide se mostra mais instável sozinho ou em combinação em qualquer 
dos tampões em pH 7,0, o que mais uma vez corrobora com sua maior estabilidade 
em pHs mais ácidos. 
 Visando uma formulação coerente com as necessidades de aplicação para os 
pacientes diabéticos, seria de maior interesse a co-formulação do pramlintide com um 
análogo de insulina ultra-rápido. 
A tentativa da co-formulação com a insulina Aspart em concentrações mais 
elevadas foi limitada pela formação de agregados em pH5,0 que não se redissolviam. 
Comparativamente o anólogo LisPro se demonstrou mais estável do que o Aspart nas 
condições testadas. Dessa forma, partiu-se para a análise da combinação pramlintide 
+ LisPro em acetato de sódio pH 5,0. 
34 
 
 O metacresol é um composto fenólico muitíssimo utilizado como preservante 
em formulações injetáveis (SINGH; HUTCHINGS; MALLELA, 2011). O análogo de 
insulina LisPro forma hexâmetros na presença de zinco e fenol e se degrada mais 
rapidamente com a depleção do fenol (TESKA et al., 2014), o que além de preservante 
demonstra um papel de estabilizante para o metacresol na formulação. Entretanto já 
foi visto que compostos fenólicos podem induzir um processo de agregação em 
compostos proteicos (BIS; MALLELA, 2014; HUTCHINGS et al., 2013; MAA; HSU, 
1996), como o metacresol está presente tanto na formulação do análogo de insulina 
LisPro quanto na formulação do pramlintide, Symlin, testou-se então a influência do 
metacresol no incremento de fluorescência de ThT. 
 O metacresol não influenciou nem nos peptídeos sozinhos nem na combinação 
quando comparados em função do incremento de fluorescência de ThT aos seus 
controles sem metacresol. 
 Até então todas as análises foram feitas com a concentração de peptídeos de 
50µM, no entanto o pramlintide é formulado a 600μg/mL o que corresponde a 
aproximadamente 150µM e o análogo LisPro é formulado a 100 IU/mL (3.5 mg/mL) o 
que corresponde a aproximadamente 600µM. De uma visão terapêutica, é indicada a 
redução de cerca de 50% da dose de insulina após a introdução do pramlintide no 
esquema de tratamento (FDA, 2005). A partir dessa premissa, foi testada então a co-
formulação de pramlintide a 150µM e LisPro a 300µM em acetato de sódio 50mM pH 
5,0. 
A co-formulação de pramlintide a 150µM e LisPro a 300µM em acetato de sódio 
50mM pH 5,0 possui uma turbidez transiente logo após a mistura das proteínas. Esse 
fenômeno é comum em interações proteicas, ensaios de cristalização e não 
necessariamente implica em desestabilidade da formulação (HAUPERT; SIMPSON, 
2011; LIMA et al., 2006) . 
 Utilizando o pramlintide em fosfato de sódio pH 7,0 como controle positivo, que 
demonstrou um perfil de agregação coerente com o já visto durante todo o trabalho 
foi possível demonstrar a estabilidade da co-formulação durante o tempo de 
experimento de quase 96h. 
 Vale ressaltar que os experimentos de estabilidade da formulação foram 
realizados a 25ºC e a co-formulação eleita ficou estável por quase 4 dias nessas 
condições. 
35 
 
 O uso do pramlintide como adjuvante no tratamento com LisPro em seringas 
separadas já foi demonstrado e bem sucedido tanto para diabetes tipo 1 quanto para 
o tipo 2 (MAGGS et al., 2004; WEYER et al., 2003). A demonstração da estabilidade 
de uma co-formulação pode facilitar o desenvolvimento e a produção de diversos tipos 
de formas farmacêuticas dessa formulação. 
 Mais estudos são necessários para a complementação desse trabalho e 
possível desenvolvimento de uma forma farmacêutica final, como análise de 
estabilidade a longo prazo, análise de estabilidade em baixa temperatura e influência 
de outros adjuvantes a formulação. 
O conjunto de informações geradas por esse trabalho adiciona peças a uma 
maior compreensão das interações proteicas em diferentes condições e como essas 
condições podem influenciar no processo de agregação amiloide. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36 
 
6. CONCLUSÃO 
 
O presente trabalho demonstrou a potencialidade do pramlintide em se organizar 
de forma oligomérica e também em agregados de maior ordem, como fibras amiloides. 
Investigou a influência do meio no processo de agregação, demonstrando 
dependência de pH e do agente tampão. 
Demonstrou características marcantes da presença de agregados amiloides 
através de diversas técnicas de análise morfológica e de estrutura secundária. 
 Também demonstrou a capacidade do pramlintide de se associar a diferentes 
análogos de insulina de forma oligomérica. 
 Investigou a influência do tampãoe do pH no processo de agregação dos 
análogos de insulina sozinhos e em conjunto com o pramlintide, demonstrando as 
condições mais ou menos favoráveis a agregação proteica. 
 Elegeu também uma combinação de análogo de insulina e pramlintide e a 
melhor condição para o desenvolvimento de uma co-formulação, além de demonstrar 
a estabilidade a curto prazo dessa co-formulação. 
Esta dissertação apresentou um conjunto de resultados em que demonstramos 
que mesmo pramlintide, um análogo de amilina humana considerável estável e 
empregado na prática terapêutica desde 2005, ainda detem propriedades 
amiloidogênicas quando colocados em condições fora de sua maior estabilidade 
(encontrada em Acetato de sódio, pH 4.0, a baixa temperatura, tal qual é formulado). 
A elevação de pH resulta em agregação amilóide, o que impede sua co-formulação 
com insulina regular que não é estável a pH menor que 7 (devido a ponto isoelétrico 
e amiloidogenese de insulina nesta condição). De outra sorte, demonstramos que 
insulina aspart e LisPro ficam estáveis a pH mais baixo, sendo ainda possível formular 
a LisPro a pH 5.0 em alta concentração com pramlintide também em alta 
concentração, demonstrando-se estável contra agregação amilóide por pelo menos 4 
dias a 25ºC. Esses dados em conjunto demonstram o potencial de obter uma 
coformulação de pramlintide com insulina ultrarápida. Passos futuros envolvendo 
estudos a mais longo prazo, estudos toxicológicos, pré-clínicos e clínicos são 
desejáveis para tentar viabilizar a chegada de um produto co-formulado até pacientes. 
 
 
 
37 
 
7. BIBLIOGRAFIA 
ABEDINI, A. et al. Time-resolved studies define the nature of toxic IAPP 
intermediates, providing insight for anti-amyloidosis therapeutics. eLife, v. 
5, 2016. 
AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Diagnosis and Classification of 
Diabetes Mellitus. Diabetes Care, v. 41, n. Supplement_1, 1 jan. 2018. 
AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Diagnosis and Classification of 
Diabetes Mellitus. Diabetes Care, v. 37, n. Supplement_1, p. S81–S90, 1 
jan. 2014. 
ARONNE, L. et al. Progressive Reduction in Body Weight after Treatment with the 
Amylin Analog Pramlintide in Obese Subjects: A Phase 2, Randomized, Placebo-
Controlled, Dose-Escalation Study. The Journal of Clinical Endocrinology & 
Metabolism, v. 92, n. 8, p. 2977–2983, ago. 2007. 
BAKAYSA, D. L. et al. Physicochemical basis for the rapid time-action of 
LysB28ProB29-insulin: Dissociation of a protein-ligand complex. Protein 
Science, v. 5, n. 12, p. 2521–2531, 1 dez. 1996. 
BENNETT, R. G.; DUCKWORTH, W. C.; HAMEL, F. G. Degradation of Amylin by 
Insulin-degrading Enzyme. Journal of Biological Chemistry, v. 275, n. 47, p. 
36621–36625, 24 nov. 2000. 
BIS, R. L.; MALLELA, K. M. G. Antimicrobial preservatives induce aggregation of 
interferon alpha-2a: The order in which preservatives induce protein aggregation 
is independent of the protein. International journal of pharmaceutics, v. 472, n. 
0, p. 356–361, 10 set. 2014. 
BRANGE, J. et al. Monomeric insulins obtained by protein engineering and their 
medical implications. Nature 333, 679–682 (16 June 1988). 
Brasil 2010. RDC Nº 55, DE 16 DE DEZEMBRO DE 2010. Dispõe sobre o 
registro de produtos biológicos novos e produtos biológicos e dá outras 
providências. 
Disponível:http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2010/anexo/anexo_r
es0055_16_12_2010.pdf Acesso: 06 fev 2018. 
BRETHERTON-WATT, D. et al. Very high concentrations of islet amyloid 
polypeptide are necessary to alter the insulin response to intravenous glucose in 
man. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, v. 74, n. 5, p. 
1032–1035, 1992. 
BUSE, J. B.; WEYER, C.; MAGGS, D. G. Amylin Replacement With Pramlintide in 
Type 1 and Type 2 Diabetes: A Physiological Approach to Overcome Barriers 
With Insulin Therapy. Clinical Diabetes, v. 20, n. 3, p. 137–144, 7 jan. 2002. 
38 
 
CHANCE, W. T. et al. Anorexia following the intrahypothalamic administration of 
amylin. Brain Research, v. 539, n. 2, p. 352–354, 25 jan. 1991. 
CHANCE, W. T. et al. Amylin increases transport of tyrosine and tryptophan into 
the brain. Brain Research, v. 593, n. 1, p. 20–24, 9 out. 1992. 
CHIANG, J. L. et al. Type 1 Diabetes Through the Life Span: A Position 
Statement of the American Diabetes Association. Diabetes Care, v. 37, n. 7, p. 
2034–2054, jul. 2014. 
CHRISTOPOULOS, G. et al. Multiple Amylin Receptors Arise from Receptor 
Activity-Modifying Protein Interaction with the Calcitonin Receptor Gene Product. 
Molecular Pharmacology, v. 56, n. 1, p. 235–242, 1 jul. 1999. 
CONDUTA TERAPÊUTICA NO DIABETES .TIPO 2: ALGORITMO SBD 2017. 
Posicionamento Oficial SBD nº 02/2017. Disponível em 
http://www.diabetes.org.br/profissionais/images/2017/POSICIONAMENTO-
OFICIAL-SBD-02-2017-ALGORITMO-SBD-2017.pdf. Acesso em: 28/12/2017. 
COOKE, C. E. et al. Persistence with injectable antidiabetic agents in members 
with type 2 diabetes in a commercial managed care organization. Current 
Medical Research and Opinion, v. 26, n. 1, p. 231–238, jan. 2010. 
COOPER, G. J. et al. Purification and characterization of a peptide from amyloid-
rich pancreases of type 2 diabetic patients. Proceedings of the National 
Academy of Sciences, v. 84, n. 23, p. 8628–8632, 1987. 
COOPER, G. J. et al. Amylin found in amyloid deposits in human type 2 diabetes 
mellitus may be a hormone that regulates glycogen metabolism in skeletal 
muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 85, n. 20, p. 
7763–7766, 1988. 
CORT, J. R. et al. Solution state structures of human pancreatic amylin and 
pramlintide. Protein Engineering Design and Selection, v. 22, n. 8, p. 497–513, 
1 ago. 2009. 
DEFRONZO, R. A. et al. Type 2 diabetes mellitus. Nature Reviews Disease 
Primers, p. 15019, 23 jul. 2015. 
Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes (2015-2016) / Adolfo Milech...[et. 
al.]; São Paulo: A.C. Farmacêutica, 2016. il. ISBN 978-85-8114-307-1 
 
Drug Approval Package: Symlin (Pramlintide Acetate) NDA #021332 FDA, 2005. 
[Internet]. Disponível em: 
https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2005/21-332_Symlin.cfm 
Acesso em: 17/01/2018 
 
http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2005/21-332_Symlin.cfm
39 
 
Drug Approval Package: Lantus (Insulin Glargine [rDNA Origin] Injection) NDA # 
21-081 FDA, 2000. [Internet]. Disponível em: 
https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2000/21081_Lantus.cfm 
Acesso em: 17/01/2018 
 
DUCKWORTH, W. C.; BENNETT, R. G.; HAMEL, F. G. Insulin degradation: 
progress and potential. Endocrine Reviews, v. 19, n. 5, p. 608–624, out. 1998. 
EANES, E.D. e GLENNER, G.G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. 
Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Vol 16, Issue 11, pp. 673 - 677. 
November 1, 1968 
EDELMAN, S. V. Optimizing diabetes treatment using an amylin analogue. The 
Diabetes Educator, v. 34 Suppl 1, p. 4S–10S, fev. 2008. 
ERTHAL, L. C. S. et al. Regulation of the assembly and amyloid aggregation of 
murine amylin by zinc. Biophysical Chemistry, v. 218, p. 58–70, nov. 2016. 
FÁVERO-RETTO, M. P. et al. Polymorphic distribution of proteins in solution by 
mass spectrometry: The analysis of insulin analogues. Biologicals, v. 45, p. 69–
77, jan. 2017. 
FDA 2014. Guidance for Industry Immunogenicity Assessment for Therapeutic 
Protein Products. U.S. Department of Health and Human ServicesFood and Drug 
Administration. August 2014. 
Disponível: https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidances/ucm338856.pdf 
Acesso: 06 fev 2018. 
 
GARVEY, M. et al. Phosphate and HEPES buffers potently affect the fibrillation 
and oligomerization mechanism of Alzheimer’s Aβ peptide. Biochemical and 
Biophysical Research Communications, v. 409, n. 3, p. 385–388, jun. 2011. 
GHATEI, M. A. et al. Amylin and amylin-amide lack an acute effect on blood 
glucose and insulin. Journal of endocrinology, v. 124, n. 2, p. R9–R11, 1990. 
GILCHRIST, P. J.; BRADSHAW, J. P. Amyloid formationby salmon calcitonin. 
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, v. 1182, n. 
1, p. 111–114, 1993. 
GILEAD, S.; GAZIT, E. The Role of the 14–20 Domain of the Islet Amyloid 
Polypeptide in Amyloid Formation. Experimental Diabetes Research, v. 2008, p. 
1–8, 2008. 
GLENNNER, G.G. et al. Amyloid fibrils formed from a segment of the pancreatic 
islet amyloid protein. Biochemical and Biophysical Research 
Communications Volume 155, Issue 2, 15 September 1988. 
40 
 
GRAHAM T. M. et al. Intention to Treat — Initiating Insulin and the 4-T Study New 
England Journal of Medicine 2007; 357:1759-1761October 25, 2007. 
GREEN, J. et al. Full-length Rat Amylin Forms Fibrils Following Substitution of 
Single Residues from Human Amylin. Journal of Molecular Biology, v. 326, n. 
4, p. 1147–1156, fev. 2003. 
GUPTA, Y.; SINGLA, G.; SINGLA, R. Insulin-derived amyloidosis. Indian Journal 
of Endocrinology and Metabolism, v. 19, n. 1, p. 174, 2015. 
GUSSO, G.; POLI NETO, P. Gestão da clínica. In: GUSSO G.; LOPES, J. M. C. 
(Org.). Tratado de medicina de família e comunidade: princípios, formação e 
prática. Porto Alegre: Artmed, 2012. v. 1, p. 159-166. 
HARTTER, E. et al. Basal and stimulated plasma levels of pancreatic amylin 
indicate its co-secretion with insulin in humans. Diabetologia, v. 34, n. 1, p. 52–
54, jan. 1991. 
HAUPERT, L.; SIMPSON, G. Screening of Protein Crystallization Trials by 
Second Order Nonlinear Optical Imaging of Chiral Crystals (SONICC). Methods 
(San Diego, Calif.), v. 55, n. 4, p. 379–386, dez. 2011. 
HAY, D. L. et al. Amylin receptors: molecular composition and pharmacology. 
Biochemical Society transactions, v. 32, n. Pt 5, p. 865–867, nov. 2004. 
HAYDEN, M. R.; TYAGI, S. C. A" is for amylin and amyloid in type 2 diabetes 
mellitus. Jop, v. 2, n. 4, p. 124–39, 2001. 
HOBBS, J. R.; MORGAN, A. D. Fluorescence microscopy with thioflavine-T in the 
diagnosis of amyloid. The Journal of pathology and bacteriology, v. 86, n. 2, p. 
437–442, 1963. 
HOLLANDER, P. et al. Effect of Pramlintide on Weight in Overweight and Obese 
Insulin-Treated Type 2 Diabetes Patients. Obesity research, v. 12, n. 4, p. 661–
668, 2004. 
HUTCHINGS, R. L. et al. Effect of antimicrobial preservatives on partial protein 
unfolding and aggregation. Journal of pharmaceutical sciences, v. 102, n. 2, p. 
365–376, fev. 2013. 
INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION. IDF Diabetes Atlas, 8th edn. 
Brussels, Belgium: International Diabetes Federation, 2017. 
http://www.diabetesatlas.org 
JAIKARAN, E. T. et al. Identification of a novel human islet amyloid polypeptide 
beta-sheet domain and factors influencing fibrillogenesis. Journal of Molecular 
Biology, v. 308, n. 3, p. 515–525, 4 maio 2001. 
http://www.nejm.org/toc/nejm/357/17/
41 
 
JAMES, J. H. et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase 
activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of 
Physiology-Endocrinology And Metabolism, v. 277, n. 1, p. E176–E186, 1999. 
JHA, S. et al. pH Dependence of Amylin Fibrillization. Biochemistry, v. 53, n. 2, 
p. 300–310, 21 jan. 2014. 
KAHN, S. E. et al. Evidence of Cosecretion of Islet Amyloid Polypeptide and 
Insulin by β-Cells. Diabetes, v. 39, n. 5, p. 634–638, 5 jan. 1990. 
KARAMANOS, T. K. et al. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution 
NMR. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy, v. 0, p. 86–
104, ago. 2015. 
KLEPPINGER, E. L.; VIVIAN, E. M. Pramlintide for the Treatment of Diabetes 
Mellitus. The Annals of Pharmacotherapy, v. 37, n. 7, p. 1082–1089, jul. 2003. 
KODALI, R.; WETZEL, R. Polymorphism in the intermediates and products of 
amyloid assembly. Current Opinion in Structural Biology, v. 17, n. 1, p. 48–57, 
fev. 2007. 
KOLTERMAN, O. G. et al. Reduction of postprandial hyperglycemia in subjects 
with IDDM by intravenous infusion of AC137, a human amylin analogue. 
Diabetes Care, v. 18, n. 8, p. 1179–1182, 1995. 
KONARKOWSKA, B. et al. The aggregation potential of human amylin 
determines its cytotoxicity towards islet β-cells. FEBS Journal, v. 273, n. 15, p. 
3614–3624, ago. 2006. 
KUROCHKIN, I. V. Insulin-degrading enzyme: embarking on amyloid destruction. 
Trends in biochemical sciences, v. 26, n. 7, p. 421–425, 2001. 
LEVINE, H. Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer’s disease β-amyloid 
peptides: Detection of amyloid aggregation in solution. Protein Science, v. 2, n. 
3, p. 404–410, 1993. 
LIMA, L. M. T. R. et al. Structural Insights into the Interaction between Prion 
Protein and Nucleic Acid †. Biochemistry, v. 45, n. 30, p. 9180–9187, ago. 2006. 
MAA, Y.-F.; HSU, C. C. Aggregation of recombinant human growth hormone 
induced by phenolic compounds. International journal of pharmaceutics, v. 
140, n. 2, p. 155–168, 1996. 
MAAS, C. et al. A Role for Protein Misfolding in Immunogenicity of 
Biopharmaceuticals. Journal of Biological Chemistry, v. 282, n. 4, p. 2229–
2236, 26 jan. 2007. 
MAGGS, D. et al. Effect of pramlintide on A1C and body weight in insulin-treated 
African Americans and Hispanics with type 2 diabetes: a pooled post hoc 
analysis. Metabolism, v. 52, n. 12, p. 1638–1642, dez. 2003. 
42 
 
MAGGS, D. G. et al. Pramlintide reduces postprandial glucose excursions when 
added to insulin LisPro in subjects with type 2 diabetes: a dose-timing study. 
Diabetes/Metabolism Research and Reviews, v. 20, n. 1, p. 55–60, jan. 2004. 
MAREK, P. J. et al. Ionic strength effects on amyloid formation by amylin are a 
complicated interplay between Debye screening, ion selectivity, and Hofmeister 
effects. Biochemistry, v. 51, n. 43, p. 8478, 2012. 
MCLATCHIE, L. M. et al. RAMPs regulate the transport and ligand specificity of 
the calcitonin-receptor-like receptor. Nature, v. 393, n. 6683, p. 333–339, 28 maio 
1998. 
MCQUEEN, J. Pramlintide acetate. American Journal of Health-System 
Pharmacy, v. 62, n. 22, p. 2363–2372, 15 nov. 2005. 
MILTON, N. G. N.; HARRIS, J. R. Fibril formation and toxicity of the non-
amyloidogenic rat amylin peptide. Micron, v. 44, p. 246–253, jan. 2013. 
NATHAN, D. M. et al. Medical Management of Hyperglycemia in Type 2 Diabetes: 
A Consensus Algorithm for the Initiation and Adjustment of Therapy: A consensus 
statement of the American Diabetes Association and the European Association 
for the Study of Diabetes. Diabetes Care, v. 32, n. 1, p. 193–203, 1 jan. 2009. 
National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Database; 
CID=70691388, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/70691388 
(accessed Feb. 6, 2018). 
National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Database; 
CID=16132430, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/16132430 
(accessed Feb. 6, 2018). 
National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Database; 
CID=123773280, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/123773280 
(accessed Feb. 6, 2018). 
NEDUMPULLY-GOVINDAN, P. et al. Stabilizing Off-pathway Oligomers by 
Polyphenol Nanoassemblies for IAPP Aggregation Inhibition. Scientific Reports, 
v. 6, 14 jan. 2016. 
NILSSON, M. R.; DOBSON, C. M. Chemical modification of insulin in amyloid 
fibrils. Protein Science : A Publication of the Protein Society, v. 12, n. 11, p. 
2637–2641, nov. 2003. 
NILSSON, M. R.; RALEIGH, D. P. Analysis of amylin cleavage products provides 
new insights into the amyloidogenic region of human amylin. Journal of 
molecular biology, v. 294, n. 5, p. 1375–1385, 1999. 
OLSEN, J. S. et al. Seminal Plasma Accelerates Semen-derived Enhancer of 
Viral Infection (SEVI) Fibril Formation by the Prostatic Acid Phosphatase 
43 
 
(PAP248-286) Peptide. Journal of Biological Chemistry, v. 287, n. 15, p. 
11842–11849, 6 abr. 2012. 
PALMIERI, L. C. et al. Stepwise oligomerization of murine amylin and assembly of 
amyloid fibrils. Biophysical Chemistry, v. 180–181, p. 135–144, out. 2013. 
PARAMESWARAN, N.; SPIELMAN, W. S. RAMPs: the past, present and future. 
Trends in Biochemical