Claudio-Sabattini-Dissertacao

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
CENTRO DE TECNONOGIA 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
CLAUDIO SABBATINI CAPELLA LOPES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Identificação de bactérias patogênicas isoladas em amostras de sushis e sashimis 
por métodos baseados em DNA: PCR e sequenciamento parcial do gene rDNA 
16S e proteínas: MALDI-TOF MS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2015 
 
 
 CLAUDIO SABBATINI CAPELLA LOPES 
 
 
 
Identificação de bactérias patogênicas isoladas em amostras de sushis e sashimis 
por métodos baseados em DNA: PCR e sequenciamento parcial do gene rDNA 
16S e proteínas: MALDI-TOF MS 
 
 
 
 
 
 
Orientador: Dra. Profª Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
Co-orientador: Dr. Prof Eduardo Mere Del Aguilla 
 
 
 
 
 Rio de Janeiro 
2015 
 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao 
Programa de Pós-Graduação em Ciência de 
Alimentos, Universidade Federal do Rio de 
Janeiro, como requisito parcial à obtenção do 
título de Mestre em Ciências de Alimentos 
 
 
 
 L864 
 Lopes, Claudio Sabbatini Capella. 
 Identificação de bactérias patogênicas isoladas em amostras de sushis e sashimis 
por métodos baseados em DNA: PCR e sequenciamento parcial do gene rDNA 
16S e proteínas: MALDI-TOF MS/ Claudio Sabbatini Capella Lopes. – Rio de 
Janeiro: UFRJ/IQ, 2015. 
 95 f.: il. 
 
Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal do Rio de 
Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Ciência de 
Alimentos, 2015. 
 Orientador: Profª Vânia Margaret Flosi Paschoalin. 
 Coorientador: Prof. Eduardo Mere Del Aguila. 
 1. Refeições à base de pescado cru. 2. PCR. 3. Sequenciamento do gene 
rDNA 16S. 4. MALDI-TOF MS. 5.Análise filoproteomica. I. Paschoalin, 
Vânia Margaret Flosi. (orient.). II. Aguila, Eduardo Del Mere (coorient.). III. 
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa e 
de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos. IV. Título. 
CDD: 664.001 
 
CLAUDIO SABBATINI CAPELLA LOPES 
 
Identificação de bactérias patogênicas isoladas em amostras de sushis e sashimis 
por métodos baseados em DNA (PCR) e sequenciamento parcial do gene rDNA 
16S e proteínas (MALDI-TOF MS) 
Dissertação de mestrado apresentada ao 
programa de pós-graduação em Ciência de 
Alimentos da Universidade Federal do Rio de 
Janeiro, como parte dos requisitos para 
obtenção do grau de Doutor em Ciências. 
 
Aprovada em: _____ de julho de 2015. 
 
 Banca Examinadora 
 
_____________________________________________________________________________ 
Prof.
a
 Dra Vânia Margaret Flosi Paschoalin-IQ/UFRJ 
(Orientadora) 
_____________________________________________________________________________ 
Prof. Dr.
 
Eduardo Mere Del Aguila- IQ/UFRJ 
(Coorientador) 
_____________________________________________________________________________ 
Prof
a 
Dr
a
 Daniela Sales Alviano-IMPPG/UFRJ 
 
Prof
a
.
 
Dra. Analy Machado de Oliveira Leite- Campus Macaé/UFRJ 
_____________________________________________________________________________ 
Dra. Patrícia Pereira 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico esta dissertação à minha família 
em especial a minha esposa pelo apoio e 
incentivo durante esta etapa. Aos meus 
pais, minha irmã, minha “tia Ivone” e aos 
meus sogros pela confiança que 
depositaram em mim. 
 
Agradecimento 
 Agradeço primeiramente ao programa de pós-graduação em Ciências de 
Alimentos (PPGCAL) e ao Instituto de Química, UFRJ. 
Agradeço as instituições de fomento CAPES, CNPQ e FAPERJ pelo apoio 
financeiro. 
Agradeço imensamente a minha orientadora professora Dra. Vânia Flosi 
Paschoalin pelos ensinamentos, pela paciência e pela confiança. Agradeço ao meu 
coorientador professor Dr. Eduardo Mere Del Aguila por toda ajuda que ele me 
proporcionou durante a minha dissertação. 
Agradeço a toda equipe do laboratório de Análises Avançadas em Bioquímica e 
Biologia Molecular, do Instituto de química-UFRJ. Ao secretário e amigo Rafael Luiz 
pelas inúmeras dicas que me forneceu; aos técnicos Ricardos Brettas e Cristiane 
Barcellos e aos colegas de laboratório: Josiane do Carmo, Cintia Freitas, Diego Baião, 
Karine Hojo, Raquel Casaes, Valdecir, Laidson Paes, Patricia Pereira, Ricardo 
Carvalho, Wilson Pinto, Julia Vasconcellos e Davi Vieira. 
Agradeço ao Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes- UFRJ, 
especialmente ao professor Sergio Fracalanzza e a doutoranda Larissa Botelho pela 
ajuda com o processamento e análise no aparelho MALDI-TOF MS. Sou muito grato ao 
professor Rafael Duarte, pela atenção e por ter cedido o espaço do seu laboratório para 
realização das análises microbiológicas e por ter permitido o uso do software 
Bionumerics. Também agradeço a doutoranda Karen Machado pela ajuda, sempre me 
esclarecendo alguma dúvida e a doutoranda Raiane Chamon que me auxiliou com a 
instalação e a inserção das amostras no software Bionumerics. O meu muito obrigado 
ao técnico Antonio, o “Toninho” e claro ao meu grande amigo Marlei pelo amplo 
conhecimento, sobretudo em relação a microbiologia convencional. 
Agradeço a minha esposa por cruzar meu caminho, o carinho e o apoio dado por 
ela foram fundamentais para a conclusão desta dissertação. Ao meu filho, uma 
continuação do amor entre mim e minha esposa. Agradeço a Deus toda vez que o vejo 
sorrindo, dormindo ou até mesmo chorando. Agradeço a meus pais pelo apoio 
incondicional e por confiarem em mim. Agradeço a minha irmã pelas longas e 
 
discontraídas conversas e a minha tia Ivone, que aos seus 91 anos é um exemplo para 
mim. Agradeço também aos meus sogros por todo apoio fornecido sempre que precisei. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Adiante! Pelos caminhos maus se 
não houver outros; Pelos caminhos 
bons se for possível. Mas adiante, 
apesar de todos os obstáculos para 
conseguir o objetivo." 
Charles Dickens. 
 
 
Resumo 
SABBATINI, Claudio,Capella, Identificação de bactérias patogênicas em amostras de 
sushis e sashimis por DNA (PCR) e proteína (MALDI-TOF MS ). Rio de Janeiro, 2015. 
Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos)- Programa de Pós-graduação em 
Ciência de Alimentos, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015. 
A popularização crescente do consumo de alimentos sem cocção, em especial de 
sushi e sashimi, pode representar um risco em potencial de transmissão de bactérias 
patogênicas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a qualidade microbiológica de 
preparos à base de pescado cru comercializados em três restaurantes do tipo self-service, 
nos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, através da detecção e identificação de 
microrganismos patogênicos, utilizando ensaios de microbiologia convencional 
associados a reações em amplificação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento 
parcial do gene rDNA 16S e ferramenta proteômica do tipo MALDI-TOF MS. 
Inicialmente foi realizado uma triagem com meios de enriquecimento e seletivos para 
isolamento de Salmonella sp. e Listeria sp. As colônias suspeitas foram analisadas pela 
PCR usando marcadores espécie-específicos. As linhagens bacterianas que foram 
negativas para os genes alvo de Salmonella sp. e Listeria sp foram submetidas à análise 
pelo sequenciamento parcial do gene rDNA 16S, considerado o método padrão-ouro de 
identificação, bem como pelo MALDI-TOF MS, no qual foi avaliado o poder de 
identificação entre ambas metodologias. O perfil espectral das cepas isoladas foi 
realizado pela “análise de componentes principais (PCA)”, disponível no pacotedo 
software BioNumerics 7.5 para determinação das relaçãoes filoproteomicas. Vinte e 
cinco porcento das amostras de sushi e sashimi apresentaram contagem de coliformes 
totais altas, em duas amostras de pescado foi detectada a presença de E.coli. As reações 
da PCR para marcadores de Salmonella sp. e Listeria sp foram negativas. Os resultados 
mostraram que das 65 cepas bacterianas isoladas, 58 (89,2%) foram identificadas e 
apresentaram concordância entre o seqüenciamento e o MS MALDI-TOF. Embora 
tenha sido observado maior desempenho do MALDI-TOF MS, que indentificou 64 
cepas (98,4%) em comparação com o seqüenciamento do rDNA 16S, que foi capaz de 
identificar 59 cepas (90,8%), a diferença não foi estatisticamente significativa 
(p=0.1306). A análise do MALDI-TOF MS associada a ferramentas de bioinformática, 
PCA, permitiu uma eficiente separação filoproteomica entre os diveros gêneros 
 
bacterianos, podendo ser considerada uma promissora e eficiente abordagem para 
identifcação de bactérias patogênicas isoladas de matrizes alimentares 
 
Palavras-chave: Refeições à base de pescado cru; PCR; Sequenciamento do gene rDNA 16S; 
MALDI-TOF MS; anealise dos componentes principais (PCA) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
SABBATINI, Claudio, Capella, Identificação de bactérias patogênicas em amostras de 
sushis e sashimis por DNA (PCR) e proteína (MALDI-TOF MS ). Rio de Janeiro, 2015. 
Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos)- Programa de Pós-graduação em 
Ciência de Alimentos, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015. 
Popularization of the consumption of raw food, such as sushi and sashimi can 
represent a potencial risk for the transmission of pathogenic bacteria. The objective of 
the present sutudy was to evaluate the microbiological quality of ready to eat meals 
based on raw fish sold in three self-serice restaurants in the city of Niterói and Rio de 
Janeiro, through convencional microbiological protocols, PCR tests,partial sequencing 
of the rDNA 16S and MALDI-TOF MS.Colonies presumply assumed as Salmonella 
sp. and Listeria sp. Were tested by PCR targeting invA and hly sequences. Bacterial 
strains negative for PCR tests were submitted to sequencing of the partial rDNA 16S 
gene wich is considered the “golden standard” identification methodology, as well as 
MALDI-TOF MS. Afterwards The discriminatory effitiency between both techiniques 
was statisclly compared. Spectral profile analysis of the isolated strains was done 
thorugh “principal component analysis” available in the 7.5 version of the software 
Bionumerics
TM
, wich led to the determination of filoproteomics relations amongst all 
strains. Tweenty five percent of the sushi and sashimi samples presented high total 
coliforms counts, and E.coli was detected in two raw fish meal samples. PCR reaction 
for Salmonella sp. and Listeria sp. targets gave a negative result for both bacterial 
pathogens. A total of 65 isolates were analyzed by rDNA 16s partial sequencing and 
MALDI-TOF MS, 58 (89.2%) were identified by both methodologies. MALDI-TOF 
MS identified 64 strains (98.4%) while rDNA 16S sequencing was only able to identify 
59 strains. No significant statistical difference was observed between both techiniques 
(p=0.1306). The association between principal component analysis and bioinformatics 
tools led to efficient discrimination amongst a broad range of bacterial genus, and can 
be considered a promissing tool for bacterial identification isolates from diferente food 
matrices. 
Keywords: Raw fish meals; PCR tests; Partial 16S rDNA gene sequencing; MALDI-TOF 
MS 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO 
1 
20 
 
2-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 
22 
 
2.1-CONSUMO DE PESCADO NO BRASIL E NO RIO DE JANEIRO 
 
22 
 
2.2- O HÁBITO DE INGERIR PESCADO “IN NATURA” NO BRASIL 
 
23 
2.3- ESPÉCIES DE PESCADOS UTILIZADOS NAS REFEIÇÕES À BASE DE PEIXE CRU 24 
2.3.1-namorado (pseudopercis numida) 
24 
2.3.2-atum (thunus sp.) 
24 
2.3.3- salmão do atlântico (salmo salar) 26 
2.4-COMPOSIÇÃO BACTERIOLÓGICA DO PESCADO 
27 
2.5-ASPECTOS SANITÁRIOS DO PESCADO 28 
2.6 BACTÉRIAS CAUSADORAS DE DTA´S ISOLADAS A APARTIR DE PESCADO 30 
2.6.1- Enterobacteriacea 
30 
2.6.2-Staphylococcus sp. 32 
2.6.3-Listeria sp. 32 
2.6.4-Enterococcus sp. 33 
2.7-AVANÇOS NA IDENTIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA ATRAVÉS DE TÉCNICAS 
34 
 
MOLECULARES 
2.7.1-PCR espécie-específica de Salmonella sp. e Listeria sp. 
35 
2.7.2-Sequenciamento do gene rDNA 16S 35 
2.7.3-MALDI-TOF MS 36 
2.7.3.1-Descrição da técnica 36 
2.7.3.2- Análise proteomica bacteriana utilizandoMALDI-TOF MS 
37 
2.7.3.3- Aplicação da análise MALDI-TOF MS na identificação de bacterias 37 
2.7.4-RELAÇÕES FILOPROTEÔMICAS 
39 
2.7.5-ANÁLISE DE CCOMPONENTES PRINCIPAIS (PCA) PARA DADOS DE MALDI-
TOF MS 
39 
 
3-JUSTITICATIVA 
 
 40 
4-OBJETIVOS 41 
4.1-OBJETIVO GERAL 
41 
4.2-OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
41 
5-MATERIAIS E MÉTODOS 
42 
5.1-ANÁLISES MICROBIOLOGICAS 
42 
5.1.1-Contagem de coliformes totais e Escherichia coli pela técnica Petrifilme
TM 
(AOAC). 
44 
5.1.2-Identificação de Salmonella sp. (método BAM/Andrews, 2007). 44 
 
 
0,5.1.3.-Identificação de Listeria spp. e Listeria monocytogenes (métodoUSDA/ 
FSIS-2009). 
44 
5.2-CONDIÇÕES DE PCR 45 
5.3-SEQUENCIAMETNO DO GENE RDNA 16S 46 
5.4-ANÁLISES PROTEÔMICAS POR MALDI-TOF-MS 46 
5.5- ANÁLISE ESTATÍSTICA 47 
6-RESULTADOS 48 
6.1- ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS 48 
6.2- PCR ESPÉCIE-ESPECÍFICA 48 
6.3-SEQUENCIAMENTO DO GENE RDNA 16S E MALDI-TOF MS 49 
6.4-DIVERSIDADE MICROBIOLÓGICA EM AMOSTRAS DE PESCADO CRU 
53 
7- DISCUSSÃO 
54 
8-ESTUDO ORIGINAL II:ANÁLISE POR PCA DE BACTÉRIAS ISOLADAS DE 
PESCADO IN NATURA 
60 
8.1-PRÉ-PROCESSAMENTO DE DADOS 
60 
8.2-ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS 
60 
8.2.1-Análise filoproteômica 68 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8.2.2-..Análise de biomarcadores de Enterococcus sp. 
 
71 
9-DISCUSSÃO PCA, ANÁLISES FILOPROTEOMICAS E BIOMARCADORES 74 
10 - CONCLUSÕES 
77 
11 - PERSPECTIVAS FUTURAS 
79 
12 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
80 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
1. Figura 1- Fluxograma correspondente as análises microbiológicas, moleculares e 
proteômicas empregados na identificação de bactérias presente em preparações 
cruas de pescado servidas em restaurantes do município do Rio de 
Janeiro...........................................................................................................................
.......... 
 
 
 
43 
 
2. Figura 2- Detecção de microrganismos patogênicos e deteriorantes em amostras de 
pescado cru obtidas de três restaurantes do município do Rio de Janeiro e 
Niterói...................................................................................................................... . 
 
 
 
54 
 3. Figura 3- Análise de componentes principais de bactérias Gram positivas; Foram 
utilizadas as cepas de referência Enterococcus faecalis ATCC 15965; Enterococcus 
faecium ATCC 6569 
 
 
64 
4. Figura 4- Análise de componentes principais de bactérias Gram negativas. Foram 
utilizadas como cepas de referência Enterobacter cloacae ATCC 23355; 
Providencia rettgeri ATCC 29944; Hafnia alvei ATCC 11604; Serratia marcens 
ATCC 14756. 
 
 
 
65 
5. Figura 9 - Dendrograma demonstrando a relação filoproteomica de bactérias Gram 
positivas............................................ 
 
67 
6. Figura 10- Comparação dos picos de massa entre um isolado de Enterococcus 
tilahandics e Enteruococcus faecalis CECT 410............................................................ 
 
68 
7. Figura 7 - Comparação dos picos de massa entre um isolado de Enterococcus faecalis e 
uma cepa de referência de Enterococcus faecalis CECT 410....................................... 
 
 
70 
 
8. Figura 8- (a) Espectrode massa apresentando os picos do Isolado n
o 
60 E. faecalis 
Figura 8- (b) Espectro de massa apresentando os picos de Enterococcus faecalis CECT 
410. Estrela preta: Picos específicos para o gênero Enterococcus sp. Estrela 
branca:pico específico para espécie bacteriana Enterococcus faecalis.Seta preta: picos 
em comum entre todas as cepas de Enterococcus faecalis porém ausente nas demais 
espécies estudadas. Seta branca pico presente na maioria das cepas de E. faecalis 
 
71 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELA 
Tabela 1– Bactérias indicadores de qualidade microbiológica de amostras de pescado 49 
Tabela 2- Comparação entre a identificação de isolados por sequenciamento parcial do gene 
rDNA 16S e MALDI-TOF MS 
53 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
ATCC American Type Culture Colection 
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
AOAC Association of Official Agricultural Chemists 
BAL bactérias ácido láticas 
BAM bacterial analytical methods 
BS bismuto sulffito 
BLAST basic çocal alignment search tool 
CDC Center for Disease Control 
CFC Center of Food Safety 
CECT Colección Española de Cultivos Tipo 
DTA Doença transmitida por alimento 
EC European Comission 
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético 
EFSA European Food Safety Authority 
EPEC Escherichia coli enteropatogência 
ETEC Escherichia coli enterotoxigênica 
FAO Food and Agriculture Organization 
FSIS Food Safety and Inspection Service 
GE 
© 
 General Eletric 
HE hecktoen 
hly Listeria hemolisin gene 
iap invasion associated protein gene 
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatitistica 
IFOP Instrumento financeiro de orientação da pesca 
INFOPESCA Centro para los servicios de información y assesoramiento sobre la 
comercialización de los productos pesqueros de América Latina 
inva Salmonella invasion gene A 
kD Quilodalton 
Kg Quilograma 
m/z massa/carga 
http://copyright.com.br/index.html
 
 
MALDI-TOF MS 
espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser 
assistida por matriz /Tempo-de-Vôo 
MO Misouri state 
MS Ministério da Saúde 
NJ New Jersey state 
NCBI National Center for Biotechnology Information 
nm nanometros 
PCA análise de componentes principais 
PCR reação em cadeia polimerase 
PFGE eletroforese em gel de campo pulsado 
pb pares de base 
PBS peptone bufferd solution 
RDC resolução da Diretoria Colegiada 
RIISPOA 
regulamento de inspeção industrial sanitária de produtos de 
origem animal 
RMRJ região metropolitana do Rio de Janeiro 
SAS statistical snalysis software 
SCP Staphylococcus coagulase Positiva 
STEC Escherichia coli produtora de toxina shiga 
SVS Secretaria de Vigilância Sanitária 
TE Tris EDTA 
TFA ácido tri-fluor acético 
TT Tetrationato 
UE União Européia 
UFC unidiade formadora de côlonia 
USDA United States Department of Agriculture 
UVM University of Vermont 
XLD xilose lisina desoxicolato 
α-CHCA ácido α-cyano-4-hydroxycinâmico 
rDNA 16S codifica a subunidade RNA ribossomal 16S 
 
 
 
 
 
20 
 
1- INTRODUÇÃO 
 
Nos últimos anos é crescente o número de restaurantes do tipo self-service, por 
quilo ou rodizio que servem pratos a base de pescado cru. Muitas vezes estes 
estabelecimentos não possuem manipuladores devidamente treinados para servir este 
tipo de refeição e também não apresentam instalações adequadas para a exposição do 
alimento sob-refrigeração, o que aumenta o risco de contaminação microbiana 
(MARTINS et al., 2006). 
A popularização deste tipo de alimento demanda uma fiscalização mais rígida pelas 
autoridades de saúde pública à medida que o consumo desta iguaria, sem o processo de 
cocção, pode aumentar os riscos de doenças transmitidas por alimentos (DTA) 
(HEINITZ et al., 2000; VIEIRA et al ., 2008) 
Novas diretrizes e estratégias devem ser propostas para diminuir o risco de 
infecções bacterianas veiculadas pelo pescado cru. Atualmente, a identificação 
bacteriana em laboratórios de rotina baseia-se em metodologias fenotípicas 
convencionais (FUNKE et al., 2011). Contudo, estes protocolos de identificação 
bacteriana são laboriosos e demandam um tempo considerável, no qual muitas vezes o 
resultado nem sempre pode ser considerado conclusivo. A técnica de sequenciamento 
do gene codificador do rDNA 16S é a metodologia mais utilizada para identificação 
bacteriana, apresentando uma alta eficiência em relação a caracterização microbiana em 
nível de espécie, sendo considerado uma técnica de caracterização microbiólogica 
“padrão ouro” (BERNARD et al., 2012). 
 A técnica de identificação denominada espectrometria de massa MALDI-TOF 
baseia-se na caracterização de um isolado bacteriano a partir do perfil proteico expresso 
por cada espécie bacteriana em condições de cultura adequada (BARBERIS et 
al.,2014). Embora a maioria dos dados gerados por essa ferramenta proteômica sejam 
relacionados a identificação de microrganismos de importância médica, atualmente esta 
metodologia pode ser aplicada para o controle e a avaliação da qualidade 
microbiológica de matrizes alimentares (CARBONNELLE et al., 2007; BARBUDDHE 
et al., 2008; GROSSE-HERRENTHEY et al., 2008; HAZEN et al., 2009). 
Recentemente o uso da espectrometria MALDI-TOF tem sido associado a ferramentas 
21 
de bioinformática, como a análise de componentes principais (PCA), com o intuito de 
auxiliar na interpretação de dados espectrais obtidos pela técnica de MALDI-TOF MS, 
reduzindo o número de variáveis complexas, gerando componentes principais os quais 
podem ser demonstrado em ilustrações gráficas em terceira dimensão (RETTINGER et 
al., 2012). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
2-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
2.1-CONSUMO DE PESCADO NO BRASIL E NO RIO DE JANEIRO 
De acordo com o regulamento de inspeção industrial sanitária de produtos de 
origem animal (RIISPOA) o termo “pescado” compreende todos os peixes, crustáceos, 
moluscos, anfíbios, quelônios e mamíferos de água doce ou salgada utilizados na 
alimentação humana (BRASIL,1984). 
Segundo dados divulgados pela Organização das Nações Unidas para a 
Alimentação e a Agricultura (FAO), em 2012 a produção mundial de pescado foi de 
86,8 milhões de toneladas, ao passo que em 2011 houve uma produção de 93,7 milhões, 
a segunda maior produção desde 1996 o qual foi de 93,8 milhões de toneladas. A 
produção brasileira de pescado, durante o período de 2011 e 2012, atingiu valores em 
torno de 1,7 milhões e 2,6 milhões de toneladas respectivamente, sendo os peixes 
pertencentes ao gênero Sardinella como o principal tipo de pescado capturado durante 
este período (FAO, 2014). 
No período 2008-2009, segundo dados do IBGE a aquisição domiciliar média per 
capita de pescado no Brasil foi de em 4 kg /ano, sendo que no meio urbano, esse valor 
atingiu 3,3 kg e no meio rural, 7,6 kg. Considerando a origem das espécies, cada 
brasileiro adquiriu 1,57 kg de pescado de água doce e 1,91 kg de pescado de água 
salgada (IBGE, 2010). O mesmo instituto publicou um novo estudo no ano seguinte a 
respeito do consumo nacional de pescado e estes dados apontaram para um consumo 
alto de pescado nas regiões Norte e Nordeste com 38,1 kg/per capita/ano e 14,6 kg/per 
capita/ ano, em contraste ao consumo de pescado entre as regiões Sudeste, Sul e Centro-
Oeste com 5,5 kg, 3,1 kg e 3,4 kg, respectivamente (IBGE, 2011). Em 2013, o Brasil 
ultrapassou o patamar de consumo mínimo estabelecido pela Organização Mundial de 
Saúde (OMS) que é de 12 kg/habitante/ano.Atualmente, a população brasileira 
consome em média 14,5 kg de pescado /habitante/ano. O consumo de pescado 
aumentou 25% considerando o ano de 2012 para 2013 (PORTAL BRASIL, 2014). 
 
23 
 
2.2- O HÁBITO DE INGERIR PESCADO “IN NATURA” NO BRASIL 
O pescado é considerada um “alimento saudável", devido à variedade e quantidade 
de nutrientes presentes em sua carne, quando comparado a outros alimentos de origem 
animal (ABABOUCH et al., 2005). O pescado de maneira geral pode ser caracterizado 
como uma boa fonte de minerais como cálcio, ferro selênio, além de possuir baixos 
teores de sódio (DE OLIVEIRA et al.,2012). Em relação ao pescado de origem marinha 
os níveis de iodo também são muito superiores ao de outras fontes de proteína animal. 
A composição lipídica é bastante distinta de mamíferos ao apresentar níveis de ácidos 
graxos poli-insaturados de cadeia longa em altas quantidades, o que reflete uma boa 
opção para a dieta de pessoas com doenças cardiovasculares (HUNTER et al., 2000). 
O hábito de consumir alimentos da culinária japonesa está cada vez mais difundido 
no Brasil entre as diversas classes sociais e dentro do processo de globalização, esta 
prática pode ser interpretada como um aprofundamento da integração social, econômica 
e politca entre culturas distintas, facilitando assim a difusão de informações, transporte, 
interações humanas e produtos no caso, alimentos a base de pescado cru (PROENÇA et 
al., 2010.) A disseminação desta culinária nipônica no habito alimentar do brasileiro 
também tem contribuído para alavancar o consumo de pescado no Brasil, a medida que 
as apresentações destes pratos típicos são um atrativo a mais, além de despertarem o 
interesse do consumidor em ingerir maiores quantidades de pescado (SANTOS et al., 
2006). Estes fatores têm refletido em um aumento no número de estabelecimentos 
dedicados as refeições orientais. 
Duas destas iguarias japonesas mais consumidas são o sushi e o sashimi. O sashimi 
é caracterizado por qualquer pescado cortado em filetes e servido sem cocção. O sushi é 
defindo como o sashimi moldado no topo de um “bolinho” de arroz japonês (LEAL et 
al., 1998; WATANABE et al., 2005;). Tradcionalmente o salmão (Salmo salar) é o 
peixe mais utilizado na preparação destas refeições (STANSBY et al.,1968), porém no 
Brasil, o atum (Thunnus sp.) e o namorado (Pseudopercis numida), são espécies que são 
encontradas em abundancia no litoral brasileiro e vêm sendo utilizadas como matéria 
prima no preparo destes alimentos. 
24 
2.3- ESPÉCIES DE PESCADOS UTILIZADOS NAS REFEIÇÕES À BASE DE 
PEIXE CRU 
2.3.1- Namorado (Pseudopercis numida) 
Espécie de peixe não migratória que pode ser encontrada nos fundos arenosos ou 
rochosos de regiões costeiras do sudeste brasileiro, mais precisamente etnre a costa dos 
estados do Rio de Janeiro e Santa Catarina (LUQUE et al., 2008). A dieta desta espécie 
de osteícte se restringe basicamente de peixes benticos ou crustáceos (MENEZES & 
FIGUEIREDO, 1985; ELÍAS & RAJOY, 1992; FROESE & POULY, 2007). 
Atualmente existem poucos dados a respeito da composição microbiológica deste 
pescado, porém em relação a contaminação por metais pesados Morgano e 
colaboradores (2014) relataram a presença de traços de arsênio em amostra de 
preparações a base de namorado. 
2.3.2-Atum (Thunnus sp.) 
São coletivamente assim denominados, porém na verdade refere-se a um conjunto 
de peixes de água salgada da família Scombridae, distribuído entre quatro gêneros 
distintos: Thunnus, Katsuwonus, Euthynnus e Auxis. Estes gêneros englobam 51 
espécies distintas que são consideradas atunideos legítimos. Em relação a morofolgia 
todos os gêneros da família Scombridae apresentam um corpo fusiforme e alongado 
porém existem variações em relação ao tamanho de cada espécie podem variar 45 cm 
a 5m (COLLETE & NAEUN, 1983). Tunídeos são peixes migratórios, com uma vasta 
distribuição pelos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico. Possuem a habilidade de 
modular a temperatura corpórea de -4 
o
C até 31
o
C (WALLI et al.,2009). Dentre as 51 
espécies de atum existentes, apenas oito são comercializados no mundo e destes, cinco 
são pescados na costa brasileira: Bonito listrado (Katsuwonus pelamis), Alabacora lage 
(Thunus albacares), Albacora-bandolim ( Thunnus obesus), Albacora branca (Thunnus 
alalunga), Atum-azul do Atlântico ( Thunnus thynnus). 
O Bonito listrado (Katsuwonus pelamis) tem um ciclo de vida de 3 a 4 anos, 
atingindo a maturidade sexual por volta de 1 ano de idade com cerca de 2 kg. Esta 
espécie de atum é altamente migratória transitando por diversos oceanos tropicais e 
subtropicais. Devido à rápida maturidade sexual e alta capacidade de se adaptar a 
diversos ambientes aquáticos, esta espécie não apresenta sinais de reduções 
25 
significativas em sua população apesar da intensa atividade pesqueira praticada por 
diversos países. O Bonito listrado é comercializado principalmente sobre a forma 
enlatada (cerca de 90%) (BERG et al., 1958 et al.,RICHARDS,2005) 
 Albacora lage (Thunus albacares) possui um ciclo de vida de 7-8 anos, podendo 
atingir a maturidade sexual em torno de 2-3 anos de idade e cerca de 25 kg. Esta espécie 
não apresenta sinais de redução da sua população e alguns estudos mostram uma 
tendência de manutenção no ritmo de crescimento populacional pelos próximos 10 anos 
(PILLING et al., 2014). Esta espéceie é comercializada principalmente sobre a forma 
enlatada e filé. (RICHARDS et al.,2005) 
 A Albacora-bandolin (Thunnus obesus) tem um ciclo de vida de 7-8 anos, podendo 
atingir a maturidade sexual em torno de 3-4 anos de idade com um peso de 25 kg. Pelo 
fato de nadarem em águas mais profundas apresentam maior teor de gordura 
polinsaturada, o que a torna mais atrativa ao mercado consumidor de peixe cru. De 
maneira geral esta espécie não demonstra indícios de sobrepesca no oceano Atlântico 
(RICHARDS et al.,2005). 
A Albacora branca (Thunnus alalunga) apresenta um ciclo de vida de cinco anos, 
atingindo a maturidade sexual em torno de 2-5anos de idade e cerca de 15 kg. Devido à 
textura branca de sua carne, este peixe é também conhecido como “a galinha do mar”. 
Nos Estados Unidos esta espécie é bastante comercializada como “atum branco”. Na 
Espanha este peixe é comercializado principalmente sobre conserva com o nome 
“Bonito Del Norte”. Ao sul do oceano atlântico existem indícios de leve sobrepesca 
desta espécie, porém estes dados são ainda preliminares (MERINO et al., 2014). 
O Atum-azul do Atlântico ( Thunnus thynnus) tem um ciclo de vida que supera os 
25 anos de vida. Atinge a maturidade sexual em torno de 4-11 anos, com peso em torno 
de 30 a 150 kg. O alto teor de gordura, a textura de sua musculatura além da quantidade 
de biomassa, torna-o extremamente requisitado no mercado de preparações de peixe 
cru, especialmente no Japão. O crescimento lento associado à intensa pressão pesqueira 
colocou esta espécie em risco de extinção, ocasionando restrições por órgãos 
internacionais como a “comissão internacional de conservação de atum do atlântico” 
(ICCAT) em relação ao limite de pesca ao ano para cada país (DINATALE et al., 2014) 
 
26 
 2.3.3- salmão do Atlântico (Salmo salar) 
O salmão considerado legítimo possui um ciclo migratório anádromo, ou seja, passa 
toda a sua vida nos oceanos do Atlântico norte até atingir a fase adulta e sobe aos rios 
nas regiões temperadas e árticas do hemisfério norte, para realizar a sua fase reprodutiva 
em águas frias e com altos teores de oxigênio. O salmão adulto pode aingir 40-120 cm 
de comprimento e em fases mais precoces de sua vida alimenta-se de insetos e 
crustáceos aquáticos (macroinvertebrados). Na fase adulta alimentam-se de krill nos 
mares do Ártico. Durante a migração não se alimentam até atingir a nascente dos rios 
para completar o seu ciclo reprodutivo (DOADÁRIO et al.,2001). 
O salmão apresenta em sua musculaturauma coloração laranja característica, 
resultado de sua alimentação a base de macroinvertebrados os quais são ricos em 
carotenóides especialmente a astanxatina. A absorção e fixação deste carotenóide 
ocorrem principalmente na musculatura, devido aos altos teores de oxigênio existente 
(OLIVEIRA et al.,2011) 
O salmão do Atlântico, Salmo salar, é a espécie mais comercializada no mundo, 
porém nos mares do oceano Pacífico o gênero Oncorhynchus é o mais dominante, 
abrangendo seis espécies: o chinook ou salmão rei, o chum ou salmão- cachoro, o pink 
ou salmão corcunda, o sockeye ou salmão –vermelho, o coho ou salmão-prateado e o 
masou ou salmão-cereja (STORER et al.,1998). 
Atualmente o salmão do Atlantico (Salmo salar) é a espécie da família Salmonidae 
mais consumido no Brasil, correspondendo a cerca de 90% de todo salmão 
comercializado no Brasil. A maior parte da produção provém da região de Puerto Montt 
(Chile) aonde cerca de 70 empresas dedicam-se a exportar além do salmão do atlântico, 
o salmão coho, o salmão real e a truta arco-íris. Em 2014 o Brasil pagou pelo salmão 
chileno algo em torno de R$ 532,1 milhões (IFOP, 2014a). No Chile, as fazendas de 
salmão têm sido a principal atividade de aquicultura desde 1978 e o Chile ocupa a 
segunda colocação como maior produtor de salmão em cativeiro, tendo uma produção 
menor apenas que a Noruega. A produção salmoneira atingiu 207 mil toneladas em 
2014 representando 41% do total de exportação de pescado do país, que foi em torno de 
509.833 toneladas e a geração de valor acumulado de 46 milhoes de dólares (IFOP, 
2014b). Todo salmão chileno é cultivado em represas localizadas na região dos Fiordes 
27 
da Patagônia, um complexo geológico formado por uma série de corpos d´agua 
compostos por mares e rios semi-aprisionados por montonhas rochosas, além de lagoas 
formadas pelo degelo da Cordilheira dos Andes durante as estações da primavera e 
verão, criando um dos maiores estuários aquáticos naturais do mundo (IRIARTE et al., 
2010). 
 Contudo as fazendas de cultivo de salmão do Chile enfrentam atualmente 
problemas sanitários, especialmente em relação às infecções virais, bacterianas e até 
mesmo parasitáiras, os quais contribuem para um aumento na taxa de morbidade e 
mortalidade dos salmonídeos cultivados, resultando em uma diminuição nas receitas 
anuais das empresas produtoras (ASCHE et al.,2009). A superlotação das represas 
criadouras como forma de aumentar o lucro da produção, pode resultar em infecções 
epizooticas na criação de salmões (SLADONJA et al.,2011), Outro problema é o 
número pequeno de vacinas atualmente disponíveis para o controle dos inúmeros 
patógenos capazes de acomenter a produção de salmão, o que tem contribuído para 
aumentar a quantidade de antibióticos administrados aos salmonídeos de cativeiro, 
gerando um aumento na prevalência de microrganimos multirresistentes (WU et 
al.,1995; CABELLO et al.,2013). 
2.4-COMPOSIÇÃO BACTERIOLÓGICA DO PESCADO 
Estudos sobre as comunidades bacterianas de pescado têm como objetivo avaliar a 
influencia destes microrganismos na fisiologia e saúde destes organismos aquáticos 
superiores (MACFARLANE et al.,1986; CAHILL et al., 1990). Diversos estudos a 
respeito da composição microbiológica do pescado tomam como base a realização de 
estudos comparativos entre bacterias presentes no intestino de peixes e o ambiente 
aquático, procurando assim demonstrar a existência de nichos bacterianos específicos, 
porem diversificados para cada tipo de pescado (AUSTIN et al., 1987; CAHILL et 
al.,1990; RINGØ et al.,1995).Algumas espécies bacterianas transitam entre o ambiente 
marinho e o intestino do pescado, enquanto outras parecem ser colonizadoras 
permanentes do trato gastro intestinal de peixes (KIM et al.,2007). 
O pescado tem o seu primeiro contato com essas bactérias nas fases iniciais dos 
estágios larvais, no qual a ingerem a água do seu habiat natural contendo esses 
microrganismos, e assim, inicia-se o processo de colonização do seu trato intestinal, 
28 
formando uma microbiota própria ao final da fase juvenil do pescado em especial 
osteíctes (HANSEN & OLAFSEN,1999). Uma vez estabelecida, as comunidades 
microbianas intestinais promovem uma série de interações benéficas com o hospedeiro, 
auxiliando a digestão, o crescimento, a nutrição, a reprodução e ainda a proteção contra 
doenças infecto-contagiosas (MACFARLANE et al.,1986). Alguns estudos sugerem 
que bactérias como Bacteroides sp. e Clostridium sp. fornecem fontes de ácidos graxos 
essenciais e vitaminas para peixes (RINGO et al.,1995). 
Segundo Ringo e colaboradores 1988, bactérias acido láticas (BAL), em sua 
maioria Lactobacillus sp., desempenham um papel importante impedindo a proliferação 
de bactérias patogênicas no trato gastro intestinal de peixes. Em estudos um pouco mais 
recentes, Izvekova e colaboradores (2007) demonstraram que embora este grupo 
bacteriano representasse apenas alguns dos vários gêneros bacterianos presentes na 
composição de peixes, eles são importantes para a saúde do peixe. 
Outros estudos demonstraram que alguns fatores podem ser considerados 
importantes para a colonização e proliferação destes microrganismos, como a 
alimentação do pescado, o pH da água e até mesmo as enzimas digestivas produzidas 
pelo peixe (HANSEN & OLAFSEN, 1999). Outros estudos demonstraram que a 
microbiota do pescado está sujeito alterações conforme a fisiologia digestiva do peixe 
evolui ao longo de sua vida (VERNER-JEFFREYS et al.,2003; ROMERO & 
NAVARRETE 2006). 
No entanto, embora muitas bactérias sejam importantes para manutenção da saúde 
do pescado, deve-se considerar que este como alimento, é um produto altamente 
perecível, podendo sofrer contaminação bacteriana através de diferentes formas, como 
poluição do seu habitat natural, falhas nas etapas de beneficiamento do pescado, 
desequilíbrio de sua própria microbiota, ou através de deficiências nas boas práticas de 
fabricação (FAO, 2010). 
2.5-ASPECTOS SANITÁRIOS DO PESCADO 
Um dos grandes desafios enfrentados pela indústria da pesca refere-se a rápida 
decomposição do pescado, quando são retirados do seu ambiente aquático. A 
diversidade microbiana intrisica deste animal pode ter um papel fundamental em 
processos deteriorativos, os quais culminam com a multiplicação de bactérias com 
29 
potencial patogênico. Deste modo a indústria pesqueira tem buscado alternativas para 
minimizar as perdas relacionadas as falhas nas etapas de acondionamento sobre 
refrigeração, transporte, manipulação e comercialização do pescado (GERMANO et 
al., 1998; CARDOSO et al.,2003). 
 Estudos relacionados a contaminação do pescado revelaram diferentes focos de 
contaminação bacteriana de acordo com a região anatômica do peixe, assim como 
podem está associados a variações no seu habitat. Toranzo e colaboradores (1989) 
demonstraram que os baixos índices de bactérias contaminantes nas brânquias e pele de 
peixes de alto mar estão relacionados principalmente as baixas temperaturas e ao 
reduzido grau de poluição existente neste nicho aquático marinho. 
Nos mares trópicais e subtropicais as temperaturas mais elevadas associadas ao 
maior nível de poluição contribuiu para aumentar o índice de contaminação do pescado. 
Uma vez capturados em áreas maritimas poluídas por dejetos, o pescado esta sujeito a 
uma maior contaminação por bactérias patogênicas e microrganismos indicadores de 
contaminação fecal (MURATORI et al.,2004). 
 A composição microbiana de corpos de agua doce possui uma composição 
distinta das águas marinhas. Embora ocorra um predomínio de bactérias Gram negativas 
no ambiente aquático, acredita-se que a composição deste meio aquático sofra 
influencia de fenomenos naturais como chuvas (MIRANDA & ZEMELMAN, 2001). 
Em relação a psicultura, a qualidade microbiológica da agua empregado no cultivo do 
pescado também exerce influencia sobrequalidade microbiológica do produto final. 
Além disso, as diferentes estratégias de alimentação impostas ao pescado quando 
criados em cativeiro podem influenciar a contaminação, como por exemplo, o uso de 
adubo animal complementando a alimentação, o qual quando feito de maneira incorreta 
pode levar a contaminação das águas dos reservatórios de criação, assim como pode 
comprometer a carne de pescado por deterioração microbiana, podendo levar a 
incidência de doenças transmitidas de alimentos no consumidor final (DTA´s) (UCHII 
et al,. 2006). 
 
 
30 
 
 
2.6 BACTÉRIAS CAUSADORAS DE DTA ISOLADAS A PARTIR DE PESCADO 
 2.6.1- Enterobacteriaceae 
Patógenos pertencente a família das Enterobacteriaceae estão distribuídos nos mais 
diversos nichos ecológicos existentes na natureza, e são capazes de colonizar vários 
hospedeiros animais (GAUTHIER et al.,2015). As bactérias que compõem o grupo 
coliforme podem ser encontradas naturalmente nos corpos dágua, solo e vegeteção 
(PARUCH et al., 2012). Os principais integrantes deste grupo são os gêneros 
Klebisella, Enterobacter, além de algumas espécies do gênero Citrobacter, assim como 
a espécie bacteriana Escherichia coli. Diversas espécies bacterianas pertencentes a esta 
família já foram isoladas de peixes incluíndo E. coli (CARDOZO et al., 2014; 
GHANEM et al., 2014). O conteúdo intestinal é o principal local de isolamento deste 
grupo bacteriano (ROCHA et al., 2014). Dentre as bactérias do grupo coliforme com 
crescimento a 45
0
C, E.coli é o patógeno alimentar mais frequentemente associado com 
infecções alimentares no Brasil, sendo isolado em amostras de peixes vertebrados, 
moluscos bivalves e crustáceos (BARTRAM et al .,1996; TEOPHILO et al., 2002; 
SILVA et al., 2003; PEREIRA et al., 2006; VIEIRA et al., 2008; SILVA et al.,2008). 
Embora existam espécies de E. coli não patogênicas, amostras representativas 
apresentando contagens elevadas de coliformes termotolerantes (superior a 10
2 
UFC\grama por amostra indicativa) aumentando a probabilidade de isolamento 
Escherichia coli patogênicas, frequentemente associado a infecções gastrointestinais e 
extras intestinais (TRABULSI et al.,2008). 
Salmonella sp. representa mais um membro da família das enterobacteriaceae 
muito importante sobre o aspecto higiênico-sanitário do pescado. Este gênero bacteriano 
apresenta duas espécies distintas S. bonori e S. Entérica, no qual a última espécie possui 
mais de 2500 sorovares distintos, a maioria deles patogênicos aos seres humanos, e que 
já foram isolados em diveros ambientes inclusive aquáticos (NORHANA et al., 2010). 
A falta de condições higiênicas sanitárias, assim como o lançamento indevido de dejetos 
provenientes de: animais selvagens, animais de produção, ou humanos nas redes 
31 
pluviais, favorecem a disseminação deste microrganismo para o ambiente marinho 
(FAO, 2010). 
 Apesar de existirem relatos de isolamento de Salmonella sp. em peixes que habitam 
águas salgadas ou doce como: truta (Salmo-gairdneri), tilápia (Tilapia-aurea) e salmão 
(Salmo-salar), ainda não foi estabelecida uma relação clara entre os casos de 
salmonelose em humanos com cepas que colonizam o trato gastro intestinal de peixes. 
Ao passo que, aspectos higiênicos sanitários precários envolvendo processos de 
beneficiamento do pescado, especialmente durante as etapas de manipulação parecem 
ser um fator de maior relevância na ocorrência de casos de salmonelose em seres 
humanos (NESSE, 2005; LUNESTAD et al., 2009; MCCOY et al., 2011). 
Outro aspecto importante em relação a contaminação do pescado por Salmonella 
sp., refere-se a haloterância apresentada por algumas cepas, o que representa uma 
limitação para os processos tecnológicos de salga e cura utilizados pela indústria na 
conservação de pescado. Diveros autores relatam a habilidade deste patógeno em 
sobreviver em matrizes alimentares a base de peixe contendo baixa atividade de água, e 
altos teores de sal ( DI PASQUA et al., 2013). 
Contudo, existem outras bactérias pertencentes a família das enterobacteriacea 
capazes de causar danos a saúde humana, através da produção de aminas biogênicas, 
como Escherichia sp., Proteus sp., Klebiseilla sp, Serratia sp. Enterobacter 
sp.(BODMER et al., 1999). Algumas aminas, como por exemplo, a histamina pode 
gerar um quadro clínico de intoxicação denominado escombrotoxicose (TAYLOR et 
al., 1982). Este composto amino bioativo é formado pela descarboxilação de um radical 
alfa carbonil de um aminoácido denominado histidina quando encontrado na forma livre 
(MORROW et al., 1991). 
A quantidade de amina biogênica ingerida pelo consumidor pode está associada a 
diferentes manifestações clínicas como: irritações pela pele e inchaço na garganta em 
casos de uma pequena ingestão de histamina ou nos casos mais graves a perda de ar, 
queda da pressãoa arterial e disfunção gastrointestinal (MAINTZ & NOVAK, 2007). De 
acordo com Maijala e Eerola (1993) entre 8±40 mg de histamina é capaz de desencadear 
sintomas brandos de toxinfecção ao passo que valores acima de 100 mg podem levar a 
graves quadros de toxinfecção. 
32 
A histamina também está presente em diversos alimentos como carne e vegetais 
fementados, porém em especial no pescado, sendo resultado de atividades proteolíticas 
bacterianas não controladas (HALÁSZ et al., 1994; SHALABY et al., 1996). Em caso 
de falhas no processo de conservação do pescado, bactérias produtoras de aminas 
biogenicas são capazes de liberar enzimas extracelulares sobre aminoácidos específicos 
encotrados em abundancia na musculatura do pescado, promovendo a descarboxilação 
dos mesmos (KIM et al., 2000). 
 2.6.2- Staphylococcus sp. 
São bactérias Gram positivas pertence à família Micrococcaceae e 
compreendem gêneros microbianos imóveis, não formadores de esporos e a maioria das 
espécies deste gênero são anaeróbios facultativos. (KONEMAN et al.,2006). 
Embora este gênero não faça parte da microbiota do pescado, existem relatos 
principalmente de espécies como Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus 
como agentes causadores de surtos alimentares envolvendo peixes de cultivo 
(KUSUDA et al.,1981). Porém a implicação do gênero Stapylococcus como 
veiculadores de doenças em criações de peixe ainda é discutível (GAUTHIER et 
al.,2015). Por outro lado devido a habilidade deste grupo bacteriano de colonizar vias 
aéreas superiores e mãos de seres humanos, a contaminação do pescado por este grupo 
bacteriano pode ocorrer devido falhas na higienização dos manipuladores nas etapas de 
beneficiamento do pescado (HUSS et al.,1997). 
Existem ainda outros membros do gênero Staphylococcus passíveis de isolamento 
em animais, os quais raramente são implicados em contaminação de alimentos como, 
por exemplo, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus delphini, Staphylococcus 
hyicus, Staphylococcus schleiferi e Staphylococcus xylosus (NEMETZ & SHOTTS, 
1993). Em relação a S. xylosus foi relatada a capacidade dessa bactéria em produzir 
aminas biogênicas a partir da degradação de aminoácidos como histamina e tiramina em 
amostras de anchova fermentada (MAH & HWANG, 2009). 
 2.6.3- Listeria monocytogenes 
Bactérias pertencentes ao gênero Listeria são caracterizados como sendo Gram 
positivas, anaeróbicas facultativas e não formadores de esporos (WONG & FREITAG, 
33 
2004). Em relação às sete espécies que compõe este gênero, Listeria monocytogenes é a 
principal causadora de uma condição clinica denominada listeriose em seres humanos 
(LOPEZ, 2008). 
L.monocytogenes é capaz de sobreviver a altos níves de salinidade ou acidez, além 
de ser um microrganismo halotolerante e capaz de se multiplicar em temperaturas de 
refrigeração, o que torna difícil sua eleiminiação de plantas industriais de pescado 
(FONNESBECH et al., 2001). Embora não seja considerado um microrganismo 
relevante no âmbito da legislação sanitária nacionalpara pescado “in natura”, este 
patógeno já foi isolado em as amostras de pescado como salmão defumado e camarão 
congelado (HOFER et al., 1994; CRUZ et al., 2008). No estudo conduzido por Oliveira 
e colaboradores (2010), revelou que existe um número considerável de surtos 
alimentares causados por L.monocytogenes não notificados ao sistema de Vigilância 
Sanitária. Nos Estados Unidos, durante o período de 2009 e 2010 houve 49 casos de 
listeriose, resultando em 40 hospitalizações e nove mortes (CDC, 2013). Na Europa, 
dados da European Food Safety Authority de 2012 registraram a contaminação por 
L.monocytogenes em peixes defumados e curados, como a mais alta dentre todas as 
refeições prontas para consumo (EFSA, 2011). 
 2.6.4- Enterococcus sp. 
Este gênero é composto por bactérias Gram positivas, sendo encontrados 
naturalmente na microbiota do solo como também do ambiente aquatico. São capazes 
de colonizar o trato gastrointestianal de animais, pássaros e humanos, promovendo uma 
relação harmoniosa com o hospedeiro (HANCOCK & GILMORE 2006). No 
processamento industrial alguns representantes do genero Enterocci são classificados 
como BAL e possuem inúmeras propriedades tecnológicas relacionadas com a 
qualidade organolépticas de pescado fermentado ou curado (FRANZ et al., 2003). 
Apesar de apresentar relevantes contribuições sensoriais para produtos fermentados, 
órgãos nacionais e internacionais de vigilância sanitária concentram esforços em 
identificar cepas de Enterococcus sp. consideradas patogênicas devido a capacidade de 
produzir aminas biogênicas (NANASOMBAT et al., 2012; BUŇKA et al., 2013). 
 
34 
2.7-AVANÇOS NA IDENTIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA ATRAVÉS DE 
TÉCNICAS MOLECULARES 
Com o objetivo de minimizar a incidência de patógenos transmitidos por alimentos, 
assim como estimar prazos de validade seguros para alimentos, bacterias patogênicas e 
deteriorantes necessitam ser identificadas de forma rápida e inequívoca (POSTOLLEC, 
2011). Diversos métodos foram propostos para a identificação das diferentes espécies 
bacterianas. 
A identificação pelos métodos microbiológicos convencionais é baseada em uma 
série de ensaios fenotípicos, pautados nas características morfológicas e bioquímicas de 
cada microrganismo. Estes ensaios além de serem muito laboriosos, em geral 
necessitam de um período de incubação superior a 24 horas para ser interpretado, o que 
pode representar uma limitação por retardar as decisões médicas e epidemiológicas, 
caso seja confirmado a infecção (BÖHME et al., 2014). 
Nas últimas décadas a identificação microbiana progrediu, tornando-se mais rápida 
e sensível, sobretudo envolvendo as técnicas baseadas na análise do DNA. Os avanços 
de bioinformática associado aos métodos moleculares baseados no sequenciamento de 
nucleotídeos do DNA estão revolucionando o conceito de identificação de 
microrganismos, inclusive de bactérias isoladas em alimentos (FENG et al., 2007). 
A associação de PCR com ferramentas de sequenciamento permitiu uma maior 
robustez dos diversos bancos de dados de acesso gratuito, permitindo uma rápida e 
intensa troca de informações relevantes sobre microrganismos de diferentes localidades 
do mundo, explorando ambiguidades e diferenças entre os mesmos (MOHANIA et al ., 
2008). 
Microchips de DNA e biosensores permitiram a substituição dos métodos de 
plaqueamento tradicional, tanto na rotina de laboratórios destinados a análises clínicas 
quanto na avaliação de alimentos (SEVERIGINI et al., 2001). A utilização de 
ferramentas moleculares tem como o objetivo auxiliar na identificação de 
microrganismos, reduzindo o tempo das analises microbiológicas e aumentando o grau 
de confiabilidade dos resultados obtidos. 
 
35 
2.7.1- PCR espécie-específicas de Salmonella sp. e Listeria sp. 
O gene invA é essencial para processo de internalização de Salmonella sp. em 
células epiteliais intestinais do hospedeiro. A PCR para esta sequencia-alvo representa 
uma nova estratégia para a detecção de Salmonella sp. Rahn e colaboradores (1992) 
descreveram a detecção de 626 isolados de Salmonella sp. através desta metodologia 
dentro dos quais encontraram apenas quatro amostras negativas, pertencentes ao sorovar 
arizonae, um sorogrupo que apresenta rotas de invasão celular alternativas, com 
deficiência na expressão do gene invA (GALAN et al .,1991) 
Quanto a detecção de Listeria sp. por métodos moleculares, Zheng e colaboradores 
(2012) descreveram uma reação de PCR multiplex, tendo como alvo o gene iap e o gene 
hly. A primeira sequencia alvo de DNA codifica a proteína p60, presente em todas as 
espécies de Listeria sp. Essa proteína esta envolvida em processos de adesão celular ao 
epitélio intestinal de hospedeiros, assim como no processo de divisão celula. A segunda 
sequencia alvo codifica uma citolisina envolvida em processos de lesão celular através 
da formação de poros na membra eucariótica da célula hospedeira, e uma vez 
completado o ciclo de internalização celular, esta proteína promove a produção de 
fosfolipase pela célula infectada, como forma de evasão de vacúolos primários e 
secundários (MCLAUCHLIN et al ., 2000). 
2.7.2- Sequenciamento do gene rDNA 16S 
 Em laboratórios de rotina, a identificação das espécies bacterianas baseia-se em 
métodos fenotípicos os quais são comparados a painéis e gráficos que demonstram as 
reações bioquímicas, resistência antimicrobiana e padrões de ácidos graxos existente 
para uma determinada família ou gênero bacteriano (O´HARA et al., 2005). Contudo 
uma ampla variabilidade morfológica existente entre bactérias pode resultar em 
interpretações equivocadas dos testes bioquímicos, especialmente em cepas isoladas de 
alimento e de origem ambiental, devido a maioria dos meios de cultura e provas 
bioquímicas serem voltados primeiramente para amostras clinicas (GORSKI et al., 
2012). A técnica de sequenciamento do gene rDNA 16S é considerado como a 
metodologia de identificação bacteriana “padrão ouro”, apresentando uma superioridade 
considerável quando comparado com com métodos fenotípicos de identificação 
36 
bacteriana (KOLBERT et al., 1999; FERRONI et al., 2002; CLOUD et al., 2004; 
BOSSHARD et al., 2006; MELLMAN et al., 2008) 
2.7.3- MALDI-TOF MS 
2.7.3.1- Descrição da técnica 
A análise por espectrometria de mssa MALDI-TOF tem como princípio a 
ionização-desorção de uma amostra previamente embebida em uma matriz ionizável, 
que ao ser bombardeada por um feixe de elétrons concentrado gera partículas ionizáveis 
as quais são aspiradas para um sistema de tubos privados de gases atmosféricos, e que 
possuem eletrodos ao final deste sistem que captam as moléculas anteriormente 
ionizadas (JONES, 2007). A escolha da matriz é essencial para o tipo de análise que 
deseja ser realizada. Análises proteômicas geralmente são realizadas utilizando matrizes 
derivadas de ácido benzoico ou ácido cinamico, (HILLEN KAMP et al., 1991), 
Inicialmente a amostra é embebida em uma solução de matriz em uma concentração 
que pode varia de 100:1 até 10.000:1. A mistura entre a amostra e uma grande 
quantidade de solução de matriz auxilia o processo de ionização e volatização da 
amostra, de maneira que não haja destruição das partículas uma vez submetidas a um 
feixe de elétrons concentrado. A solução de matriz abosrve rapidamente a radiação 
gerada por um pulso de laser que aquece a amostra ao ponto de volatiza-lá. Ao mesmo 
tempo um elétron de cada partícula ionizável presente no analito é deslocado. Esta 
técnia de ionização em que utiliza um reagente com o objetivo de impedir que a 
amostra aborva diretamente o feixe de elétrons é denominada ionização por desorção 
a laser assistida por matriz. É considerada uma ionização suave por manter a integridade 
da amostra durante este processo (MARVIN et al ., 2003) 
Ao perder um elétron, a molécula torna-se elétricamente instável ao mesmo tempo 
em queo calor promove a formação de cristais peptídicos. O feixe elétrico desloca um 
elétron de cada molécula presente na amostra gerando biopartículas carregadas 
positivamente. As micropartículas positivas são aspiradas para o analisador de massa 
tempo de voo, formado por uma rede de tubos equipados com duas placas metálicas 
contendo cargas opostas entre si em um microambiente isolado de pressão atmosférica 
externa (vácuo). Dentro do analisador de massa tempo de voo, a diferença de potencial 
existente entre as placas contribuem para acelerar a passagem de partículas carregadas 
37 
positivamente pelo sistema até atingirem o sensor de detecção de partículas 
(SCHALLEY, 2000). 
O princípio do analisador tempo de voo baseia-se na relação massa carga (m/z) 
existente entre as partículas previamente ionizadas. Partículas que foram previamente 
ionizadas e possuem cargas iguais que irão ter a mesma energia cinética, porém a 
velocidade que ambas as partículas irão percorrer a extensão do tubo e atingir os 
sensores do analisador tempo de voo irá depender da massa que cada partícula possui. 
Moléculas mais leves atingirão os sensores mais rapidamente ao passo que 
moléculas mais pesadas irão demorar mais tempo para percorrer o sistema e ser 
detectado pelos sensores. Ao final do processo o “tempo de voo” de cada partícula 
resultará na formação de um espectro o qual poderá ser visualizado graficamente em um 
plano cartesiano, aonde o eixo das abcissa representa a massa atômica unificada de uma 
molécula (m) e o eixo das ordenadas representa a sua respectiva carga formal (z) 
(SCHALLEY, 2000). 
2.7.3.2- Análise proteômica bacteriana utilizando MALDI-TOF MS 
O metabolismo celular é controlado quase em sua totalidade por processos 
envolvendo proteínas que podem apresentar-se de diversas formas como receptores 
celulares, enzimas, fatores de virulência (ABERSOLD, 2003). Deste modo a técnica de 
espectrometria de massa MALDI-TOF na área da microbiologia permite analisar o 
perfil proteico de diferentes tipos de microrganismos, possibilitando a identificação de 
bactérias relevantes tanto na área médica como também na área de tecnologia e 
alimentos (DALLUJE, 2000). A partir de uma quantidade ínfima de material biológico, 
e um preparo mínimo da amostra é possível obter a identificação de uma espécie 
bacteriana em alguns minutos, o que representa um significativo ganho de tempo na 
obtenção do resultado final quando comparado com as metodologias microbiológicas 
convencionais (GIEBEL et al., 2010). 
2.7.3.3- Aplicação da análise MALDI-TOF MS na identificação de bactérias 
A espectrometria de massa MALDI-TOF permite a identificação de bactérias Gram-
negativas ou Gram-positivas retiradas diretamente de um meio de cultura baseado no 
perfil proteômico único, ou “impressão digital proteica” deste microrganismo, que 
38 
posteriormente será comparado a um banco de dados bacteriano universal (CLAYDON 
et al., 1996). De acordo com o grau de similaridade entre as impressões digitais 
proteicas existentes neste banco de dados, atribui-se à cepa desconhecida, um valor em 
escala logarítmica ou “log score” baseado no grau de similaridade entre a cepa a qual se 
deseja identificar e as cepas depositadas no bando de dados. 
O sistema MALDI BiotyperTM
 
considera valores maiores que 2.3 como uma 
identificação bacteriana segura em nível de espécie, enquanto que valores entre 2.2 e 2.0 
asseguram a identificação em nível de gênero. Valores entre 1.9 e 1.7 permitem uma 
possível identificação no nível de gênero, e valores inferiores a 1.7 não devem ser 
considerados. 
A qualidade do banco de dados universal é um fator crucial na acurácia da 
identificação taxonomica bacteriana. O uso de cepas de referencia com uma grau 
taxonômico bem definido é um pré-requisito para uma identificação de confiança, e 
conforme um maior número de espectros, inclusive espectros de cepas de referencia são 
depositados no banco de dados, o processo de identificação pelo sistema torna-se mais 
confiável e seguro (SENG et al., 2009). 
Porém atualmente existem estudos demonstrando que é possível utilizar valores 
logarítmicos menores do que os valores empregados na plataforma de identificação 
MALDI BioTyper
TM
 e ainda assim atingir uma identificação segura de algumas 
espécies bacterianas com valores abaixo de 2.3 ou até mesmo, por exemplo, igual a 1.7. 
Em um trabalho abordando a identificação de bactérias pertencentes ao gênero 
Staphylococcus, Richter et al., 2012 demonstraram uma segura identificação em nível 
de espécie para as bactérias: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. xylosus com 
valores de 2.0. O estudo também demonstrou que valores de 1.7 foram suficientes para 
garantir a identificação das bactérias: S. intermedius, Kocuria kristinae, Kocuria 
rhizophila. Bizzini et al.(2010) relataram quem valores de 2.0 são suficientes para 
garantir uma identificação segura em nível de espécie para bactérias pertencentes à 
família Enterobactriaceae e para o gênero Enterocci. 
 
 
39 
2.7.4-Relações filoproteômicas 
O perfil espectral de um determinado grupo de microrganismo consiste em outra 
abordagem, possibilitando a investigação da presença de biomarcadores específicos para 
uma determinada espécie bacteriana, bem como permite estabelecer relações 
filoproteômicas entre grupos bacterianos distintos (FENSESLAU et al., 2001). 
O alto grau de similaridade de sequencias nucleotídicas existentes entre espécies de 
ambos os gêneros dificulta em alguns casos a correta identificação em nível de espécie, 
através do sequenciamento rDNA 16S. Daffonchio e colaboradores (2006) 
demonstraram a dificuldade de caracterização de certas espécies bacterianas pela técnica 
de sequenciamento do DNA ribossomal rDNA 16S, porém ao utilizarem a 
espectrometria de massa MALDI-TOF observaram à presença de perfis espectrais 
distintos que possibilitaram uma correta identificação de isolados bacterianos de ambas 
as espécies. 
Atualmente alguns estudos vêm sendo propostos relacionados à utilização de 
ferramentais de bioinformática com o intuito de aprimorar entendimento do perfil 
taxonômico de bactérias, o que permite revelar novos marcadores que possam fornecer 
informações adicionais sobre diferentes espécies bacterianas (ZIEGLER et al., 2015). 
2.7.5-Análise de Componentes Principais (PCA) para dados de MALDI-TOF MS 
 
Análise de componentes principais consiste numa ferramenta estatística apropriada, 
quando um observador necessita responder uma pergunta que possui um número 
considerável de variáveis, e, portanto o observador deseja desenvolver um número 
menor de variáveis artificiais com para elucidar a pergunta inicial. Os componentes 
principais gerados irão englobar grande parte das variações observadas dentro das 
variáveis originais. Os componentes principais gerados podem ser utilizados com 
critérios de variabilidade em análises subsequentes (SAS, 1989). O exemplo abaixo 
fornece uma visualização do conceito de PCA. 
Em análises de componentes principais, os valores exatos de cada dado obtido não 
indica necessariamente a natureza do valor (valores positivos ou negativos) e sim o 
quanto que duas grandezas podem contribuir para o terceiro componente (vetor) gerado. 
40 
Valores próximos a zero indicam que os componentes gerados não possibilitaram uma 
boa diferenciação dos dados obtidos (SAS, 1989). 
3-JUSTITICATIVA 
O Brasil ainda carece de dados a respeito de microrganismos presentes em pescado 
que habitam a costa nacional e são utilizados como matéria prima para as refeições 
japonesas cruas, servidas em estabelecimentos comerciais de todo o país como o atum 
(Thunnus sp.) e o namorado (Pseudopercis munida). A utilização de técnicas 
moleculares e proteômica abre a possibilidade de melhor explorar a microbiota presente 
no pescado nacional, possibilitando extrair novas informações sobre esses 
microrganismoscontaminantes. 
O aumento no consumo de pescado cru no Brasil pode acarretar em um aumento de 
DTA transmitidas por refeições a base de peixe “in natura”. 
A RDC n
o
 12 que dispõe sobre o padrão microbiológico de refeições a base de 
pescado cru não contempla certos patógenos alimentares que já foram previamente 
isolados em refeições como sushi e sashimi. 
Outro ponto relevante consiste na possibilidade de aprimorar o processo de 
identificação de bactérias causadora de DTA isoladas a partir de pescado cru. 
Técnicas moleculares permitem uma maior especificidade e rapidez na análise da 
microbiota do pescado. 
Dados obtidos podem auxiliar no aperfeiçoamento das boas práticas de fabricação 
de restaurantes self-service que comercializam refeições a base de pescado cru, e 
disponibilizar informações para agências fiscalizadoras a respeito da qualidade 
microbiológica do pescado comercializado em restaurantes do Rio de Janeiro e Niterói. 
 
 
 
 
41 
 
4-OBJETIVO 
4.1- OBJETIVO GERAL 
 
O presente estudo tem como objetivo avaliar a qualidade microbiológica em 
preparações a base de pescado cru, em três variedades de pescado distintas: atum 
(Thunnus sp.), namorado (Pseudopercis numida) e salmão (Salmo salar) 
comercializados em três restaurantes tipo self-service nos municípios de Rio de Janeiro 
e Niterói, utilizando microbiologia convencional associada a PCR espécie-específicas, 
sequenciamento parcial do gene rDNA 16S e MALDI-TOF MS. 
 
4.2-OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
* Quantificar coliformes totais e Escherichia coli em amostra de refeições a base 
de pescado cru e o pecado utilizado para a fabricação destas preparações nipônicas 
* Pesquisar Salmonella sp. e Listeria monocytogenes em amostras de sushi e 
sashimi servidos em restaurantes do Rio de Janeiro por microbiologia convencional 
e teste de PCR; 
* Identificar bactérias contaminantes por sequenciamento parcial do gene rDNA- 
16S e MALDI-TOF; 
* Comparar a identificação bacteriana pelas metodologias de sequenciamento 
parcial do gene rDNA 16S e ferramenta proteômica do tipo MALDI-TOF MS 
* Determinar o perfil proteômico de espécies bacterianas potencialmente 
patogênicas isoladas a partir de preparações a base de peixe através da a 
“Análise de componentes principais (PCA)” e a construção de dendrogramas 
filoproteômico. 
 
 
42 
5-MATERIAL E MÉTODOS 
5.1-ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS 
Foram coletadas 28 amostras de pescado de preparações japonesas do tipo sashimi e 
sushi e três amostras de pescado “in natura” a partir de três espécies distintas de peixe: 
Salmão (Salmo salar), atum (Thunnus albacares) e namorado (Pseudopercis numida). 
Foi coletada uma alíquota de 25 gramas de cada peixe antes de ser manipulado (matéria 
prima) para as análises proteômicas. As amostras eram provenientes dos três 
restaurantes distintos situados em três zonas geográficas do estado do Rio de Janeiro: 
Região metropolitana: - Restaurante “R1” (Zona Sul da cidade) e Restaurante “R2” 
(zona norte da cidade), Restaurante “R3” (município de Niterói). As amostras foram 
avaliadas para a enumeração de coliformes totais e E. coli de acordo com o método 
Petrifilm
TM
 (AOAC991. 14). O isolamento de Salmonella sp. foi realizada de acordo 
com o método BAM a análise para identificação de Listeria monocytogenes foi 
realizada de acordo com a metodologia USDA/FSIS-2009. A confirmação bioquímica 
para a presença de Salmonella sp. e L. monocytogenes foram substituídas pela 
confirmação molecular por teste de PCR. O fluxograma apresentado a seguir resume as 
análises microbiológicas que foram realizadas em ordem cronológica (Figura 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
http://pt.wikipedia.org/wiki/Salmo_salar
http://pt.wikipedia.org/wiki/Thunnus_albacares
43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Confirmação de colônias 
suspeitas de Listeria sp. e Listeria 
monocytogenes por teste de PCR 
 
Confirmação de 
colônias suspeitas de 
Salmonella sp. por 
teste dePCR 
Identificação de colônias isoladas em meios de cultura seletivos para L.monocytogenes e Salmonella 
sp. não confirmadas por PCR convencional através de sequenciamento parcial do gene rDNA 16S e 
MALDI-TOF MS 
Isolamento de 
colônias típicas de 
Salmonella sp. 
Contagem de coliformes 
totais e E.coli pelo Método 
Petrifilm 
Isolamento de colônias 
típicas de Listeria sp. 
 
Enriquecimento 
secundário em caldo 
TT/RV 
Enriquecimento 
secundário em caldo 
Fraser 
Enriquecimento 
primário em água 
peptonada 
Tamponada 
Diluição seriada em 
salina a 0,85% 
Enriquecimento 
primário em caldo UVM 
suplementado 
25g de sushi, sashimi e 
matéria-prima de salmão, 
namorado e atum 
Pesquisa de 
Salmonella sp. 
Contagem de coliformes totais 
e Escherichia coli 
 
Pesquisa de Listeria 
monocytogenes 
 
 
DIA 1 
DIA 2 
Dia 3 
Figura 1- Fluxograma da análise de microrganismos isolados de pescado por análises 
microbiológicas convencionais técnicas e moleculares baseados em DNA e proteínas. 
44 
5.1.1-Contagem de coliformes totais e Escherichia coli pela técnica Petrifilm
TM 
(AOAC). 
A partir de 25g de cada amostra de preparação a base de pescado cru, 225 mL de 
água peptonada estéril foi adicionada e homogeinizado utilizando um Stomacher 
(Seward Stomacher® 400 circulator, West Sussex, UK) por 60s. Diluições seriais 
decimais foram realizadas e alíquotas de 1;0,1;0,001 ml foram inoculadas e espalhadas 
em Petrifilm E.coli Count Plate 3M
TM 
e incubadas a 37
o
C por 48 h (método AOAC 
991.14 ). Após o período de incubação, as placas que apresentaram entre 15-150 
colônias foram selecionadas para enumeração de coliformes totais e E.coli. Colônias 
apresentando coloração azulada com ou sem a produção de gás são consideradas 
coliformes totais. Colônias vermelhas ou vermelho-azuladas com produção de gás são 
consideradas E.coli 
5.1.2-Identificação de Salmonella sp. (método BAM/Andrews, 2007). 
 Para investigar a presença de Salmonella sp. foi utilizado água peptonada 
tamponada como caldo de pré-enriquecimento. Caldo tetra-tionato e caldo Rappaport-
Vassiliadis foram usados como enriquecimento secundário (Himedia, Mumbai, Índia). 
Foi utilizado ágar Hecktoen, ágar bismuto sulfite e agar xilose lisina desoxicolato como 
meio sólido seletivo para o isolamento de colônias típicas de Salmonella sp. Colônias 
apresentando características morfológicas típicas de Salmonella sp. foram submetidas à 
confirmação molecular por teste de PCR espécie-especifica. 
5.1.3.-Identificação de Listeria sp. e Listeria monocytogenes (métodoUSDA/ 
FSIS-2009). 
 Foi investigada a presença de L. monocytogenes utilizando o caldo University of 
Vermont (Himedia, Mumbai, Índia) suplementado com 4mg de acriflavina e 10 mg de 
ácido nalidíxico como enriquecimento primário. Caldo Fraser contendo 20 mg de citrato 
férrico amoniacal (Himedia, Mumbai, Índia) foi utilizado como caldo de 
enriquecimento secundário. Foi utilizado o ágar Palcam (Himedia, Mumbai, India) 
como meio sólido seletivo para o isolamento de colônias típicas de L. monocytogenes. 
Colônias apresentando características morfológicas típicas de Listeria sp. foram 
submetidos a testes de PCR para L.monocytogenes. 
45 
5.2-Condições de PCR 
Cepas presumidas de Salmonella sp. e Listeria sp. isoladas em seus respectivos 
meios seletivos foram submetidos a testes de PCR espécie-específicos. Foi realizada lise 
térmica em Tris-EDTA (TE) de acordo com a metodologia descrita por Dias e 
colaboradores (2008) para liberação do DNA microbiano. Colônias suspeitas de 
Salmonella sp. foram analisadas para presença do gene invA de acordo com a 
metodologia descrito por Kapley e colaboradores (2000). As concentrações dos 
reagentes da reação de PCR foram 5 µL de solução tampão 1X, 2,5 mM de MgCl2, 200 
mM de DNTP, 0.25 µM de cada sequencia iniciadora e 2,5 U de enzima taq polimerase 
(InvitrogenTM
, EUA) e 100 ng de DNA genômico, resultando em um volume de reação 
final de 50 µL. 
Os pares de primers utilizados foram: invAf (5’ CTG ATC GAA TGG CTG CCA 
GGC TCC 3’) e invAR (5’CAA CCA GAC GAT AGT TAT CAC GCA3’). As 
condições de PCR foram uma desnaturação inicial de 94 
o
C/30s seguido de 40 ciclos de 
(94
o
C/30s, 60
 o
C/30s, 72
 o
C/2min); e uma etapa de extensão final de 72
 o
C/7min. O 
produto de PCR esperado era de 598 pb. 
Colônias apresentando morfologia característica de Listeria sp. foram submetidos a 
confirmação para L.monocytogenes através de reação de PCR para amplificação do gene 
Hly descrito por Zeng e colaboradores (2006). 
A concentração dos reagentes da reação de PCR foram 5 µL de tampão 1X, 2,0 mM 
de MgCl2, 200mM de dNTP´s total, 0,20 µM de cada primer, 5U de enzima Taq 
polimerase (Invitrogen
TM
, USA) e 100 ng de DNA gnômico resultando em um volume 
final de 50 µL. Os pares de primers utilizados foram: hly f (5’ GCA GTT GCA AGC 
TTG GAG TGA A 3’) e Hly R (GCA ACG TAT CCT CCA GAG TGA TCG3’). As 
condições de PCR foram uma desnaturação inicial de 94°C /4 min, seguido por 30 
ciclos de (94°C /30 s, 60°C/40 s e 72°C/40 s), e uma extensão final de 72°C/ 7min, 
resultando em um fragmento de 420 pb. 
As reações da PCR foram realizadas em um termociclador MyCycler Thermal 
Cycler (Bio Rad, Hercules, Califórnia, EUA). Os fragmentos gerados foram separados 
em eletroforese em gel de agarote a 2% e as condições de corrida eletroforética foram: 
100V, 200 MA por 80 min. Após a corrida o produto de PCR foi corado com Gel Red. 
46 
(Biomédica, Telavive, Israel). A visualização do fragmento amplificado foi realizada 
em sistema de foto documentação MiniLumi Bio-systems (BioAmerica, Tel Aviv, 
Israel). 
5.3-Sequenciamento parcial do gene rDNA 16S 
 Cepas bacterianas que não apresentaram amplificação para os genes invA e Hly 
foram submetidos a sequenciamento parcial do gene rDNA 16S e as condições de PCR 
foram realizadas de acordo com o protocolo descrito por Leite e colaboradores (2013) 
gerando um fragmento de 1,2kb. Os pares de primes utilizados foram: 27f (5´-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) e 1512r (5´ACGGCTACCTTGTTACGACT3´) 
(DEVEREUX & WILLIS, 1995). A desnaturação inicial foi realizada a 95
o
c/10min, 
seguido por 25 ciclos (etapa de desnaturação: 93
o
C /1 min, etapa de apelamento: 50 
o
C / 
1 min, etapa de extensão: 72 
o
C/ 1 min 30s e extensão final 72 
o
C /5 min). Os produtos 
da PCR foram purificados com o kit da illustra™ GFX™ PCR DNA e Gel Band 
Purification Kit, (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Os produtos da PCR 
foram sequenciados utilizando 20 ng de DNA purificado e 13 μl de sequencias 
iniciadoras com um volume final de 20 μL (Applied Biosystems, CA, EUA) e 
sequenciado em aparelho Genetic Analyzer 3130(Applied Biosystems, CA, EUA). As 
sequencias produzidas foram editadas com auxílio do software BioEdit v.7.2.5 5. 
Posteriormente as sequências finais foram comparadas com sequências previamente 
depositadas no banco de dados (NCBI/BLAST). As espécies identificadas foram 
consideradas quando apresentaram um valor percentual de homologia maior ou igual a 
97%. 
5.4-Análises proteômicas por MALDI-TOF-MS 
As cepas bacterianas analisadas por sequenciamento do gene rDNA 16S foram 
posteriormente analisadas por MALDI-TOF MS. As linhagens bacterianas pertencentes 
aos gêneros: Macrococcus sp. Staphylococcus sp. e Kocuria sp. foram previamente 
caracterizadas por ferramentas moleculares (rDNA 16S) em um estudo anterior (Projeto 
Prioridade Rio 2014 - E-26/010.001968/2014- Autenticidade de atuns e sardinhas e 
condição higiênico-sanitária de pescados e preparações de pescado comercializados no 
Estado do Rio de Janeiro) também foram submetidas a análise por MALDI-TOF MS. 
47 
O protocolo de extração proteica foi realizado de acordo com Böhme e colaboradores 
(2011). 
Isolados bacterianos foram semeados em ágar tripticase soja e incubadas a 35°C por 
24 h. Uma alçada de cada cepa foi tratada com 100 μL de uma solução contendo 50% 
acetonitrila (Merck, Darmstadt-Alemanaha) e 1% ácido trifluoracético (TFA; Acros 
Organics, NJ, EUA). Após agitar vigorosamente a mistura com o auxílio de um córtex, 
a solução foi centrifugado e adicionado o ácido α-cyano-4-hydroxycinâmico (α-CHCA; 
Sigma-Adrice, Saint Louis, MO, EUA) ao sobrenadante. O material foi depositado 
sobre uma placa de aço de 96 poços. As análises de espectrometria de massa foram 
realizadas em um espectrômetro de massa “MALDI-TOF” (Microflex, Bruker 
Daltonics; Bremen, Alemanha) equipado com um canhão de laser (comprimento de 
onda, 337 nm;), operando em modo linear positivo. Os espectros de massa foram 
analisados entre as faixas m/z de 2.000 e 20000. 
Posteriormente os espectros obtidos foram compararados com os dados disponíveis 
no banco de dados universal Biotyper v 3.0 (Bruker Daltonics
TM
, Alemanha). Como 
critério de identificação para os gêneros Staphylococcus sp.,Kocuria sp. e Macrococcus 
sp. foi utilizado um ponto de corte em log, igual ou acima de 2.0, que indica uma 
identificação bacteriana em nível de espécie para S. aureus, S. epidermidis, S. 
saprophyticus, S. xylosus (RICHTER et al., 2012). Pontos de corte igual ou superior a 
1.7 indicavam uma identificação para S. intermedius, Kocuria kristinae, Kocuria 
rhizophila, e Macrococcus caseolyticus. Pontos de corte abaixo de 1.6 foram 
considerados insuficientes para identificação bacteriana. Os pontos de corte para 
Enteroabcteriaceae e para o gênero Enterocci foi baseado de acordo com Bizzini e 
colaboradores (2010) e foi considerada uma identificação segura em nível de espécies 
quando apresentavam valores ≥ 2.0. Pontos de corte entre 1.9 e 1.7 foram considerados 
para identificação em nível de gênero, dentro de membros pertencem a esta família. 
5.5- Análises estatísticas 
 A análise de dados foi realizada com auxílio de uma planilha eletrônica Excel 
(Microsof
t
 Inc.) e o programa bioestatístico Epi Info v. 7. Estatística descritiva foi 
realizada através de uma distribuição de frequência para todos os microrganismos 
analisados pela técnica de sequenciamento parcial do gene rDNA 16S e MALDI-TOF 
48 
MS. Teste de Mc Nemar´s e teste Chi quadrado foram aplicados para comparar os 
resultados obtidos para ambas às metodologias de identificação, com um nível de 
significância de 5% (p ≤0,05). 
6- RESULTADOS 
6.1. ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS 
 Em relação à contagem de coliformes totais, cinco amostras (25%) apresentaram 
índices limítrofes para este parâmetro microbiológico. No R3 foram encontradas três 
amostras de pescado com altos índices de coliformes totais, sendo que em duas 
amostras de sushi e sashimi de namorado, foi identificado E. Coli, havendo indício de 
contaminação de origem fecal (tabela 1). O restaurante R3 apresentou um número maior 
de amostras reprovadas em relação à contagem de coliformes totais e presença de 
E.coli. Das 31 amostras avaliadas, 13 apresentaram colônias suspeitas de Salmonella sp. 
e em 30 amostras foram isoladas colônias suspeitas de Listeria sp. nos respectivos 
meios seletivos, 
6.2- PCR ESPÉCIE-ESPECÍFICA 
 A partir das colônias isoladas que apresentaram características morfológicas típicas 
de Salmonella sp. e L. monocytogenes, reações de PCR foram realizadas em cada cinco 
isolado bacteriano, porém não foi observada amplificação para nenhum dos genes, invA 
e hly (Tabela 1). Com o intuito de excluir a possibilidade de amostras falsa negativa 
foram realizadas centrifugações dos caldos TT, RV e Fraser, posteriormente lavagens 
sucessivas com PBS 1X, e reações de PCR a partir destes respectivos caldos diluídos, 
visando assim minimizar efeitos de compostos inibitórios presentes nestes meios de 
cultura, e para certificar que não existia nenhuma célula morta em etapas de 
enriquecimento anterior ao isolamento em meios seletivos. 
 
49 
 
6.3-SEQUENCIAMENTO