CCS-M-LuizeGoncalvesLima

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Universidade Federal do Rio de Janeiro 
Centro de Ciências da Saúde 
Instituto de Bioquímica Médica 
 
 
 
 
 
LUIZE GONÇALVES LIMA 
 
 
 
MICROVESÍCULAS TUMORAIS: 
Papel na Biologia do Tumor com Ênfase em 
Processos Imunossupressivos 
e Pró-Trombóticos 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
Março de 2008
MICROVESÍCULAS TUMORAIS: 
Papel na Biologia do Tumor com Ênfase em 
Processos Imunossupressivos e Pró-Trombóticos 
 
 
Luize Gonçalves Lima 
 
 
Dissertação submetida ao Instituto de 
Bioquímica Médica - IBqM da 
Universidade Federal do Rio de Janeiro 
- UFRJ, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do grau de 
Mestre em Química Biológica 
 
 
 
 
Orientador: Dr. Robson Q. Monteiro 
Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/CCS/UFRJ 
Co-orientador: Dr. Marcello A. Barcinski 
Professor Titular do Departamento de Parasitologia/ICB/USP 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
Março de 2008 
 iii
Folha de Aprovação 
 
Luize Gonçalves Lima 
 
MICROVESÍCULAS TUMORAIS: papel na biologia do tumor com 
ênfase em processos imunossupressivos e pró-trombóticos 
 
Rio de Janeiro, 07 de março de 2008. 
 
_______________________________________ 
(Dr. Robson de Queiroz Monteiro, Prof. Adjunto do IBqM, UFRJ) 
 
_______________________________________ 
(Dr. Marcello Barcinski, Prof. Titular do Instituto de Ciências Biomédicas, USP) 
 
_______________________________________ 
(Dra. Russolina Benedeta Zingali, Profª. Adjunta do IBqM, UFRJ ) 
 
_______________________________________ 
(Dr. Hugo Caire de Castro Faria Neto, Pesquisador Titular da FIOCRUZ, RJ) 
 
_______________________________________ 
(Dr. Roger Chammas, Prof. Associado da Faculdade de Medicina da USP, SP) 
 
_______________________________________ 
(Dra. Vivian Mary B. D. Rumjanek, Profª. Titular do IBqM, UFRJ) 
 
_______________________________________ 
(Dra. Sandra König, Profª. Adjunta do Instituto de Ciências Biomédicas, UFRJ) 
 iv
 
Ficha Catalográfica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lima, Luize Gonçalves. 
 
Microvesículas tumorais: papel na biologia do tumor com ênfase em 
processos imunossupressivos e pró-trombóticos / Luize Gonçalves 
Lima. – Rio de Janeiro, 2008. 
 
xviii, 120f. 
 
Dissertação (Mestrado em Química Biológica) – Universidade Federal 
do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica – CCS, 2008. 
 
Orientador: Robson de Queiroz Monteiro 
Co-orientador: Marcello André Barcinski 
 
1. Palavras chaves: 
 
I. Monteiro, Robson de Queiroz (Orient.). II. Universidade Federal do 
Rio de Janeiro. Instituto de Bioquímica Médica. III. Título. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 v
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A Bete, 
por me apresentar à carreira científica de maneira tão prazerosa, 
e por me iniciar no “Fantástico Mundo das Microvesículas”, 
dois empreendimentos importantes que me trouxeram até esse momento. 
 vi
Agradecimentos 
 
Gostaria de aproveitar este espaço para agradecer àqueles que foram de 
fundamental importância para a realização deste trabalho, assim como às 
pessoas que contribuíram, de alguma forma, para a minha formação profissional, 
assim como para meu crescimento pessoal. 
Primeiramente, agradeço a esta força superior cósmica, que me guia e que 
me abre portas, e a qual já foi citada por Albert Einstein como “a mais forte 
motivação da pesquisa científica”, por se mostrar sempre presente e por tornar 
impossível duvidar de sua existência. 
Aos meus heróis, meus queridos pais, palavras não são suficientes para 
expressar minha enorme gratidão por todo apoio e por todo suporte físico, 
emocional e afetivo, acompanhados sempre de seu amor incondicional. Obrigada, 
mãe e pai, pela amizade, pela confiança em meus passos e pelo orgulho que 
sentem de minhas conquistas, as quais são sempre comemoradas como se 
fossem suas próprias. 
Por toda sua dedicação e carinho, gostaria de agradecer a minha ‘vó 
Cecília’, que me estimula sempre a correr atrás de meus sonhos. 
Agradeço ainda aos meus irmãos, especialmente a meu eterno ‘maninho’ 
Rafael, assim como às minhas queridas cunhadas, pela nossa relação de 
amizade, por todo amor e apoio. 
E a vocês, meus outros “irmãos”, amigos especiais que escolhi para 
fazerem parte de minha vida (e cujos nomes não serão citados porque corro sério 
risco de esquecer alguém!), obrigada pela amizade e carinho irrestritos. 
A essa pessoa tão especial em minha vida, meu amado companheiro 
Osny, agradeço por todos os momentos compartilhados, sejam eles felizes ou 
tristes, por toda a ansiedade e estresse suportados, pelo sorriso nas horas 
difíceis, pelo amor e cuidado dedicados. Sua presença é essencial em minha 
vida, e graças a todo apoio que me destina, continuo construindo meu caminho 
nessa atividade apaixonante que é a pesquisa. Aproveito para agradecer pela 
segunda família que colocou em minha vida, meus sogros e meu cunhado 
queridos, aos quais dedico todo amor e gratidão. 
 vii
Agradeço ao caríssimo Dr. Marcello Barcinski – Marcello, sem formalidades 
– por me acolher na Divisão de Medicina Experimental e especialmente no Grupo 
Infecção e Câncer. Obrigada pela confiança em meu trabalho e por todo 
direcionamento. 
Ao Robson, obrigada por me receber em seu grupo, por toda orientação, 
pela troca e doação de idéias, pelos desabafos ouvidos pacientemente, por seu 
infinito entusiasmo e pela compreensão e apoio sempre. 
Não poderia deixar de agradecer ainda à professora Vivian, pelos 
valiosíssimos conselhos e dicas, os quais foram de extrema importância para 
determinar os rumos de meu trabalho. 
Agradeço também aos “amigos trombóticos” pelo dia-a-dia compartilhado, 
repleto de deliciosas conversas, nem sempre muito “científicas”, as quais tornam 
a rotina de trabalho bastante agradável. Especialmente às meninas, Andréa, 
Andreia, Angélica, Camilla, Dani, Fabiana, Flávia, Luciana, Morgana, Renata e 
Tati, é um grande prazer conviver e dividir com vocês não só bancadas, materiais, 
computadores, etc., mas também importantes momentos da minha vida. 
Aos amigos que fiz na Divisão de Medicina Experimental, e que não 
necessariamente continuam por lá, especialmente aos Barcinskianos, 
Bonomianos e Martinianos, “companheiros do mesmo lado”, agradeço pela troca 
de experiências, pelas pipetas e materiais emprestados, pelas prazerosas (e cada 
vez mais raras, no meu caso) pausas para o café... Jéssica, João Luiz, Poli, 
Lúcia, Fernanda, Aline, Sheila, João Paulo, Rafa, Ana Paula, Rômulos, Carol, 
Chica, Gustavo, enfim, obrigada a todos pela amizade que por vezes extrapolou 
as paredes do INCa, proporcionando encontros muito felizes. 
À minha aluna talentosíssima, Juliana, obrigada pela nossa relação de 
amizade e por me proporcionar desenvolver essa gratificante atividade que é a 
orientação, a qual me permite aprender muito mais do que ensinar. 
Agradeço aos professores/colaboradores: Dra. Lina Zingali, Dra. Sandra 
König, Dr. Roger Chammas, Dr. Ernesto de Meis, Dr. José Morgado, que de 
alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho, seja através da troca 
de idéias e da disponibilidade constante, dos reagentes e materiais emprestados, 
ou ainda, dos ensinamentos compartilhados para sempre. 
Quero agradecer também ao IBqM, por toda oportunidade e conhecimento 
transmitido, e por me permitir conhecer e conquistar amigos maravilhosos. 
 viii
Finalmente, gostaria de agradecer às agências e instituições de fomento 
(Faperj, CNPq, FUJB, INCa/FAF, Swiss Bridge) pello importante suporte 
financeiro. Obrigada por todo crédito e investimento no trabalho e, principalmente, 
por fazer as coisas acontecerem. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ix
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
"A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original." 
- Albert Einstein- 
 x
Resumo 
 
Microvesículas (MVs) são fragmentos de membrana liberados a partir da 
superfície de diversos tipos celulares, após processos como ativação celular e 
apoptose, e sua formação está intimamente ligada à perda de assimetria 
fosfolipídica de membrana, especialmente à exposição de fosfatidilserina (PS). 
Embora os efeitos biológicos de MVs sejam extremamente variados, acredita-se 
que a produção de MVs desempenha uma importante função na biologia tumoral, 
com possível envolvimento na modulação de estados imunossupressivos e pró-
trombóticos. Nesse contexto, procuramos esclarecer o papel de microvesículas 
produzidas pelo melanoma no estabelecimento do tumor maligno. Dessa forma, 
observamos que células B16F10, uma linhagem de melanoma altamente 
metastática, produz, in vitro, grandes quantidades de MVs expondo PS. Tais MVs 
foram capazes de estimular, in vitro, a produção de TGF-β1 – um fator 
imunorregulatório com grande importância no processo de progressão maligna – 
por macrófagos, assim como aumentar o potencial metastático in vivo de células 
B16F10. Ambos os efeitos foram dependentes de PS, sendo revertidos por 
anexina V. Interessantemente, MVs de melanoma induziram ainda metástases 
pulmonares após inóculo de células B16F10 em camundongos BALB/c, 
normalmente resistentes a essa linhagem celular. Além disso, buscamos 
caracterizar as propriedades pró-coagulantes de MVs produzidas pela linhagem 
de melanoma Tm1, tal como comparada à sua linhagem parental de melanócitos 
não-tumorigênicos (melan-A). Apesar da taxa de produção de MVs ser 
consideravelmente maior na linhagem celular tumoral, a exposição de PS foi 
bastante semelhante em MVs derivadas de ambas as linhagens melan-A e Tm1. 
Isso se refletiu na capacidade dessas estruturas em promover a formação do 
complexo pró-coagulante protrombinase, um processo dependente da presença 
de superfícies aniônicas ricas em PS. Como esperado, ambas as MVs permitiram 
a ativação de protrombina em níveis similares. Por outro lado, MVs derivadas de 
melanoma aceleraram o tempo de coagulação plasmático de maneira mais 
eficiente, sugerindo uma maior exposição da proteína iniciadora da coagulação 
Fator Tecidual, a qual foi detectada na superfície de células Tm1, mas não de 
melan-A. Finalmente, MVs obtidas de plasma de camundongos inoculados com 
células de melanoma apresentaram um padrão pró-coagulante similar ao de MVs 
produzidas in vitro pela linhagem Tm1. Em conjunto, nossos resultados 
demonstram que MVs tumorais desempenham importante papel no 
estabelecimento do melanoma maligno in vivo, e indicam sua participação na 
modulação de respostas inflamatórias e imunes anti-tumorais, assim como na 
ativação do processo de coagulação sanguínea. 
 
 
 
 
 
 xi
Abstract 
 
Microvesicles (MVs) are membrane fragments that can be shed from the cell 
surface of various cell types under conditions such as cell activation and 
apoptosis, being this phenomenon closely associated with loss of phospholipid 
asymmetry, especially to phosphatidylserine (PS) exposure. Despite the variety of 
biological effects related to MVs, it is supposed that MVs production play an 
important role in tumor biology and might modulate immunosupressive and 
prothrombotic states. Within this context, we attempted to elucidate the 
contribution of melanoma-derived MVs to the establishment of malignant tumor. 
Herein we observed that B16F10 cells, a highly metastatic melanoma cell line, 
produce large quantities of PS-containing microvesicles in vitro. Tumor MVs 
increased TGF-β1 production by cultured macrophages and, in vivo, enhanced the 
metastatic potential of B16F10 cells in C57BL/6 mice, both effects being reversed 
by annexin V. Most strikingly, MVs induced melanoma metastasis in BALB/c mice, 
which are normally resistant to this tumor cell line. Furthermore, we characterized 
the procoagulant properties of MVs produced by the tumorigenic melanoma cell 
line Tm1, as compared to its counterpart non-tumorigenic melanocyte-derived cell 
line, melan-A. Although the rate of MVs production was considerably higher in the 
tumorigenic cell line, PS exposure was nearly identical in MVs from both melan-A 
and Tm-1. This result is reflected by the ability of these structures to assembly the 
procoagulant complex prothrombinase, a process that is dependent on the 
presence of PS-rich anionic membranes. As expected, both MVs supported 
prothrombin activation at similar rates. On the other hand, melanoma-derived MVs 
shortened the coagulation time of murine plasma in a lower concentration range 
than melan-A MVs, suggesting the presence of higher amounts of the clotting 
initiator, Tissue Factor. In support of this observation, Tissue Factor was detected 
on the surface of Tm1 but not melan-A cells. Finally, MVs obtained from plasma of 
melanoma-bearing mice showed a similar procoagulant pattern as compared to 
Tm1 MVs produced in vitro. Altogether, our results show that tumor-derived MVs 
play an important role in the in vivo establishment of malignant melanoma and 
further indicate their involvement in the modulation of host’s inflammatory and/or 
anti-tumoral immune responses, as well as in blood coagulation activation. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 xii
Lista de Siglas e Abreviaturas 
 
ADP adenosina difosfato 
An V anexina V 
ATP adenosina trifosfato 
BSA albumina sérica bovina 
DME Dulbecco’s Modified Eagle (meio de cultura) 
EDTA ácido etilenodiaminotetracético 
FITC isoticianato de fluoresceína 
FIX fator IX 
FIXa fator IX ativado 
FSC espalhamento de luz frontal 
FVa fator V ativado 
FVIIa fator VII ativado 
FVIIIa fator VIII ativado 
FX fator X 
FXa fator X ativado 
FXI fator XI 
FXIa fator XI ativado 
IFNγ interferon gama 
IL-1β interleucina 1 beta 
IL-10 interleucina 10 
IL-12 interleucina 12 
LPS lipopolissacarídeo 
MAA antígeno associado a melanoma 
MHC complexo maior de histocompatibilidade 
 xiii
Mφ macrófagos 
MVs microvesículas 
PAR receptor ativado por protease 
PBS salina tamponada por fosfato 
PI iodeto de propídeo 
PMA forbol 12-miristato 13-acetato 
PS fosfatidilserina 
PSGL-1 glicoproteína ligante de P-selectina 1 
SFB soro fetal bovino 
SSC espalhamento de luz lateral 
TEV tromboembolismo venoso 
TF fator tecidual 
TGF-β fator de crescimento tumoral beta 
TNFα fator de necrose tumoral alfa 
VEGF fator de crescimento do endotélio vascular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 xiv
Lista de Figuras 
 
Figura 1 – Exemplos de MVs liberadas por diferentes tipos celulares 
ativados ............................................................................................................ 3
Figura 2 – Mecanismos associados ao processo de formação de MVs .......... 5
Figura 3 – Presença de microvesículas no microambiente tumoral ................ 8
Figura 4 – Modelo de modulação da resposta imune por microvesículas 
tumorais ........................................................................................................... 13
Figura 5 – Cascata de coagulação sanguínea ................................................ 15
Figura 6 – Reações da coagulação dependentes de superfícies de 
membrana ........................................................................................................ 16
Figura 7 – Caracterização de MVs produzidas in vitro por células B16F10 .... 40
Figura 8 – Detecção da exposição do antígeno MAA em MVs de melanoma 
por citometria de fluxo ...................................................................................... 40
Figura 9 – Análise da exposição PS na superfície de células B16F10 ........... 42
Figura 10 – Análise da exposição de PS em MVs derivadas de células 
B16F10 ............................................................................................................ 43
Figura 11 – Formação do complexo protrombinase promovida por MVs de 
melanoma B16F10 ........................................................................................... 44Figura 12 – Efeito inibitório de anexina V sobre a formação do complexo 
protrombinase induzida por MVs de melanoma .............................................. 45
Figura 13 – Modulação da produção de TGF-β1 por MVs de melanoma em 
culturas de macrófagos ativados ..................................................................... 46
Figura 14 – Papel de MVs tumorais no estabelecimento do melanoma 
B16F10 em camundongos C57BL/6 ................................................................ 47
Figura 15 – Papel de MVs tumorais no estabelecimento do melanoma 
B16F10 em camundongos BALB/c .................................................................. 49
Figura 16 – Produção de MVs pelas linhagens celulares melan-A e Tm1 51
 xv
Figura 17 – Análise da exposição de PS em MVs derivadas de células Tm1 
e melan-A ......................................................................................................... 53
Figura 18 – Formação do complexo protrombinase promovida por MVs de 
melanócitos melan-A e de melanoma Tm1 ..................................................... 54
Figure 19 – Atividade pró-coagulante de MVs derivadas das linhagens 
celulares melan-A e Tm1 ................................................................................. 56
Figura 20 – Análise da exposição de Fator Tecidual em células Tm1 e 
melan-A ............................................................................................................ 56
Figura 21 – Análise da presença de MVs em plasma de camundongos 
C57BL/6 inoculados com células de melanoma Tm1 ou melanócitos 
melan-A ............................................................................................................ 58
Figure 22 – Atividade pró-coagulante de MVs obtidas ex vivo a partir do 
plasma de camundongos inoculados com a linhagem celular Tm1 ................ 59
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 xvi
Sumário 
 
1. Introdução ................................................................................................. 1
1.1. Microvesículas ....................................................................................... 2
1.1.1. Breve histórico .................................................................................... 2
1.1.2. Processo de formação de microvesículas .......................................... 4
1.2. Características funcionais de microvesículas ........................................ 6
1.3. Microvesículas e câncer ........................................................................ 7
1.3.1. Câncer e imunossupressão ................................................................ 9
1.3.1.1. Papel do TGF-β1 no câncer ............................................................. 10
1.3.1.2. Microvesículas tumorais como partículas imunossupressoras ........ 11
1.3.2. Câncer e coagulação .......................................................................... 13
1.3.2.1. Coagulação sanguínea .................................................................... 13
1.3.2.2. Estados hipercoagulantes no câncer ............................................... 17
1.3.2.3. Câncer e microvesículas pró-coagulantes ....................................... 20
1.4. Papel de microvesículas no estabelecimento do melanoma maligno ... 23
2. Objetivos ................................................................................................... 26
2.1. Objetivo geral ......................................................................................... 27
2.2. Objetivos específicos ............................................................................. 27
3. Materiais e métodos .................................................................................. 28
3.1. Cultura de células .................................................................................. 29
3.2. Purificação de MVs secretadas em sobrenadantes de cultura de 
células ........................................................................................................... 29
3.3. Análises por citometria de fluxo ............................................................. 30
3.3.1. Avaliação da exposição de fosfatidilserina ......................................... 30
3.3.2. Avaliação da exposição do antígeno associado a melanoma MAA ... 31
 xvii
3.3.3. Avaliação da exposição de Fator Tecidual ......................................... 31
3.4. Microscopia de fluorescência ................................................................. 32
3.5. Microscopia eletrônica ........................................................................... 33
3.6. Ensaio de ativação da protrombina ....................................................... 34
3.7. Quantificação de TGF-β1 em co-culturas de macrófagos e MVs de 
melanoma B16F10 ........................................................................................ 35
3.8. Estabelecimento in vivo do melanoma B16F10: modelo de metástase 35
3.9. Ativação da coagulação sanguínea in vitro ........................................... 36
3.10. Purificação de MVs a partir do plasma de camundongos C57BL/6 
inoculados com células de melanoma Tm1 ou melanócitos melan-A .......... 36
3.11. Análises estatísticas ............................................................................ 37
4. Resultados ................................................................................................ 38
4.1. Papel de microvesículas de melanoma B16F10 na metástase tumoral 39
4.1.1. Células de melanoma B16F10 produzem microvesículas in vitro ...... 39
4.1.2. Células B16F10 e microvesículas de melanoma expõem PS em sua 
superfície externa ......................................................................................... 41
4.1.3. Microvesículas derivadas de células B16F10 modulam a produção 
de TGF-β1 por macrófagos ........................................................................... 45
4.1.4. Microvesículas tumorais aumentam o potencial metastático de 
células B16F10 em camundongos C57BL/6 ................................................. 46
4.1.5. Microvesículas tumorais aumentam o potencial metastático de 
células B16F10 em camundongos BALB/c ................................................... 48
4.2. Caracterização da atividade pró-coagulante de microvesículas 
derivadas de melanócitos e melanoma ........................................................ 50
4.2.1. Produção de microvesículas por melanócitos murinos melan-A e 
células de melanoma Tm1 ............................................................................ 50
4.2.2. Exposição de PS e promoção da formação do complexo 
protrombinase por ambas as MVs produzidas por melanócitos e células de 51
 xviii
melanoma ..................................................................................................... 
4.2.3. MVs de melanoma aceleram o tempo de coagulação de plasma 
murino de maneira mais eficiente do que MVs produzidas por melanócitos 54
4.2.4. MVs derivadas ex vivo de camundongos C57BL/6 inoculados com 
células de melanoma Tm1 apresentam potencial pró-coagulante 
semelhante àquelas obtidas in vitro .............................................................. 57
5. Discussão ................................................................................................. 60
6. Conclusão ................................................................................................. 68
7. Referências ............................................................................................... 70
Anexos .......................................................................................................... 83
Anexo 1 – Tumor-derived microvesicles modulate the establishment of 
metastatic melanoma in a phosphatidylserine-dependent manner ............... 84
Anexo 2 – Procoagulant properties of human MV3 melanoma cells ……..... 1131 INTRODUÇÃO 
 2
1.1 MICROVESÍCULAS 
Microvesículas (MVs) são fragmentos liberados a partir da membrana 
plasmática de células viáveis ou danificadas, normais ou malignas, quando estas 
são submetidas a estados de ativação celular, os quais incluem crescimento e 
proliferação celulares, ou ainda, ao processo de morte celular por apoptose 
(FREYSSINET, 2003). Essas estruturas vesiculares intactas são bastante 
heterogêneas em tamanho (seu diâmetro pode variar de 0,1-1 μm) e composição, 
sendo constituídas principalmente de diferentes lipídios e proteínas de membrana 
similares àqueles presentes na célula da qual se originam. Além disso, podem 
conter proteínas e transcritos de RNA mensageiro derivados do meio 
intracitoplasmático (RATAJCZAK et al., 2006a) ou, ainda, seqüestrarem organelas 
inteiras como mitocôndrias (SPEES et al., 2006). 
 
1.1.1 Breve histórico 
A primeira evidência da existência de MVs surgiu ainda na década de 40, 
quando Chargaff e West observaram que frações subcelulares de soro e plasma 
humanos continham um fator precipitável que facilitava a geração de trombina e 
conseqüente formação de fibrina (CHARGAFF e WEST, 1946). Contudo, apenas 
em 1967, com o surgimento de técnicas mais eficientes de microscopia eletrônica, 
Wolf foi capaz de demonstrar que este fator, obtido a partir da ultracentrifugação 
de plasma livre de plaquetas, consistia, na verdade, em pequenas vesículas 
derivadas da membrana celular de plaquetas ativadas, as quais apresentavam 
atividade pró-coagulante comparável à célula de origem (WOLF, 1967). 
 3
Desde então, a produção de MVs já foi descrita em diversos tipos celulares 
(Fig. 1), e vários termos já foram utilizados para denominar essas estruturas, 
originalmente chamadas de “poeira de plaquetas”. Estas mesmas MVs derivadas 
de plaquetas ativadas, por exemplo, são atualmente mais conhecidas como 
“micropartículas”, enquanto MVs liberadas por leucócitos polimorfonucleares 
ativados são freqüentemente chamadas de “ectossomos”. Apesar de produzidas 
por praticamente todos as células eucarióticas, grande ênfase tem sido dada ao 
estudo de MVs derivadas de células sanguíneas, provavelmente devido ao fato de 
estas serem componentes constitutivos do plasma humano normal, sendo 
secretadas por leucócitos, eritrócitos, células endoteliais e plaquetas. Além disso, 
MVs têm seu número aumentado no sangue periférico em processos como injúria 
celular, inflamação, trombose, hipóxia, entre outros, e podem ser produzidas 
também por células neoplásicas (RATAJCZAK et al., 2006b). Isso explica os 
maiores níveis de MVs circulantes em pacientes com infecções, doenças 
cardiovasculares e câncer, além de evidenciar a grande relevância clínica desses 
fragmentos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 – Exemplos de MVs liberadas por diferentes tipos celulares ativados. (A) 
Microscopia eletrônica de varredura mostrando a liberação de MVs por células endoteliais de 
veia umbilical humana (HUVEC) após estímulo com interleucina 1. (B) MV (seta branca) 
liberada por células K562 tratadas com dose sublítica de anticorpo e complemento. 
Microscopia ótica, tamanho da vesícula: ∼1 μm. (C) Ectossomos liberados por células 
polimorfonucleares ativadas com fMLP. Microscopia eletrônica de transmissão, marcação 
negativa. Adaptado de Diamant et al., 2004; e Pilzer et al., 2005. 
 4
1.1.2 Processo de formação de microvesículas 
Os mecanismos exatos envolvidos no processo de formação de MVs ainda 
não são completamente conhecidos. Porém, sabe-se que este fenômeno 
demanda gastos de energia e é dependente do aumento dos níveis intracelulares 
de cálcio, assim como da conseqüente ativação de proteases como a calpaína, 
que desestabilizam a ancoragem da membrana plasmática ao citoesqueleto 
através da clivagem de filamentos de actina e de outras proteínas a estes 
associadas (FOX et al., 1990; FOX et al., 1991; PICCIN, MURPHY e SMITH, 
2007). 
Ao mesmo tempo, outras duas enzimas presentes na membrana 
plasmática, em particular, têm sua atividade modulada pelos níveis aumentados 
de cálcio no citoplasma: aminofosfolipídio translocase e escramblase. A primeira, 
também conhecida como flipase dependente de adenosina trifosfato (ATP), e 
inibida por cálcio, é a principal responsável pela manutenção da assimetria da 
membrana plasmática, uma vez que transporta os aminofosfolipídios 
fosfatidilserina (PS) e fosfatidiletanolamina (PE) da camada externa para a 
camada interna da membrana, de modo específico e contra seu gradiente de 
concentração. Já a segunda, ativada por cálcio, atua no transporte lipídico 
bidirecional não-específico. Em conjunto, a inibição da aminofosfolipídio 
translocase e a ativação da escramblase por altas concentrações de cálcio 
provocam o colapso da assimetria de membrana, levando a uma distribuição 
randômica de fosfolipídios entre ambas as faces da membrana plasmática. Tal 
processo é normalmente acompanhado pelo brotamento de MVs “simétricas” a 
partir da superfície celular; logo, a microvesiculação parece ser parte integrante 
do processo de remodelamento de membranas plasmáticas, estando intimamente 
 5
ligada à externalização de PS (COMFURIUS et al., 1990; ZWAAL e SCHROIT, 
1997). De fato, dados na literatura mostram que células provenientes de 
indivíduos portadores da Síndrome de Scott, uma desordem hemorrágica 
hereditária caracterizada por uma deficiência na atividade escramblase induzida 
por cálcio, apresentam uma redução do transporte de PS para a face externa da 
membrana plasmática, assim como uma incapacidade de liberar MVs a partir de 
sua superfície celular (TOTI et al., 1996; CASTAMAN et al., 1997), o que 
corrobora essa forte associação. 
Portanto, pode-se afirmar que ao menos o colapso da assimetria 
fosfolipídica de membrana e a degradação do citoesqueleto a ela associado pela 
protease calpaína, ambos os eventos desencadeados pelo aumento da 
concentração de cálcio intracelular, são necessários para a formação de MVs 
(Fig. 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 – Mecanismos associados ao processo de formação de MVs. Na presença de 
níveis elevados de cálcio, a distribuição aleatória de PS (representada na figura em azul) entre 
ambas as camadas da membrana plasmática é induzida, através da regulação positiva e 
negativa das enzimas escramblase e aminofosfolipídio translocase, respectivamente, e a 
assimetria fosfolipídica é perdida; além disso, observa-se a ativação da enzima calpaína, 
provocando a degradação do citoesqueleto associado à membrana e permitindo a liberação de 
MVs expondo PS. Adaptado de Zwaal e Schroit, 1997. 
 6
1.2 CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS DE MICROVESÍCULAS 
Sendo MVs fragmentos de membrana complexos, com uma rica 
composição molecular – herdada tanto da superfície quanto do meio 
intracitoplasmático de sua célula de origem –, é razoável supor que estas possam 
interagir com outras células e, dessa forma, influenciar a biologia de tais tipos 
celulares. Realmente, vários autores têm abordado o seu papel em diversos 
processos biológicos, levando-nos a considerá-las como parte importante e 
integral do ambiente intercelular. 
Recentemente, diversos trabalhos têm discutido, de maneira geral, o papel 
de MVs como importantes mediadores de comunicação intercelular. Diferentes 
mecanismos, através dos quais MVs poderiam influenciar a biologia de diversos 
tipos celulares, já foram relatados na literatura, tais como a atuação como 
“complexos sinalizadores” (apresentam ligantes de superfície capazes de 
desencadear inúmeras respostas biológicas na célula-alvo), e a transferência de 
receptores de superfície entre tipos celulares distintos, assim como de conteúdo 
intracitoplasmático (proteínas, RNAs mensageiros e lipídios bioativos). 
Tomando o ambiente vascular como modelo, podemos citar várias 
respostas biológicas desencadeadas por MVs. Micropartículas derivadas de 
plaquetas ativadas, por exemplo, sãocapazes de ativar células endoteliais, 
leucócitos e, inclusive, suas próprias células de origem, desencadeando 
processos como agregação plaquetária e produção de prostaglandinas pelo 
endotélio (BARRY et al., 1997), e aumento da aderência entre monócitos e 
células endoteliais provocado pela regulação positiva de moléculas de adesão em 
ambos os tipos celulares (BARRY et al., 1998). Tais efeitos parecem ser 
mediados pela transferência intercelular de ácido aracdônico, um lipídio bioativo 
 7
presente nestas micropartículas, e envolvem, pelo menos em parte, a ativação de 
vias de sinalização celular como fosfatidilinositol 3-cinase (PI3-K), proteína cinase 
C (PKC) e proteínas cinase ativadas por mitógeno (MAPK p42/p44, p38 cinase e 
JNK1) (BARRY et al., 1999). Já MVs produzidas por leucócitos humanos 
demonstraram modular o potencial inflamatório e pró-coagulante de células 
endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC), através da indução da liberação 
de citocinas como a proteína quimiotática de monócitos, MCP-1, e a interleucina 
6, além da expressão de Fator Tecidual, com envolvimento de vias de sinalização 
possivelmente associadas à fosforilação da cinase JNK1 (MESRI e ALTIERI, 
1999). Do mesmo modo, MVs derivadas de células endoteliais ativadas podem 
interagir com células da linhagem monocítica THP-1, estimulando sua atividade 
pró-coagulante (SABATIER et al., 2002). 
Outros modelos têm sugerido ainda o envolvimento de MVs em 
mecanismos de reprogramação epigenética e transferência intercelular de 
organelas, como mitocôndrias (RATAJCZAK et al., 2006b). Contudo, embora o 
processo de vesiculação seja observado em diversos tipos celulares e os efeitos 
das MVs sejam extremamente variados, estudos atuais vêm se acumulando no 
papel de MVs na biologia tumoral, coagulação sangüínea, e resposta imune 
(RATAJCZAK et al., 2006b). Sua relação com tais processos será mais bem 
discutida a seguir. 
 
1.3 MICROVESÍCULAS E CÂNCER 
O interesse pelo estudo do papel de MVs na progressão tumoral deve-se 
essencialmente à grande quantidade de vesículas encontradas em fluidos 
biológicos de pacientes com câncer em estágio avançado, e à sua escassez ou 
 8
ausência nos fluidos corporais de indivíduos normais (GINESTRA et al., 1999; 
KIM et al., 2003). Apesar da origem dessas estruturas ainda não estar 
completamente esclarecida, observa-se que seu acúmulo ocorre freqüentemente 
em culturas de células neoplásicas, estimuladas ou não, e alguns autores já 
demonstraram sua capacidade de interagir com células normalmente presentes 
no microambiente tumoral, como fibroblastos, células endoteliais e diferentes tipos 
de leucócitos, modulando suas atividades (RATAJCZAK et al., 2006b) (Fig. 3). 
Além disso, sua abundância e conteúdo proteolítico – sobretudo de 
metaloproteinases de matriz – parecem se correlacionar com a invasividade de 
linhagens celulares tumorais in vitro (GINESTRA et al., 1998), que por sua vez se 
correlaciona com a capacidade metastática de alguns tumores in vivo (GRAVES 
et al., 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Além de atividades proteolíticas, funções imunossupressivas e pró-
coagulantes já descritas para MVs são possivelmente as principais características 
Figura 3 – Presença de microvesículas no microambiente tumoral. MVs presentes no sítio 
de desenvolvimento neoplásico podem interagir com diversos elementos celulares contidos em 
tal microambiente (como vasos neo-formados, células estromais, leucócitos, e as próprias 
células do tumor) e, dessa forma, modular as atividades da célula-alvo em questão, 
influenciando toda a biologia tumoral. Adaptado de Ratajczak et al., 2006b. 
 9
responsáveis pelo seu envolvimento no estabelecimento de uma grande 
variedade de tumores, uma vez que estas estão relacionadas a processos 
centrais no desenvolvimento neoplásico, como aquisição de capacidade invasiva 
e metastática, indução de angiogênese e escape da vigilância imune. 
 
1.3.1 Câncer e imunossupressão 
 Em 1909, Paul Erlich postulou que, se o sistema imune não fosse capaz de 
remover “germes aberrantes” de nosso organismo (tumores “recém-natos”), todos 
nós morreríamos de câncer. Mais tarde, outros pesquisadores reafirmaram a 
proposta de Erlich como a teoria da vigilância imune contra o câncer, a qual 
estaria associada a algumas hipóteses: (i) células malignas apresentariam 
características antigênicas distintas daquelas presentes no tipo celular do qual se 
originou, tornando possível o seu reconhecimento por células T e a montagem de 
uma resposta antitumoral eficiente; (ii) a incidência da doença maligna seria maior 
em períodos de relativa ineficiência imunológica, como na idade avançada; (iii) 
estados de imunossupressão, genética ou induzida por fatores como drogas, 
radiação, infecções, etc., aumentariam a incidência de câncer; e (iv) a regressão 
espontânea de tumores deveria ser observada. De certa forma, essa teoria tem se 
mostrado de acordo com uma grande variedade de estudos clínicos e 
experimentais, os quais têm demonstrado por diversos princípios a existência de 
uma resposta imune específica contra diferentes tipos de tumores. 
 Contudo, o fato de que a grande maioria dos tumores consegue se 
desenvolver, e eventualmente é fatal ao seu hospedeiro no caso de nenhuma 
intervenção terapêutica, indica claramente que células neoplásicas podem 
escapar do controle imune. Mecanismos imunossupressores utilizados por células 
 10
tumorais para transpor as barreiras imunológicas que restringem a progressão da 
doença envolvem contatos célula-célula e a liberação de fatores solúveis. A 
apresentação ineficiente de antígenos tumorais, ou seja, a ativação da resposta 
de células T na ausência de co-estímulos apropriados, por exemplo, pode levar a 
um estado de anergia desses linfócitos, normalmente observado no 
microambiente tumoral (RIVOLTINI et al., 2002). Já no contexto da liberação de 
fatores solúveis, uma importante citocina capaz de modular a resposta imune é o 
fator de crescimento tumoral beta (TGF-β). 
 
1.3.1.1 Papel do TGF-β1 no câncer 
O TGF-β1 atua, normalmente, como um potente inibidor de proliferação, 
crescimento e diferenciação celulares; porém, no que se refere às células 
tumorais, sabe-se que, em determinado momento do processo de transformação 
maligna, a maioria das células transformadas se torna parcial ou totalmente 
resistente a esses efeitos, devido a mutações ou perda de expressão de 
diferentes membros da via de sinalização de TGF-β1 (PASCHE, 2001; 
MOUSTAKAS et al., 2002). Em geral, estas células cancerosas passam, inclusive, 
a secretar níveis não-fisiológicos dessa citocina que afetam, de maneira 
autócrina, seu crescimento e diferenciação e, de forma parácrina, todo o ambiente 
celular adjacente, contribuindo para sua progressão e metástase (MOUSTAKAS 
et al., 2002). Estudos clínicos mostraram, por exemplo, que pacientes com 
melanoma, quando comparados a controles sadios, apresentam níveis séricos 
elevados de TGF-β1 relacionados à disseminação tumoral (KRASAGAKIS et al., 
1998). Além disso, a análise de amostras de melanoma primário mostrou altos 
níveis de mensagem dessa citocina em áreas de lesão progressiva, o que não foi 
 11
observado nas lesões em processo de regressão (CONRAD et al., 1999). Essa 
forte associação entre a secreção de TGF-β1 e estágios avançados de progressão 
tumoral pode ser explicada pelo fato deste fator desempenhar um importante 
papel na regulação da resposta imunológica, através da supressão do 
crescimento e diferenciação de células do sistema imune, inclusive das linhagens 
linfocíticas B e T (MOUSTAKAS et al., 2002). Isso previne respostas auto-imunes 
inadequadas, porém, no contexto do câncer, essa função imunossupressora pode 
significar o escape das células tumorais de uma resposta imune protetora. Um 
estudo com camundongos transgênicos, onde um receptor para TGF-β tipo II 
dominante negativofoi expresso apenas em células T, mostrou, por exemplo, que 
o bloqueio da sinalização de TGF-β nestas células leva a um aumento da 
resistência a tumores (GORELIK e FLAVELL, 2001), o que reforça a idéia de 
correlação entre a produção de TGF-β e desenvolvimento tumoral. 
 
1.3.1.2 Microvesículas tumorais como partículas imunossupressoras 
 Efeitos inibitórios de MVs tumorais sobre diferentes células do sistema 
imune, tais como bloqueio de proliferação e atividade citotóxica e indução de 
apoptose em linfócitos (TAYLOR et al., 2000; ANDREOLA et al., 2002; KIM et al., 
2004), e supressão da expressão de moléculas de MHC classe II por 
monócitos/macrófagos (POUTSIAKA et al., 1985), têm sido descritos na literatura, 
o que sugere uma importante associação entre a produção de MVs e estados de 
imunossupressão. 
No contexto da morte celular por apoptose, o fosfolipídio PS, presente na 
superfície de MVs e células apoptóticas, é capaz de estimular respostas 
antiinflamatórias e imunossupressivas, permitindo a remoção “imunologicamente 
 12
silenciosa” de células apoptóticas por fagócitos (SAVILL et al., 2002). Fadok e 
colaboradores observaram, por exemplo, que macrófagos humanos, quando 
estimulados na presença de neutrófilos apoptóticos, produzem grandes 
quantidades de fatores imunorregulatórios como TGF-β1 (FADOK et al., 1998). 
Mais tarde, estudos in vivo demonstraram que a secreção de TGF-β1 por 
macrófagos, dependente de PS, acelera a resolução da inflamação aguda em 
modelos inflamatórios peritoneal (injeção de tioglicolato) e pulmonar (instilação de 
lipopolissacarídeo, LPS) (HUYNH, FADOK e HENSON, 2002), além de inibir 
outros fenótipos inflamatórios tais como a indução da apoptose em células 
tumorais por macrófagos estimulados com interferon-γ (IFN-γ) e LPS (REITER, 
KRAMMER e SCHWAMBERGER, 1999). 
Por isso, uma vez que análises semi-quantitativas de PS na face externa 
da membrana plasmática de linhagens celulares humanas mostraram que células 
tumorais expõem altos níveis de PS em relação a células normais (CONNOR et 
al., 1989; UTSUGI et al., 1991), e considerando que a formação de MVs e a 
exposição de PS são fenômenos estritamente relacionados, podemos supor o seu 
envolvimento no estabelecimento tumoral, possivelmente através da regulação da 
produção de TGF-β1 e conseqüente modulação da ativação de células do sistema 
imune como macrófagos (Fig. 4). Assim sendo, MVs poderiam inibir respostas 
inflamatórias antitumorais, propiciando o escape do tumor de uma resposta imune 
efetiva. 
 
 
 
 13
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 – Modelo de modulação da resposta imune por microvesículas tumorais. MVs 
funcionariam como estruturas amplificadoras dos sinais tumorais, através da manutenção da 
PS externalizada e de sua interação com diversos tipos celulares do sistema imune presentes 
no microambiente do tumor, como macrófagos (MO), células dendríticas (DC) e linfócitos (LO). 
Como possível conseqüência dessa interação, observa-se exemplos de supressão da 
resposta imune, como a inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IL-1β e IL-
12) e a indução da liberação de fatores antiinflamatórios (TGF-β1 e IL-10) por fagócitos 
profissionais (MO e DC); e, ainda, a regulação negativa do crescimento e da diferenciação 
linfocitários
 
 
 
 
1.3.2 Câncer e coagulação 
1.3.2.1 Coagulação sanguínea 
O processo de coagulação sanguínea é parte integrante de um complexo 
mecanismo denominado sistema hemostático, cuja função primordial consiste em 
reconhecer danos vasculares e recrutar uma apropriada combinação de células e 
enzimas, que levam à produção de um "tampão" insolúvel, constituído de 
plaquetas e fibrina, interrompendo assim a perda de sangue. A cascata de 
coagulação pode ser explicada de maneira simplificada como uma série de 
reações proteolíticas de ativação de zimogênios, que culmina na geração de 
 14
trombina e conseqüente formação de fibrina a partir de uma proteína solúvel do 
plasma denominada fibrinogênio (Fig. 5). Esse evento envolve, de forma geral, 
três importantes pilares: fatores de coagulação plasmáticos; íons cálcio; e 
superfícies membranares pró-coagulantes. Quando devidamente combinados, 
esses três grupos formam os efetores centrais do processo de coagulação: os 
complexos tenase extrínseco e intrínseco, e o complexo protrombinase. Em cada 
caso, uma enzima serino-protease ativa se liga ao seu co-fator protéico, na 
presença de íons Ca2+, de maneira a formar um complexo enzimático em uma 
superfície de membrana. Em situações onde há injúria vascular, o complexo 
iniciador, tenase extrínseco, é formado quando a enzima fator VIIa, presente no 
plasma, entra em contato com o Fator Tecidual (TF), uma proteína 
transmembranar de 47 kD constitutivamente expressa na superfície de células 
sub-endoteliais e em alguns tecidos extravasculares (BROZE, 1995), mas que 
também pode estar presente na membrana de células vasculares ativadas como 
monócitos e células endoteliais. Esse complexo (TF/fator VIIa) converte o 
zimogênio fator X em uma serino-protease ativa, o fator Xa. Este se dissocia do 
complexo tenase e se associa ao co-fator protéico fator Va, íons Ca2+ e 
superfícies celulares ricas em fosfolipídios aniônicos, especialmente PS, para 
formar o complexo protrombinase, que ativa o zimogênio protrombina na serino-
protease trombina. Finalmente, a trombina promove a clivagem de fibrinogênio, 
permitindo a formação de polímeros de fibrina, que por sua vez darão origem ao 
coágulo de fibrina. O complexo tenase extrínseco converte ainda o zimogênio 
fator IX na sua forma ativa, fator IXa, que associado ao co-fator protéico fator 
VIIIa, íons Ca2+ e fosfolipídios forma o complexo tenase intrínseco e também 
catalisa a ativação do fator X. 
 15
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Como pode ser observado, membranas celulares são elementos essenciais 
para a ativação da coagulação sanguínea, tanto no início, durante a exposição de 
Fator Tecidual ao plasma, permitindo a montagem do complexo tenase 
extrínseco, quanto na fase de propagação da cascata, onde a presença de 
fosfolipídios aniônicos, em especial PS, é crítica para a formação dos complexos 
tenase intrínseco e protrombinase (KALAFATIS et al., 1994) (Fig. 6). 
 
 
 
Figura 5 – Cascata de coagulação sanguínea. Esquema simplificado do processo de 
coagulação in vivo. Cores indicam: zimogênios, verde; enzimas ativas, laranja; co-fatores, 
azul. FVIIa, FIX, FIXa, FX, FXa, FVIIIa, FVa, FPA e FPB representam, respectivamente, os 
fatores VIIa, IX, IXa, X, Xa, VIIIa e Va, e os fibrinopeptídeos A e B. 
 16
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A conservação da integridade do sistema vascular – e conseqüentemente o 
bom funcionamento do sistema hemostático – é essencial para a manutenção da 
vida humana, uma vez que este é responsável por funções vitais que incluem o 
transporte de oxigênio e nutrientes para os tecidos e restos metabólicos para vias 
de excreção adequadas. Contudo, apesar da existência de mecanismos 
complexos de regulação, o processo de hemostasia pode acontecer também na 
ausência de dano vascular, levando à formação de trombos capazes de ocluir os 
vasos sanguíneos. Essa ativação não específica do sistema hemostático está 
relacionada ao desenvolvimento de diversas doenças tromboembólicas, tais como 
a trombose venosa profunda e o embolismo pulmonar, e ocorre em maior 
freqüência em diferentes estados patológicos como diabetes, aterosclerose, 
sepse e câncer (RICKLES e LEVINE, 2001; HIRSH, O'DONNELL e WEITZ, 
2005). 
Figura 6 – Reações da coagulação dependentes de superfícies de membrana. 
Representação esquemática dos principais complexos enzimáticos da coagulação, onde cada 
serino-protease está associada ao seu co-fator protéico e substrato apropriados, em uma 
superfície de membrana expondo Fator Tecidual (no caso do complexo tenase extrínseco) ou 
fosfatidilserina,representada em azul (no caso dos complexos tenase intrínseco e 
protrombinase). Adaptado de Kalafatis et al., 1994. 
 17
1.3.2.2 Estados hipercoagulantes no câncer 
Uma importante correlação entre câncer e estados de hipercoagulação foi 
descrita há mais de um século pelo clínico francês Armand Trousseau (1801-
1867), e desde então é amplamente discutida na literatura. 
A ocorrência de trombose é comumente observada em indivíduos com 
neoplasias malignas, sendo esta incidência variável de acordo com o tipo de 
câncer, e particularmente alta em tumores de pâncreas, pulmão e do trato 
gastrointestinal, além de gliomas e algumas leucemias (HOFFMAN, HAIM e 
BRENNER, 2001; RICKLES e LEVINE, 2001). Em muitos casos, a doença 
tromboembólica é diagnosticada como a primeira manifestação clínica de um 
tumor, sendo freqüentemente a principal complicação nos pacientes oncológicos 
e a segunda causa de óbito na maioria dos tipos de neoplasia (DONATI, 1995; 
MANDALA et al., 2003). Além disso, estudos epidemiológicos têm demonstrado 
uma significativa correlação entre a ocorrência de trombose e um pior prognóstico 
da doença (SORENSEN et al., 2000). 
Corroborando os diversos dados clínicos que evidenciam uma íntima 
associação entre a progressão tumoral e o desenvolvimento de um estado de 
hipercoagulabilidade no paciente em questão, análises histopatológicas 
demonstram a presença de depósitos de fibrina e de agregados de plaquetas 
dentro e em volta de diferentes tumores, indicando uma ativação local da 
coagulação. Além disso, mesmo pacientes com câncer sem manifestações 
clínicas de trombose apresentam anormalidades em testes laboratoriais de 
coagulação (alterações hemostáticas levando à hipercoagulabilidade ocorrem em 
60% a 100% destes indivíduos), caracterizadas por diferentes níveis de ativação 
da coagulação sanguínea, e que incluem: redução do tempo de tromboplastina 
 18
parcial ativada; níveis elevados de proteínas da coagulação (fibrinogênio, fatores 
V, VIII, IX e X); trombocitose; aumento dos produtos de degradação de fibrina e 
fibrinogênio, entre outros (ZWICKER, FURIE e FURIE, 2007). 
Essa condição hipercoagulável dos pacientes com câncer pode ser 
parcialmente explicada por mecanismos gerais de resposta do hospedeiro à 
doença maligna, como por exemplo, respostas inflamatórias, mudanças no 
metabolismo protéico e estase venosa. Contudo, a ativação do sistema 
hemostático desses indivíduos deve-se, sobretudo, a propriedades pró-
coagulantes específicas das células tumorais, as quais incluem: (i) a síntese de 
moléculas pró-coagulantes, particularmente Fator Tecidual e o pró-coagulante 
neoplásico CP, um ativador direto do fator X; (ii) a síntese de citocinas pró-
inflamatórias, como o fator de necrose tumoral alfa (TNFα), interleucina 1 beta (IL-
1β) e interferon gama (IFNγ), as quais podem ativar células endoteliais e 
monócitos a expressarem o Fator Tecidual em sua membrana externa, por 
exemplo; (iii) a interação direta com células vasculares, resultando na ativação 
destas últimas e na conseqüente modulação do sistema hemostático; e (iv) a 
exposição do fosfolipídio fosfatidilserina (PS) na membrana externa das células 
tumorais, permitindo a geração de superfícies lipídicas que suportam os 
complexos da coagulação sanguínea. 
É importante ressaltar que as evidências que suportam a relação entre 
trombose e neoplasia não se restringem apenas à maior incidência de eventos 
trombóticos em pacientes com câncer, e vice-versa, mas também ao fato de que 
pacientes com trombose e câncer têm uma neoplasia de comportamento mais 
agressivo do que aqueles que não apresentaram fenômenos de trombose. 
 19
Em um importante estudo nessa área, Sorensen e colaboradores 
observaram, por exemplo, que em pacientes diagnosticados concomitantemente 
com câncer e tromboembolismo venoso (TEV), a taxa de sobrevida após um ano 
foi de 12%, contra 36% em pacientes com câncer sem diagnóstico de eventos 
tromboembólicos (diferença essa que se mostrou bastante importante 
particularmente nos dez primeiros anos após o diagnóstico da neoplasia), o que 
os levou à conclusão de que episódios de TEV estão frequentemente associados 
a um estágio avançado do câncer, assim como a um pior prognóstico 
(SORENSEN et al., 2000). 
Neste contexto, vários autores têm enfatizado cada vez mais a importância 
do sistema de coagulação sanguínea em diferentes processos do 
desenvolvimento neoplásico, principalmente no que diz respeito a angiogênese e 
metástase tumorais. Através do estudo de culturas de células, assim como de 
amostras de pacientes, diferentes trabalhos têm demonstrado, por exemplo, uma 
forte associação entre a expressão de Fator Tecidual e o padrão agressivo de 
células neoplásicas (GUAN et al., 2002; ISHIMARU et al., 2003). A presença de 
Fator Tecidual tem se correlacionado ainda com a produção do fator de 
crescimento do endotélio vascular (VEGF), um dos principais fatores pró-
angiogênicos já descritos, assim como a uma maior densidade microvascular 
(GUAN et al., 2002; NAKASAKI et al., 2002). Além disso, a superexpressão de 
receptores sensíveis às enzimas da coagulação, denominados PAR (do inglês 
Protease Activated Receptor), em células tumorais, e sua conseqüente ativação 
por essas proteínas também têm sido associadas a vários aspectos da biologia do 
câncer, incluindo migração, invasão, sobrevivência, e a produção de fatores 
angiogênicos, metaloproteinases e citocinas pró-tumorais (EVEN-RAM et al., 
 20
1998; BELTING, AHAMED e RUF, 2005; RAO e PENDURTHI, 2005). Portanto, o 
estudo dos mecanismos pró-coagulantes associados ao desenvolvimento 
neoplásico, responsáveis pelos estados pró-trombóticos observados, poderia 
revelar não apenas possíveis alvos terapêuticos contra tal efeito colateral (os 
eventos tromboembólicos), mas também contra a doença primária, o câncer. 
 
1.3.2.3 Câncer e microvesículas pró-coagulantes 
Microvesículas, de uma forma geral, transportam antígenos de membrana de 
seu tecido de origem. Logo, MVs produzidas por células neoplásicas poderiam 
mimetizar e amplificar suas propriedades pró-coagulantes específicas já 
mencionadas acima. De fato, em 1981, Dvorak e colaboradores demonstraram 
pela primeira vez que fragmentos de membrana liberados por linhagens celulares 
tumorais em cultura apresentavam comportamento pró-coagulante consistente 
com a atividade de Fator Tecidual (DVORAK et al., 1981). Desde então, a 
presença de Fator Tecidual em MVs tumorais tem sido apontada como 
responsável, pelo menos em parte, pela atividade pró-coagulante/estado pró-
trombótico observado em linhagens tumorais e pacientes com câncer, 
respectivamente, de diversas origens, como glioma, certos tipos de leucemia 
(incluindo as leucemias promielocítica e monocítica agudas, e a leucemia mielóide 
crônica), carcinoma de pulmão, e adenocarcinomas de pâncreas e mama 
(BASTIDA et al., 1984; CARR, DVORAK e DVORAK, 1985; DEL CONDE et al., 
2007; TESSELAAR et al., 2007). Além disso, a exposição de PS em MVs 
tumorais possibilita a montagem do complexo pró-coagulante protrombinase 
(DVORAK et al., 1983; VANDEWATER et al., 1985), dependente de membranas 
carregadas negativamente, as quais, em condições de dano vascular, são 
 21
constituídas pela superfície de plaquetas ativadas no sítio de lesão em questão 
(MONROE, HOFFMAN e ROBERTS, 2002). 
Em paralelo, a grande maioria das células do compartimento vascular, 
quando submetidas a um estímulo pró-coagulante, pró-inflamatório ou apoptótico, 
também apresenta o fenômeno de perda da assimetria da membrana plasmática, 
tendo como conseqüência a exposição de PS na sua face extracelular e 
concomitante liberação de MVs, que podem conter, além de PS, outras proteínas 
que sejam expressas por estas células de origem. 
Por serem ricas em PS, MVs originadas de plaquetas ativadas, por exemplo, 
podem funcionar como superfícies para a ligação deproteínas da cascata de 
coagulação – como os fatores VIIIa, IXa, Va e Xa – e conseqüente montagem dos 
complexos dependentes de membranas carregadas negativamente, contribuindo 
assim para a geração de trombina (DIAMANT et al., 2004; FURIE et al., 2005; 
ZWICKER, FURIE e FURIE, 2007). Além disso, MVs derivadas de células 
endoteliais e monócitos ativados, que carregam Fator Tecidual a partir de sua 
célula de origem (SATTA et al., 1994; COMBES et al., 1999), podem ser 
superfícies adequadas à interação com o fator VIIa. Estas últimas são capazes, 
ainda, de se ligar às plaquetas nos locais de injúria vascular através da interação 
entre a glicoproteína ligante de P-selectina (PSGL-1), presente nas MVs, e a P-
selectina, presente nas plaquetas ativadas (MCGREGOR, MARTIN e 
MCGREGOR, 2006). Subseqüentemente, estas podem fundir-se às plaquetas, 
em um processo dependente de PSGL-1 e Fator Tecidual. Ao se fundirem, ocorre 
a transferência de Fator Tecidual e de outras proteínas à membrana plaquetária, 
o que a torna uma superfície com maior potencial pró-coagulante, aumentando a 
 22
atividade Fator Tecidual-fator VIIa e a geração de local de trombina (RAUCH et 
al., 2000; EILERTSEN e ØSTERUD, 2004). 
O papel pró-coagulante in vivo de MVs tem sido ainda reforçado por 
diferentes evidências na literatura. Como exemplos principais, podemos citar a 
importante relação entre números elevados de MVs circulantes no plasma 
humano e o risco aumentado de complicações tromboembólicas, a qual tem sido 
demonstrada em diversos estudos (KAHN, ZUCKER-FRANKLIN e KARPATKIN, 
1975; MALLAT et al., 2000; ANDO et al., 2002). Por outro lado, uma maior 
tendência a eventos hemorrágicos e níveis reduzidos de MVs circulantes também 
têm sido associados em síndromes severas raras (GEMMELL, SEFTON e YEO, 
1993; CASTAMAN et al., 1997). Finalmente, MVs obtidas a partir de indivíduos 
normais, assim como de diferentes populações de pacientes, são capazes de 
promover a coagulação in vitro, e, ao mesmo tempo, sabe-se que a administração 
sistêmica de MVs, em modelo de trombose venosa em ratos, leva a uma 
formação significativa de trombos (BIRÓ et al., 2003). Em conjunto, esses dados 
sugerem fortemente a grande relevância clínica e fisiológica dessas estruturas no 
processo de coagulação in vivo. 
MVs produzidas por células tumorais e células vasculares ativadas 
poderiam exercer, portanto, um papel importante na biologia tumoral, através da 
manutenção de PS externalizada e da presença de outras moléculas, como o 
Fator Tecidual, contribuindo para a ativação do processo de coagulação. 
Contudo, apesar de diversos trabalhos indicarem a presença de MVs pró-
coagulantes em uma grande variedade de pacientes com câncer que apresentam 
conhecidamente uma alta incidência de eventos tromboembólicos, maiores 
esforços devem ser direcionados a fim de se confirmar se altas concentrações de 
 23
MVs pró-coagulantes seriam clinicamente importantes marcadores de 
complicações tromboembólicas, além de se determinar se tais estruturas 
desempenham realmente um papel central (‘causal’) na patogênese da trombose 
associada ao câncer e vice-versa. 
 
1.4 PAPEL DE MICROVESÍCULAS NO ESTABELECIMENTO DO 
MELANOMA MALIGNO 
 Nesse estudo, buscamos entender o papel de MVs em modelos de 
melanoma maligno, um tipo de câncer que se origina dos melanócitos, os quais 
são as células da pele produtoras de melanina. Embora apresente a menor 
incidência entre todos os tipos de câncer de pele, sua letalidade é bastante 
elevada, sendo considerado o mais grave, principalmente devido à sua grande 
capacidade metastática. 
Como vimos, MVs, de uma forma geral, transportam moléculas de 
superfície de suas células de origem, o que inclui o fosfolipídio PS. A exposição 
de PS em membranas celulares está envolvida em processos biológicos como a 
apoptose – onde é responsável pelo reconhecimento e remoção antiinflamatória 
de células apoptóticas por fagócitos – e a ativação da cascata de coagulação 
sanguínea, onde participa da montagem de diferentes complexos enzimáticos 
pró-coagulantes. 
Análises semiquantitativas de PS na face externa da membrana plasmática 
de linhagens celulares humanas mostraram que células tumorais expõem altos 
níveis de PS em relação às células normais (CONNOR et al., 1989; UTSUGI et 
al., 1991), sugerindo o envolvimento desse fosfolipídio na biologia tumoral. Por 
isso, considerando o papel modulador de PS na atividade antiinflamatória 
 24
macrofágica, é possível que seu reconhecimento em membranas de MVs seja 
capaz de inibir o desenvolvimento de uma resposta inflamatória anti-tumoral, 
regulando positivamente a liberação de fatores imunorregulatórios como o TGF-
β1, um importante mediador do processo de progressão maligna. Assim sendo, 
propiciaria, de forma semelhante ao que é visto em células apoptóticas, uma 
resposta imune menos efetiva e um processo inflamatório pouco desenvolvido. De 
fato, estudos clínicos mostraram que pacientes com melanoma, quando 
comparados a controles sadios, apresentam níveis séricos elevados de TGF-β1, 
sendo estes relacionados à disseminação tumoral. Além disso, a análise de 
amostras de melanoma primário mostrou altos níveis de mensagem dessa 
citocina em áreas de lesão progressiva, o que não foi observado nas lesões em 
processo de regressão. 
Ainda no contexto do câncer, sabe-se que a exposição de PS em MVs 
tumorais possibilita a montagem de complexos pró-coagulantes dependentes de 
membranas carregadas negativamente, algo que possivelmente contribui para a 
seu papel pró-trombótico, e sugere sua participação nos mecanismos patogênicos 
implicados na associação bidirecional entre câncer e estados hipercoagulantes. 
Além disso, a presença do fator pró-coagulante Fator Tecidual nessas partículas 
derivadas de células neoplásicas tem sido também apontada como responsável, 
pelo menos em parte, pela atividade pró-coagulante/estado pró-trombótico 
observado em linhagens tumorais e pacientes com câncer, respectivamente. 
Como já citado, o melanoma é um tipo de câncer altamente metastático, e 
há fortes evidências sugerindo que suas propriedades pró-coagulantes 
contribuam para o seu comportamento agressivo (MUELLER et al., 1992; 
BROMBERG et al., 1995). Tal padrão é refletido ainda em um perfil 
 25
hipercoagulante de pacientes com melanoma, quando estes são analisados 
através de testes laboratoriais de ativação da coagulação sanguínea (BOTTASSO 
et al., 1996). 
Portanto, MVs produzidas por células tumorais poderiam exercer um papel 
importante no estabelecimento do tumor, através da manutenção da PS 
externalizada e da amplificação dos sinais tumorais, interagindo com diversos 
tipos celulares presentes no microambiente do tumor. Dentre estes fenômenos, a 
modulação das respostas imune e inflamatória, assim com a ativação do processo 
de coagulação, seria de grande importância. 
É importante ressaltar que a identificação das MVs em pacientes com 
câncer e o seu papel na progressão tumoral ainda são pouco compreendidos e, 
por isso, esperamos contribuir para a elucidação dos mecanismos responsáveis 
pela importante ação pró-tumoral desempenhada por estas estruturas. 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 26
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 OBJETIVOS 
 27
2.1 OBJETIVO GERAL 
Esclarecer o papel de microvesículas produzidas pelo melanoma maligno 
no reconhecimento, estabelecimento e metástase do tumor. 
Para esse fim, utilizamos a linhagem celular de melanoma B16F10, a qual 
é amplamente utilizada na literatura, devido a sua alta capacidade metastática. 
Além disso, trabalhamos com um modelo comparativo entre a linhagem celular de 
melanoma Tm1 e sua linhagem celular parental de melanócitos, melan-A 
(CORREA et al., 2005). 
 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
• Identificar a produção de MVs in vitro pelo melanoma B16F10, assim como 
a exposição funcionalde PS em ambas as estruturas; 
• Investigar a modulação da resposta inflamatória de macrófagos por MVs 
derivadas de células B16F10, principalmente no que diz respeito à produção de 
TGF-β1; 
• Investigar o papel de MVs e da exposição de PS no modelo de metástase 
in vivo do melanoma B16F10; 
• Observar e comparar a produção de MVs in vitro pelas linhagens celulares 
de melanoma Tm1, e de melanócitos, melan-A; 
• Caracterizar in vitro a atividade pró-coagulante de MVs liberadas na cultura 
de células de Tm1 e melan-A; 
• Avaliar a presença de MVs tumorais no plasma de camundongos pré-
inoculados com células de melanoma, além de caracterizar suas propriedades 
pró-coagulantes ex vivo. 
 28
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 MATERIAIS E MÉTODOS 
 29
3.1 CULTURA DE CÉLULAS 
As linhagens celulares murinas B16F10 e Tm1 (melanomas), e melan-A 
(melanócitos) (estas últimas gentilmente doadas pelo Dr. Roger Chammas, 
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo) foram 
mantidas à 37ºC, em estufa com 5% de CO2, através de duas passagens 
semanais em garrafas de cultura contendo meio DME (Dulbecco´s Modified Eagle 
Medium, GibcoBRL), acrescido de 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB), e 
suplementado com 2,4 g/L de HEPES, 3,7 g/L de bicarbonato de sódio, 125 mg/L 
de fosfato de sódio dihidrogenado, 110 mg/L de piruvato de sódio, 100.000 U/L de 
penicillina, 100 mg/L de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 55 μM de β-
mercaptoetanol, além de 200 nM do éster de forbol PMA (forbol 12-miristato 13-
acetato), no caso da linhagem melan-A. Após separação do sobrenadante de 
cultura para posterior purificação de microvesículas, as células eram soltas com 
tampão Hank’s contendo 10 mM de HEPES e 0,2 mM de EDTA, centrifugadas a 
350 x g por 7 min, ressuspendidas em meio DME contendo 10% (v/v) de SFB 
(suplementado como descrito acima) e transferidas para outra garrafa de cultura – 
ou ainda, mantidas a 4oC até sua utilização. 
 
3.2 PURIFICAÇÃO DE MVS SECRETADAS EM SOBRENADANTES DE 
CULTURA DE CÉLULAS 
Sobrenadantes de cultura de células eram centrifugados primeiramente a 
800 x g por 10 min (para eliminação de possíveis células mortas) e, em seguida, a 
16.000 x g por 15 min, sempre a 4°C. O precipitado obtido era então lavado uma 
vez e ressuspendido em salina tamponada por fosfato (PBS, do inglês phosphate 
 30
buffer saline), quantificado por contagem em um citômetro de fluxo BD 
FACScalibur™ (Becton, Dickinson and Company), e conservado a –80°C até sua 
utilização. A quantificação de microvesículas por análise citofluorimétrica foi ainda 
validada por quantificação protéica, através do ensaio de Bradford. 
Cabe ressaltar que vesículas menores (os chamados exossomos) não 
foram incluídas neste estudo, uma vez que ultracentrifugações mais vigorosas 
(100.000 x g por 60 min, por exemplo) dos sobrenadantes de cultura não foram 
realizadas. 
 
3.3 ANÁLISES POR CITOMETRIA DE FLUXO 
3.3.1 Avaliação da exposição de fosfatidilserina 
Para detecção da exposição de PS, células e MVs B16F10 foram 
ressuspendidas em 150 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de 
MgCl2 e 10 mM de HEPES, pH 7,3 (tampão de ligação de anexina) e incubadas 
com 25 μg/mL de anexina V conjugada a fluoresceína (FITC) (Molecular Probes) 
por 15 min à temperatura ambiente. Células B16F10 foram ainda marcadas com 
10 μg/mL de iodeto de propídeo (PI) para exclusão daquelas que tivessem 
perdido a integridade de sua membrana plasmática, tornando-se for permeáveis a 
PI. 
Já MVs derivadas de células melan-A e Tm1 foram ressuspendidas em 
PBS contendo 10% (v/v) de soro bovino adulto (necessário para ligação do 
anticorpo a PS), e incubadas por 15 min à temperatura ambiente com anticorpo 
monoclonal murino anti-PS 3G4 (previamente descrito por RAN et al., 2005 e 
gentilmente doado pelo Dr. Philip E. Thorpe, Department of Pharmacology and 
 31
Simmons and Hamon Cancer Centers, University of Texas Southwestern Medical 
Center at Dallas, Texas) conjugado a Alexa 488 e diluído 1:200. As amostras 
foram então lavadas extensivamente com PBS e, assim como células e MVs de 
melanoma B1F10, adquiridas em um citômetro de fluxo BD FACScaliburTM 
(Becton, Dickinson and Company) (total de 10.000 eventos por amostra), e os 
dados coletados analisados pelo programa BD CellQuest ProTM (Becton, 
Dickinson and Company). 
 
3.3.2 Avaliação da exposição do antígeno associado a melanoma MAA 
MVs derivadas de células B16F10 foram ressuspendidas em PBS contendo 
1% (m/v) de albumina bovina sérica (BSA) e incubadas por 1 h a 4ºC com 
anticorpo monoclonal murino anti-MAA (MM29B6, sobrenadante de hibridoma 
gentilmente doado pelo Dr. Roger Chammas, Faculdade de Medicina da 
Universidade de São Paulo, São Paulo), diluído 1:1. As amostras foram então 
lavadas com PBS, e incubadas com anticorpo secundário anti-IgG murino 
conjugado a FITC (Sigma), diluído 1:800, por 1 h a 4ºC. Um controle para 
marcação secundária não-específica foi feito incubando-se uma alíquota somente 
com o anticorpo anti-IgG murino. Após extensivas lavagens com PBS, amostras 
foram adquiridas em um citômetro de fluxo BD FACScaliburTM (Becton, Dickinson 
and Company) (total de 10.000 eventos por amostra), e os dados coletados 
analisados pelo programa BD CellQuest ProTM (Becton, Dickinson and Company). 
 
3.3.3 Avaliação da exposição de Fator Tecidual 
 32
Células foram lavadas com PBS contendo 2% de soro normal de 
camundongo (bloqueio para ligações inespecíficas utilizado durante as 
incubações), e incubadas por 30 min a 4ºC com 200 μg/mL de anticorpo policlonal 
anti-TF murino (American Diagnostica) ou controle isotipo IgG de coelho (Santa 
Cruz Biotechnology Inc.). As amostras foram então fixadas com paraformaldeído 
1%, incubadas com 15 μg/mL de anticorpo secundário anti-IgG de coelho 
conjugado a biotina (Invitrogen) por 30 min a 4ºC, e finalmente incubadas com 2.5 
μg/mL de estreptavidina conjugada a ficoeritrina (BD Pharmingen), também por 30 
min a 4ºC. Após serem lavadas duas vezes com PBS (o que foi realizado também 
entre as incubações), as amostras foram adquiridas em um citômetro de fluxo BD 
FACScaliburTM (Becton, Dickinson and Company) (total de 10.000 eventos por 
amostra), e os dados coletados analisados pelo programa BD CellQuest ProTM 
(Becton, Dickinson and Company). 
 
3.4 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA 
Células B16F10 foram crescidas em lamínulas depositadas em placa de 24 
poços (TPP) (105 células/mL de meio DME suplementado contendo 10% (v/v) de 
SFB), mantidas a 37°C, em estufa com 5% de CO2, por 24h. As células foram 
então lavadas três vezes com tampão Hank’s, incubadas com anexina V 
conjugada a biotina (PharMingen), diluída 1:10, em tampão de ligação de anexina 
por 15 min à temperatura ambiente, e incubadas em seguida com 2,5 µg/mL de 
estreptavidina-FITC (PharMingen), novamente em tampão de ligação de anexina 
por 15 min à temperatura ambiente. Após cada incubação, as lamínulas foram 
lavadas três vezes, sempre em tampão de anexina. Estas foram então dispostas 
sobre lâminas, montadas com n-propilgalato e seladas com esmalte incolor, e 
 33
observadas em um microscópio Axiovert S 100 equipado com um analisador de 
imagens KS300 (Zeiss). 
Um controle de marcação secundária não-específica foi feito incubando-se 
MVs diretamente com estreptavidina-FITC. Além disso, uma amostra 
permeabilizada foi preparada após fixação com 2% de paraformaldeído em PBS 
por 30 min e posterior tratamento com 40 µM de digitonina por 10 min antes das 
incubações com anexina V e estreptavidina. 
 
3.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA 
Para localização de resíduos de fosfatidilserina por microscopia eletrônica 
de transmissão, MVs derivadas de células B16F10 foram pré-fixadas por 10 min a 
4oC, em uma solução contendo 0,1% de glutaraldeído e 4% de paraformaldeído 
em 0,1 M de tampão cacodilato, pH 7,2. Após pré-fixação, as amostrasforam 
lavadas três vezes em tampão de anexina contendo 3% de BSA, incubadas por 
30 min a 4oC com anexina V biotinilada (Pharmingen) – diluída 1:10 –, e pós-
incubadas com 0,5 U/mL de estreptavidina conjugada a partículas de ouro 
coloidal de 10 nm (Sigma), também por 30 min a 4oC. Um controle da marcação 
secundária não-específica foi feito a partir da incubação direta das MVs com a 
estreptavidina. 
Após a última incubação, MVs foram lavadas três vezes em tampão de 
anexina contendo 3% de BSA, fixadas por 1 h a 37o C em uma solução contendo 
2,5% de glutaraldeído, 1% de paraformaldeído, 8% de sacarose e 2,5 mM de 
CaCl2 em 0,1 M de tampão cacodilato, pH 7,2, e lavadas três vezes mais em 0,1 
M de tampão cacodilato contendo 2,5 mM de CaCl2. Estas foram ainda pós-
fixadas em incubação com tetróxido de ósmio e ferrocianeto de potássio (1:1) por 
 34
30 min a 4°C, no escuro, e lavadas quatro vezes novamente em 0,1 M de tampão 
cacodilato contendo 2,5 mM de CaCl2. 
As amostras foram então desidratadas com acetona (30%, 50%, 70%, 
90%, 100% e super seca, seqüencialmente, a cada 10 min) e incluídas em resina 
epon por 48 h a 60°C. Cortes ultrafinos foram marcados com acetato de uranila e 
citrato de chumbo, lavados com água destilada, e examinados em um 
microscópio eletrônico de transmissão Zeiss CEM 900 (Zeiss). 
Para a simples visualização das MVs, um protocolo similar foi seguido, 
porém sem os passos de marcação com anexina V e estreptavidina. 
 
3.6 ENSAIO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA 
A ativação da protrombina pelo complexo protrombinase (fator Xa/fator Va) 
foi realizada em 50 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 1 mg/mL 
de BSA, pH 7,5 (tampão HEPES-BSA). Fator Xa (10 pM, concentração final) foi 
incubado com Fator Va (1 nM, concentração final), na presença de MVs, por 2 
min a 37°C. A reação foi então iniciada pela adição de protrombina (500 nM, 
concentração final), e alíquotas de 10 µL foram removidas a cada 1 min e 
adicionadas a poços de microplaca contendo 40 µL de tampão Tris-EDTA. Após a 
adição de 50 µL do peptídeo sintético S-2238 200 µM (substrato cromogênico 
para trombina preparado em tampão Tris-EDTA – Chromogenix), a absorbância a 
405 nm foi lida a 37°C, por 20 min, a intervalos de 6 s, através de um leitor de 
microplacas Thermomax Microplate Reader (Molecular Devices). Velocidades 
(mOD/min) obtidas nos primeiros minutos de reação foram utilizadas para o 
cálculo da concentração de trombina formada. 
 35
O efeito da anexina V sobre a formação de trombina foi ainda analisado 
através da incubação de MVs (3,6 x 104/mL) com concentrações variáveis de 
anexina V (0-100 nM) por 5 min a 37°C em tampão HEPES-BSA. MVs foram 
então incubadas com fator Xa (10 pM) e fator Va (1 nM) por 2 min a 37°C, e, em 
seguida, com protrombina (500 nM). Alíquotas de 10 µL foram removidas após 5 
min, e adicionadas a poços de microplaca contendo 40 µL de tampão Tris-EDTA. 
A concentração de trombina formada foi avaliada como descrito anteriormente, 
utilizando-se o substrato cromogênico S-2238. 
 
3.7 QUANTIFICAÇÃO DE TGF-Β1 EM CO-CULTURAS DE MACRÓFAGOS E 
MVS DE MELANOMA B16F10 
Macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, ativados com tioglicolato 
(Sigma-Aldrich), foram recolhidos e lavados em meio DME contendo 10% (v/v) de 
SFB (suplementado como descrito anteriormente). Após contagem de células, 5 x 
105 macrófagos foram crescidos em placa de 24 poços (TPP), mantidos a 37°C, 
em estufa com 5% de CO2. Após 2 h de incubação para aderência, células foram 
lavadas e cultivadas na presença de MVs de melanoma B16F10 (pré-incubadas 
ou não com anexina V Pharmingen diluída 1:250 por 15 min) por 12-18 h a 37°C, 
em meio DME livre de soro. A liberação de TGF-β1 nos sobrenadantes das co-
culturas foi então analisada por ELISA (DuoSet kit; R&D Systems). 
 
3.8 ESTABELECIMENTO IN VIVO DO MELANOMA B16F10: MODELO DE 
METÁSTASE 
 36
Camundongos isogênicos C57BL/6 ou BALB/c, de 6-8 semanas, foram 
inoculados por via intravenosa (veia lateral da cauda) com 104 células B16F10 
ressuspendidas em 100 μL de meio DME. Após duas a quatro semanas, os 
animais foram mortos por inalação de CO2, os pulmões foram removidos, e o 
número de nódulos tumorais pulmonares foi contado apenas na face convexa 
desse órgão (o que foi realizado com o auxílio de uma lupa). 
Para investigar o efeito de MVs de melanoma B16F10 nesse modelo, 
camundongos foram inoculados por via intravenosa com 5 x 104 MVs 
ressuspendidas em 100 μL de meio DME (pré-incubadas ou não com anexina V 
Pharmingen diluída 1:250 por 15 min), 2h antes ou ao mesmo tempo do inóculo 
de células B16F10. 
 
3.9 ATIVAÇÃO DA COAGULAÇÃO SANGUÍNEA IN VITRO 
A habilidade de MVs estudadas em potencializar a coagulação sanguínea 
in vitro foi avaliada através de ensaio de recalcificação do plasma, de acordo com 
o seguinte protocolo: 50 μL de plasma murino pobre em plaquetas contendo 
citrato de sódio (citrato de sódio 3,8%, 1:9, v/v) foi incubado com 50 μL de 
microvesículas ressuspendidas em PBS, em diferentes concentrações – ou ainda, 
com 50 μL apenas de PBS –, por 1 min a 37 oC. Adicionou-se então 100 μL de 
CaCl2 6,25 mM, e o tempo necessário para ocorrência de coagulação foi 
monitorado em um Coagulômetro KC-4 micro Amelung (Amelung Ltd, Diagnostic 
Grifols). 
 
 37
3.10 PURIFICAÇÃO DE MVS A PARTIR DO PLASMA DE CAMUNDONGOS 
C57BL/6 INOCULADOS COM CÉLULAS DE MELANOMA TM1 OU 
MELANÓCITOS MELAN-A 
Camundongos isogênicos C57BL/6, de 6-8 semanas, foram inoculados por 
via subcutânea com 5 x 105 células Tm1 ou melan-A ressuspendidas em 100 μL 
de meio DME, ou apenas com o veículo de inoculação. Após 17 dias, animais 
foram anestesiados e amostras de sangue foram recolhidas por punção cardíaca 
na presença de citrato de sódio (citrato de sódio 3,8%, 1:9, v/v). O plasma foi 
separado por centrifugação do sangue total, e purificado de acordo com o mesmo 
protocolo de purificação de MVs produzidas in vitro. A presença de MVs foi então 
analisada e quantificada por contagem em um citômetro de fluxo BD 
FACScalibur™ (Becton, Dickinson and Company). 
 
3.11 ANÁLISES ESTATÍSTICAS 
Teste t não pareado com correção de Welch foi realizado através do 
programa InStat (GraphPad). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 38
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 RESULTADOS 
 39
4.1 PAPEL DE MICROVESÍCULAS DE MELANOMA B16F10 NA 
METÁSTASE TUMORAL 
4.1.1 Células de melanoma B16F10 produzem microvesículas in vitro 
Células de melanoma murino B16F10, uma linhagem tumoral altamente 
metastática, foram selecionadas in vivo por sua alta capacidade de formar 
nódulos tumorais pulmonares em seu hospedeiro singeneico – a linhagem de 
camundongos isogênicos C57BL/6 – quando inoculadas por via intravenosa 
(FIDLER, 1973). A fim de investigar o papel da formação de MVs no 
estabelecimento do melanoma maligno, examinamos a produção in vitro destas 
estruturas pela linhagem celular B16F10, amplamente utilizada na literatura. 
Através de sucessivas centrifugações diferenciais de sobrenadantes de cultura 
dessas células, conseguimos isolar um precipitado de MVs, as quais foram 
caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e citometria de fluxo. 
Com a primeira técnica, pudemos observar fragmentos de membrana circulares, 
com uma morfologia relativamente homogênea, apresentando um diâmetro 
estimado de 200 nm – o qual se encaixa no padrão de tamanhos já descritos na 
literatura para essas estruturas (0,1-1 μm) – e carregando um material 
eletrondenso em sua porção interna, interpretado como melanina (Fig. 7A). Cabe 
ressaltar que a presença de DNA foi descartada pela marcação negativa com 
iodeto de propídeo e por análise em gel de agarose, o que as diferencia de corpos 
apoptóticos. Já a citometria de fluxo nos permitiu determinar um perfil de 
espalhamento de luz frontal/lateral dessas MVs (forward vs. side light scattering