CCS-D-LuizeGoncalvesLima

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Universidade Federal do Rio de Janeiro 
Centro de Ciências da Saúde 
Instituto de Bioquímica Médica 
 
 
 
 
 
LUIZE GONÇALVES LIMA 
 
 
 
ENVOLVIMENTO DE MICROVESÍCULAS CONTENDO 
FATOR TECIDUAL 
EM DIFERENTES ASPECTOS DA BIOLOGIA 
TUMORAL 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
Julho de 2012
 
ENVOLVIMENTO DE MICROVESÍCULAS CONTENDO 
FATOR TECIDUAL EM DIFERENTES ASPECTOS DA 
BIOLOGIA TUMORAL 
 
 
Luize Gonçalves Lima 
 
 
Tese submetida ao Instituto de Bioquímica 
Médica - IBqM da Universidade Federal do 
Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos 
requisitos necessários à obtenção do grau 
de Doutor(a) em Química Biológica 
 
 
 
 
Orientador: Dr. Robson Q. Monteiro 
Professor Associado do Instituto de Bioquímica Médica/CCS/UFRJ 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
Julho de 2012
ii 
 
Folha de Aprovação 
 
Luize Gonçalves Lima 
 
ENVOLVIMENTO DE MICROVESÍCULAS CONTENDO FATOR 
TECIDUAL EM DIFERENTES ASPECTOS DA BIOLOGIA TUMORAL 
 
Rio de Janeiro, 04 de julho de 2012. 
 
_______________________________________ 
(Dr. Robson de Queiroz Monteiro, Prof. Associado do IBqM, UFRJ) 
 
_______________________________________ 
(Dr. Mauro Sérgio Gonçalves Pavão, Prof. Associado do IBqM, UFRJ) 
 
_______________________________________ 
(Dra. Thereza Christina Barja Fidalgo, Professora Associada do Departamento de 
Biologia Celular, IBRAG, UERJ) 
 
_______________________________________ 
(Dr. João Paulo de Biaso Viola, Pesquisador Titular da Divisão de Biologia Celular, 
INCa) 
 
_______________________________________ 
(Dr. Andre Marco de Oliveira Gomes, Prof. Adjunto do IBqM, UFRJ) 
 
_______________________________________ 
(Dra. Elvira Maria Saraiva Chequer Bou Habib, Professora Associada do Instituto de 
Microbiologia Professor Paulo de Góes, UFRJ) 
iii 
 
Ficha Catalográfica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lima, Luize Gonçalves. 
Envolvimento de microvesículas contendo fator tecidual 
em diferentes aspectos da biologia tumoral / Luize Gonçalves 
Lima. -- Rio de Janeiro: UFRJ / IBqM, 2012. 
xvi, 108f. : il. 
Orientador: Robson de Queiroz Monteiro 
Tese (doutorado) – Universidade Federal do Rio de 
Janeiro / Instituto de Bioquímica Médica / Programa de Pós-
Graduação em Química Biológica, 2012. 
Referências bibliográficas: f. 83-95 
1. Microvesículas. 2. Coagulação. 3. Câncer. - Tese. I. 
Monteiro, Robson de Queiroz. II. Universidade Federal do Rio 
de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-
Graduação em Química Biológica. III. Título. 
iv 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À minha querida vó Cecília 
Por todo amor e dedicação 
v 
 
Agradecimentos 
 
Ao meu marido, Osny, por todo amor, carinho e respeito dedicados. Agradeço 
pelo apoio constante e por todos os momentos compartilhados, das vitórias felizes 
às horas de maior ansiedade e estresse. Obrigada por estar sempre ao meu lado 
durante a construção de meu caminho pessoal e profissional, me ajudando a corrigir 
os erros trilhados e a enxergar (e me orgulhar de) os passos acertados. 
 Aos meus pais e heróis. Obrigada por TUDO. É impossível descrever em 
palavras a minha gratidão. Vocês me deram “um espaço maior no mundo”. “O 
espaço daqueles que podem compreender melhor o mundo em que vivem e 
fazerem-se mais compreendidos por ele... através do conhecimento e do amor”. 
Palavras lindas que me foram concedidas tão generosamente em uma dedicatória 
de livro, no momento em que “ganhei o domínio da leitura”. Deixo meus 
agradecimentos representados no bom uso que sempre tentei fazer desse espaço... 
Aos meus irmãos, especialmente a meu eterno ‘maninho’ Rafael, assim como 
aos meus queridos cunhadas e cunhados, pela nossa relação de amizade e por todo 
companheirismo. E as minhas sobrinhas e sobrinhos lindos, por tornarem minha vida 
mais alegre e completa com a paixão que sinto por vocês. 
A vocês, meus “irmãos por opção”, amigos que escolhi para fazerem parte de 
minha vida, obrigada pela amizade e carinho irrestritos. 
Dani Sanches, Dani Rey, Tuane e Mari, um especial “obrigada” por todas as 
felicidades e angústias, profissionais e pessoais, divididas nesses últimos anos; e a 
Cynthia, Patricia e Rafael, obrigada por fazerem “valer a pena”. 
Aos amigos do IBqM, do Laboratório de Hemostase e Venenos e, em 
especial, ao grupo “Coagulação e Câncer”. Andréa, Andreia, Angélica, Araci, 
Camilla, Carol, Dani, Giana, Jorgeane, Ju, Mayara, Natália, obrigada pelas 
conversas, viagens, experiências e experimentos compartilhados. Flávia, Lu e Tati, 
obrigada por toda amizade, pelos encontros felizes e por viverem momentos tão 
importantes da minha vida como se fossem seus. 
Ao Robson, para o qual me faltam palavras. Obrigada por todo 
direcionamento, por todo investimento em minha formação, pela confiança sempre 
depositada em meu trabalho, e pela liberdade que sempre tive em expressar minhas 
ideias e colocá-las em prática. Obrigada por ser mais do que um simples orientador. 
Agradeço pela paciência em ouvir todos os meus desabafos e por nunca me impedir 
de tomar as minhas próprias decisões, sem jamais deixar de colocar sua opinião. 
Obrigada por me permitir tornar a profissional que hoje sou. A você, devo 
imensamente a conquista desse “momento”. 
vi 
 
Aos professores/colaboradores Dra. Cristina Vicente, Dra. Lina Zingali, Dra. 
Maria Isabel Rossi, Dra. Sandra König, Dra. Vivian Rumjanek, Dr. Ernesto de Meis, 
Dr. Lars Petersen, Dr. Martin Bonamino e Dr. Roger Chammas, que de alguma 
forma contribuíram para a realização desse trabalho, seja através da troca de ideias 
e da disponibilidade constante, dos reagentes e materiais emprestados, ou ainda, 
dos ensinamentos compartilhados para sempre. Ao Dr. Marcello Barcinski, agradeço 
especialmente por ser um grande exemplo, o qual procurei sempre seguir durante 
minha formação. 
Ao Dr. Andre Gomes, pela revisão e acompanhamento da tese sempre tão 
cuidadosos. 
Às agências e instituições de fomento (CNPq, CAPES, Faperj e Fundação do 
Câncer), pelo importante suporte financeiro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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“Não são as respostas que movem o mundo. São as perguntas.”, 
Já dizia a vinheta do Canal Futura... 
Ou seria o mundo o que move as perguntas? 
O que eu sei? Só sei que a resposta do professor nunca me satisfez... 
viii 
 
Resumo 
A produção de microvesículas (MVs) por células tumorais tem sido implicada em 
uma variedade de processos biológicos, incluindo o estabelecimento de estados 
hipercoaguláveis associados ao câncer. Ao mesmo tempo, sabe-se que fatores 
hemostáticos desempenham um papel crucial em diversos aspectos da biologia 
tumoral. Em particular, a expressão da proteína iniciadora da cascata de coagulação 
Fator Tecidual (FT) tem sido frequentemente correlacionada com o perfil de 
agressividade de células neoplásicas. Nesse contexto, examinamos a produção de 
MVs por diferentes linhagens celulares tumorais, assim como a presença de FT 
nessas estruturas, investigando seu papel no estabelecimento de estados pró-
trombóticos e em outros processos celulares importantes para a biologia do tumor. 
Primeiramente, caracterizamos as propriedades pró-coagulantes e pró-trombóticas 
de MVs produzidas pela linhagem de melanoma Tm1, tal como comparada à sua 
linhagem parental de melanócitos não-tumorigênicos (melan-a). Células tumorais 
exibiram uma taxa de produção de MVs cerca de duas vezes maior do que a 
observada para melanócitos. MVs de melanoma, por sua vez, apresentaram uma 
atividade pró-coagulante mais pronunciada, assim como níveis elevados de FT em 
sua superfície. Esses resultados se refletiram em um maior potencial pró-trombótico 
in vivo, o qual foi dependente de FT. Análises do plasma de camundongos com 
melanoma demonstraram a presença de MVs tumorais pró-coagulantes,positivas 
para FT, na circulação desses animais. Uma vez que FT pode ser incorporado em 
MVs tumorais, as quais são capazes de transferir seu conteúdo membranar e 
intravesicular entre diferentes células, analisamos então o compartilhamento de MVs 
contendo FT entre linhagens celulares de câncer de mama com diferentes perfis de 
agressividade. Como esperado, células MDA-MB-231, altamente invasivas e 
metástaticas, apresentaram maiores níveis de FT funcional em sua superfície, 
quando comparadas à linhagem celular menos agressiva MCF7. De acordo com 
essa observação, MVs derivadas de células MDA-MB-231 exibiram um maior 
potencial pró-coagulante, assim como uma maior capacidade de promover a 
formação do complexo tenase extrínseco (FT/Fator VIIa/Fator X), dependente de FT. 
Finalmente, a incubação dessas MVs com a linhagem celular MCF7, inicialmente 
incapaz de sustentar a ativação de FX por esse mesmo complexo, promoveu um 
ganho de atividade de FT por estas células. Tal mudança foi inibida pelo pré-
tratamento de MVs com um anticorpo neutralizante anti-FT ou anexina V, que 
bloqueia resíduos do fosfolipídio fusogênico fosfatidilserina na superfície de MVs. 
Em conjunto, nossos dados sugerem que a transformação maligna aumenta a 
produção de MVs trombogênicas, as quais parecem estar envolvidas na patogênese 
dos estados trombofílicos relacionados ao câncer. Além disso, o compartilhamento 
de MVs tumorais contendo a proteína pró-coagulante FT entre diferentes populações 
de células neoplásicas indica uma possível contribuição dessas estruturas para a 
propagação de um fenótipo agressivo associado à presença de FT entre 
subpopulações celulares heterogêneas presentes em um mesmo tumor. 
 
 
 
ix 
 
Abstract 
Shedding of microvesicles (MVs) by cancer cells is implicated in a variety of 
biological effects, including the establishment of cancer-associated hypercoagulable 
states. At the same time, it is known that hemostatic factors play a critical role in 
diverse aspects of tumor biology. In particular, the expression of the clotting initiator 
protein tissue factor (TF) has been frequently correlated with cancer cell 
aggressiveness. In this context, we examined MVs production by different tumor cell 
lines, as well as the TF content of these structures, and investigated its role on the 
establishment of prothrombotic states and other cellular processes related to tumor 
biology. First, we characterized the procoagulant and prothrombotic properties of 
MVs produced by the melanoma cell line Tm1 as compared to its parental non-
tumourigenic melanocyte-derived cell line (melan-a). Tumour cells exhibited a two-
fold higher rate of MVs production as compared to melan-a. Melanoma MVs 
displayed a more pronounced procoagulant activity and elevated levels of surface 
TF. These results were reflected in a higher prothrombotic potential in vivo, which 
was TF-dependent. Analysis of plasma obtained from melanoma-bearing mice 
showed the presence of TF-positive procoagulant tumor-derived MVs at the 
circulation of these animals. Since TF was shown to be incorporated into tumor-
derived MVs, which may transfer their membrane and intravesicular cargo between 
different cells, we then analyzed the exchange of TF-bearing MVs between breast 
cancer cell lines with different aggressiveness potential. As expected, the highly 
invasive and metastatic MDA-MB-231 cells displayed higher levels of functional TF 
on their surface when compared to the less aggressive cell line MCF-7. Accordingly, 
MVs derived from MDA-MB-231 cells exhibited a higher procoagulant potential, as 
well as a greater ability to promote the assembly of the TF-dependent extrinsic 
tenase complex (TF/Factor VIIa/Factor X). Finally, incubation of MDA-MB-231 MVs 
with the MCF7 cell line, initially incapable to support factor X activation by this same 
complex, rendered these cells a significant gain of TF activity. This change was 
inhibited by pretreatment of MVs with an anti-TF neutralizing antibody or annexin V, 
which blocks fusogenic phosphatidylserine sites on MVs surface. Altogether our data 
suggest that malignant transformation increases the production of thrombogenic 
MVs, which seem to be involved in the pathogenesis of cancer-related thrombophilic 
states. Furthermore, the exchange of TF-bearing MVs between different populations 
of cancer cells indicates a possible contribution of these structures to the propagation 
of a TF-related aggressive phenotype among heterogeneous cell subsets present in 
a tumor. 
 
 
x 
 
Lista de Siglas e Abreviaturas 
 
ADP adenosina difosfato 
ATP adenosina trifosfato 
BSA albumina sérica bovina 
DME Dulbecco’s Modified Eagle (meio de cultura) 
EDTA ácido etilenodiaminotetracético 
EGFR receptor do fator de crescimento epidérmico 
FasL proteína ligante do receptor Fas 
FSC espalhamento de luz frontal 
FT fator tecidual 
FVa fator V ativado 
FVIIa fator VII ativado 
FX fator X 
FXa fator X ativado 
FXIII fator XIII 
GFP proteína fluorescente verde 
i.v. por via intravenosa 
JNK1 quinase c-jun n-terminal 1 
MAA antígeno associado a melanoma 
MAPK proteína quinase ativada por mitógenos 
MEC matriz extracelular 
MIF média geométrica global de intensidade de fluorescência 
MV(s) microvesícula(s) 
PAR receptor ativado por protease 
PBS salina tamponada por fosfato 
xi 
 
PMA forbol 12-miristato 13-acetato 
PPP plasma pobre em plaquetas 
PS fosfatidilserina 
PSGL-1 glicoproteína ligante de P-selectina 1 
RNA ácido ribonucleico 
RT-PCR reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa 
s.c. por via subcutânea 
SFB soro fetal bovino 
SSC espalhamento de luz lateral 
TEP tromboembolismo pulmonar 
TEV tromboembolismo venoso 
TVP trombose venosa profunda 
VEGF fator de crescimento do endotélio vascular 
 
xii 
 
Lista de Figuras 
 
Figura 1. Mecanismos associados ao processo de formação de MVs ............ 06 
Figura 2. Composição de MVs ......................................................................... 08 
Figura 3. Exemplos de análises morfológicas de MVs produzidas por 
diferentes células tumorais .............................................................................. 11 
Figura 4. Esquema simplificado do processo de coagulação sanguínea in 
vivo ................................................................................................................... 15 
Figura 5. Ativação extravascular da coagulação no câncer ............................ 22 
Figura 6. Ativação intravascular da coagulação no câncer ............................. 26 
Figura 7. Tipos de interações entre MVs e células-alvo .................................. 30 
Figura 8. Produção de MVs pró-coagulantes pelas linhagens celulares 
melan-a e Tm1 ................................................................................................. 50 
Figura 9. Exposição de PS e montagem do complexo pró-coagulante 
protrombinase na superfície de MVs derivadas de células Tm1 e melan-a .... 51 
Figura 10. Expressão de FT por células melan-a e Tm1 ................................. 53 
Figura 11. Detecção de FT na superfície de MVs derivadas de células Tm1 
e melan-a por citometria de fluxo .................................................................... 53 
Figura 12. Formação do complexo tenase extrínseco na superfície de 
melanócitos melan-a e células de melanoma Tm1 ......................................... 54 
Figura 13. Formação do complexo tenase extrínseco na superfície de MVs 
derivadas de melanócitos melan-a e de células de melanoma Tm1 ............... 55 
Figura 14. Efeito de MVs derivadas de células melan-a e Tm1 sobre a 
formação de trombo arterial em camundongos ............................................... 57 
Figura 15. Efeito do antagonista de FT, FFR-FVIIa, sobre a atividade 
trombogênica de MVs derivadas de células de melanoma B16F10 ................ 58 
Figura 16. Acúmulo de MVs derivadas de células B16F10 GFP+ no sítio deinjúria vascular ................................................................................................. 59 
xiii 
 
Figura 17. Presença de MVs em plasma de camundongos inoculados com 
células Tm1 ou melan-a ................................................................................... 60 
Figura 18. Atividade pró-coagulante de MVs tumorais obtidas a partir do 
plasma de camundongos inoculados com células de melanoma .................... 62 
Figura 19. Expressão de FT por células de carcinoma de mama humano 
MCF7 e MDA-MB-231 ..................................................................................... 63 
Figure 20. Análise da atividade pró-coagulante de células MCF7 e MDA-MB-
231 ................................................................................................................... 64 
Figura 21. Produção de MVs pelas linhagens celulares MCF7 e MDA-MB-
231 ................................................................................................................... 65 
Figura 22. Análise da atividade pró-coagulante de MVs derivadas de células 
MCF7 e MDA-MB-231 ..................................................................................... 66 
Figura 23. Análise da atividade de FT de células MCF7 co-cultivadas com 
MVs derivadas de células MDA-MB-231 ......................................................... 68 
Figura 24. Efeito inibitório da anexina V e de um anticorpo neutralizante anti-
FT humano sobre o ganho de atividade de FT por células MCF7 co-
cultivadas com MVs derivadas de células MDA-MB-231 ................................ 69 
 
xiv 
 
Lista de Tabelas 
 
Tabela 1. Possível significado funcional de moléculas presentes em 
MVs tumorais ................................................................................................... 12 
Tabela 2. Comparação fenotípica entre células de melanoma Tm1 
e melanócitos melan-a ..................................................................................... 38 
Tabela 3. Comparação dos níveis de agressividade entre as linhagens 
celulares de câncer de mama MCF7 e MDA-MB-231 ..................................... 38 
 
 
xv 
 
Sumário 
 
1. Introdução .................................................................................................. 01 
1.1 Microvesículas ........................................................................................... 02 
1.1.1 Breve histórico ........................................................................................ 03 
1.1.2 Mecanismos de formação de microvesículas ......................................... 04 
1.1.3 Composição e papéis biológicos desempenhados por microvesículas .. 07 
1.2 Microvesículas e câncer ............................................................................ 10 
1.3 Distúrbios da coagulação sanguínea no câncer ........................................ 13 
1.3.1 Cascata de coagulação sanguínea ......................................................... 13 
1.3.2 Câncer e trombose: considerações clínicas ........................................... 16 
1.3.3 Bases moleculares e celulares da trombose no câncer ......................... 18 
1.3.3.1 Ativação de células vasculares ............................................................ 19 
1.3.3.2 Expressão de FT e exposição de PS por células tumorais ................. 20 
1.3.3.3 Participação de microvesículas na trombogênese associada ao 
câncer .............................................................................................................. 22 
1.3.4 Papel de fatores hemostáticos na progressão tumoral ........................... 26 
1.4 Microvesículas como mediadores de comunicação intercelular no 
microambiente tumoral .................................................................................... 29 
1.5 Papel de microvesículas contendo FT na biologia do câncer .................... 32 
2. Objetivos ..................................................................................................... 34 
2.1 Objetivo geral ............................................................................................. 35 
2.2 Objetivos específicos ................................................................................. 35 
3. Materiais e métodos .................................................................................. 36 
3.1 Cultivo de células ....................................................................................... 37 
 
xvi 
 
3.2 Purificação de MVs secretadas em sobrenadantes de cultura de 
linhagens celulares .......................................................................................... 39 
3.3 Análises por citometria de fluxo ................................................................. 39 
3.4 Ativação da coagulação sanguínea in vitro ............................................... 41 
3.5 Ensaio de ativação de protrombina ........................................................... 41 
3.6 Ensaio de ativação de fator X ................................................................... 42 
3.7 Isolamento de RNA e reação em cadeia da polimerase após transcrição 
reversa (RT-PCR) ............................................................................................ 43 
3.8 Geração da linhagem B16F10-GFP .......................................................... 44 
3.9 Trombose arterial induzida por injúria fotoquímica .................................... 45 
3.10 Microscopia de fluorescência ................................................................... 45 
3.11 Isolamento de MVs a partir de plasmas de camundongos inoculados 
com células de melanoma ou melanócitos ...................................................... 46 
3.12 Ensaios de transferência intercelular de MVs .......................................... 47 
3.13 Utilização de animais de experimentação ............................................... 47 
3.14 Análises estatísticas ................................................................................ 48 
4. Resultados .................................................................................................. 49 
4.1 Análise da atividade pró-coagulante e pró-trombótica de MVs produzidas 
por células tumorais ......................................................................................... 50 
4.1.1 A transformação maligna está associada a uma maior exposição de 
FT na superfície de MVs .................................................................................. 50 
4.1.2 MVs derivadas de células de melanoma aceleram a formação de 
trombos in vivo ................................................................................................. 57 
4.1.3 MVs derivadas de células de melanoma migram para a artéria carótida 
após indução de injúria vascular ...................................................................... 59 
4.1.4 Camundongos inoculados s.c. com células de melanoma apresentam 
MVs tumorais pró-coagulantes circulantes ...................................................... 61 
 
xvii 
 
4.2 Análise da transferência de fator tecidual entre diferentes populações de 
céulas tumorais através de MVs ...................................................................... 64 
4.2.1 Células de câncer de mama mais agressivas apresentam maiores 
níveis de FT ..................................................................................................... 64 
4.2.2 Perfil pró-coagulante de MVs produzidas pelas linhagens celulares 
MDA-MB-231 e MCF7 ..................................................................................... 66 
4.2.3 FT pode ser transferido de maneira funcional entre diferentes 
linhagens de câncer de mama através de MVs ............................................... 68 
5. Discussão ................................................................................................... 72 
6. Conclusão................................................................................................... 81 
7. Referências ................................................................................................. 83 
Anexos ............................................................................................................ 96 
Anexo 1. Malignant transformation in melanocytes is associated with 
increased production of procoagulant microvesicles ....................................... 97 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
2 
 
Embora muitos avanços tenham sido alcançados no entendimento da 
patogênese do câncer, muitos processos ainda são pouco compreendidos. Estudos 
recentes têm demonstrado a produção de fragmentos celulares, denominados 
microvesículas, em diferentes patologias, incluindo o câncer. Apesar do grande 
interesse nesse fenômeno, assim como seu crescente reconhecimento como uma 
característica típica de neoplasias malignas, sua importância na progressão tumoral 
ainda não está inteiramente esclarecida. Nos últimos anos, a participação de 
microvesículas tem sido sugerida em processos tumorais como angiogênese, 
metástase, e estabelecimento de estados pró-trombóticos. Tais fenômenos são de 
reconhecida implicação no curso do câncer, e seu melhor entendimento seria de 
grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento e 
prognóstico desta doença. 
 
1.1 MICROVESÍCULAS 
Microvesículas (MVs) são fragmentos liberados a partir da membrana 
plasmática de células normais ou malignas, quando estas são submetidas a 
determinadas condições de estresse fisiológico, como ativação celular e apoptose 
(FREYSSINET, 2003; RATAJCZAK et al., 2006b). Estas estruturas circulares 
apresentam tamanho heterogêneo (0,1-1 µm de diâmetro) e composição variada, a 
qual reflete sua origem celular. MVs transportam principalmente proteínas e lipídios 
presentes na membrana plasmática das células a partir das quais são liberadas. 
Além disso, podem conter moléculas provenientes do meio intracitoplasmático, 
incluindo ácidos nucleicos e proteínas. Sua presença em diferentes fluidos 
biológicos, como sangue periférico, urina e ascites, já foi demonstrada por diversos 
3 
 
trabalhos na literatura e, nos últimos anos, um interesse crescente tem sido 
observado em relação a suas possíveis funções biológicas. 
 
1.1.1 Breve Histórico 
A primeira evidência da existência de MVs surgiu ainda na década de 40, 
quando Chargaff e West observaram que frações subcelulares de soro e plasma 
humanos continham um fator precipitável que facilitava a geração de trombina e 
consequente formação de fibrina (CHARGAFF e WEST, 1946). Contudo, apenas em 
1967, com o surgimento de técnicas mais eficientes de microscopia eletrônica, Wolf 
foi capaz de demonstrar que este fator, obtido a partir da ultracentrifugação de 
plasma livre de plaquetas, consistia, na verdade, em pequenas vesículas derivadas 
da membrana celular de plaquetas ativadas, as quais apresentavam atividade pró-
coagulante comparável à célula de origem (WOLF, 1967). 
Desde então, a produção de MVs já foi descrita em diversos tipos celulares – 
o que inclui células epiteliais, hematopoiéticas, placentárias e fibroblastos (PAP et 
al., 2009) –, e vários termos já foram utilizados para denominar essas estruturas, 
originalmente chamadas de “poeira de plaquetas”. Estas mesmas MVs derivadas de 
plaquetas ativadas, p. ex., são atualmente mais conhecidas como “micropartículas”, 
enquanto MVs liberadas por leucócitos polimorfonucleares ativados são 
frequentemente chamadas de “ectossomos”. Apesar de produzidas por praticamente 
todas as células eucarióticas, grande ênfase tem sido dada ao estudo de MVs 
derivadas de células sanguíneas, provavelmente devido ao fato de estas serem 
componentes constitutivos do plasma humano normal, sendo secretadas por 
leucócitos, eritrócitos, células endoteliais e plaquetas. Além disso, MVs têm seu 
número aumentado no sangue periférico em processos como injúria celular, 
4 
 
inflamação, trombose, hipóxia, entre outros, e podem ser produzidas também por 
células neoplásicas (RATAJCZAK et al., 2006b). Isso explica os maiores níveis de 
MVs circulantes em pacientes com infecções, doenças cardiovasculares e câncer, 
além de evidenciar a grande relevância clínica desses fragmentos. 
 
1.1.2 Mecanismos de Formação de MVs 
A produção e liberação de MVs pode acontecer de maneira constitutiva, como 
no caso de grande parte das células tumorais, ou requerer sinais de ativação 
específicos, como por exemplo, a estimulação de plaquetas por trombina, ou de 
monócitos e células endoteliais por lipopolissacarídeo e diferentes citocinas 
(FREYSSINET, 2003). 
A etapa final de formação de MVs parece ocorrer através da indução de uma 
curvatura da membrana plasmática em direção ao meio extracelular e sua posterior 
fissão (COCUCCI, RACCHETTI e MELDOLESI, 2009). Apesar das bases 
moleculares desse fenômeno ainda não estarem completamente esclarecidas, sabe-
se que envolve gastos de energia, síntese de RNA e tradução proteica 
(MURALIDHARAN-CHARI et al., 2010), sugerindo a existência de um processo 
altamente regulado, o qual modularia a liberação dessas partículas. Além disso, 
eventos como o aumento dos níveis intracelulares de cálcio e a consequente 
ativação de proteases como a calpaína, que desestabiliza a ancoragem da 
membrana plasmática ao citoesqueleto através da clivagem de filamentos de actina 
e de outras proteínas a estes associadas (FOX et al., 1990; FOX et al., 1991; 
PICCIN, MURPHY e SMITH, 2007), parecem estar diretamente envolvidos nesse 
processo. 
5 
 
Outras duas enzimas presentes na membrana plasmática, em particular, têm 
sua atividade modulada pelos níveis aumentados de cálcio no citoplasma: 
aminofosfolipídio translocase e escramblase. A primeira, também conhecida como 
flipase dependente de adenosina trifosfato (ATP), é inibida por cálcio, além de ser a 
principal responsável pela manutenção da assimetria da membrana plasmática, uma 
vez que transporta os aminofosfolipídios fosfatidilserina (PS) e fosfatidiletanolamina 
da camada externa para a camada interna da membrana, de modo específico e 
contra seu gradiente de concentração. Já a segunda, ativada por cálcio, atua no 
transporte lipídico bidirecional não-específico. Em conjunto, a inibição da 
aminofosfolipídio translocase e a ativação da escramblase por altas concentrações 
de cálcio provocam o colapso da assimetria de membrana, levando a uma 
distribuição randômica de fosfolipídios entre ambas as faces da membrana 
plasmática. Tal processo é normalmente acompanhado pelo brotamento de MVs 
“simétricas” a partir da superfície celular; logo, a microvesiculação parece ser parte 
integrante do processo de remodelamento de membranas plasmáticas, estando 
intimamente ligada à externalização de PS (COMFURIUS et al., 1990; ZWAAL e 
SCHROIT, 1997). De fato, dados na literatura mostram que células provenientes de 
indivíduos portadores da Síndrome de Scott, uma desordem hemorrágica hereditária 
caracterizada por uma deficiência na atividade escramblase induzida por cálcio, 
apresentam uma redução do transporte de PS para a face externa da membrana 
plasmática, assim como uma incapacidade de liberar MVs a partir de sua superfície 
celular (TOTI et al., 1996; CASTAMAN et al., 1997), o que corrobora essa forte 
associação. 
Portanto, pode-se afirmar que ao menos o colapso da assimetria fosfolipídica 
de membrana e a degradação do citoesqueleto a ela associado pela protease 
6 
 
calpaína, ambos os eventos desencadeados pelo aumento da concentração de 
cálcio intracelular, são necessários para a formação de MVs (Fig. 1). 
 
 
Figura 1. Mecanismos associados ao processo de formação de MVs. Na 
presença de níveis elevados de cálcio, a distribuição aleatória de PS (representada 
na figuraem azul) entre ambas as camadas da membrana plasmática é induzida, 
através da regulação positiva e negativa das enzimas escramblase e 
aminofosfolipídio translocase, respectivamente, e a assimetria fosfolipídica é 
perdida; além disso, observa-se a ativação da enzima calpaína, provocando a 
degradação do citoesqueleto associado à membrana e permitindo a liberação de 
MVs expondo PS. Adaptado de ZWAAL e SCHROIT, 1997. 
 
Embora diferentes autores utilizem os termos MVs e exossomos para referir-
se a um grupo único de vesículas extracelulares, e ambos os tipos de partículas 
sejam gerados através de mecanismos de exocitose não-convencionais, revisões 
recentes da literatura têm discutido algumas diferenças capazes de separá-los em 
duas populações distintas. Em contraste com MVs, exossomos são formados 
intracelularmente, via invaginação endocítica, e posterior fusão de uma estrutura 
denominada corpo multivesicular com a membrana plasmática, liberando exossomos 
para o meio extracelular (SCHOREY e BHATNAGAR, 2008). Além disso, 
representam estruturas menores do que MVs, com diâmetro entre 50 e 80 nm e 
7 
 
morfologia mais homogênea, cuja purificação demanda diferentes ciclos de 
ultracentrifugação (cerca de 100.000 x g), enquanto MVs podem ser sedimentadas a 
velocidades mais baixas, em torno de 20.000 x g (MURALIDHARAN-CHARI et al., 
2010). Dessa forma, torna-se fundamental a consideração de tais características 
para melhor interpretação dos resultados gerados pelos mais diversos estudos 
publicados nessa área. 
 
1.1.3 Composição e papéis biológicos desempenhados por MVs 
Uma vez que MVs são fragmentos de membrana complexos, com uma rica 
composição molecular – herdada tanto da superfície quanto do meio 
intracitoplasmático de sua célula de origem –, é razoável supor que estas possam 
interagir com outras células e, dessa forma, influenciar sua biologia. A função de 
uma determinada população de MVs, por sua vez, estará sempre relacionada ao seu 
conteúdo de moléculas bioativas, o qual depende especialmente do tipo celular a 
partir do qual estas se originam. Micropartículas liberadas por plaquetas, p. ex., 
carregam a molécula de adesão P-selectina (NOMURA et al., 1995), essencial para 
sua interação com outras células vasculares, enquanto MVs geradas por trofoblastos 
apresentam em sua superfície o antígeno leucocitário humano HLA-G, além da 
proteína ligante de Fas (FasL) (PAP et al., 2009), ambos envolvidos na tolerância 
imune gestacional. 
Em contraste ao seu repertório proteico, o conteúdo lipídico de MVs 
permanece relativamente constante, assim como a distribuição de fosfolipídios entre 
as duas camadas (interna e externa) da membrana microvesicular, já discutida 
anteriomente. A presença de microdomínios de membrana enriquecidos em 
colesterol (os chamados “lipid rafts”) também já foi descrita em MVs de diferentes 
origens (LOPEZ, DEL CONDE e SHRIMPTON, 2005). 
8 
 
Finalmente, ácidos nucleicos, especialmente moléculas de RNA mensageiro e 
microRNA, também são encontrados em MVs, podendo participar da troca de 
informação genética entre diferentes células pertencentes a um dado microambiente 
celular (BAJ-KRZYWORZEKA et al., 2006; RATAJCZAK et al., 2006a; SKOG et al., 
2008a). 
É importante ressaltar que o conteúdo global de MVs muitas vezes distingue-
se daquele encontrado em sua célula parental, sugerindo um remodelamento 
específico e aquisição de funções especializadas. Nesse contexto, sabe-se, 
atualmente, que nem todas as proteínas da membrana celular são incorporadas em 
MVs; além disso, como vimos anteriormente, o fosfolipídio PS, normalmente 
presente na porção interna da membrana plasmática de células viáveis normais, 
encontra-se exposto na superfície de MVs, enquanto a topologia das proteínas 
incorporadas nessas partículas se mantém (Fig. 2). 
 
Figura 2. Composição de MVs. Apesar de liberadas diretamente a partir da 
membrana plasmática de sua célula parental, nem todas as proteínas originalmente 
presentes nesse compartimento celular encontram-se incorporadas na superfície de 
MVs (como exemplificado pela proteína multipass ilustrada em laranja), embora sua 
topologia se mantenha intacta. Receptores de membrana e proteínas solúveis, 
assim como ácidos nucleicos, têm sido encontrados em MVs. Estas parecem ser 
enriquecidas em alguns lipídios tais como colesterol, enquanto PS encontra-se 
realocada na porção externa da membrana celular especificamente em sítios de 
microvesiculação. Adaptado de MURALIDHARAN-CHARI et al., 2010. 
9 
 
Vários autores têm abordado o papel de MVs em diferentes processos 
fisiológicos e patológicos, tais como modulação do sistema imune (na inflamação e 
durante a gravidez), participação no sistema hemostático e envolvimento na biologia 
tumoral, levando-nos a considerá-las como parte importante e integral do ambiente 
intercelular. 
Tomando o compartimento vascular como modelo, podemos citar várias 
respostas biológicas desencadeadas por MVs. Micropartículas derivadas de 
plaquetas ativadas, p. ex., são capazes de ativar células endoteliais, leucócitos e, 
inclusive, suas próprias células de origem. Essa ativação pode desencadear 
processos como: agregação plaquetária e produção de prostaglandinas pelo 
endotélio (BARRY et al., 1997); e aumento da aderência entre monócitos e células 
endoteliais, provocado pela regulação positiva de moléculas de adesão em ambos 
os tipos celulares (BARRY et al., 1998). Tais efeitos parecem ser mediados pela 
transferência intercelular de ácido aracdônico, um lipídio bioativo presente nestas 
micropartículas, e envolvem, pelo menos em parte, a participação de moléculas 
como fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-K), proteína quinase C (PKC) e proteínas 
quinases ativadas por mitógenos (p42/p44, p38, e JNK1) na ativação de diferentes 
vias de sinalização celular (BARRY et al., 1999). Já MVs produzidas por leucócitos 
humanos apresentaram a capacidade de modular o potencial inflamatório e pró-
coagulante de células endoteliais de veia umbilical humana, através da indução da 
liberação de citocinas como a proteína quimiotática de monócitos, MCP-1, e a 
interleucina 6, além da expressão da proteína pró-coagulante Fator Tecidual, com 
envolvimento de vias de sinalização possivelmente associadas à fosforilação da 
quinase JNK1 (MESRI e ALTIERI, 1999). Do mesmo modo, MVs derivadas de 
células endoteliais ativadas foram capazes de interagir com células da linhagem 
10 
 
monocítica THP-1, estimulando sua atividade pró-coagulante (SABATIER et al., 
2002). Paralelamente, o aumento dos níveis circulantes de MVs tem sido observado 
em diferentes patologias com envolvimento vascular e inflamatório, incluindo sepse, 
diabetes mellitus e aterosclerose (PICCIN, MURPHY e SMITH, 2007), corroborando 
a importância dessas estruturas nesse contexto. 
Alguns estudos têm discutido ainda a produção de MVs como um importante 
fator na regulação das interações imunológicas entre mãe e feto (PAP et al., 2009) 
durante a gravidez. Na gestação normal, o número absoluto de MVs plasmáticas 
maternas encontra-se aumentado, e, de maneira geral, o conjunto de MVs formadas 
a partir de diferentes células e tecidos parece induzir um estado de tolerância 
imunológica em relação ao feto. Isso inclui a regulação negativa de células T 
citotóxicas e células NK maternas, assim como o recrutamento de macrófagos 
capazes de modular a resposta inflamatória nesse microambiente. Por outro lado, 
em distúrbios da gravidez como a pré-eclampsia, o desequilíbrio desse balanço 
homeostático parece estar intimamente associado com mudanças no padrão e na 
natureza de MVs circulantes, indicando funções opostas para estas partículas no 
âmbito gestacional. 
Embora o fenômeno de vesiculação seja observado em diversos tipos 
celulares, com efeitos extremamente variados, estudos atuais vêm acumulando-se 
na investigação do papel de MVs no câncer e na coagulação sanguínea.1.2 MICROVESÍCULAS E CÂNCER 
Em 1978, Friend e colaboradores relataram, pela primeira vez, a presença de 
MVs em culturas de células do baço e linfonodo de um paciente com doença de 
Hodgkin (FRIEND et al., 1978). Dois anos mais tarde, a produção espontânea de 
11 
 
MVs por células de uma linhagem de melanoma murino altamente metastática, 
B16F10, foi observada por Poste e Nicolson, os quais demonstraram ainda a 
capacidade dessas partículas de estimular o potencial metastático de uma linhagem 
de melanoma murino menos agressiva, B16F1 (POSTE e NICOLSON, 1980). A 
partir daí, pode-se constatar um interesse crescente pelo papel das MVs na 
progressão tumoral, devido, sobretudo, à grande quantidade de estudos 
demonstrando um aumento significativo de MVs em fluidos de pacientes 
oncológicos, assim como um acúmulo frequente dessas estruturas em culturas de 
células neoplásicas (Fig. 3). 
 
 
Figura 3. Exemplos de análises morfológicas de MVs produzidas por diferentes 
células tumorais. (A-E) Microscopia eletrônica de varredura. (F) Microscopia 
eletrônica de transmissão. (A) Geração de MVs na superfície de células de glioma 
humano U373vIII. (B e C) MVs produzidas pelas mesmas células U373vIII, 
purificadas e observadas em diferentes aumentos (AL-NEDAWI et al., 2008). (D) 
MVs produzidas por células de carcinoma epidermóide A431 adsorvidas em beads 
de poli-L-lisina (AL-NEDAWI et al., 2009). Barra de escala = 1 µm. (E) MV derivada 
da linhagem de câncer de mama humano MDA-MB-231 (ANTONYAK et al., 2011). 
(F) MV derivada de células de glioblastoma humano U87 cultivadas sob condição de 
hipóxia (SVENSSON et al., 2011). 
 
Diversos autores já demonstraram a capacidade de MVs de interagir com 
células normalmente presentes no microambiente tumoral, como fibroblastos, células 
12 
 
endoteliais e diferentes tipos de leucócitos, modulando suas atividades 
(RATAJCZAK et al., 2006b). Dessa forma, vários efeitos relacionados a MVs têm 
sido descritos em diferentes aspectos da biologia tumoral, tais como angiogênese 
(JANOWSKA-WIECZOREK et al., 2005), escape da vigilância imune (VALENTI et 
al., 2007), degradação da matriz extracelular (MEC) (GINESTRA et al., 1998), 
capacidade metastática (LIMA et al., 2009), e ativação da coagulação sanguínea 
(DVORAK et al., 1981). Tais efeitos biológicos estão diretamente associados à 
natureza das moléculas presentes na superfície ou no meio interno dessas MVs. Na 
Tabela 1, estão relacionadas algumas moléculas presentes em MVs tumorais, assim 
como seu possível papel na progressão do tumor. 
 
Tabela 1. Possível significado funcional de moléculas presentes em 
MVs tumorais* 
 
Tipo de molécula Proteína de interesse Função 
Solúvel Metaloproteases de matriz 
(MMP-2 e MMP-9) 
Fator de crescimento do 
endotélio vascular (VEGF) 
Degradação da MEC após 
ruptura de MVs 
Promoção de angiogênese 
Associada à 
membrana 
Integrina β1 
ARF6 
FasL 
 
Fator Tecidual 
PS 
Adesão à MEC 
Liberação de MVs 
Promoção da apoptose de 
células T 
 
Formação de trombos 
Aumento do potencial 
metastático 
*Adaptado de MURALIDHARAN-CHARI et al., 2010. 
 
13 
 
Recentemente, grande interesse tem surgido pelo papel de MVs contendo a 
proteína iniciadora da cascata de coagulação sanguínea, Fator Tecidual (listada na 
Tabela 1), no contexto do câncer. De fato, essas estruturas têm sido implicadas na 
ativação da coagulação sanguínea e na consequente promoção dos estados 
trombofílicos observados nos pacientes oncológicos. A relação entre MVs, fatores da 
coagulação e câncer será mais bem discutida a seguir. 
 
1.3 DISTÚRBIOS DA COAGULAÇÃO SANGUÍNEA NO CÂNCER 
 
1.3.1 Cascata de coagulação sanguínea 
O processo de coagulação sanguínea é parte integrante de um importante 
mecanismo fisiológico denominado sistema hemostático, cuja função primordial 
consiste em reconhecer danos vasculares e recrutar uma apropriada combinação de 
células e enzimas, que levam à produção de um "tampão" insolúvel nos locais de 
lesão (constituído de plaquetas e fibrina), interrompendo assim a perda de sangue. A 
cascata de coagulação pode ser explicada de maneira simplificada como uma série 
de reações proteolíticas de ativação de zimogênios, que culmina na geração de 
grande quantidade de trombina, e consequente formação de um agregado insolúvel 
de fibrina a partir de uma proteína solúvel do plasma denominada fibrinogênio (Fig. 
4). Esse evento envolve, de forma geral, três importantes pilares: fatores de 
coagulação plasmáticos; íons cálcio; e superfícies celulares pró-coagulantes. 
Quando devidamente combinados, esses três grupos formam os diferentes 
complexos pró-coagulantes, que representam os efetores centrais do processo de 
coagulação. Em cada caso, uma enzima serino-protease ativa se liga ao seu co-fator 
proteico, na presença de íons Ca2+, de maneira a formar um complexo enzimático 
14 
 
em uma superfície celular. Em situações de injúria vascular, o complexo iniciador 
tenase extrínseco é formado quando a enzima fator VIIa (FVIIa), presente no 
plasma, entra em contato com o Fator Tecidual (FT), uma proteína transmembranar 
de 47 kD constitutivamente expressa na superfície de células sub-endoteliais e em 
alguns tecidos extravasculares (BROZE JR., 1995), mas que também pode estar 
presente na membrana de células vasculares ativadas como monócitos e células 
endoteliais. Esse complexo (FT/FVIIa) converte o zimogênio fator X (FX) em uma 
serino-protease ativa, o fator Xa (FXa). Este se dissocia de tal complexo e se 
associa ao co-fator proteico fator Va (FVa), íons Ca2+ e superfícies celulares ricas 
em fosfolipídios aniônicos, para formar o complexo protrombinase, que ativa o 
zimogênio protrombina na serino-protease trombina. Finalmente, a trombina 
promove a clivagem de fibrinogênio, permitindo a formação de polímeros de fibrina, 
que por sua vez darão origem ao coágulo de fibrina. O complexo tenase extrínseco 
converte ainda o zimogênio fator IX (FIX) na sua forma ativa, fator IXa (FIXa), que 
associado ao co-fator proteico fator VIIIa (FVIIIa), íons Ca2+ e fosfolipídios forma o 
complexo tenase intrínseco e também catalisa a ativação do FX. 
Como pode ser observado, membranas celulares são elementos essenciais 
para a ativação da coagulação sanguínea, tanto no início, durante a exposição de 
FT ao plasma, permitindo a montagem do complexo tenase extrínseco, quanto na 
fase de propagação da cascata, onde a presença de fosfolipídios aniônicos, em 
especial PS, é crítica para a formação dos complexos tenase intrínseco e 
protrombinase (KALAFATIS et al., 1994) (Fig. 4). 
 
15 
 
 
 
Figura 4. Esquema simplificado do processo de coagulação sanguínea in vivo. 
Reações da coagulação dependentes de superfícies de membrana (montagem dos 
principais complexos enzimáticos) estão representadas; cada serino-protease (VIIa, 
IXa e Xa) está associada ao seu co-fator proteico (TF, VIIIa e Va) e substrato 
apropriados (X, IX e II), em uma superfície de membrana expondo Fator Tecidual 
(TF, no caso do complexo tenase extrínseco) ou PS, representada em azul (no caso 
dos complexos tenase intrínseco e protrombinase). II = protrombina. Adaptado de 
KALAFATIS et al., 1994. 
 
A conservação da integridade do sistema vascular e, consequentemente, o 
bom funcionamento do sistema hemostático, são essenciais para a manutenção da 
vida humana, uma vez que este é responsável por funções vitais, que incluem o 
transporte de oxigênio e nutrientes para os tecidos e restos metabólicos para vias de 
excreção adequadas. Contudo, apesar da existência de mecanismos complexos de 
regulação, o processo hemostático pode acontecer também na ausência de dano 
vascular, levando à formação patológica de trombos no interior de vasos 
sanguíneos. O trombo é capaz de obstruir o fluxo sanguíneo no próprio local de sua 
geração, ou ainda, desprender-se da parede do vaso originando um êmbolo. Essaativação não específica do sistema hemostático está relacionada ao 
16 
 
desenvolvimento de diversas doenças tromboembólicas, tais como a trombose 
venosa profunda (TVP) e o tromboembolismo pulmonar (TEP), e ocorre em maior 
frequência em diferentes estados patológicos, como diabetes, aterosclerose, sepse 
e câncer. 
 
1.3.2 Câncer e trombose: considerações clínicas 
Há mais de um século, mais precisamente em 1865, Armand Trousseau 
descreveu a ocorrência de desordens trombóticas “inexplicáveis” em pacientes com 
câncer, em seu livro Clinique médicale de l’Hôtel-Dieu de Paris, e concluiu que 
eventos de coagulação sanguínea espontânea são comuns nesses indivíduos 
devido a uma “crise especial em seu sangue” (TROUSSEAU, 1865). Desde então, 
Trousseau tem sido frequentemente considerado o primeiro cientista a relatar a 
associação entre episódios de trombose e neoplasias malignas, emprestando 
inclusive seu nome à ocorrência de tromboflebite em pacientes portadores de 
neoplasias, a Síndrome de Trousseau. Atualmente, esta denominação abrange 
casos em que os eventos trombóticos inexplicados precedem o diagnóstico de uma 
neoplasia maligna oculta ou aparecem concomitantemente com o tumor. Contudo, já 
em 1823, Bouillard descreveu três pacientes com TVP e câncer, e sugeriu que os 
edemas periféricos observados em tais pacientes eram decorrentes da obstrução 
das veias por coágulos de fibrina (‘caillot fibrineux’) induzidos pelo processo 
neoplásico (BOUILLARD e BOUILLAUD, 1823). Além disso, ainda em 1856, 
Rudolph Virchow apresentou, em uma monografia sobre obstruções das artérias 
pulmonares, cinco pacientes com diferentes tipos de câncer que sucumbiram ao 
TEP e tiveram confirmado, pelo exame clínico e posterior necropsia, o diagnóstico 
de TVP (VIRCHOW, 1856). Com base nessas observações, ele atentou para a 
17 
 
relação entre tromboembolismo venoso (TEV) e doenças crônicas, incluindo o 
câncer. 
De fato, manifestações de síndromes trombóticas (incluindo tromboses 
arteriais e venosas, locais e sistêmicas) são bastante comuns em pacientes com 
câncer (HOFFMAN, HAIM e BRENNER, 2001), sendo a principal complicação clínica 
e a segunda causa de morte desses indivíduos (DONATI, 1995; MANDALA et al., 
2003). De maneira geral, quando comparados a outros tipos de pacientes, indivíduos 
com câncer apresentam um risco 6 a 7 vezes maior de desenvolverem TEV 
sintomático – com frequências similares para ambas as patologias TVP e TEP (HEIT 
et al., 2000; BLOM et al., 2005). Entre pequenos estudos de coorte e extensas 
análises baseadas em populações portadoras de neoplasias, a incidência de TEV 
clinicamente manifestado e confirmado variou de 1% a 4% (esta pode ser, contudo, 
uma análise subestimada, uma vez que estudos em necropsias constataram a 
presença de trombose em 50% dos pacientes sem o diagnóstico clínico de trombose 
no pre-mortem) (BULLER et al., 2007; DE MEIS et al., 2010). Além disso, se 
considerarmos a duração entre o diagnóstico do câncer e a ocorrência de TEV, 
observamos que nos primeiros 3 meses após o diagnóstico o risco de TEV é 
significativamente maior, com uma OR (odds ratio) = 54, enquanto no período de 3 a 
12 meses seguintes, a OR encontrada passa a ser igual a 14, finalmente caindo 
para 4 entre 12 e 36 meses (BULLER et al., 2007). 
Os principais determinantes para um maior risco de TEV em pacientes com 
câncer são: tipo de tumor, doença metastática, terapia antitumoral, infecção e 
passagem por cirurgias, além de fatores de risco clássicos, tais como imobilidade, 
idade e anormalidades pró-trombóticas de origem genética. Portadores da mutação 
fator V de Leiden, p. ex., em associação com doenças neoplásicas, apresentaram 
18 
 
um risco 12 vezes maior de desenvolverem TEV quando comparados a indivíduos 
com a mesma mutação, mas sem câncer (BLOM et al., 2005). 
Apesar de praticamente todas as neoplasias já terem sido associadas a 
manifestações tromboembólicas, sabe-se que o risco de TEV não é igual entre elas. 
Geralmente, os maiores riscos encontrados são para pacientes com doenças 
malignas hematológicas (linfomas e leucemias), tumores de pâncreas e tumores 
cerebrais, seguidos de perto por tumores de pulmão, além de tumores de fígado, 
estômago, bexiga, útero e rins. Vale notar, no entanto, que devido ao grande número 
de casos encontrados em certas neoplasias (como câncer de mama), apesar do 
risco de trombose não ser o mais elevado, podemos encontrar um grande número 
de pacientes com eventos trombóticos. 
Em relação à presença de metástase no momento do diagnóstico do câncer, 
o risco de surgimento de episódios de TEV parece ser de 4 a 13 vezes maior nesses 
pacientes, se comparado a casos de doença localizada (CHEW et al., 2006). 
 
1.3.3 Bases moleculares e celulares da trombose no câncer 
Corroborando os diversos dados clínicos que indicam uma íntima associação 
entre a progressão tumoral e o desenvolvimento de um estado de predisposição a 
distúrbios trombóticos, várias evidências moleculares e celulares da existência de 
um estado de hipercoagulabilidade nos pacientes com câncer já foram descritas. 
Análises histopatológicas demonstram a presença de depósitos de fibrina e de 
agregados de plaquetas dentro e em torno de diferentes tumores, indicando uma 
ativação local da coagulação. Além disso, alterações hemostáticas são encontradas 
em 60% a 100% dos portadores de neoplasias (incluindo aqueles sem quadro clínico 
de trombose), quando analisadas por meio de testes laboratoriais, sendo 
19 
 
caracterizadas por diferentes níveis de anormalidades na coagulação sanguínea, 
tais como: redução do tempo de tromboplastina parcial ativada; níveis elevados de 
proteínas da coagulação (fibrinogênio, fatores V, VIII, IX e X); trombocitose; aumento 
dos produtos de degradação de fibrina e fibrinogênio, entre outros (ZWICKER, 
FURIE e FURIE, 2007). 
Tais achados podem ser parcialmente explicados pela própria resposta do 
hospedeiro à neoplasia (inflamação), por uma mudança no metabolismo proteico e 
pela estase venosa. No entanto, diversos estudos têm demonstrado a importância 
das propriedades pró-coagulantes específicas das células tumorais. Diversos 
mecanismos têm sido propostos para explicar o estado trombofílico do paciente com 
câncer, dentre os quais podemos citar como principais: (i) a síntese de citocinas pró-
inflamatórias, por células de algumas neoplasias, ou devido à resposta imunológica 
antitumoral. Estas citocinas podem, p. ex., ativar células endoteliais e monócitos a 
expressarem moléculas pró-coagulantes em sua membrana externa; (ii) a interação 
direta entre as células tumorais e as células vasculares, resultando na ativação 
destas últimas; (iii) a síntese de moléculas pró-coagulantes pelas células tumorais, 
especialmente FT; (iv) a exposição do fosfolipídeo PS na parte externa da 
membrana das células tumorais, permitindo a geração de superfícies lipídicas que 
suportam a formação dos complexos da coagulação sanguínea; e (v) o aumento nos 
níveis plasmáticos de MVs com atividade pró-coagulante. 
 
1.3.3.1 Ativação de células vasculares 
As células neoplásicas, assim como a resposta imunológica antitumoral, 
produzem e liberam uma variedade de citocinas pró-inflamatórias, incluindo o fator 
de necrose tumoral alfa (TNFα), interleucina 1 beta (IL-1β) e interferon gama (IFN). 
20 
 
Estes mediadores podem estimular o endotélio e células circulantes (como 
monócitos) a expressarem FT, além de diminuir a expressão da trombomodulina 
(molécula importante para ativação da via anticoagulante da proteína C) (RICKLES e 
FALANGA, 2001; ZWICKER, FURIE e FURIE, 2007; DE MEIS et al., 2010). Além 
disso, estimulam a produção de inibidores da fibrinólise, como o inibidor do ativador 
do plasminogênio (PAI-1), aumentando ainda mais o potencial trombótico (DANO et 
al., 2005). 
Contudo, mediadores inflamatórios não são os únicos produtos envolvidosna 
associação entre desenvolvimento neoplásico e coagulação. As células malignas 
podem também produzir (ou induzir a produção de) VEGF, que por sua vez tem a 
capacidade de modular as funções endoteliais próximas ao tumor (Fig. 5), atrair 
macrófagos e induzir a expressão de FT em monócitos e células endoteliais 
(ZWICKER, FURIE e FURIE, 2007). O VEGF está implicado ainda na produção de 
novos vasos sanguíneos (neoangiogênese) que irão alimentar o crescimento 
neoplásico (BERGERS e BENJAMIN, 2003; BYRNE, BOUCHIER-HAYES e 
HARMEY, 2005). 
 
1.3.3.2 Expressão de FT e exposição de PS por células tumorais 
O FT encontra-se normalmente expresso na superfície de células malignas 
(ao contrário das células normais), e sua presença tem sido relacionada à atividade 
pró-coagulante dessas células, assim como à agressividade tumoral (MUELLER et 
al., 1992; YU et al., 2005). Ao mesmo tempo, sua superexpressão já foi observada 
em amostras de pacientes com diferentes tipos de neoplasias, o que inclui grande 
parte dos carcinomas e outros tumores como o melanoma (RAK et al., 2009), 
estando correlacionada com grau histológico de malignidade, invasividade tumoral, 
21 
 
maior angiogênese e menor sobrevida (GUAN et al., 2002; ISHIMARU et al., 2003; 
KHORANA et al., 2007; BULLER et al., 2007). Dessa forma, acredita-se que o FT 
desempenhe papel essencial nas complicações pró-trombóticas observadas em 
pacientes com câncer, assim como na progressão tumoral. 
Células tumorais expõem ainda altos níveis do fosfolipídeo PS na parte 
externa de sua membrana (se comparadas às células normais) (UTSUGI et al., 
1991), sendo capazes de suportar a formação dos complexos da coagulação 
sanguínea dependentes de membranas carregadas negativamente. Assim, as 
células tumorais, por apresentarem FT e PS, podem funcionar como superfícies para 
a ligação de diferentes proteínas da cascata de coagulação – como os fatores VIIa, 
VIIIa, IXa, Va e Xa – e consequente montagem dos complexos tenase e 
protrombinase, contribuindo para a geração de fibrina no ambiente extravascular 
(Fig. 5). 
De fato, sabe-se que a expressão de FT pelas células tumorais possibilita a 
formação do complexo tenase extrínseco (RICKLES e FALANGA, 2001). Também 
têm sido descritas as formações dos complexos tenase intrínseco e protrombinase, 
em alguns casos comprovadamente devido à presença de PS na parte externa da 
membrana celular das células tumorais (VANDEWATER et al., 1985; KIRSZBERG, 
RUMJANEK e MONTEIRO, 2005; FERNANDES et al., 2006). 
 
22 
 
 
 
Figura 5. Ativação extravascular da coagulação no câncer. (A) O tumor é capaz 
de induzir um aumento da permeabilidade do endotélio vascular adjacente, através 
da produção de fatores como VEGF. Dessa forma, fatores plasmáticos da 
coagulação alcançam o microambiente tumoral (extravascular), entrando em contato 
com a membrana plasmática das células tumorais, rica em moléculas pró-
coagulantes como fator tecidual (TF) (B) e PS (C). A montagem eficiente dos 
diferentes complexos da coagulação culmina então na geração de depósitos de 
fibrina dentro e em torno do tumor. 
 
 
1.3.3.3 Participação de MVs na trombogênese associada ao câncer 
MVs, de uma forma geral, transportam antígenos de membrana de seu tecido 
de origem. Logo, MVs produzidas por células neoplásicas poderiam mimetizar e 
amplificar suas propriedades pró-coagulantes específicas já mencionadas acima. De 
23 
 
fato, em 1981, Dvorak e colaboradores demonstraram pela primeira vez que 
fragmentos de membrana liberados por linhagens celulares tumorais em cultura 
apresentavam comportamento pró-coagulante consistente com a atividade de FT 
(DVORAK et al., 1981). Desde então, diferentes trabalhos têm demonstrado a 
presença de FT na superfície de MVs tumorais, a qual tem sido apontada como 
responsável, pelo menos em parte, pela atividade pró-coagulante e o estado 
trombofílico observado em linhagens tumorais (BASTIDA et al., 1984; YU e RAK, 
2004; DAVILA et al., 2008; THOMAS et al., 2009) e pacientes com câncer de 
diversas origens (TESSELAAR et al., 2007; HRON et al., 2007; LANGER et al., 
2008; ZWICKER et al., 2009). Além disso, a exposição de PS em MVs tumorais 
possibilita a montagem do complexo pró-coagulante protrombinase (DVORAK et al., 
1983; VANDEWATER et al., 1985), dependente de membranas carregadas 
negativamente, as quais, em condições de dano vascular, são constituídas pela 
superfície de plaquetas ativadas no sítio de lesão em questão (MONROE, 
HOFFMAN e ROBERTS, 2002). 
Uma vez que os mecanismos pró-coagulantes intrínsecos das células 
neoplásicas não conseguem esclarecer completamente a base da ativação 
intravascular da coagulação no paciente oncológico, MVs circulantes poderiam ser 
os principais fatores envolvidos na patogênese da trombose associada ao câncer 
(Fig. 6), além de explicar o fato de que o paciente pode apresentar um evento 
trombótico em sítio afastado do local de desenvolvimento da neoplasia. 
Em paralelo, a grande maioria das células do compartimento vascular, 
quando submetidas a um estímulo pró-coagulante, pró-inflamatório ou apoptótico, 
também apresenta o fenômeno de perda da assimetria da membrana plasmática, 
tendo como consequência a exposição de PS na sua face extracelular e 
24 
 
concomitante liberação de MVs, que podem conter, além de PS, outras proteínas 
que sejam expressas por estas células de origem. 
Por serem ricas em PS, MVs originadas de plaquetas ativadas, p. ex., podem 
funcionar como superfícies para a ligação de proteínas da cascata de coagulação – 
como os fatores VIIIa, IXa, Va e Xa – e consequente montagem dos complexos 
dependentes de membranas carregadas negativamente, contribuindo assim para a 
geração de trombina (DIAMANT et al., 2004; FURIE et al., 2005; ZWICKER, FURIE 
e FURIE, 2007). Além disso, MVs derivadas de células endoteliais e monócitos 
ativados, que carregam FT a partir de sua célula de origem (SATTA et al., 1994; 
COMBES et al., 1999), podem ser superfícies adequadas à interação com o FVIIa. 
Estas últimas são capazes, ainda, de se ligar às plaquetas nos locais de injúria 
vascular através da interação entre a glicoproteína ligante de P-selectina (PSGL-1), 
presente nas MVs, e a P-selectina, presente nas plaquetas ativadas (MCGREGOR, 
MARTIN e MCGREGOR, 2006). Subsequentemente, estas podem fundir-se às 
plaquetas, em um processo dependente de PSGL-1 e FT. Ao se fundirem, ocorre a 
transferência de FT e de outras proteínas à membrana plaquetária, o que a torna 
uma superfície com maior potencial pró-coagulante, aumentando a atividade FT-
FVIIa e a geração local de trombina (RAUCH et al., 2000; EILERTSEN e OSTERUD, 
2004). 
O papel pró-coagulante in vivo de MVs tem sido ainda reforçado por 
diferentes evidências na literatura. Como exemplos principais, podemos citar a 
importante relação entre números elevados de MVs circulantes no plasma humano e 
o risco aumentado de complicações tromboembólicas, a qual tem sido demonstrada 
em diversos estudos (KHAN, ZUCKER-FRANKLIN e KARPATKIN, 1975; MALLAT et 
al., 2000; ANDO et al., 2002). Por outro lado, uma maior tendência a eventos 
25 
 
hemorrágicos e níveis reduzidos de MVs circulantes também têm sido associados 
em síndromes severas raras (GEMMELL, SEFTON e YEO, 1993; CASTAMAN et al., 
1997). Finalmente, MVs obtidas a partir de indivíduos normais, assim como de 
diferentes populações de pacientes, são capazes de promover a coagulação in vitro, 
e, ao mesmo tempo, sabe-se que a administração sistêmica de MVs, em modelo de 
trombose venosa em ratos, leva a uma formação significativa de trombos (BIRO et 
al., 2003). Em conjunto, esses dados sugerem fortemente a grande relevância 
clínica e fisiológica dessas estruturas no processo de coagulação in vivo. 
MVs produzidas por células tumorais e células vasculares ativadas poderiam 
exercer, portanto, um papel importante na biologia tumoral, através da manutençãode PS externalizada e da presença de outras moléculas, como o FT, contribuindo 
para a ativação do processo de coagulação. Contudo, apesar de diversos trabalhos 
indicarem a presença de MVs pró-coagulantes em uma grande variedade de 
pacientes com câncer que apresentam conhecidamente uma alta incidência de 
eventos tromboembólicos, maiores esforços devem ser direcionados a fim de se 
confirmar se altas concentrações de MVs pró-coagulantes seriam clinicamente 
importantes marcadores de complicações tromboembólicas, além de se determinar 
se tais estruturas desempenham realmente um papel central (‘causal’) na 
patogênese da trombose associada ao câncer e vice-versa. 
 
26 
 
 
 
Figura 6. Ativação intravascular da coagulação no câncer. MVs pró-coagulantes 
liberadas pelo tumor, ricas em fator tecidual (TF) e PS, podem alcançar a circulação 
e levar à ativação da cascata de coagulação sanguínea, com consequente formação 
de trombos no interior dos vasos sanguíneos. 
 
1.3.4 Papel de fatores hemostáticos na progressão tumoral 
É importante ressaltar que as evidências que suportam a relação entre 
trombose e neoplasia não se restringem apenas à incidência de eventos trombóticos 
em pacientes com câncer, mas também ao fato de que estes pacientes têm uma 
evolução clínica na qual a neoplasia tem um comportamento mais agressivo do que 
aqueles que não apresentaram fenômenos de trombose. Em um importante estudo 
nessa área, Sorensen e colaboradores observaram, p. ex., que em pacientes 
diagnosticados concomitantemente com câncer e TEV, a taxa de sobrevida após um 
ano foi de 12%, contra 36% em pacientes com câncer sem diagnóstico de eventos 
tromboembólicos (SORENSEN et al., 2000). Além disso, em um estudo no qual mais 
de 1 milhão de pacientes portadores de neoplasias foram comparados com cerca de 
8 milhões de pacientes sem neoplasia, observou-se que os portadores de 
neoplasias associadas à trombose apresentavam um risco muito superior de vir a 
óbito nos primeiros 6 meses pós-evento trombótico do que aqueles com neoplasia 
sem trombose ou sem neoplasia e com trombose (LEVITAN et al., 1999). 
27 
 
Vale notar que a menor sobrevida observada em pacientes oncológicos com 
perfil trombofílico não está necessariamente associada ao evento trombótico, mas 
provavelmente a uma neoplasia com características mais agressivas. Sallah e 
colaboradores, p. ex., demonstraram que a ocorrência de coagulação intravascular 
disseminada (uma complicação hemostática associada à ativação excessiva de 
fatores da coagulação e fibrinolíticos) em pacientes com tumores sólidos 
apresentava um efeito negativo na sobrevida desses mesmos indivíduos, 
independente da manifestação de trombose (SALLAH et al., 2001). 
Estes estudos deram subsídios a atual teoria de que episódios de TEV, além 
de estarem frequentemente associados a um estágio avançado do câncer, também 
estão relacionados a um pior prognóstico para o paciente, o que nos leva a 
considerar que o sistema hemostático possa desempenhar um importante papel na 
patogênese do câncer. 
De fato, um grande número de evidências tem indicado uma participação 
ativa de fatores hemostáticos, celulares ou circulantes, em aspectos fundamentais 
da biologia tumoral, como angiogênese, metástase e respostas imunes inatas 
(DEGEN e PALUMBO, 2012). Isso inclui estratégias farmacológicas de modulação 
da função plaquetária e de diversos constituintes da cascata de coagulação 
sanguínea em modelos experimentais in vivo, assim como a utilização de animais 
geneticamente modificados, com alterações na expressão ou atividade desses 
mesmos componentes. 
A expressão de FT por células presentes no microambiente tumoral 
(neoplásicas ou estromais) tem sido particularmente relacionada a eventos 
associados ao crescimento e metástase tumorais. Tais mecanismos incluem: (i) a 
geração de trombina, e sua subsequente interação com seus múltiplos alvos; e (ii) a 
28 
 
regulação de vias de sinalização dependentes tanto do domínio intracitoplasmático 
do FT, como da ativação de receptores ativados por outras enzimas da cascata de 
coagulação. 
Nas fases iniciais do processo metastático, o depósito de fibrina e o 
recrutamento de plaquetas por trombina no ambiente intravascular parece ser crucial 
para a sobrevivência de células tumorais aderidas à parede endotelial, protegendo-
as da eliminação por células NK e permitindo sua firme adesão e posterior 
disseminação (CAMERER et al., 2004; PALUMBO et al., 2005; IM et al., 2004; RUF 
et al., 2011). Em suporte dessas observações, o aumento do potencial metástatico 
associado à exposição de FT na célula tumoral tem-se mostrado dependente da 
presença de fatores hemostáticos circulantes, tais como protrombina, plaquetas, 
fibrinogênio e fator XIII (FXIII) (PALUMBO e DEGEN, 2007; PALUMBO et al., 2007; 
PALUMBO et al., 2008). 
Além da formação de trombina, o FT possibilita a ativação de receptores de 
membrana sensíveis às proteases da coagulação, como o FVIIa, FXa e a própria 
trombina. Estes receptores, denominados PAR (do inglês Protease-Activated 
Receptor), são expressos em diversos tecidos e estão envolvidos em uma série de 
fenômenos biológicos de natureza fisiológica ou patológica (OSSOVSKAYA e 
BUNNETT, 2004). Os receptores do tipo PAR estão frequentemente superexpressos 
em tumores de maior agressividade (HENRIKSON et al., 1999; IKEDA et al., 2003; 
YIN et al., 2003). A ativação proteolítica destes receptores em células tumorais 
desencadeia complexos mecanismos de sinalização celular, que podem ocasionar, 
entre outros fenômenos, a migração e/ou invasão celular e a liberação de 
metaloproteases, além da produção de fatores quimiotáticos como a interleucina 8, e 
de fatores pró-angiogênicos como o VEGF (SCHAFFNER e RUF, 2008). 
29 
 
Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado, p. ex., que a sinalização 
intracelular promovida pela trombina, através da proteólise do receptor PAR1 em 
células tumorais e no endotélio (COUGHLIN, 2000), desencadeia o processo de 
angiogênese, e está associada com a produção de VEGF e de metaloproteases de 
matriz (MARAGOUDAKIS et al., 2000). Outros trabalhos mostram uma correlação 
entre a expressão de FT e a produção de VEGF, fenômeno esse que parece estar 
correlacionado com a sinalização intracelular promovida pelo próprio FT, ao se ligar 
ao FVIIa (RIEWALD e RUF, 2002; RUF, DORFLEUTNER e RIEWALD, 2003; CHEN 
et al., 2001; BELTING et al., 2004), e com a sinalização intracelular promovida pelos 
fatores VIIa e Xa através da proteólise de receptores PAR2 em células tumorais 
(RIEWALD e RUF, 2002; JIANG et al., 2004; BELTING et al., 2004; HJORTOE et al., 
2004). Desta forma, sugere-se que a presença de FT e de enzimas da coagulação 
sanguínea em áreas próximas à neoplasia maligna possui uma íntima correlação 
com diferentes processos da progressão tumoral, principalmente por meio da 
ativação dos receptores PAR1 e PAR2. 
 
1.4 MICROVESÍCULAS COMO MEDIADORES DA COMUNICAÇÃO 
INTERCELULAR NO MICROAMBIENTE TUMORAL 
O reconhecimento de MVs como verdadeiros “pacotes de informação” que 
podem alcançar diferentes alvos, não apenas localmente, mas também a longas 
distâncias, levantou um novo olhar sobre o entendimento do processo de 
comunicação intercelular. Recentemente, diversos trabalhos têm discutido o papel 
de MVs como importantes mediadores desse fenômeno. Diferentes mecanismos de 
interação entre MVs e células-alvo (Fig. 7), através dos quais MVs poderiam 
influenciar a biologia celular, já foram relatados na literatura e, além de sua atuação 
30 
 
como “complexos sinalizadores” (apresentam ligantes de superfície capazes de 
desencadear inúmeras respostas biológicas na célula-alvo), a transferência de 
moléculas de superfície entre tipos celulares distintos, assim como de conteúdo 
intracitoplasmático (proteínas, RNAs mensageiros, microRNAs e lipídios bioativos), 
tem apresentado grande significadobiológico. 
 
 
 
Figura 7. Tipos de interações entre MVs e células-alvo. MVs liberadas no espaço 
extracelular podem: (a) ligar-se à superfície da célula-alvo através de receptores 
específicos; (b) fundir com a membrana plasmática da célula-alvo, transferindo 
moléculas de superfície para esta última e descarregando seu conteúdo no citosol 
da mesma; ou (c) ser endocitada pela célula-alvo. Nesse último caso, a 
internalização pode ser seguida pela descarga do conteúdo microvesicular no citosol 
da célula-alvo por meio da fusão das membranas da MV e do endossomo, ou pelo 
encaminhamento da MV à via lisossomal. Adaptado de COCUCCI, RACCHETTI e 
MELDOLESI, 2009. 
 
31 
 
Diferentes estudos demonstraram que MVs liberadas por células tumorais são 
capazes de transferir ácidos nucleicos (SKOG et al., 2008a), receptores de 
quimiocina (BAJ-KRZYWORZEKA et al., 2006), receptores de fatores de 
crescimento (AL-NEDAWI et al., 2008; AL-NEDAWI et al., 2009) e outras proteínas 
transmembranares funcionais, entre outras moléculas bioativas (ANTONYAK et al., 
2011). Uma variante oncogênica do receptor do fator de crescimento epidérmico 
(EGFRvIII), p. ex., encontrada em subpopulações de células de glioma humano, 
pode ser transferida para uma população de células tumorais menos agressivas, 
com alterações significativas em seu fenótipo (AL-NEDAWI et al., 2008). As células 
receptoras apresentaram um comportamento tumoral mais agressivo, incluindo 
capacidade de crescimento independente de ancoragem e transformação 
morfológica, associadas à ativação de vias de sinalização (MAPK e Akt) e a 
mudanças na expressão de genes regulados por EGFRvIII (p. ex., VEGF). Tais 
respostas foram inibidas pela incubação de MVs com anexina V, uma proteína 
ligadora de PS que bloqueia a fusão de MVs com membranas celulares, mas não a 
sua ligação (DEL CONDE et al., 2005a), indicando a participação do mecanismo 
fusogênico nos efeitos biológicos observados. 
Em um estudo posterior, Al-Nedawi e colaboradores demonstraram que a 
transferência do mesmo receptor, por meio de MVs derivadas da linhagem celular de 
carcinoma epidermóide A431, para células endoteliais, promoveu um aumento da 
expressão de VEGF nessas células, com consequente ativação de seu receptor 
VEGFR2 (AL-NEDAWI et al., 2009). Em camundongos com implantes de células 
neoplásicas humanas positivas para EGFRvIII, observou-se ainda a presença dessa 
proteína humana em células endoteliais do microambiente tumoral, enquanto o 
tratamento com dianexina, um homodímero recombinante da anexina V humana, 
32 
 
levou à redução do crescimento do tumor, assim como da sua densidade 
microvascular. MVs derivadas de culturas primárias de células de glioblastoma 
humano também foram capazes de transferir RNAs mensageiros para células 
endoteliais (os quais foram eficientemente traduzidos pelas células-alvo), além de 
modular o potencial angiogênico dessas últimas, estimulando a formação de túbulos 
in vitro (SKOG et al., 2008a). Essas mesmas MVs modularam positivamente a 
proliferação de células da linhagem celular de glioblastoma humano U87, indicando 
ainda um aspecto auto-promotor. 
Além de células endoteliais, a aquisição de um fenótipo transformado por 
outros tipos celulares normais, após interação com MVs tumorais, já foi 
demonstrada. A incubação de MVs derivadas de diferentes linhagens celulares 
tumorais humanas conferiu a fibroblastos e células epiteliais algumas características 
de células malignas, como a habilidade de crescimento em ágar e capacidade de 
sobrevida aumentada, ambas dependentes da transferência da enzima 
transglutaminase tecidual (tTG) (ANTONYAK et al., 2011). Em conjunto, esses 
resultados indicam um importante envolvimento de MVs no compartilhamento de 
informações moleculares entre diferentes populações de células presentes no 
microambiente tumoral. 
 
1.5 PAPEL DE MVS CONTENDO FT NA BIOLOGIA DO CÂNCER 
 Embora o potencial pró-trombótico de MVs tumorais tenha sido recentemente 
demonstrado (THOMAS et al., 2009), existem poucos estudos que correlacionam a 
aquisição do fenótipo maligno com mudanças nos padrões pró-coagulante e 
trombogênico de MVs. Nesse contexto, um modelo pareado, no qual uma população 
de células tumorais é isolada a partir de uma linhagem celular não-maligna, 
33 
 
representaria uma excelente ferramenta para avaliar a possível correlação entre o 
processo de transformação maligna e a produção de MVs pró-coagulantes contendo 
FT. 
Além disso, uma vez que MVs são capazes de transferir informações 
moleculares entre diferentes populações celulares no microambiente tumoral, é 
razoável supor que estas poderiam participar do compartilhamento de FT entre 
subpopulações de células tumorais com diferentes níveis de expressão dessa 
proteína, contribuindo para a propagação de um fenótipo maligno mais agressivo, 
dependente de FT. 
Portanto, MVs produzidas por células tumorais poderiam exercer um papel 
importante nos mecanismos patogênicos implicados na associação bidirecional entre 
câncer e estados hipercoagulantes, através da exposição de FT e da amplificação 
dos sinais tumorais, interagindo com diversos tipos celulares presentes no 
microambiente do tumor, assim como em sítios distantes. 
É importante ressaltar que a identificação de MVs em pacientes oncológicos e 
o seu papel na progressão do câncer ainda são pouco compreendidos e, por isso, 
esperamos contribuir para a elucidação dos eventos associados à participação 
destas estruturas na biologia tumoral. 
 
 
 
 
 
 
 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. OBJETIVOS 
35 
 
2.1 OBJETIVO GERAL 
Analisar a produção de MVs por diferentes linhagens celulares tumorais, 
assim como a presença de FT nessas estruturas, investigando seu papel no 
estabelecimento de estados pró-trombóticos e em processos celulares importantes 
para a biologia do tumor. 
Para esse fim, trabalhamos com modelos comparativos entre linhagens de 
melanócitos normais e tumorigênicos (células de melanoma Tm1 e sua linhagem 
celular parental de melanócitos, melan-a), assim como de células de câncer de 
mama com diferentes perfis de agressividade (células MDA-MB-231 e MCF7). 
 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
- Analisar a atividade pró-coagulante e pró-trombótica de MVs produzidas por 
células tumorais, através de ensaios de coagulação in vitro e modelos de trombose 
in vivo. 
- Avaliar a participação de FT no potencial pró-trombótico de MVs tumorais. 
- Investigar a presença de MVs tumorais no plasma de camundongos pré-
inoculados com células de melanoma, além de caracterizar suas propriedades pró-
coagulantes ex vivo. 
- Caracterizar a transferência intercelular de FT, por meio de MVs, entre 
linhagens celulares tumorais com diferentes níveis de agressividade. 
- Investigar o efeito da transferência intercelular de FT na aquisição de 
fenótipo tumoral pró-coagulante. 
 
36 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
37 
 
3.1 CULTIVO DE CÉLULAS 
A linhagem de melanócitos murinos melan-a foi mantida a 37°C, em 
atmosfera úmida com 5% de CO2, em meio DME (Dulbecco´s Modified Eagle 
Medium, GibcoBRL), pH 6,9, contendo soro fetal bovino (SFB) 10% (v/v) e 
suplementado com 2,4 g/L de HEPES, 3,7 g/L de bicarbonato de sódio, 125 mg/L de 
fosfato de sódio dihidrogenado, 110 mg/L de piruvato de sódio, 100.000 U/L de 
penicillina, 100 mg/L de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 55 M de -
mercaptoetanol, e 200 nM de 12-o-tetradecanoyl PMA (Sigma Chemical Co.). As 
linhagens murinas de melanoma Tm1 e B16F10 foram cultivadas sob as mesmas 
condições, exceto pelo PMA. Após separação do sobrenadante de cultura para 
posterior purificação de MVs, as células foram recolhidas com solução de Hank 
contendo 10 mM de HEPES e 0,2 mM de EDTA (ácido etilenodiaminatetraacético; 
Sigma Chemical