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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS Caracterização fenotípica e funcional de subpopulações de linhagem humana de câncer de mama e mecanismos de migração para a medula óssea. ANNELIESE FORTUNA DE AZEVEDO FREIRE DA COSTA RIO DE JANEIRO 2011 i Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Ciências Biomédicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas Anneliese Fortuna de Azevedo Freire da Costa Caracterização fenotípica e funcional de subpopulações de linhagem humana de câncer de mama e mecanismos de migração para a medula óssea. Rio de Janeiro 2011 Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas. Orientadora: Prof.ª Maria Isabel Doria Rossi Programa de Bioengenharia Tecidual – ICB – UFRJ Laboratório de Biologia Celular Aplicada à Medicina ii Fortuna, Anneliese de Azevedo Freire da Costa Caracterização fenotípica e funcional de subpopulações de linhagem humana de câncer de mama e mecanismos de migração para a medula óssea / Anneliese Fortuna de Azevedo Freire da Costa. Rio de Janeiro: UFRJ/ ICB/PCM, 2011 xv, 83 p. il. Orientadora: Maria Isabel Doria Rossi Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Ciências Biomédicas/ Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, 2011 1.Câncer de Mama. 2.Células Tronco do Câncer. 3.Metástase. 4. Células Mesenquimais da Medula Óssea. 5.Quimiocinas. 6.Receptores de Quimiocina. – Tese. I. Rossi, Maria Isabel Doria. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, PCM. III. Título iii Anneliese Fortuna de Azevedo Freire da Costa Caracterização fenotípica e funcional de subpopulações de linhagem humana de câncer de mama e mecanismos de migração para a medula óssea. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Isabel Doria Rossi Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas. Prof.ª Dr.ª Claudia dos Santos Mermelstein, ICB/UFRJ (examinadora) Prof.ª Dr.ª Luciana Barreto Chiarini, IBCCF/ UFRJ (examinadora) Prof. Dr. Willian Fernando Zambuzzi, UFF (examinador) Prof.ª Dr.ª Morgana T. L. Castelo Branco, ICB/UFRJ (revisora e membro suplente) Prof. Dr. Mauro Sérgio Gonçalves Pavão, IBqM/UFRJ (membro suplente) Prof.ª Dr.ª Maria Isabel Doria Rossi (orientadora) Prof.ª Drª. Flávia Carvalho Alcantara Gomes (coordenadora do curso) Rio de Janeiro,__de_________de 2011. iv Agradecimentos “No man is an island, entire of itself; every man is a piece of the continent, a part of the main.” Meditation XVII – Jonh Donne Aos meus pais, Marcelo e Denise, que são a base de tudo que sou e que conquistei até hoje. Ao meu irmão, Gustavo, por ser insuportável 99% do tempo, mas insubstituível no 1 % restante. Aos meus avós, por serem pessoas que eu admiro e me espelho. Aos meus familiares, tios e primos, que estão sempre torcendo pelo meu sucesso. Às minhas queridas amigas “agostinianas”, pela amizade inestimável e pelos muitos encontros com diversão garantida! Aos meus amigos biomédicos. Excelentes companhias para risos e melhores ainda para lamentações científicas! Só vocês me entendem! Aos adoráveis amigos que fiz ao longo desta trajetória científica! A todos os funcionários do Laboratório de Cultura e Criopreservação de Medula Óssea, pelas inúmeras ajudas recebidas e por todo companheirismo que sempre demonstram. Em especial ao Gabriel, por toda amizade, conselhos e inúmeras ajudas ao longo desses anos! Ao meu ex-orientador, Hélio Dutra, por continuar presente em minha vida acadêmica, sempre me ajudando e torcendo por mim. Ao Professor Radovan Borojevic, por todo o trabalho que gerou essa estrutura que hoje utilizamos para fazer nossas pesquisas. v A Drª Andrea Pires, por ter nos recebido em seu laboratório com tanta boa vontade e ter contribuído enormemente para o trabalho. Ao Professor Roger Chammas e sua aluna de pós-doutorado Camila Machado, que foram imprescindíveis para realização deste trabalho. A todas as “meninas superpoderosas” do LABCAM: Ana Paula, Araci, Daiana, Danielle, Mariana, Rhayra e Suzana. Por terem me acolhido tão bem no laboratório, pelos ensinamentos e por todo apoio nos momentos difíceis. Vocês são maravilhosas! Em especial a Ana Paula e a Araci, que participaram diretamente da realização deste trabalho. Sem vocês teria sido mais difícil e menos divertido! À minha orientadora Maria Isabel Doria Rossi, pela oportunidade que me deu quando eu “caí de paraquedas” no laboratório. No final deste ciclo percebo o quanto amadureci cientificamente e o quanto deste amadurecimento se deve à sua excelente orientação! Ao CNPq, pelo suporte financeiro que me permitiu realizar este trabalho. A todos que vem me acompanhando e me apoiando nesta “tortuosa caminhada”, meus sinceros agradecimentos! vi A palavra mágica Certa palavra dorme na sombra de um livro raro. Como desencantá-la? É a senha da vida a senha do mundo. Vou procurá-la. Vou procurá-la a vida inteira no mundo todo. Se tarda o encontro, se não a encontro, não desanimo, procuro sempre. Procuro sempre, e minha procura ficará sendo minha palavra. Carlos Drummond de Andrade vii Resumo A hipótese de que tumores sólidos possuem uma célula tronco capaz de gerar toda sua progênie tem sido muito debatida nos últimos anos. As supostas células tronco tumorais foram identificadas tanto em tumores primários quanto em linhagens humanas de câncer de mama através do fenótipo CD24 - CD44 + . Células tumorais com este mesmo fenótipo foram observadas na medula óssea destas pacientes e correlacionadas com um pior prognóstico. Acredita-se que a quimiocina CXCL12, secretada pelas células estromais mesenquimais da medula óssea, esteja envolvida na migração das células tumorais de mama para este órgão. A expressão de seus receptores CXCR4 e, mais recentemente de CXCR7, por células tumorais foi correlacionada com um fenótipo mais agressivo. O objetivo deste estudo foi investigar as propriedades biológicas de linhagens celulares com fenótipo de células tronco de tumor de mama e os mecanismos de migração para a medula óssea. Através de citometria de fluxo, verificou-se que a linhagem T-47D é heterogênea com duas subpopulações claramente distintas, sendo uma majoritária CD44-CD24+ e uma minoritária CD44+CD24-, compatível com o fenótipo de células tronco tumorais. Estas subpopulações foram isoladas por citometria de fluxo e seus fenótipos se mantiveram estáveis em cultura. As células CD44+CD24- apresentaram morfologia compatível com células basais, tanto em monocamada quanto no cultivo em Matrigel, diferente da outra subpopulação, que apresentou morfologia compatível com células luminais. Apenas a subpopulação CD44+CD24- gerou tumores em camundongos Nude. Embora os tumores fossem heterogêneos, a subpopulação CD44+CD24- não foi capaz de gerar a subpopulação CD44-CD24+. Em ensaios de invasão utilizando modelo 3D de esferoides de MO, as células CD44+CD24- invadiram estas estruturas, enquanto as células CD44-CD24+ aderiram à superfície dos mesmos.No ensaio de migração em sistema Transwell, apenas a subpopulação CD44+CD24- migrou em resposta a fatores solúveis secretados pelas células estromais mesenquimais da medula óssea. As linhagens basais e invasivas MDA- MB-231 e MDA-MB-468, assim como a linhagem luminal e não invasiva MCF-7 e as subpopulações da linhagem T-47D expressaram o receptor CXCR4. Somente a linhagem MCF-7 expressou o receptor CXCR7 na superfície. Os resultados indicam que as células com fenótipo CD44+CD24-, da linhagem T-47D, não representam verdadeiras células tronco tumorais e sim células com características basais e mais agressivas. Não foi observada correlação entre a expressão dos receptores de quimiocina CXCR4 e CXCR7 e a capacidade de migração e invasão destas células. viii Abstract The hypothesis that solid tumors possess a stem cell capable of generating all its progeny has been debating in the last years. The putative cancer stem cells were identified in primary tumors and in breast cancer cell lines by the phenotype CD44+CD24-. Tumor cells with this same phenotype were observed in the bone marrow of these patients and were correlated with a worse prognostic. It is believe that the chemokine CXCL12, secreted by bone marrow derived mesenchymal stromal cells, is involved in the migration of breast cancer cells to this organ. The expression of their receptors CXCR4, and the more recently described CXCR7, were correlated with a more aggressive phenotype. The aim of this study was to investigate the biological properties of cell lines with the breast cancer stem cells phenotype and the mechanisms of migration to bone marrow. By flow cytometry it was shown that the T-47D cell line is heterogeneous with two clearly distinct subpopulations, a major subpopulation composed of CD44-CD24+ cells and a minor one composed of CD44+CD24- cells, compatible with the CSC phenotype. These subpopulations were sorted and their phenotypes kept stable in culture. The CD44+CD24- cells showed the morphology of basal cells, both in monolayer culture and in Matrigel, different from the other subpopulation that showed a luminal-like morphology. Only the CD44+CD24- subpopulation generated tumors in Nude mice. Although the tumors were heterogeneous, a subpopulação CD44+CD24- não foi capaz de gerar a subpopulação CD44-CD24+the CD44-CD24+ cells were not observed. In invasion assays with the 3D culture model of bone marrow spheroids, CD44+CD24- cells invaded these structures while CD44-CD24+ cells adhered to their surfaces. In migration assays in Transwell system, only the CD44+CD24- cells migrated in response to soluble factors secreted by bone marrow derived mesenchymal stromal cells. The basal and invasive cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-468 as well as the luminal e noninvasive cell line MCF-7 and the T-47D subpopulations expressed the CXCR4 receptor. Surface expression of CXCR7 was observed only in the MCF-7 cell line. These results indicate that the T-47D cells with CD44+CD24- phenotype do not represent true cancer stem cells, but a more aggressive cell subpopulation with basal characteristics. No correlation between the expression of the chemokine receptors CXCR4 and CXCR7 and the migration and invasion capacities of these cells was observed. ix Lista de Siglas e Abreviaturas 3D Tridimensional ALDH-1 Aldehyde dehydrogenase 1 (aldeído desidrogenase 1) APC Allophycocyanin (alo-ficocianina) BSA Bovine Serum Albumin (albumina sérica bovina) CCL5 Chemokine (C-C motif) ligand type 5 (quimiocina motivo C-C ligante tipo 5) CD24 Cluster of Differentiation 24 (cluster de diferenciação 24) CD44 Cluster of Differentiation 44 (cluster de diferenciação 44) CFSE (CFDA-SE) 5-(e 6)- Carboxifluoresceína Diacetato de Succinil Éster CFU-F Colony Forming Unit – Fibroblast (unidade formadora de colônia fibroblastóide) CSC Cancer Stem Cell (célula tronco do câncer) CTD Células Tumorais Disseminadas CXCL12 Chemokine (C-X-C motif) ligand type 12 (quimiocina motivo C-X-C ligante tipo 12) CXCR4 C-X-C Chemokine Receptor type 4 (receptor de quimiocina da família C- X-C 4 CXCR7 C-X-C Chemokine Receptor type 7 (receptor de quimiocina da família C- X-C 7 DMEM Dulbecco’s Modified Eagles Medium (meio Eagle modificado por Dulbecco) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (ácido etilenodiamino tetra acético) EMT Epithelial-Mesenchymal Transition (transição epitélio-mesenquimal) EPCR Endothelial Protein C Receptor (receptor endotelial da proteína C) ERK Extracellular-Signal-Regulated Kinases (quinase regulada por sinais extracelulares) x ESA Epithelial Specific Antigen (antígeno epitelial específico) FACS FGF Fluorescence Activated Cell Sorter (separador de células ativado por fluorescência) Fibroblast Growth Factor (fator de crescimento de fibroblasto) FITC Fluorescein Isothiocyanate (isotiocianato de fluoresceína) FPH Fibroblasto de Pele Humana GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase HA Hyaluronic acid (ácido hialurônico) HE Hematoxilina e Eosina ICAM-1 Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 (molécula de adesão intercelular-1) IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (Meio Dulbecco Modificado por Iscove) MC MEC Meio Condicionado Matriz Extracelular MO Medula Óssea MSC Mesenchymal Stromal Cells (células estromais mesenquimais multipotentes) NOD/SCID Non-Obese Diabetes/ Severe Combined Immunodeficiency (Diabético não obeso/ Imunodeficiência combinada severa) PE Phycoerythrin (ficoeritrina) SFB Soro Fetal Bovino PBS Phosphate Buffered Saline (salina tamponada com fosfato) RANTES Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed and Secreted (Secretado e expresso por Células T normais e regulado sobre ativação) RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa) SAV Streptoavidin (estreptavidina) xi SDF-1 Stromal Cell-Derived Factor 1 (Fator 1 derivado de células do estroma) TA TGF- Temperatura Ambiente Transforming Growth Factor-( Fator de Crescimento Transformante beta) VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule 1 ( mólecula de adesão celular vascular 1) xii SUMÁRIO 1. Introdução ................................................................................................................................. 1 2. Revisão da Literatura .............................................................................................................. 5 2.1. O câncer de mama e a disseminação das células tumorais para a medula óssea.................................................................................................................................................... 5 2.2. Mecanismos relacionados com a disseminação de células tumorais.......................... 7 2.3. As hipóteses da heterogeneidade tumoral ................................................................... 14 2.4. O modelo de estudo do câncer de mama .................................................................... 20 3. Objetivos .................................................................................................................................. 24 3.1. Objetivo Geral .................................................................................................................. 24 3.2. Objetivos Específicos ...................................................................................................... 24 4. Materiais e Métodos .............................................................................................................. 25 4.1. Células e Amostras. ........................................................................................................ 25 4.2. Animais. ............................................................................................................................26 4.3. Anticorpos......................................................................................................................... 26 4.4. Isolamento de células mesenquimais do estroma da medula óssea. ...................... 27 4.5. Obtenção de meio condicionado de células mesenquimais derivadas do estroma da medula óssea e de fibroblasto de pele humana. .................................................................... 29 4.6. Cultivo em sistema de cultura tridimensional do tipo Matrigel. ................................... 29 4.7. Ensaio de invasão tumoral em modelo de cultura tridimensional do tipo esferoide.30 4.8. Migração de células tumorais em sistema Transwell: ensaio de quimiotaxia.................................................................................................................32 xiii 4.9. Marcação das células tumorais com CFSE. ................................................................ 34 4.10. Citometria de Fluxo e Seleção de células (Sorting). ................................................... 34 4.11. Isolamento de RNA e reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR)........................................................................................................................................... 36 4.12. Ensaio de tumorigênese em camundongo imunodeficiente. ..................................... 37 4.13. Análise histológica. .......................................................................................................... 38 4.14. Aquisição e processamento de imagens. .................................................................... 39 4.15. Análise estatística ............................................................................................................ 39 5. Resultados .............................................................................................................................. 40 5.1. Análise fenotípica das linhagens de tumor de mama quanto à expressão das moléculas CD24 e CD44 e seleção por citometria de fluxo das subpopulações da linhagem T-47D. 40 5.2. Caracterização das subpopulações selecionadas da linhagem T-47D. .................. 43 5.3. Ensaio de tumorigênese em camundongo imunodeficiente. ..................................... 46 5.4. Ensaio de invasão tumoral em modelo de cultura tridimensional do tipo esferoide.54 5.5. Migração em sistema Transwell: ensaio de quimiotaxia. ........................................... 59 5.6. Análise da expressão de CXCL12 nas populações de células mesenquimais derivadas do estroma da medula óssea e de fibroblasto de pele humana.. ............................. 61 5.7. Expressão dos receptores de quimiocinas CXCR4 e CXCR7 nas linhagens de câncer de mama. .............................................................................................................................. 61 6. Discussão ................................................................................................................................ 64 7. Conclusões ............................................................................................................................. 73 8. Referências Bibliográficas .................................................................................................. 74 xiv Lista de Figuras FIGURA 1. Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2011, exceto pele não melanoma, na população brasileira (INCA, 2010). ..................................................... 1 FIGURA 2. Modelos da cascata metastática.. ........................................................... 4 FIGURA 3. Curva de sobrevida de pacientes com câncer de mama pós-cirurgia de acordo com a presença ou não de células tumorais disseminadas nos linfonodos ou na MO ........................................................................................................................ 6 FIGURA 4. Importância do receptor CXCR4 e seu ligante CXCL12 no microambiente tumoral e na metástase .............................................................................................. 9 FIGURA 5. Modelo da atividade de CD24 e função de CXCR4.. ............................. 11 FIGURA 6. Dois modelos da heterogeneidade em tumores sólidos. ........................ 16 FIGURA 7. Dois modelos que explicam a presença de CSC com potencial metastático em tumores de mama.. ......................................................................... 20 FIGURA 8. Esquema ilustrativo de cultivo de esferoides.. ....................................... 31 FIGURA 9. Esquema ilustrativo da co-cultura de células tumorais com esferoides. . 32 FIGURA 10. Esquema ilustrativo do ensaio de migração em sistema Transwell®. .. 33 FIGURA 11. Análise fenotípica das linhagens de tumor de mama quanto à expressão das moléculas CD24 e CD44. ................................................................. 41 FIGURA 12. Seleção por citometria de fluxo das subpopulações da linhagem de tumor de mama T-47D. ............................................................................................ 42 FIGURA 13. Expressão de CD44 e CD24 nas células T-47D selecionadas por citometria de fluxo e mantidas em cultura. ............................................................... 43 FIGURA 14. Aspectos morfológicos das subpopulações T-47D CD44+ e T-47D CD24+ em cultura.. ................................................................................................... 44 FIGURA 15. Aspecto morfológico do crescimento em Matrigel das subpopulações T-47D CD44+ e T-47D CD24+. ................................................................................. 45 FIGURA 16. Aspecto morfológico das células T-47D CD24+ após 10 dias de cultura em Matrigel. ............................................................................................................. 46 FIGURA 17. Crescimento tumoral em camundongos Nude da subpopulação CD44+ da linhagem T-47D................................................................................................... 48 xv FIGURA 18. Análises histopatológicas dos tumores gerados em camundongos Nude.. ...................................................................................................................... 50 FIGURA 19. Imunohistoquímica para citoqueratinas luminais nos tumores gerados em camundongos Nude.. ......................................................................................... 51 FIGURA 20. Imunohistoquímica para marcadores mioepiteliais/ basais.. ................ 52 FIGURA 21. Expressão de CD24 nos tumores gerados nos camundongos Nude. Imunohistoquímica para CD24 em secções histológicas dos tumores. .................... 54 FIGURA 22. Expressão de CD24 nas células dos tumores isolados de camundongos Nude ........................................................................................................................ 54 FIGURA 23. Co-culturas de esferoides mistos de MO ou de esferoides simples de FPH com células T-47D CD24+ e T-47D CD44+. ...................................................... 56 FIGURA 24. Capacidade de invasão da subpopulação CD44+ nos esferoides. ....... 58 FIGURA 25. Migração da subpopulação T-47D CD44+ em sistema Transwell......... 60 FIGURA 26. Análise qualitativa por RT-PCR da expressão de CXCL12 em MSC e FPH em monocamada.. ........................................................................................... 61 FIGURA 27. Expressão do receptor CXCR4 em linhagens de tumor de mama.. ..... 62 FIGURA 28. Expressão do receptor CXCR7 em linhagens de tumor de mama.. ..... 63 FIGURA 29. Análise intracelular do receptor CXCR7 em linhagens de tumor de mama.. ..................................................................................................................... 63 Lista de Tabelas TABELA 1. Característicasdos anticorpos utilizados em imunohistoquímica. ......... 27 TABELA 2. Características dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados. ................ 37 TABELA 3. Classificação e perfil fenotípico das linhagens de câncer de mama. ..... 41 TABELA 4. Ensaio de tumorigênese em camundongos Nude – diluição limitante. .. 47 TABELA 5. Cinética de crescimento tumoral. .......................................................... 47 TABELA 6. Perfil imunohistoquímico dos tumores em relação a marcadores luminais e mioepiteliais/basais. .............................................................................................. 52 file:///E:/Dissertação/Dissertação%20completa_Final.doc%23_Toc301221119 file:///E:/Dissertação/Dissertação%20completa_Final.doc%23_Toc301221119 Introdução | 1 1. Introdução_________________________________________ A prevenção e o controle do câncer estão entre os mais importantes desafios científicos e de saúde pública de nossa época. Segundo recente relatório da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer/ Organização Mundial da Saúde (IARC/WHO, International Agency for Research on Cancer/ World Health Organization), o impacto global do câncer mais que dobrou em 30 anos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008). O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e é o principal câncer em mulheres, representando 16% de todos os cânceres femininos. No Brasil são esperados 49.240 novos casos de câncer de mama em 2011, o que representa 19,5% dos casos de câncer estimados para mulheres no país (INCA, 2010) (Fig.1). Apesar de ser considerado um câncer de relativo bom prognóstico, se diagnosticado e tratado oportunamente, suas taxas de mortalidade continuam elevadas (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008). FIGURA 1. Tipos de câncer mais incidentes estimados para 2011, exceto pele não melanoma, na população brasileira (INCA, 2010). Revisão da Literatura | 3 A sobrevida média após cinco anos da doença varia bruscamente em função do nível de desenvolvimento econômico do país. Esta discrepância é explicada pelo subinvestimento na saúde verificado nos países de baixo desenvolvimento econômico. A carência de equipamentos e programas voltados para detecção precoce do câncer de mama resulta numa alta proporção de mulheres diagnosticadas já nos estágios avançados da doença (COLEMAN et al., 2008; LACEY et al., 2009). Na prática clínica, o tamanho do tumor, sua graduação histopatológica (grau de diferenciação), o número de linfonodos regionais metastáticos e a presença de metástases distantes são fatores que auxiliam na predição do prognóstico do paciente e que, por conseguinte, influenciam na escolha do tratamento (revisado em VINCENT-SALOMON et al., 2008). Por exemplo, a presença de metástase nos linfonodos axilares é um fator negativo no prognóstico de câncer de mama. Todavia, entre 20 e 30% das pacientes que não apresentam linfonodos metastáticos, também desenvolvem a doença em sítios distantes, indicando, então, que outras formas de disseminação das células tumorais também exercem um papel importante (BRAUN et al., 2001B e 2003; PANTEL et al., 2003) (Fig 2). Neste contexto, há uma real necessidade de se identificar novos e mais acurados fatores prognósticos. Revisão da Literatura | 4 FIGURA 2. Modelos da cascata metastática. As células tumorais podem disseminar do sítio primário através da via linfática (setas vermelhas) ou pela via hematogênica (setas azuis). No primeiro modelo (disseminação linfática), as células tumorais disseminadas proliferam nos linfonodos e formam metástases sólidas. Em estágios mais avançados, estas células tumorais saem dos linfonodos e estabelecem metástases secundárias distantes. No segundo modelo, as células tumorais disseminam primeiramente pela via hematogênica e estabelecem metástases distantes. Isto ocorre em pacientes que desenvolvem metástases distantes, mas nos quais os linfonodos não apresentam células tumorais, como nas pacientes com câncer de mama. A disseminação hematogênica parece se iniciar em estágios iniciais da progressão tumoral (PANTEL & BRAKENHOFF, 2004). Revisão da Literatura | 5 2. Revisão da Literatura___________________________________ 2.1. O câncer de mama e a disseminação das células tumorais para a medula óssea. Nos últimos anos, a presença de células tumorais disseminadas (CTD) tem despontado como um possível fator prognóstico de risco. As CTD são definidas como células tumorais isoladas ou pequenos clusters de células que podem ser detectadas nos linfonodos regionais, no sangue periférico (também referidas como células tumorais circulantes), ou em órgãos distantes do tumor primário. Estas células têm sido controversamente descritas como micrometástases. No entanto, as micrometástases se referem a um pequeno grupo de células tumorais derivadas das CTD, que conseguiram crescer no órgão secundário, mas que é muito pequeno para ser detectado pelos métodos disponíveis (revisado em PANTEL & BRAKENHOFF, 2004; revisado em AGUIRRE-GHISO, 2007). Os avanços no desenvolvimento de ensaios imunocitoquímicos e moleculares possibilitaram a detecção específica das CTD, permitindo melhor investigar a questão da disseminação das células tumorais como uma etapa inicial e crucial na cascata metastática (revisado em VINCENT-SALOMON et al., 2008). Para tumores epiteliais, as citoqueratinas mostraram-se, até o momento, os melhores marcadores para identificar as CTD, sendo a medula óssea (MO) o principal local onde essas CTD foram encontradas (BRAUN et al, 2000). As CTD estão presentes na MO de 20 a 40% dos pacientes com variados tumores epiteliais (como carcinoma de mama, próstata, cólon ou pulmão), mesmo na ausência de metástase nos linfonodos ou de sinais clínicos detectáveis de metástases distantes. (BRAUN et al., 2000 e 2001C; PANTEL, 1996; PANTEL et al., 1996 e 2003). Revisão da Literatura | 6 No caso específico do câncer de mama, o estudo realizado por Braun e colaboradores no ano de 2005 mostrou que para pacientes nos estágios I-III da doença, ou seja, em estágios iniciais da doença, a presença de CTD na MO, no momento do diagnóstico inicial, é um fator prognóstico desfavorável independente. Este resultado foi obtido mediante análise de dados compilados de 4703 pacientes com câncer de mama que participaram de 9 estudos clínicos diferentes, onde não se conseguiu identificar um subgrupo de pacientes nos quais a presença de CTD na MO tenha se mostrado irrelevante para o prognóstico (BRAUN et al., 2005). FIGURA 3. Curva de sobrevida de pacientes com câncer de mama pós-cirurgia de acordo com a presença ou não de células tumorais disseminadas nos linfonodos ou MO. Pacientes em que não se encontrou CTD apresentaram a curva de sobrevida mais favorável, em contraste com aqueles em que as CTD foram encontradas em ambos os órgãos. As curva de sobrevida de pacientes que apresentaram CTD ou nos linfonodos ou na MO foi semelhante (BRAUN et al., 2000). A disseminação de células tumorais é um evento que ocorre em estágios iniciais da doença e diversos grupos têm demonstrado a importância de se identificar CTD na MO de pacientes com câncer de mama para o prognóstico da doença Revisão da Literatura | 7 (SCHLIMOK et al., 1987; BRAUN et al., 2000, 2001A, 2001D, 2003 e 2005; PANTEL et al., 2003; THURM et al., 2003; BIDARD et al., 2008) e, consequentemente, para a escolha do tratamento mais adequado (GOLDHIRSCH et al., 2003). A despeito dessas informações, as técnicas de detecção de CTD na MO não estão ainda implementadas na rotina clínica e nenhum consenso internacional as recomendou como um protocolo padrão (revisado em FEHM et al., 2006). Entretanto, o estabelecimento desta técnica na prática clínica só será de grande valia se a biologia das CTD puder ser melhor compreendia e, então, a intervenção terapêutica maisadequada para a paciente puder ser melhor definida. A elucidação dos mecanismos que controlam a disseminação de células tumorais abriria uma brecha para a tentativa de uma intervenção terapêutica direcionada, impedindo que essas células colonizem a MO, o que preveniria a recidiva da doença. Por outro lado, para pacientes que já apresentem CTD na MO, conhecer as relações que as CTD estabelecem no microambiente da MO poderia revelar uma forma eficiente de eliminar essas células e, mais uma vez, impedir a progressão da doença (revisado em PANTEL & BRAKENHOFF, 2004; revisado em ZLOTNIK, 2006; revisado em AGUIRRE-GHISO, 2007). 2.2 . Mecanismos relacionados com a disseminação de células tumorais. Os mecanismos moleculares e celulares que dão suporte para as diferentes formas de disseminação das células tumorais são assunto de constantes debates e de intenso empenho em pesquisas, uma vez que possuem implicações importantes na capacidade de predizer, identificar e erradicar a doença metastática (revisado em ECCLES & PAON, 2005). Embora inúmeras moléculas tenham sido implicadas na disseminação das células tumorais, os mecanismos precisos que determinam a Revisão da Literatura | 8 migração e a invasão direcionadas em órgãos específicos ainda precisam ser estabelecidos (MÜLLER et al., 2001 ; WANG et al., 2008). As quimiocinas são polipeptídios quimioatratores caracterizados por sua capacidade de induzir a migração direcional e a ativação dos leucócitos, regulando processos como adesão, tráfego e homing, além de contribuírem para a linfopoese e hematopoese (GUNN et al., 1999; revisado em CYSTER, 1999). Resultados de estudos recentes indicam que as células tumorais podem se valer de mecanismos mediados por quimiocinas, similares aos utilizados por leucócitos, durante seu processo de disseminação (KOSHIBA et al., 2000; SCOTTON et al., 2001; TAICHMAN et al., 2002). As quimiocinas são produzidas por variados tipos celulares, de origem hematopoetica ou não, e se ligam e ativam receptores da superfície celular do tipo serpentina, acoplados a proteína G (revisado em MURPHY et al. 2000 ). O receptor CXCR4 é um dos receptores de quimiocina mais bem estudados, em parte, devido ao seu papel como um co-receptor para entrada do vírus da imunodeficiência humana (HIV, Human Immunodeficiency Virus) e, também, por ser o receptor de quimiocina mais expresso em células tumorais (revisado em ZLOTNIK, 2006; revisado em BUSILLO & BENOVIC, 2007). O receptor CXCR4 interage com a quimiocina CXCL12, também conhecida como fator -1 derivado de células do estroma (SDF-1, Stromal Cell-Derived Factor 1) (revisado em BUSILLO & BENOVIC, 2007). Esta quimiocina foi originalmente descrita como um fator de crescimento para células pré-B, produzido pelas células do estroma da MO (NAGASAWA et al., 1996; MA et al., 1998). No entanto, ela também está relacionada ao homing e a retenção de células progenitoras hematopoéticas CD34+ na MO e na migração transendotelial de leucócitos Revisão da Literatura | 9 (GRABOVSKY et al., 2000; revisado em PAPAYANNOPOULOU, 2004). Foi verificado que a expressão de CXCL12 é capaz de promover a progressão do câncer de mama mediante a estimulação do crescimento tumoral e do recrutamento de progenitores de células endoteliais, necessários para a angiogênese tumoral. Além disso, os fibroblastos associados ao carcinoma, mas não os fibroblastos mamários normais, expressam altos níveis de CXCL12 que, aparentemente, podem promover a progressão tumoral de forma parácrina (ALLINEN et al., 2004; ORIMO et al., 2005) (Fig. 4). FIGURA 4. Importância do receptor CXCR4 e seu ligante CXCL12 no microambiente tumoral e na metástase. Em áreas hipóxicas do tumor, tanto a secreção de CXCL12 pelos fibroblastos associados ao tumor quanto a expressão de CXCR4 pelas células tumorais aumenta, o que estimula a motilidade e a invasão. CXCL12 promove o crescimento tumoral de forma parácrina através do estimulo de CXCR4 presente nas células tumorais ou através do recrutamento de progenitores endoteliais que favorecem a angiogênese. A metástase direcionada para a MO ou outros locais com elevada expressão de CXCL12 envolve a ativação de CXCR4 em células tumorais circulantes, que são atraídas pelo gradiente de CXCL12 (BURGER & KIPPS, 2006). Revisão da Literatura | 10 Entretanto, o papel de CXCL12 e de seu receptor CXCR4, como mediadores da disseminação das células do câncer de mama, ainda é pouco conhecido. Informações relevantes sobre esta interação foram fornecidas pelo trabalho de Müller e colaboradores, em 2001, o qual mostrou que as células tumorais de câncer de mama, em contraste com células do tecido mamário normal, expressam o receptor CXCR4. Os autores verificaram que a sinalização mediada por este receptor é capaz de induzir a formação de pseudópodos em células de câncer de mama, além de induzir resposta quimiotática e invasiva in vitro e in vivo (MÜLLER et al., 2001). Outras evidências sugerem, no entanto, que a expressão de CXCR4 em células de câncer de mama não se correlaciona com sua atividade funcional, assim como não condiz com a aquisição de um fenótipo invasivo. Especula-se que, nas células não invasivas que expressam CXCR4, haja uma alteração no acoplamento da proteína G ao receptor de quimiocina e, por conseguinte, estes receptores não são capazes de levar a mobilização de cálcio, ativação de ERK ou migração, em contraste com as células invasivas que tem esta via de sinalização conservada (HOLLAND et al., 2006). De modo interessante, foi verificado que as células B, em seu processo de maturação, perdem progressivamente sua capacidade de responder a CXCL12, mesmo quando a expressão de CXCR4 permanece elevada (FEDYK et al., 1999; HONCZARENKO et al., 1999). A sinalização por CXCR4 ocorre da forma mais eficiente quando estes receptores estão localizados em microdomínios lipídicos da membrana celular (lipid rafts, balsas lipídicas) (MAÑES et al., 2001; NGUYEN & TAUB., 2002 e 2003; WYSOCZYNSKI et al., 2005). O trabalho de Schabath e colaboradores (2005) mostrou que a proteína de superfície celular CD24 é capaz de Revisão da Literatura | 11 reduzir a migração e a sinalização através de CXCR4 em linfócitos pré-B e em células de câncer de mama. A presença de CD24 nas balsas lipídicas altera a localização de CXCR4 que, não se encontrando mais nestes microdomínios de membrana, tem sua sinalização através da fosforilação de ERK1/2 prejudicada (SCHABATH et al., 2006). Portanto, a proteína CD24 pode ser um elemento importante para a compreensão da relevância de CXCR4 no processo de disseminação de células tumorais (Fig. 5). FIGURA 5. Modelo da atividade de CD24 e função de CXCR4. Em células negativas ou com baixa expressão de CD24, o receptor CXCR4 encontra-se localizado preferencialmente em balsas lipídicas. Como resultado, a sinalização de CXCR4 em resposta a CXCL12 (SDF- 1) ativa a motilidade celular através da fosforilação de ERK. Em células positivas para CD24, o receptor CXCR4 é excluído das balsas lipídicas e é incapaz de desencadear sinalização em resposta a CXCL12. Isto previne a fosforilação de ERK e bloqueia a motilidade celular e atenua o crescimento tumoral (SCHABATH et al., 2006). A expressão de CXCR4 em células tumorais tem sido associada com um pior prognóstico em pacientes com câncer de mama (LI et al., 2004) e acredita-se que este receptor possa direcionar estas células tumorais para tecidos e órgãos ricos em CXCL12, como a MO (MÜLLER et al., 2001), que representariam o nicho no qual estas células irão se alojar (revisado em EPSTEIN, 2004). Os trabalhos supracitados reforçam a ideia de que as células tumorais não migram aleatoriamente e que, no caso do câncer de mama, o eixo CXCL12/CXCR4 deva ser mais bem investigado, Crescimento tumoral atenuado Redução da capacidade demigração CD24-/Low CD24+ Revisão da Literatura | 12 uma vez que ele tem despontado como um possível alvo de intervenção terapêutica (revisado em ROSSI & ZLOTNIK, 2000; MÜLLER et al., 2001; ZLOTNIK, 2008). Contudo, durante muitos anos, assumiu-se que havia uma relação monogâmica entre CXCR4 e CXCL12, uma vez que a deleção genética de CXCR4 ou de CXCL12 ocasionava um fenótipo similar em embriões de camundongos, caracterizado pelo defeito na linfopoese e mielopoese, vasculatura defeituosa e desenvolvimento anormal do cérebro e coração, acarretando a morte perinatal (NAGASAWA et al., 1996; ZOU et al., 1998). Em 2005, o trabalho de Balabanian e colaboradores identificou outro receptor ao qual CXCL12 era capaz de se ligar (BALABANIAN et al., 2005). Este receptor era até então denominado RDC1, mas já se sabia que, assim como CXCR4, ele era um co-receptor para a entrada do HIV em células T CD4+. Além disso, seu gene está localizado no mesmo cromossoma de CXCR4 (SHIMIZU et al, 2000). Estas e outras evidências despertaram a ideia de que RDC1 possuía muitas similaridades com receptores de quimiocinas e, a partir do trabalho de Balabanian e colaboradores, RDC1 foi renomeado CXCR7, o segundo receptor para CXCL12 que, diferentemente de CXCR4, também interage com a quimiocina CXCL11 (BALABANIAN et al., 2005). Assim como CXCR4, o papel de CXCR7 no desenvolvimento tumoral tem sido amplamente investigado. Linhagens humanas de células tumorais expressam CXCR7, assim como células de tumores primários de variados tipos de cânceres, como, próstata, pulmão, renal e melanoma (BURNS et al., 2006; MIAO et al., 2007; WANG et al., 2008). Em dois trabalhos distintos, verificou-se que a transfecção de células tumorais com CXCR7 conduziu ao aumento da taxa de proliferação celular, a uma menor fração de células apoptóticas e também ao aumento da capacidade de adesão às Revisão da Literatura | 13 células endoteliais (BURNS et al., 2006; WANG et al., 2008). Wang e colaboradores também constataram que a superexpressão de CXCR7 em células de linhagens humanas de câncer de próstata aumentou a capacidade de invasão destas células em modelos in vitro. Além disso, os autores observaram que CXCR7 é capaz de alterar a expressão de várias moléculas relacionadas à progressão tumoral como fibronectina, caderina 11, CD44, metaloproteases (MMP3, MMP10, MMP11) e fatores pró-angiogênicos (IL-8 e VEGF) (WANG et al., 2008). A sinalização mediada por CXCR7 é um dos aspectos deste receptor que carece de mais estudos. Alguns trabalhos têm demonstrado que a ativação de CXCR7 por CXCL12 não acarreta o influxo de íons cálcio, ou seja, não há ativação da proteína G (BURNS et al. 2006; MIAO et al, 2007; SIERRO et al., 2007; LEVOYE et al., 2009; RAJAGOPAL et al., 2010). Por outro lado, foi mostrado que CXCR7 pode sinalizar através da via não clássica de -arrestina. A -arrestina foi inicialmente descrita como uma proteína reguladora negativa da sinalização mediada por proteína G em receptores do tipo serpentina, mas, subsequentemente, foi descoberto que ela também era capaz de regular positivamente a sinalização celular (ZABEL et al., 2009; RAJAGOPAL et al., 2010). Segundo o trabalho de Zabel e colaboradores (2009), a sinalização através de CXCR7 não é relevante para a migração das células tumorais em ensaios de quimiotaxia in vitro, porém este receptor exerce um papel essencial na migração transendotelial das células CXCR4+CXCR7+, mediada pela sinalização CXCL12/CXCR4, indicando, então, que este receptor possa atuar direcionando a metástase e a invasão tecidual das células tumorais (ZABEL et al., 2009) . Em concordância com o trabalho supracitado, foi verificado, em um modelo murino de reparo de lesão renal aguda por injeção de progenitores de células renais, Revisão da Literatura | 14 que CXCR4 mostrou-se necessário para a migração destes progenitores, enquanto CXCR7 mostrou-se essencial na adesão às células endoteliais durante o processo de transmigração e, também, na sobrevivência destes progenitores (MAZZINGHI et al., 2008). Estes trabalhos fornecem, então, evidências de que CXCR4 e CXCR7 possam exercer papéis essenciais, porém diferentes, mediante a sinalização por CXCL12. Levoye e colaboradores também investigaram a possível cooperação entre CXCR4 e CXCR7 em resposta a CXCL12. Eles observaram que, quando CXCR4 e CXCR7 são coexpressos, eles são capazes de formar heterodímeros, de modo tão eficiente quanto de formar homodímeros. A formação do heterodímero induz o rearranjo conformacional do complexo formado por CXCR4 e G (subunidade da proteína G), prejudicando a capacidade de CXCR4 de ativar a proteína G, após a interação com CXCL12 (LEVOYE et al., 2009). Entretanto, até o momento, ainda pouco se sabe a respeito da interação e regulação mútua entre CXCL12, CXCR4 e CXCR7, assim como as similaridades e diferenças entre CXCR4 e CXCR7 em termos de estrutura e função (MAZZINGHI et al., 2008; revisado em THELEN & THELEN, 2008; LEVOYE et al., 2009; ZABEL et al., 2009). Além disso, os estudos investigando uma correlação entre a expressão de CXCR4 e CXCR7 e o risco de disseminação de células tumorais são escassos e muito recentes (BURNS et al., 2006; MIAO et al., 2007; WANG et al., 2008). 2.3. As hipóteses da heterogeneidade tumoral Uma característica que todos os cânceres possuem em comum é uma evidente variabilidade entre as células tumorais de um mesmo tumor. Estas células diferem em características como tamanho, morfologia, expressão de antígenos e Revisão da Literatura | 15 composição da membrana celular, assim como em comportamentos como taxa de proliferação, interações célula-célula, predisposição para metástase e sensibilidade à quimioterapia (revisado em HEPPNER, 1984; AXELSON et al., 2005). As duas ideias que se propõem a descrever o estabelecimento e a manutenção desta heterogeneidade tumoral são o modelo da evolução clonal e a hipótese da célula tronco do câncer (CSC, Cancer Stem Cells) (revisado em CAMPBELL & POLYAK, 2007). O modelo da evolução clonal foi proposto em 1976 por Peter Nowell. Ele observou que os tumores geralmente perdiam sua capacidade de diferenciação à medida que progrediam, e interpretou esta perda de funções especializadas como uma forma do tumor maximizar sua proliferação e invasividade (NOWELL et al., 1976). Este modelo estabelece, então, que a iniciação do tumor ocorre a partir de uma única célula aleatória que sofre múltiplas mutações, o que lhe confere vantagem no crescimento em relação às células normais adjacentes. À medida que o tumor progride, a instabilidade genética e a proliferação descontrolada possibilitam a produção de células com mutações adicionais. Esta derivação genética, juntamente com o processo de seleção dos mais adaptados, ocasiona que as células mais agressivas geradas conduzem a progressão tumoral. Desta forma, novas subpopulações de células são geradas enquanto outras subpopulações podem reduzir, resultando na heterogeneidade tumoral. Mediante este processo, que ocorre ao longo da vida do tumor, qualquer célula tumoral poderia potencialmente torna-se invasiva e causar metástase ou tornar-se resistente à terapia e acarretar a recaída da doença (NOWELL, 1976; revisado em HEPPNER, 1984) (Fig. 6A). Revisão da Literatura | 16 Por sua vez, a hipótese da CSC pressupõe que um subgrupo de células tumorais com propriedades de células tronco, denominadas CSC, conduz a iniciação, a progressão e a recorrência dos tumores. Por definição, estas células possuem a habilidade de se autorrenovar indefinidamente e de se diferenciar, mesmas características das células tronco adultas. A sua autorrenovação e diferenciação conduzem ao surgimento dos diferentes tipos celulares de um tumor, desencadeando, então, a heterogeneidade tumoral. No entanto, as demais célulasdo tumor não possuiriam esta capacidade de autorrenovação e também não seriam capazes de se diferenciar e produzir todos os tipos celulares do tumor. Acredita-se que as CSC ou se originem de células tronco normais do tecido, ou sejam células tumorais que adquiriram propriedades de células tronco. Também segundo está hipótese, as CSC se manteriam como uma pequena fração das células do tumor e a progressão tumoral seria o resultado da disseminação destas células enquanto a recorrência do câncer seria causada pela resistência delas à terapia (revisado em REYA et al., 2001; POLYAK & HAHN, 2006)(Fig. 6B). FIGURA 6. Dois modelos da heterogeneidade em tumores sólidos. (a) As células tumorais são heterogêneas, mas a maioria é capaz de proliferar amplamente e formar novos tumores. (b) As células tumorais são heterogêneas, mas somente as CSC são capazes de proliferar amplamente e de gerar novos tumores (REYA et al., 2001). Revisão da Literatura | 17 Apesar de esta hipótese ter sido proposta há mais de 1 século pelo patologista alemão Rudolph Virchow, a maioria das evidências que a suportam foram geradas recentemente (revisado em HUNTLY & GILLILAND, 2004). As células com propriedades de CSC foram identificadas primeiramente em 1997, quando Bonnet e Dick mostraram que uma pequena população de células oriundas de leucemia mielóide aguda humana, que expressavam algumas móleculas de superfície celular associados com células tronco hematopoéticas normais, eram capazes de iniciar a leucemia em camundongos NOD/SCID, diferentemente das demais células (BONNET & DICK, 1997). Este mesmo princípio tem sido utilizado para identificar as CSC em tumores sólidos (revisado em REYA et al., 2001; AL- HAJJ et al., 2003; SINGH et al., 2004 ; revisado em JORDAN et al., 2004; RICCI- VITIANI et al., 2007). Em 2003, Al-Hajj e colaboradores utilizaram a molécula CD44, um marcador associado com células tronco normais da mama (STINGL et al., 1998 e 2001; GUDJONSSON et al., 2002) , para identificar células tronco do câncer de mama. Os autores mostraram que células com fenótipo CD44+CD24-/Low, isoladas de efusões pleurais de pacientes com câncer de mama, eram capazes de gerar tumores em camundongos imunodeficientes, e as células presentes nestes tumores eram similares às encontradas nas amostras do carcinoma original, ou seja, esta subpopulação tumorigênica foi capaz de gerar as demais subpopulações do tumor. Em contrapartida, as células CD44-CD24+ não foram capazes de originar tumores, levando os autores a proporem que a fração CD44+CD24-/Low seria, então, representativa das CSC do câncer de mama (AL-HAJJ et al., 2003). Trabalhos subsequentes confirmaram que as células CD44+CD24-/Low são tumorigênicas Revisão da Literatura | 18 quando injetadas em camundongos imunodeficientes e que possuem propriedades semelhantes as de células tronco ( PATRAWALA et al., 2005; PONTI et al., 2005). Entretanto, ao se investigar a prevalência das células CD44+CD24-/Low em tumores de mama e o seu valor prognóstico, a visão de que esta fração representaria as CSC do câncer de mama começou a se modificar. Foi demonstrado que, em amostras de tecido de carcinoma de mama, o percentual de células CD44+CD24-/Low é altamente variável (entre 0-80%) e que o tamanho desta fração não influência o tempo de sobrevida da paciente. Verificou-se também que, pacientes com tumores com elevados percentuais de células CD44+CD24-/Low e que apresentaram recaída da doença, foram mais susceptíveis à metástase distante, preferencialmente a metástase óssea (ABRAHAM et al., 2005). Em concordância com este resultado, o trabalho de Balic e colaboradores (2006) mostrou pela primeira vez que, entre as CTD de câncer de mama presentes na MO de pacientes em estágios iniciais da doença, foi possível identificar células CD44+CD24-/Low, o proposto fenótipo de CSC do câncer de mama (BALIC et al., 2006). Estes 2 resultados sugerem que, independentemente desta fração representar as CSC, estas células apresentam a capacidade de se disseminar pelo organismo e de se alojar em locais distantes. Utilizando o modelo de xenoenxerto para testar a capacidade tumorigênica de células de melanoma humano em camundongos imunodeficientes, Quintana e colaboradores verificaram que, mediante algumas modificações metodológicas que favorecem o crescimento celular, a capacidade tumorigênica destas células pôde ser optimizada (QUINTANA et al., 2008). Em virtude de uma imunocompetência residual nos animais utilizados em modelos de xenoenxerto e do veículo no qual estas células são inoculadas, a proporção das células capazes de gerar tumor, Revisão da Literatura | 19 denominadas CSC, pode estar sendo subestimada (KELLY et al., 2007; QUINTANA et al., 2008), o que aumenta a discussão acerca da identidade das CSC. A transição epitélio-mesenquimal (EMT, Epithelial Mesenchymal Transition) é um fenômeno fisiológico que ocorre durante determinadas fases do desenvolvimento embrionário, através do qual células epiteliais diferenciadas transformam-se em células mesenquimais. Este processo é caracterizado pela perda de proteínas de junções celulares (como E-caderinas, proteínas de junções aderentes e oclusivas e proteínas desmossomais) e pelo ganho de motilidade celular, expressão de N- caderina e da caderina-11 e pela presença de um filamento intermediário rico em vimentina (revisado em THIERY & SLEEMAN, 2006). As células tumorais de origem epitelial podem sofrer transformações que as conduzem a um fenótipo mesenquimal, tendo como principal característica, a aquisição da capacidade de invasão e migração e, por isso, este fenótipo tem sido implicado na disseminação de células de tumores epiteliais. Uma vez que este processo apresenta similaridades com o fenômeno fisiológico supracitado, o mesmo também tem sido denominado EMT (revisado em YANG & WEINBERG, 2008). Trabalhos recentes têm demonstrado que células tumorais, que passaram pelo processo de EMT, compartilham diversas características com as supostas CSC (MANI et al., 2008; MOREL et al., 2008; BLICK et al., 2008), sugerindo que estas supostas CSC possam, na verdade, representar células que sofreram EMT (MANI et al., 2008). Revisão da Literatura | 20 FIGURA 7. Dois modelos que explicam a presença de CSC com potencial metastático em tumores de mama. Acredita-se que as CSC intrínsecas existam no tumor primário desde os estágios iniciais da tumorigênese. Por sua vez, as CSC induzidas surgiriam como consequência da EMT. Neste caso, células do carcinoma recrutam inicialmente variadas células estromais como fibroblastos, miofibroblastos, granulócitos, macrófagos, células mesenquimais e linfócitos. Juntas estas células criam um microambiente reativo que libera fatores (como Wnt, TGF e FGF) que levam as células tumorais vizinhas a sofrerem EMT e adquirirem características semelhantes à de CSC (CHAFFER & WEINBERG, 2011). 2.4. O modelo de estudo do câncer de mama A glândula mamária é composta por uma combinação de múltiplos tipos celulares que juntos formam uma complexa rede de interações necessárias ao adequado desenvolvimento e funcionamento do órgão. Os ductos lactíferos ramificados são formados por uma camada externa de células mioepiteliais que produzem a membrana basal e por uma camada interna de células epiteliais, que produzem leite durante a lactação. Os dutos são circundados pelo microambiente composto pela matriz extracelular (MEC) e várias células estromais como células endoteliais, fibroblastos, miofibroblastos e leucócitos. Inúmeras evidências sugerem que as interações célula-célula e célula-microambiente modificam a capacidade de proliferação, sobrevivência, polaridade, diferenciação e invasividade das células epiteliais mamárias. Uma ampla caracterização e compreensão de cada tipo celular Revisão da Literatura | 21 que compõe otecido mamário é essencial para aumentar nosso conhecimento acerca das funções exercidas por estas células no funcionamento da glândula mamária normal e no processo de tumorigênese da mama (POLYAK & KALLURI, 2010). Apesar da complexidade do microambiente da glândula mamária e de seu processo de tumorigênese, a grande maioria dos trabalhos in vitro, relacionados ao câncer de mama, utiliza como modelo de estudo as diversas linhagens humanas de câncer de mama que foram estabelecidas ao longo dos anos. Estas linhagens representam populações heterogêneas de células tumorais que se adaptaram as condições de cultura in vitro. Através do padrão de expressão gênica destas linhagens, foi verificado que é possível distingui-las entre os subtipos Luminal, Basal A e Basal B, sugerindo que, apesar delas terem adquirido a habilidade de crescer in vitro, elas permanecem com as características fenotípicas e genotípicas do tumor primário do qual derivaram (revisado em LACROIX & LECLERCQ, 2004; NEVE et al., 2006). Fillmore e Kuperwasser verificaram que linhagens de câncer de mama também possuem células com o fenótipo CD44+CD24- e que estas células apresentam as características das supostas CSC, o que validaria a utilização das mesmas para estudos de CSC (FILLMORE & KUPERWASSER, 2008). Também em consonância com a hipótese de CSC, alguns trabalhos tem demonstrado a interconversão entre os fenótipos CD44+CD24- e CD44-CD24+, ou seja, que uma subpopulação estaria originando a outra (HWANG-VERSLUES et al., 2009; BLICK et al., 2010). No entanto, em outros trabalhos em que se utilizaram linhagens de câncer de mama, foi verificado que as células CD44+CD24- e CD44-CD24+ correlacionam-se aos fenótipos basal e luminal, respectivamente (HONETH et al., 2008; SHERIDAN et Revisão da Literatura | 22 al., 2006; FILLMORE & KUPERWASSER, 2008). Portanto, estes resultados suscitam questionamentos sobre o processo biológico envolvido nesta interconversão de fenótipos, bem como sobre a relevância destes fenótipos na classificação dos tumores. Foi verificado ainda que as células tumorais de câncer de mama com fenótipo CD44+CD24- apresentam maior expressão de genes pró-invasivos e que também possuem a capacidade de invasão em modelos in vitro (SHERIDAN et al., 2006; SHIPITSIN et al., 2007). A molécula CD44, cuja presença parece estar relacionada a progressão tumoral, é uma glicoproteína transmembranar receptora, capaz de se ligar ao ácido hialurônico (HA, hyaluronic acid) presente na MEC, o que desencadeia a sinalização intracelular. Foi verificado que, em linhagens de câncer de mama, CD44 está envolvido na capacidade de adesão, motilidade e invasão destas células (AFIFY et al., 2009). O trabalho de Avigdor e colaboradores (2004) mostrou que CD44 e o HA cooperam com CXCL12 no tráfego de progenitores hematopoéticos para a MO. Esta cooperação ocorre na medida em que CXCL12 estimula a adesão dos progenitores ao HA e a formação de protrusões, em cujas extremidades CD44 se localiza (AVIGDOR et al., 2004). Entretanto, no caso do câncer de mama, ainda se desconhece a existência de uma correlação entre a presença de CD44 e de CXCR4 e um aumento da capacidade invasiva das células tumorais, ou se há um crosstalk entre estes receptores. Como mencionado, a superexpressão de CXCR7 em células de linhagens humanas de câncer de próstata acarreta o aumento da expressão de CD44 e também da capacidade invasiva (WANG et al., 2008), figurando como um indício de que possa existir uma correlação entre CD44, os receptores de quimiocina e o aumento da invasividade das células tumorais. Revisão da Literatura | 23 Apesar de inúmeros grupos que trabalham com câncer de mama terem se proposto a estudar estas subpopulações celulares no contexto de CSC, pouco ainda se sabe sobre diversos comportamentos biológicos destas células. Uma vez que as linhagens de câncer de mama mostraram-se representativas do tumor de origem, e que foi possível selecionar a suposta população de CSC, estas linhagens figuram como uma ferramenta interessante para melhor compreender características destas subpopulações, como a expressão e função de receptores de quimiocinas implicados na capacidade metastática das células tumorais, bem como se a subpopulação CD44+CD24- representa de fato células com propriedades de CSC. Objetivos | 24 3. Objetivos_____________________________________________ 3.1. Objetivo Geral Investigar propriedades biológicas de linhagens celulares de câncer de mama humano com características de células-tronco do câncer e mecanismos envolvidos na migração para a medula óssea. 3.2. Objetivos Específicos - Caracterizar fenotipicamente as linhagens de câncer de mama humano MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 e T-47D quanto à expressão das moléculas CD44 e CD24. - Selecionar e caracterizar as subpopulações da linhagem de câncer de mama T-47D de acordo com o fenótipo CD44 e CD24. - Investigar a capacidade de invasão das subpopulações selecionadas em modelo de esferoide que mimetiza o nicho subendosteal ou em esferoides simples de fibroblasto de pele. - Investigar a capacidade de migração das subpopulações selecionadas em sistema Transwell, em resposta a fatores secretados pelas células mesenquimais derivadas do estroma da medula óssea. - Investigar, nas linhagens de câncer de mama, a expressão de receptores CXCR4 e CXCR7. Materiais e Métodos| 25 4. Materiais e Métodos______________________________________ 4.1. Células e Amostras. As linhagens de fibroblasto de pele humana (FPH - código CRL-2088) e de carcinoma de mama humano MCF-7 e MDA-MB-468 foram fornecidas pelo Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). As linhagens de câncer de mama MDA-MB-231 e T-47D foram gentilmente cedidas pelo Professor Dr. Roger Chammas, Faculdade de Medicina, USP. A classificação destas linhagens é apresentada na tabela 3. As linhagens de câncer de mama foram mantidas em meio de cultura IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, LGC, São Paulo, SP, Brasil) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB, Cultilab, Campinas, SP, Brasil) e antibióticos (Penicilina G sódica 100 U/ml e Estreptomicina 100 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). A linhagem de FPH foi mantida em meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium- Low Glucose, LGC, São Paulo, SP, Brasil) suplementado com 10% de SFB e antibióticos. Todas as linhagens foram incubadas a 37ºC com 5% de CO2. Amostras de medula óssea foram obtidas a partir de aspirados da crista ilíaca de doadores voluntários da Unidade de Transplante de Medula Óssea, afiliada ao Serviço de Hematologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF- UFRJ). A utilização das amostras foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HUCFF-UFRJ, estando o projeto cadastrado sob as seguintes numerações: CIC: 066/02 e CEP: 022/02. Uma exceção à necessidade do termo de consentimento foi aprovada pela Comissão de Investigação Científica (CIC) do Materiais e Métodos| 26 HUCFF, uma vez que os dados foram analisados de forma anônima e foram derivados de amostras descartadas. 4.2. Animais. Foram utilizadas 12 fêmeas de camundongos atímicos BALB/c nu/nu (Nude) com idade de 8 semanas obtidos e mantidos no Biotério de Experimentação do Laboratório de Oncologia, da Faculdade de Medicina da USP. Os animais foram mantidos em temperatura controlada entre 20 a 25ºC, com água e ração estéreis ad libitum e com ciclo de luz de 12 horas. Todos os procedimentos foram realizados em colaboração com o Prof. Dr. Roger Chammas, no Laboratório de Oncologia Experimental da Faculdade de Medicina da USP, de acordo com as normas éticas estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e aprovados pelo Comitê de Ética em ExperimentaçãoAnimal da Faculdade de Medicina da USP, estando o projeto cadastrado sob o nº: 0995/09. 4.3. Anticorpos. Os anticorpos utilizados para citometria de fluxo foram: camundongo anti- CD24 humano conjugado ao fluorocromo PE (Clone ML5, Caltag-Medsystems Ltd., Buckingham, Buckinghamshire, Reino Unido), rato anti-CD44 humano/camundongo conjugado ao fluorocromo APC (Clone IM7, eBiosciences Incorporated, San Diego, CA, EUA), camundongo anti-pan-citoqueratina humana conjugado ao fluorocromo FITC (Clone C-11, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA ) camundongo anti-CXCR7 humano/camundongo biotinilado (Clone 8F11-M16) e camundongo anti-CXCR4 humano conjugado ao fluorocromo APC (Clone 12G5), ambos da BioLegend, San Diego, CA, EUA. A estreptavidina conjugada ao fluorocromo PE (Caltag Lab. Invitrogen, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA) foi utilizada para revelar o Materiais e Métodos| 27 anticorpo biotinilado. O anticorpo IgG1 de camundongo conjugado ao fluorocromo FITC (Clone MOPC-21, BD Pharmingen, San Diego CA, EUA) foi utilizado como isotipo controle do anticorpo anti-pan-citoqueratina humana conjugado ao fluorocromo FITC. Os anticorpos utilizados para imunohistoquímica estão listados na tabela 1. TABELA 1. Características dos anticorpos utilizados em imunohistoquímica. Anticorpos primários Tipo Clone Fabricante Anti-Calponina Camundongo IgG1/k CALP Cell Marque, Rocklin, CA, EUA Anti-CD24 Rato IgG2b M1/69.16.11.HL Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz CA, EUA Anti-Citoqueratina 7 Camundongo IgG1 OV-TL12/13 Biogenex, San Ramon, CA, EUA Anti-Citoqueratina 18 Camundongo IgG1 DC10 Anti-Citoqueratina 19 Camundongo IgG1 RCK108 Anti-Citoqueratinas de alto peso Camundongo IgG1 AE3 Cell Marque, Rocklin, CA, EUA Anti-Pan-Citoqueratinas Camundongo IgG1 AE1 & AE3* Anti-p63 Camundongo IgG2a/k 4A4 Anti-Receptor de estrogênio Coelho IgG SP1 *AE1 reconhece citoqueratinas de baixo peso molecular e AE3 reconhece citoqueratinas de alto peso molecular 4.4. Isolamento de células mesenquimais do estroma da medula óssea. A obtenção das células foi feita mediante a lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS, phosphate buffered saline) das bolsas de coleta de medula óssea, após a transferência dos aspirados para as bolsas de infusão. As Materiais e Métodos| 28 células estromais mesenquimais multipotentes (MSC, Mesenchymal Stromal Cells) derivadas da MO foram obtidas seguindo-se o protocolo descrito de unidade formadora de colônia fibroblastóide (CFU-F, Colony Forming Unit – Fibroblast) (FRIEDENSTEIN et al., 1976). Resumidamente, a hemossedimentação foi realizada diluindo-se os aspirados de medula óssea na proporção 6:1 com Hespan (hidroxietil de amido, McGaw Park, IL, EUA) e, após 30 minutos a temperatura ambiente, o sobrenadante foi coletado e lavado com PBS. Em seguida, 1 x 106 células/ml foram distribuídas em frascos de cultura de 25 cm2 com meio de cultura DMEM suplementado com 10% de SFB e antibióticos e incubadas a 37ºC com 5% de CO2 por 3 a 4 dias. Após este período, as células não aderentes foram removidas mediante a lavagem com PBS, adicionou-se meio de cultura completo e as células aderentes foram novamente incubadas nas condições supracitadas. As células foram mantidas em cultura até atingirem pré-confluência (70% de confluência), quando foram removidas por digestão enzimática com solução de tripsina a 0,125% e ácido etilenodiamino tetra acético (EDTA, Ethylenediamine tetraacetic acid) a 0,78 mM (ambos da Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e expandidas até a quinta passagem. Uma vez que MSC derivadas de diferentes doadores apresentam variações na expressão gênica, mesmo utilizando-se o mesmo protocolo de isolamento (revisado em PHINNEY & PROCKOP, 2007), células obtidas de diversos doadores foram utilizadas nos experimentos, para confirmação dos fenômenos observados. Materiais e Métodos| 29 4.5. Obtenção de meio condicionado de células mesenquimais derivadas do estroma da medula óssea e de fibroblasto de pele humana. As células foram cultivadas rotineiramente em frascos de cultura de 25 cm2 até atingirem de 70% a 80% de confluência. O meio foi então retirado e adicionou-se 10 ml de meio DMEM suplementado com 5% de SFB. Após 7 dias, o meio condicionado da cultura foi coletado e centrifugado a 3000 rpm por 15 minutos para retirar células ou restos celulares. O meio condicionado foi estocado em alíquotas a -20ºC para posterior utilização. 4.6. Cultivo em sistema de cultura tridimensional do tipo Matrigel. Os poços de placas de 48 poços foram recobertos com 100 l de Matrigel (BD MatrigelTM Basement Membrane Matrix, BD Biosciences, Bedford, MA,EUA). A placa foi mantida a 37ºC com 5% de CO2 por 30 minutos para a polimerização do Matrigel. As células tumorais foram ressuspensas em meio IMDM suplementado com 20% SFB e 2% de Matrigel e 2,5 x 104 células em um volume de 200 l foram aplicadas sobre a camada de Matrigel polimerizada. A cultura foi mantida a 37ºC com 5% de CO2 durante 10 dias. As trocas de meio foram realizadas a cada dois dias. Após 10 dias a cultura foi fixada em paraformaldeído (Vetec Química Fina, Duque de Caxias, RJ, Brasil) tamponado a 4%, por 30 minutos. Os poços foram lavados com PBS e, em seguida, as células foram coradas com TO-PRO®-3 (Invitrogen – Molecular Probes, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA ), diluído na proporção 1:1000 em PBS com 0,3% de albumina sérica bovina (BSA, bovine serum albumin, Sigma- Aldrich, St Louis, MO, EUA), por 1 hora a temperatura ambiente (TA). As células foram observadas em microscópio Confocal (LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Jena,TH, Materiais e Métodos| 30 Alemanha) e, para a análise de imagens, foi utilizado o software Zeiss Image Browser (Carl Zeiss, Jena,TH, Alemanha). 4.7. Ensaio de invasão tumoral em modelo de cultura tridimensional do tipo esferoide. Esferoides simples de FPH foram desenvolvidos distribuindo-se 2,5 x 104 células em poços de placa de 96 poços com fundo redondo (em formato de “U”) que foram previamente recobertos com película de agarose a 1% (Invitrogen,) como descrito (KUNZ-SCHUGHART et al., 1999) (Fig. 8B). As células foram incubadas a 37ºC com 5% de CO2 por pelo menos 4 dias. Esferoides multicelulares mistos de MO foram desenvolvidos como descrito (DE BARROS et al., 2010). Resumidamente, MSC de MO na terceira passagem foram induzidas para a linhagem osteogênica durante 7 dias mediante cultivo em meio osteoindutor (PITTENGER et al., 1999) constituído de DMEM suplementado com 10% de SFB, 50 M de ácido ascórbico, 10 mM de -glicerolfosfato, 10-7M de dexametasona (todos da Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e antibióticos. Após este período, 1,25 x 104 células osteoinduzidas foram distribuídas como descrito acima. Após 3 a 4 dias, igual número de MSC não induzidas foi distribuído sobre os esferoides osteinduzidos (Fig. 8A). Materiais e Métodos| 31 FIGURA 8. Esquema ilustrativo de cultivo de esferoides. Em (A) esferoide misto de MO e (B) esferoide simples de FPH. Após a formação dos esferoides, os mesmos foram co-cultivados com 3 x 103 células tumorais previamente marcadas ou não com com 5-(e 6)- carboxifluoresceína diacetato de succinil éster (CFSE, CFDA SE, Invitrogen- Molecular Probes) e mantidos em cultura por até 72 horas (Fig. 9). Após o período de co-cultura, o sobrenadante foi coletado e os esferoides ou foram fixados em paraformaldeído tamponado a 4% para posterior análise morfológica, ou foram lavados vigorosamente com PBS para remover células fracamente aderidas a eles. Os esferoides lavados foram dissociados por digestão enzimática com solução de tripsina-EDTA, associado com dissociação mecânica (pipetagem) para análise por citometria de fluxo. Cada ponto do experimento foi feitoem duplicata, sendo cada duplicata o pool de três esferoides. As células CFSE positivas no sobrenadante e nos esferoides foram avaliadas, e a proporção de células que migrou para o interior do esferoide foi calculada como o percentual do total de células CFSE positivas. Materiais e Métodos| 32 FIGURA 9. Esquema ilustrativo da co-cultura de células tumorais com esferoides. Em (A) co-cultura com esferoide misto de MO e (B) com esferoide simples de FPH. 4.8. Migração de células tumorais em sistema Transwell: ensaio de quimiotaxia. O ensaio de migração foi realizado utilizando-se o sistema Transwell® (Corning Incorporated, Corning, NY, EUA) com membrana de policarbonato de 6.5 mm de diâmetro, 10 m de espessura e poros de 8 m de diâmetro, adaptável ao poço de uma placa de 24 poços (Fig. 10). As linhagens tumorais foram mantidas por 18 horas em meio IMDM com 0,3% de BSA. Após esse período, as células foram removidas dos frascos de cultura mediante a utilização de solução de PBS com EDTA a 2 mM. Foram adicionadas 1 x 105 células num volume de 100 l de meio IMDM com 0,3% de BSA na câmara superior. Previamente, foi adicionado na parte inferior da câmara, 600 l de meio de cultura nas seguintes condições: (i) IMDM com 5 ou 10% de SFB (controle positivo); (ii) IMDM com 10% de meio condicionado de MSC da MO; (iii) IMDM com 10% de meio condicionado de FPH e (iv) IMDM com 0,5% de SFB (controle do meio condicionado). Foram feitas duplicatas das condições controle e triplicatas das condições teste. A placa foi mantida a 37ºC em Materiais e Métodos| 33 5% de CO2 durante 4 horas. Após 4 horas, as membranas foram gentilmente lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído tamponado a 4% durante 30 minutos. As células que não migraram através dos poros da membrana foram retiradas da face superior da membrana com auxílio de um cotonete. Para quantificar as células que migraram e aderiram na face inferior da membrana, estas foram lavadas com água destilada e, em seguida, coradas com solução de cristal violeta (Merck, Darmstadt, HE, Alemanha) a 1% por 10 minutos. Seis campos aleatórios por membrana foram fotografados em microscópio óptico invertido (Axiovert 35 inverted, Carl Zeiss, Oberkochen, BW, Alemanha) equipado com câmera fotográfica digital (AxioCam MRm, Carl Zeiss, Jena,TH, Alemanha ). O resultado foi expresso como média e erro padrão da contagem de células por campo. FIGURA 10. Esquema ilustrativo do ensaio de migração em sistema Transwell®. As células foram plaqueadas no compartimento superior do Insert Transwell, que contém uma membrana com poros de 8 m de diâmetro. Previamente, foi adicionado no compartimento inferior, meio de cultura suplementado com fatores para induzir quimiotaxia. As células responsivas aos fatores quimiotáticos atravessam os microporos da membrana e aderem na face inferior da mesma. Adaptado de http://catalog2.corning.com/Lifesciences/media/pdf/Transwell_InstructionManual.pdf (Março de 2011) Materiais e Métodos| 34 4.9. Marcação das células tumorais com CFSE. Para identificação das células tumorais após co-cultura com os esferoides, as mesmas foram previamente marcadas com CFSE. Após as células terem sido removidas dos frascos de cultura por digestão enzimática com solução de tripsina- EDTA, a suspensão celular foi lavada duas vezes com PBS. A concentração da suspensão celular foi ajustada para 2-5 x 106 células/ml em uma solução de PBS com BSA a 0,1% e CFSE a 10 M. As células foram incubadas por 10 minutos em banho-maria a 37ºC. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS com 10% de SFB, ressuspensas em meio IMDM suplementado com 20% de SFB e aplicadas nos poços de cultura. 4.10. Citometria de Fluxo e Seleção de células (Sorting). Para análise da expressão dos receptores de quimiocina CXCR4 e CXCR7 as suspensões celulares foram obtidas por dissociação com solução de PBS com EDTA a 2 mM. Nos demais casos, as suspensões celulares foram obtidas por digestão enzimática com tripsina-EDTA. As células foram lavadas com PBS contendo 3% de SFB e 0,01% de azida sódica (tampão de FACS) e a marcação de superfície foi realizada incubando-se as células com os anticorpos por 30 min a 4ºC. Para revelar o anticorpo biotinilado, as células incubadas foram lavadas em tampão de FACS e, então, incubadas com estreptoavidina por 25 minutos a 4ºC. Para análise de expressão de antígenos intracelulares, após a marcação de superfície, as células foram fixadas com paraformaldeído tamponado a 1% por 40 minutos a TA ou overnight a 4ºC e permeabilizadas. A permeabilização foi feita como descrito (ROSSI et al., 2001). Resumidamente, após fixação, a suspensão celular foi lavada duas vezes com tampão de FACS e, em seguida, ressuspensa em 1 ml de etanol a 70% Materiais e Métodos| 35 a -20ºC e incubadas por 1 hora no gelo ou overnight a -20ºC. A suspensão celular foi lavada 3 vezes com tampão de FACS e, em seguida, as células foram incubadas com os anticorpos por 30 minutos a 4ºC. A suspensão foi lavada em tampão de FACS e incubada, quando necessário, com estreptoavidina por 25 minutos a 4ºC. As células foram lavadas e ressuspensas em tampão de FACS para aquisição em citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) equipado com software CellQuest Pro (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Para avaliação de invasão em modelo de esferoide, as células foram ressuspensas rigorosamente em 400 l de tampão de FACS e o tempo foi determinado como parâmetro de aquisição. As análises foram realizadas com o programa livre WinMDI 2.9 (http://en.bio-soft.net/other/WinMDI.html) (Obtido em Novembro de 2010). A seleção por citometria de fluxo (cell sorting) foi realizada incubando-se as células com os anticorpos em tampão de FACS sem azida sódica. Antes da aquisição, as células foram filtradas em malha de nylon de 70 m e ressuspensas em PBS contendo 10% de SFB. Em seguida, foram selecionadas em citômetro de fluxo com separador de células (MoFlo High-Performance Cell Sorter, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) da Unidade Multiusuário de Citometria de Fluxo do CCS, UFRJ e análise foi feita com o programa Summit 4.3 (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca). Após a seleção, a pureza das populações foi verificada e dupla seleção foi realizada para atingir, quando necessário, pureza de 99%. Materiais e Métodos| 36 4.11. Isolamento de RNA e reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) A expressão do gene CXCL12 foi avaliada nas populações de MSC e de FPH cultivadas em monocamada. O gene gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), expresso constitutivamente em células humanas, foi utilizado como controle da eficiência da síntese do DNA complementar (cDNA, complementary DNA) (análise qualitativa). Primeiramente, as células foram tratadas com TRIzol® (Invitrogen) para extração de RNA total, de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Para a síntese de cDNA foram utilizados 2 g de RNA total e 0,5 g do iniciador oligo(dT) (Oligo(dT)12-18 Primer, Invitrogen). A mistura foi incubada a 68ºC por 4 minutos. Após este período, adicionou-se ditiotreitol (DTT, Invitrogen) a 0,01 M, uma mistura equimolar de desoxirribonucleotídeos fosfatados (dNTPs) (dNTPs Mix, Invitrogen) a 0,5 mM e 200 U da enzima transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney (M-MLV RT, Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, Invitrogen). A mistura foi incubada sequencialmente a 39ºC e a 90ºC por 2 horas e por 10 minutos, respectivamente, e foi armazenada a -20ºC. O cDNA foi utilizado para amplificação por PCR com os oligonucleotídeos iniciadores específicos descritos na tabela
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