Josiane-Dissertacao

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
CENTRO DE TECNOLOGIA 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO POR Staphylococcus aureus ATRAVÉS DE 
TÉCNICAS MOLECULARES E CORRELAÇÃO COM OS ASPECTOS HIGIÊNICO-
SANITÁRIOS EM PREPARAÇÕES DE PESCADO CRU (SUSHI E SASHIMI) 
 
 
 
JOSIANE MARÍLIA DO CARMO 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2015 
 
 
 
 
 
JOSIANE MARÍLIA DO CARMO 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO POR Staphylococcus aureus ATRAVÉS DE 
TÉCNICAS MOLECULARES E CORRELAÇÃO COM OS ASPECTOS HIGIÊNICO-
SANITÁRIOS EM PREPARAÇÕES DE PESCADO CRU (SUSHI E SASHIMI) 
 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do 
Programa de Pós-graduação em Ciência de 
Alimentos – UFRJ, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do grau de Mestre em 
Ciência de Alimentos 
 
Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
Co-orientador: Ana Carolina da S. Carvalho 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2015 
 
 
 
 
 
 
C287 
 Carmo, Josiane Marília do. 
 Avaliação da contaminação por Staphylococcus aureus através de 
técnicas moleculares e correlação com os aspectos higiênico-sanitários em 
preparações de pescado cru (sushi e sashimi) / Josiane Marília do Carmo. 
– Rio de Janeiro: UFRJ/ IQ, 2015. 
 
 87f. 
 
 Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin. 
 
 Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio de Janeiro, 
Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Ciência de 
Alimentos, 2015. 
 
 
 1. Sushi e sahimi. 2. Reação em cadeia da polimerase. 3. 
Staphylococcus aureus. I. Paschoalin, Vânia Margaret Flosi. (Orient.). II. 
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa 
de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos III. Título. 
 
 
 CDD: 664.001 
 
 
 
 
JOSIANE MARÍLIA DO CARMO 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DA CONTAMINAÇÃO POR Staphylococcus aureus ATRAVÉS DE 
TÉCNICAS MOLECULARES E CORRELAÇÃO COM OS ASPECTOS HIGIÊNICO-
SANITÁRIOS EM PREPARAÇÕES DE PESCADO CRU (SUSHI E SASHIMI) 
 
 
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do 
Programa de Pós-graduação em Ciência de 
Alimentos – UFRJ, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do grau de Mestre em 
Ciência de Alimentos 
 
Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
Co-orientador: Ana Carolina Carvalho 
 
 
 
Aprovado em: 
 
 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
_____________________________________________ 
Profa. Dra. Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
Instituto de Química - UFRJ 
 
 
_____________________________________________ 
Prof. Dra. Daniela Sales Alviano 
Instituto de Microbiologia Paulo de Góes- UFRJ 
 
 
_____________________________________________ 
Dra. Patrícia Ribeiro Pereira 
Instituto de Química - UFRJ
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Primeiramente a Deus, por me conceder consciência e discernimento ao desenvolver o 
meu trabalho e por ser meu auxílio nos momentos difíceis. 
Em especial ao meu noivo Ivan Lima, por sua compreensão pelo tempo ausente, por 
tolerar meus estresses em determinados momentos desta pesquisa e principalmente por me 
ensinar o que é uma verdadeira relação de parceria. Meu agradecimento com imenso carinho! 
A todos os meus familiares e amigos pelas orações e apoio em todos os momentos. 
Ao Instituto de Química e ao Programa de Pós Graduação em Ciência de Alimentos pela 
oportunidade e suporte para minha formação profissional. 
A equipe do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Profº Rafael Duarte, Karen 
Machado, Rayane Charmon e Marlei Gomes, pela troca de experiências e toda colaboração para 
o desenvolvimento dos experimentos deste estudo. 
A Professora Vânia Paschoalin pela orientação e todos os recursos. 
Aos amigos pesquisadores do projeto de pesquisa em segurança e higiene do pescado, 
Claudius Cabral, Claudio Capella, e a minha Co-orientadora Ana Carolina Carvalho pelos 
inúmeros “brainstorms”. 
Aos demais integrantes do laboratório 545, em especial o professor Eduardo Mere e 
Raquel Casaes, pelas dúvidas esclarecidas e contribuição com esse estudo. 
A equipe de nutrição institucional do Hospital Universitário da UERJ, Samyra Kede, 
Jacqueline Carvalho, Cinthia Souza, Vânia Magalhães e Débora de Jesus, pela colaboração e 
coberturas na escala de trabalho. 
A Roberta Cândido, minha “filha”, pela solidariedade e importante ajuda com as minhas 
dificuldades de informática. 
E as demais pessoas que por ventura eu não tenha citado aqui, mas que participaram com 
igual importância deste período de minha formação, o meu muito obrigada! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este estudo a uma pessoa muito especial que chegou como um 
presente divino e fez uma transformação em minha vida. 
 
Ivan Lima, apesar da minha determinação, sem o seu apoio 
não sei se esse objetivo seria concretizado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
"Você não pode mudar o vento, mas pode ajustar as velas do 
barco para chegar onde quer." 
 
 
Confúcio 
 
 
 
 
RESUMO 
Carmo, Josiane Marília do. Avaliação da contaminação por Staphylococcus aureus através de técnicas 
moleculares e correlação com os aspectos higiênico-sanitários em preparações de pescado cru (sushi e 
sashimi). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2015. 
 
 A globalização tem contribuído para incorporação da culinária tradicional de diferentes culturas 
no cotidiano da população brasileira, o que aliado aos benefícios nutricionais do pescado e a busca por 
alimentos mais saudáveis tem contribuído com a popularização do hábito de ingerir pescado cru no país, 
sobretudo na forma de sushi e sashimi. O pescado sem prévio tratamento térmico pode estar associado a 
veiculação de microrganismo patogênicos, e comprometer a saúde do consumidor. O objetivo do presente 
estudo foi avaliar a qualidade de preparações de sushi e sashimi quanto a presença de Staphylococcus 
coagulase positiva comercializados em três unidades de uma rede de restaurantes não especializados em 
culinária nipônica. As condições higiênico-sanitárias destes estabelecimentos foram avaliadas, assim 
como se os manipuladores eram portadores assintomáticos dos microrganismos. Foram utilizadas técnicas 
de microbiologia convencional e ferramentas moleculares como a PCR, sequenciamento do gene 16S 
rDNA e PFGE (eletroforese em campo pulsado). Também foi determinada a resistência antimicrobiana 
dos isolados de S. aureus para pesquisar cepas resistentes à meticilina (MRSA). Um total de 31 amostras 
de pescado e 06 amostras de manipuladores (cavidades nasofaringeana e orofaringeana e mãos) foi 
coletado. 29% das amostras de alimentos apresentaram contagem elevada de Staphylococcus coagulase 
positiva (SCP) em meio seletivo. Quinze isolados foram identificados como S. aureus, sendo 12 deles pelo 
teste de PCR e 03 pelo sequenciamento do gene 16SrDNA. A relação clonal entre os isolados de pescado 
e dos manipuladores foi analisada por PFGE, demonstrando que um dos manipuladores avaliados foi a 
fonte de contaminação de preparações de pescado cru servidos naquele restaurante. Quanto aos demais 
grupos bacterianos que foram isolados a partir das amostras de sushi e sashimi, houve prevalência de 
membros da família Enterobacteriaceae (88%). Em relação às boas práticas de fabricação, apenas um dos 
estabelecimentos apresentou percentual de conformidades superior a 76%. No presente estudo, foi 
demonstrado que a qualidade microbiológica das preparações a base de pescado cru apresentaram 
contaminação que parece estar relacionada à condições higiênico-sanitárias não satisfatórias. 
Palavra-chave: Staphylococcus aureus, Sushi e sashimi, PCR, PFGE, Sequenciamento do gene 16SrDNA, 
Boas Práticasde Fabricação. 
 
 
 
ABSTRACT 
Carmo, Josiane Marília do. Identificação de Staphylococcus aureus por técnicas moleculares e correlação 
com os aspectos higiênico-sanitários em preparações a base de pescado cru (sushi e sashimi). Instituto de 
Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2015. 
 
Globalization has contributed to the incorporation of traditional cuisine of different cultures in 
everyday life of the population, combining the nutritional benefits of fish and the search for healthier 
foods has contributed to the popularity of the habit of eating raw fish in the country, such as sushi and 
sashimi. The raw fish consumption has been associated with transmission of pathogenic microorganisms 
that can jeopardize consumers health. The aim of this study was to evaluate the quality of sushi and 
sashimi preparations for the presence of coagulase positive Staphylococcus (SCP) marketed in three units 
of restaurants form the same chain, do not specialize in Japanese food. The sanitary conditions of these 
restaurants were evaluated including the evaluation of handlers as asymptomatic carriers of SCP. Raw fish 
microbiota was studied by conventional microbiology and molecular tools as PCR, 16S rDNA partial 
sequencing and pulse-field gel electrophoresis (PFGE). It was also determined the antimicrobial resistance 
of S. aureus strains to methicillin (MRSA). A total of 31 samples from raw fish and 06 samples from 
handlers (nasopharyngeal and oropharyngeal cavities and hands) were collected. 29% of food samples 
showed high counts of Staphylococcus coagulase positive (SCP) in selective medium. Fifteen isolates 
were identified as S. aureus, 12 of them by PCR and 03, by 16S rDNA sequencing. The relationship 
between clonal isolates of fish and handlers was evaluated by PFGE, showing that one of the handlers was 
the source of raw fish contamination served at the restaurant. Other bacteria species were isolated from 
sushi and sashimi, with high prevalence (88%) of Enterobacteriaceae members. A compliance of 76% to 
good manufacturing practices was reached by a single restaurant. A single restaurant showed compliance 
superior to 76% to good manufacturing practices. In the present study, it was shown that the 
microbiological quality of the raw fish contamination may be related to unsatisfactory sanitary conditions. 
Keywords: Staphylococcus aureus, Sushi and Sashimi, PCR, PFGE, 16S rDNA sequencing, 
Good Manufacturing Practices 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1. Valores mínimos e máximos em UFC/g, de Staphylococcus 
coagulase positiva (SCP) encontradas em amostras de peixes, filés e 
preparados (sushi e sashimi) de salmão, atum e namorado, coletados em três 
restaurantes (R1, R2, R3) dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no 
período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014. 
 
42 
Tabela 2. Análises microbiológicas (UFC/g), de Staphylococcus coagulase 
positiva em amostras de filé e preparados (sushi e sashimi) de atum 
(Thunnus sp.), coletados em três restaurantes dos municípios do Rio de 
Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014. 
 
43 
Tabela 3. Análises microbiológicas (UFC/g de alimento), de 
Staphylococcus coagulase positiva em amostras de matéria-prima, filé e 
preparados (sushi e sashimi) de namorado (Pseudopercis numda), coletados 
em três restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período 
de setembro de 2013 a fevereiro de 2014. 
 
 
43 
Tabela 4. Análises microbiológicas (UFC/g de alimento), de 
Staphylococcus coagulase positiva em amostras de matéria-prima, filé e 
preparados (sushi e sashimi) de salmão (Salmo salar), coletados em três 
restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de 
setembro de 2013 a fevereiro de 2014. 
 
44 
Tabela 5. Análise microbiológica de amostras coletadas de manipuladores 
quanto a presença de Staphylococcus coagulase positiva por estabelecimento 
estudado, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014 (nos 
municípios do Rio de Janeiro e Niterói). 
 
45 
Tabela 6. Análise microbiológica de amostras coletadas de manipuladores 
quanto a presença de Staphylococcus coagulase positiva de nasofaringe, 
orofaringe e mãos dos manipuladores de três restaurantes dos municípios do 
Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 
2014. 
 
45 
Tabela 7. Identificação de isolados bacterianos por sequenciamento parcial 
do 16S rDNA. 
48 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1. Staphylococcus aureus - www.hivwebstudy.org 
 
30 
Figura 2. Identificação de S. aureus em amostras de preparados de peixe cru 
e manipuladores de três restaurantes dos municípios do Rio de Janeiro e 
Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014. 
 
46 
Figura 3. Dendograma de distribuição dos perfis clonais e resistência a 
antimicrobianos observados entre S. aureus isolados de preparações a base 
de peixe cru (sashimi e shushi) e manipuladores em restaurantes (R1, R2 e 
R3) dos municípios do Rio de Janeiro e Niterói, no período de setembro de 
2013 a fevereiro de 2014. 
 
49 
Figura 4. Avaliação da adequação das condições higiênico-sanitárias do 
estabelecimento R1 de acordo com os itens de BPF estabelecidos pela RDC 
216 - ANVISA. 
 
51 
Figura 5. Avaliação da adequação das condições higiênico-sanitárias do 
estabelecimento R2 de acordo com os itens de BPF estabelecidos pela RDC 
216 - ANVISA. 
 
51 
Figura 6. Avaliação da adequação das condições higiênico-sanitárias do 
estabelecimento R3 de acordo com os itens de BPF estabelecidos pela RDC 
216 - ANVISA. 
 
52 
Figura 7. Relação entre as amostras reprovadas quanto aos limites 
estabelecidos pela RDC 12 – ANVISA e percentual de adequação das Boas 
Práticas definidas pela RDC 216 – ANVISA. 
53 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
https://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAYQjB1qFQoTCM26pf3Vq8cCFYGKkAodrVsDig&url=http%3A%2F%2Fwww.hivwebstudy.org%2Fcases%2Fdermatologic-manifestations%2Fmethicillin-resistant-staphylococcus-aureus-mrsa-skin-and-soft&ei=vX7PVY3oJ4GVwgStt43QCA&bvm=bv.99804247,d.Y2I&psig=AFQjCNE64zOqWGpEDc10gaaN9DWjRbGB2A&ust=1439747738790083
 
 
 
LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS 
 
DTA - Doença Transmitida por Alimento 
BPF - Boas Práticas de Fabricação 
APPCC - Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle 
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
RDC – Resolução da Diretoria Colegiada 
MS – Ministério da Saúde 
IDEC – Instituto de Defesa do Consumidor 
MAPA – Ministério de Agricultura Pecuária e Abastecimento 
SVS – Secretaria de Vigilância em Saúde 
OMS – Organização Mundial de Saúde 
ICMSF – International Commission on Microbiological Specifications for Foods 
SCP – Sthaphylococcus Coagulase Positiva 
PCR – Polymerase Chain Reaction 
PFGE – Pulsed Field Gel Eletrophoresis 
MRSA – Staphylococcus aureus resistente a meticilina 
TSA – Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos 
CLSI - Clinical and Laboratorial Standarts Institute 
UPGMA – Unweighteh Pais Group Method whith Arithmetic Mean 
 
 
 
 
 SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO 15 
2 REVISÃO DE LITERATURA 17 
2.1 Consumo de preparações a base de pescado cru – Culinária Japonesa 17 
2.2 Vigilância Sanitária 17 
2.3 Segurança dos Alimentos 19 
2.4 Higiene do ambiente, equipamentos e utensílios 21 
2.5 Manipuladores de alimentos 22 
2.6 Importância do controle microbiológico nos alimentos 24 
2.7 Pescado 26 
2.8 Conservação do Pescado 26 
2.9 Aspectos microbiológicos de pescados 27 
2.10 Staphylococcus Coagulase Positiva (SCP) 28 
2.11 Staphylococcus aureus 30 
2.12 Identificação de Staphylococcus aureus em alimentos 31 
2.13 Resistência a antimicrobianos 32 
3 JUSTIFICATIVA 35 
4 OBJETIVOS 36 
4.1 Objetivo geral 36 
4.2 Objetivos específicos 36 
5 MATERIAL E MÉTODO 37 
5.1 Desenho experimental 37 
5.2 Análise microbiológicae isolamento de SCP em preparados a base de peixe cru 
(sushi e sashimi) e manipuladores 
37 
5.3 Testes de PCR para identificação dos isolados 37 
5.4 Identificação dos isolados por sequenciamento parcial do gene 16S rDNA 38 
5.5 Comparação do perfil clonal de S. aureus por Pulsed Field Gel Electrophoresis 
(PFGE) 
39 
5.6 Teste de suscetibilidade dos isolados a agentes antimicrobianos (TSA) 40 
 
 
 
5.7 Avaliação dos restaurantes estudados quanto aos critérios de Boas Práticas na 
Manipulação dos Alimentos 
40 
5.8 Análise de dados 40 
5.9 Aspectos éticos 41 
6 RESULTADOS 42 
6.1 Análise microbiológica do pescado in natura, preparados a base de peixe cru 
(sushi e sashimi) e manipuladores 
42 
6.2 Identificação dos microrganismos isolados por técnicas moleculares 46 
6.2.1 Baseadas em PCR 46 
6.2.2 Baseadas no sequenciamento parcial do gene 16S rDNA 45 
6.3 Comparação do perfil clonal de S. aureus por PFGE 48 
6.4 Teste de suscetibilidade a substâncias antimicrobianas (TSA) 50 
6.5 Avaliação de critérios de Boas Práticas na Manipulação dos Alimentos 50 
7 DISCUSSÃO 54 
8 CONCLUSÕES 58 
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 59 
ANEXOS 
I - CHECKLIST PARA AVALIAÇÃO DE BOAS PRÁTICAS EM SERVIÇOS DE 
ALIMENTAÇÃO 
68 
II - RESUMO PUBLICADO EM EVENTO CIENTÍFICO - 27º Congresso Brasileiro 
de Microbiologia 
79 
III - RESUMO PUBLICADO EM EVENTO CIENTÍFICO - CHEMRIO 2014, 
Symposium 
80 
IV - RESUMO PUBLICADO EM EVENTO CIENTÍFICO - 3ºI Seminário em 
Inovação e Tecnologia na Área de Alimentos, SITA 
81 
V - APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTO CIENTÍFICO: VII 
Congresso Latino-Americano e XIII Congresso Brasileiro de Higienistas de 
Alimentos. 
82 
 
15 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
O perfil alimentar da população é influenciado por diversos aspectos, como a disponibilidade 
dos alimentos, hábitos regionais e aspectos econômicos. No caso do Brasil, o hábito alimentar é 
um reflexo dos padrões socioculturais introduzidos pela migração maciça de diferentes grupos 
étnicos, resultando em diferenças em áreas ou regiões do país (DUTRA DE OLIVEIRA et al, 
2002). No que tange à imigração, destaca-se a japonesa que tem promovido um enraizamento 
muito crescente de seus costumes alimentares no cotidiano brasileiro, tanto considerando o 
aumento do número de restaurantes especializados na culinária japonesa, como a presença de 
alguns pratos típicos servidos em restaurantes não especializados. As lojas especializadas em 
alimentos típicos da culinária japonesa, anteriormente restritas a regiões onde predominavam 
imigrantes asiáticos, tornaram-se comuns, estando presentes em quase todos os shopping centers 
dentro da categoria fast-food, existindo, até mesmo, lojas especializadas na modalidade de 
entrega em domicílio - delivery (GERMANO & GERMANO, 2008). 
Denomina-se sashimi qualquer alimento marítimo consumido cru, como peixes, mariscos e 
camarões (ALCÂNTRA, 2009). Segundo Sikorski, Kolakowaska e Burt (1990) o pescado 
destinado à elaboração do sashimi deve ser fresco e não pode ser submetido ao congelamento, 
permitindo-se apenas o resfriamento, visando o retardo do desenvolvimento microbiano. Por isso, 
a captura, manipulação e conservação do pescado para a preparação deste tipo de alimento, 
necessitam de cuidados especiais. 
Considerando a elevação de consumo de sushi e sashimi no país, é importante a realização de 
uma reflexão no contexto da Segurança Alimentar e Nutricional (SAN). Estima-se que 
aproximadamente 100 milhões de indivíduos, considerando a população de todos os países 
industrializados, contraem doenças de origem alimentar, convencionalmente chamadas de 
doenças transmitidas por alimentos (DTA), devido ao consumo de água e/ou alimentos 
contaminados (FIGUEIREDO, 2004). 
As enfermidades de origem alimentar são devido à ingestão de alimentos contaminados com 
micro-organismos ou toxinas indesejáveis (MARTINS, 2006). Muitos casos de enfermidades 
causados por alimentos não são notificados aos órgãos de inspeção ou agências de saúde, pois 
seus sintomas são geralmente brandos e a vítima não busca atendimento médico (FORSYTHE, 
2002). Além disso, certas sociedades não associam a diarreia a um sintoma de doença, mas a 
ocorrências naturais, não relacionadas com a contaminação do alimento, tais como: indigestão, 
16 
 
 
excesso de condimentos e superstições (MOTARJEMI & KÄFERSTEIN, 1997). Esse 
desconhecimento sobre a origem das DTAS faz com que muitos consumidores subestimem a 
frequência das sérias consequências de se ingerir um alimento contaminado com micro-
organismos patogênicos (HANASHIRO, 2002). 
O número de casos de doenças transmitidas por alimentos (DTAs) tendo como veículo os 
pescados é geralmente baixo quando comparado ao dos causados por carnes de maneira geral e 
frango em particular, ovos, leite e derivados. A importância do pescado como veiculador de 
patógenos depende de fatores como a dieta e a forma de preparo. No Japão, onde o peixe é 
importante parte da dieta, sendo muitas vezes consumido cru, a proporção de DTAs oriunda de 
pescados é maior que nos países ocidentais (HUSS; REILLY; EMBAREK, 2000). Moluscos 
filtradores e peixes consumidos crus são produtos de alto risco, já que não há como fazer o 
controle completo de agentes patogênicos destes produtos. O consumo de pescados que sofreram 
cocção é mais seguro do ponto de vista microbiológico (HUSS; REILLY; EMBAREK, 2000). 
No caso de iguarias como sushi e sashimi, preparadas manualmente, além da contaminação 
do pescado, o contato direto do alimento com as mãos dos manipuladores pode levar ao aumento 
da incidência de patógenos como Staphylococcus aureus (JAY, 2005). Segundo Silva Jr. (2001), 
preparações muito manipuladas são consideradas de alto risco, especialmente quando elaboradas 
por pessoas que não possuem treinamento adequado. Deste modo, aspectos higiênico-sanitários 
devem ser controlados para um consumo seguro desses alimentos. 
O presente trabalho teve como objetivo identificar e enumerar a presença de Staphylococcus 
coagulase positiva em preparações a base de pescado cru (sushi e sashimi) comercializados em 
três unidades de uma rede de restaurantes não especializados em culinária nipônica, dos 
municípios de Niterói e Rio de Janeiro - RJ, investigando sua procedência através de uma análise 
das condições higiênico-sanitárias a que esses alimentos foram submetidos, e correlacionar a 
presença destes micro-organismos nos manipuladores, denominados sushimen. 
17 
 
 
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
2.1 Consumo de preparações a base de pescado cru – Culinária Japonesa 
 Dentre os fatores que influenciam no consumo alimentar de uma população, podemos 
citar aspectos nutricionais, sociais, históricos, simbólicos, políticos e até ideológicos. Os 
pescados em geral têm alcançado popularidade na mesa dos brasileiros. Atualmente a influência 
da culinária japonesa tem se difundido muito, principalmente pelo consumo de sushi e sashimi 
(ALCÂNTRA, 2009). 
O sushi é constituído à base de arroz temperado com vinagre, açúcar e sal combinado com 
pescado cru ou ainda vegetal e frutas. Já o sashimi corresponde ao peixe cru filetado em pequenas 
porções. Entre os peixes mais utilizados estão o atum, o salmão e o namorado (MATTÉ et al., 
2006). 
A comida japonesa está em alta no Brasil. Nos últimos quinze anos o consumo de comida 
japonesa nas cidades brasileiras aumentou 400%. Este movimento tem recebido auxílio até das 
churrascarias, que ultimamente, oferecem essas iguarias em seu bufê de saladas. O número de 
restaurantes especializados também tem aumentado. Um dos motivos associados está a culinária 
saudável com baixo teor de gorduras saturadas (CARNEIRO, 2012). 
 
2.2 Vigilância Sanitária 
Segundo a Lei n° 8.080 de 19 de setembro de 1990 (artigo 6°, § 1°) a Vigilância Sanitária 
é definida por “um conjunto de ações capaz de eliminar, diminuir ou prevenir riscos à saúde e de 
intervir nos problemas sanitáriosdecorrentes do meio ambiente; da produção e circulação de 
bens; e da prestação de serviços de interesse da saúde, abrangendo o controle de bens de consumo 
que, direta ou indiretamente, se relacionam com a saúde, compreendidas todas as etapas e 
processo, da produção ao consumo; e o controle da prestação de serviços que se relacionam direta 
ou indiretamente com a saúde” (BRASIL, 1990). 
A eficiência do órgão fiscalizador está diretamente ligada às políticas de saúde adotadas 
pelos Governos Federal, Estadual e Municipal, onde as ações de vigilância sanitária têm 
predominantemente caráter fiscal, e são exclusivas do Estado (VALENTE, 2001). Como um pré-
requisito para a saúde, a alimentação pode sofrer intervenção de políticas públicas com objetivo 
18 
 
 
de assegurar o acesso da população a alimentos de qualidade (SOUZA; PELICIONI; PEREIRA, 
2003). 
Em 26 de novembro de 1993, o Ministério da Saúde (MS) publicou a Portaria Federal n° 
1.428 que estabeleceu diretrizes para as Boas Práticas de Fabricação (BPF) e a utilização do 
Sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle - APPCC, visando à prevenção e 
controle higiênico dos alimentos (GERMANO et al, 2000). 
Diante do crescimento de estabelecimentos comerciais que prestam serviços de 
alimentação, o Ministério da Saúde, por meio de seu órgão regulador, a Agência Nacional de 
Vigilância Sanitária (ANVISA), juntamente com representantes dos diversos setores e 
profissionais de estabelecimentos que prestam este tipo de serviço, definiram o conteúdo de uma 
resolução aplicável em âmbito nacional, à padronização os processos envolvidos na produção de 
alimentos e à fiscalização exercida pelas ações de vigilância sanitária. Assim, em 16 de setembro 
de 2004 foi publicada no Diário Oficial da União a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 
216 (BRASIL, 2004) que dispõe sobre o “Regulamento Técnico de Boas Práticas para Serviços 
de Alimentação” cujo objetivo foi estabelecer procedimentos de Boas Práticas de Fabricação para 
serviços de alimentação a fim de garantir as condições higiênico-sanitárias do alimento 
preparado. Cabe à Vigilância Sanitária, a fiscalização deste tipo de estabelecimento no 
cumprimento das legislações, garantindo a segurança do alimento comercializado. 
De acordo com Silva Júnior (2014), as BPF são normas de procedimentos que tem como 
objetivo, atingir um determinado Padrão de Identidade e Qualidade de um produto e/ou um 
serviço na área de alimentos, cuja eficácia e efetividade deverão ser avaliadas através de inspeção 
e/ou investigação. São práticas preventivas que incluem aspectos que vão desde a produção no 
campo até a mesa do consumidor final, passando pela industrialização, distribuição e 
comercialização (PAS, 2004). 
A aplicação das BPF é de extrema importância, pois a partir destas ocorreram grandes 
mudanças, tanto estruturais como comportamentais nos estabelecimentos comerciais e industriais, 
entre outros seguimentos que manipulam alimentos, para promover a qualidade higiênico-
sanitária e a conformidade da produção de alimentos de acordo com a legislação vigente (RÊGO 
et al, 2001). 
Os itens para a elaboração do manual de boas práticas e para as diretrizes da inspeção 
sanitária são: responsabilidade técnica, controle de saúde dos funcionários, controle de água para 
19 
 
 
o consumo, controle das matérias primas, controle integrado de pragas, visitantes, estrutura dos 
estabelecimentos, higiene, manipulação e transporte (SILVA JÚNIOR, 2014). 
A garantia de um alimento seguro para o consumidor pode ser avaliada através de uma 
lista de verificação, também chamada de checklist após a implantação de programas de qualidade. 
Este é um formulário que analisa requisitos relativos aos funcionários, instalações, saneamento, 
sanitização, equipamentos, produção e controle de qualidade. A partir desta análise pode ser 
realizado um levantamento dos pontos críticos e planejar ações corretivas visando à adequação de 
todo o processo conforme a legislação vigente (SEIXAS et al, 2008). 
 
2.3 Segurança dos Alimentos 
Entende-se por segurança dos alimentos a aquisição, pelo consumidor, de alimentos de 
boa qualidade, livre de contaminantes, ou perigos, de natureza química, biológica, física ou 
quaisquer substâncias que possam causar danos à saúde (CALAÇA, 2003). 
Os principais órgãos responsáveis pelo controle de qualidade dos alimentos no Brasil são: 
o Ministério da Saúde (MS), Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) e o 
Instituto Brasileiro de Defesa do Consumidor (IDEC) (CAVALLI, 2001). 
Vários fatores podem contribuir para que um alimento deixe de ser seguro e torne-se um 
fator de risco para a saúde humana, entre eles podemos citar matérias primas contaminadas, 
instalações inadequadas, manipuladores portadores de micro-organismos patogênicos, alimentos 
preparados com muita antecedência, falta de higiene de manipuladores, procedimentos de 
higienização de equipamentos e utensílios deficientes, cozimento insuficiente, contaminação por 
pragas e vetores e estocagem de alimentos em temperaturas inseguras. Essas situações 
contribuem para que ocorram alterações nos alimentos que muitas vezes não está diretamente 
relacionado com sua aparência, e sim com suas características físicas, químicas e 
microbiológicas, ou seja, um alimento aparentemente bom pode estar alterado ou deteriorado. 
 Existem várias doenças que podem ser veiculadas pelos alimentos; muitas podem causar 
problemas graves de saúde, inclusive levar ao óbito do consumidor (FERREIRA, 2006). 
As doenças transmitidas por alimentos (DTAs) representam um problema de grande 
importância na Saúde Pública, pois ocasionam a redução da produtividade, perdas econômicas e 
afetam a confiança do consumidor. Países em desenvolvimento, como o Brasil possuem uma taxa 
mais alta de incidência de DTAs quando comparados com países desenvolvidos. A gravidade da 
20 
 
 
doença depende da quantidade do alimento contaminado ingerido, do tipo de micro-organismo 
e/ou toxina envolvida, e do estado de saúde do indivíduo acometido (BENEVIDES; LOVATTI, 
2004). 
No Brasil, somente alguns estados e/ou municípios dispõem de estatísticas e dados sobre a 
ocorrência de surtos de DTA, agentes etiológicos mais comuns, alimentos mais frequentemente 
implicados, população de maior risco e outros fatores. Porém, a maioria dos casos de DTA não 
são notificados como explicado anteriormente (SANTOS, 2010). O Ministério da Saúde, por 
meio das secretarias municipais de saúde, é o órgão responsável pelos registros de surtos de DTA 
no país. 
Dados da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS, apud SANTOS, 2010) indicam que 
foram notificados 6602 surtos de DTA no Brasil com 117300 indivíduos doentes e 64 óbitos no 
período de 1999-2008. Segundo a SVS estes números estariam subestimados. Os dados 
disponíveis indicam que o agente etiológico era ignorado em 51% dos surtos e o veículo 
(alimento) era desconhecido em 34,3% dos surtos. De acordo com as informações disponíveis, a 
maior parte dos surtos de DTA (84%) é causada por bactérias patogênicas e/ou suas toxinas, 
predominando Salmonella spp. (42,9%), Staphylococcus spp. (20,2%), Bacillus cereus (6,9%), 
Clostridium perfringens (4,9%), Salmonella enteritidis (4,0%), Shigella sp. (2,7%), e outros 
(18,4%), seguidas por vírus (13,6%), contaminantes químicos (1,2%) e parasitos (1%). 
A diarreia é um dos sintomas mais comuns da DTA, juntamente com a dor de estômago, 
náusea, vômitos e febre (FORYSTHE, 2002). Cerca de 70% dos casos de doença diarreica aguda 
são causados por consumo de água e/ou alimentos contaminados, segundo estimativas da 
Organização Mundial de Saúde (OMS) (REUNIÃO INTERAMERICANA DE SAÚDE E 
AGRICULTURA, 2003). 
Registros epidemiológicos mostram que os serviços de alimentação contribuem para o 
alto índice de DTA, sendo responsáveis por mais de 50% da ocorrência de surtos. (FERREIRA,2006). Garantir a segurança dos alimentos exige a aplicação de sistemas que monitorem a 
qualidade dos produtos nas etapas operacionais que vão desde a recepção e armazenamento dos 
produtos até a manipulação e distribuição do alimento preparado (CALAÇA, 2003). 
 
2.4 Higiene do ambiente, equipamentos e utensílios 
As superfícies utilizadas para preparação de alimentos, como os equipamentos e 
21 
 
 
utensílios, podem ser focos de contaminação, principalmente se não forem higienizados 
corretamente. Às superfícies como aço, vidro, polipropileno, plástico, borracha, fórmicas e ferro, 
podem ocorrer agregação de resíduos orgânicos, como restos de alimentos decorrentes desta má 
higienização. Esses resíduos são fonte de energia para que micro-organismos, bactérias e fungos, 
permitindo a adesão e multiplicação de micróbios (ABERC, 2000). 
A contaminação, multiplicação e sobrevivência microbiana no ambiente e equipamentos 
devem ser controladas. A comprovação e/ou monitorização devem determinar se o nível de 
higiene é aceitável para que as correções sejam realizadas em tempo necessário a fim de manter o 
controle do processo. A comprovação das condições de higiene dos equipamentos deve ser 
atestada após inspeção do processo de limpeza (SILVA JÚNIOR, 2014). 
A limpeza aparente pode induzir ao erro e dar uma falsa sensação de segurança. É 
desejável confirmar o nível de limpeza e desinfecção mediante análise microbiológica de 
amostras provenientes do equipamento e do meio ambiente (SILVA JÚNIOR, 2014). 
Como descrito na RDC nº 216 (BRASIL, 2004), as instalações, os equipamentos e 
utensílios devem ser mantidos em condições higiênico-sanitárias apropriadas. As operações 
devem ser realizadas por funcionários capacitados e com frequência de maneira a garantir 
condições de higiene e minimizar o risco de contaminação do alimento. Os funcionários devem 
utilizar uniformes apropriados e diferenciados dos manipuladores de alimentos. 
A área de preparo dos alimentos, assim como os equipamentos e utensílios utilizados, 
deve ser higienizada quantas vezes forem necessárias e imediatamente após o término do 
trabalho. Os produtos sanitizantes utilizados deverão estar regularizados pelo Ministério da 
Saúde. A diluição, o tempo de contato e modo de uso e/ou aplicação destes produtos, deverão 
obedecer às instruções recomendadas pelo fabricante. Após utilizados, deverão ser identificados e 
guardados em locais próprios (BRASIL, 2004). 
Andrade, Silva e Brabes (2003) ao fazerem uma avaliação microbiológica das condições 
higiênico-sanitárias dos equipamentos e utensílios de 12 restaurantes industriais localizados nas 
regiões da Zona da Mata e Metalúrgica de Minas Gerais, com capacidade para produção de 1.000 
a 4.000 refeições/dia, verificaram que apenas 18,6% apresentavam resultado microbiológico 
condizente com higienização eficiente. 
 
2.5 Manipuladores de alimentos 
22 
 
 
Para efeito da inspeção sanitária de alimentos, qualquer pessoa que entra direta ou 
indiretamente em contato com substâncias alimentícias é considerado manipulador, ou seja, todas 
as pessoas que estão relacionadas com o preparo, conservação e a comercialização dos alimentos 
(RIEDEL, 1992). 
Segundo Corrêa (2004) o manipulador é responsável por grande parte das enfermidades 
transmitidas por alimentos, uma vez que seu estado de saúde e suas práticas de higiene pessoal 
influenciam nas operações realizadas. 
Existem várias fontes de contaminação de alimentos e vários fatores que contribuem para 
aumentar a probabilidade dessa contaminação. A higiene do manipulador e de todo material que 
o alimento entra em contato deve ser muito rígida e é de extrema importância para a produção 
segura do produto final (TEDESCO et al, 2004). 
Segundo Silva Júnior (2001), preparações muito manipuladas são consideradas de alto 
risco, especialmente quando elaboradas por pessoas que não possuam treinamento adequado. 
Os manipuladores de alimentos são responsáveis por até 26% dos surtos de DTA de 
origem bacteriana, de acordo com dados da Organização Mundial de Saúde - OMS (ANDRADE; 
SILVA; BRABES, 2003; COELHO et al, 2010). Em sua maioria, não possuem ou praticam 
inadequadamente a higiene pessoal, e os micro-organismos se multiplicam quando ocorre 
qualquer falha sanitária. Mesmo que assintomáticos, estes manipuladores podem eliminar micro-
organismos patogênicos. Aqueles com sinais de febre, diarreia, faringite ou sinusite devem ser 
afastados do trabalho imediatamente para não comprometerem a segurança dos alimentos (GÓES 
et al, 2001). 
A saúde do manipulador é um fator muito importante, porque é pelos exames médicos e 
laboratoriais realizados na contratação, que se verifica se o funcionário possui ou não alguma 
patologia ou micro-organismo que pode ser transmitido pela contaminação de alimentos ao ser 
humano. O exame médico de um manipulador de alimentos deve ser feito sempre que houver 
uma indicação clínica ou epidemiológica. A legislação exige exames médicos periódicos, estes 
incluem exame físico, de sangue e de fezes para fazer a verificação de patógenos. Outros exames 
podem ser realizados como o de cultura de secreção orofaríngea e a cultura do material dos dedos 
(SILVA JÚNIOR, 2014). 
Com a realização destes exames, o médico poderá averiguar se o funcionário está em 
condições ótimas para desenvolver a função a que foi destinado, não sofrendo os riscos de um 
23 
 
 
acidente de trabalho causado por uma parasitose, por uma infecção subclínica ou por qualquer 
alteração que passaria despercebida sem os exames laboratoriais e a consequente avaliação 
clínica do médico do trabalho (BRASIL, 2004). 
Ferreira (2006) realizou uma pesquisa bibliográfica sobre a contaminação dos alimentos 
ocasionada pelos manipuladores, onde foram enfocados os principais micro-organismos 
envolvidos nestes episódios. Dentre estes, Staphylococcus aureus esteve envolvido com maior 
frequência nos casos de contaminação dos alimentos provocada por falhas na manipulação, pois 
na maioria das vezes essa contaminação ocorre por meio de ferimento nas mãos, outras lesões 
purulentas ou secreções que contaminam os alimentos durante sua manipulação. Cerca de 25% 
das pessoas são portadores deste micro-organismo alocado nas fossas nasais e muitas vezes os 
manipuladores não têm conhecimento sobre este fato. 
De acordo com a RDC nº 216 (BRASIL, 2004), os manipuladores devem lavar 
cuidadosamente as mãos ao chegar ao trabalho, antes e após manipular alimentos, após qualquer 
interrupção do serviço, após trocar materiais contaminados, após usar os sanitários e sempre que 
se fizer necessário. Devem ser afixados cartazes de orientação aos manipuladores sobre a correta 
lavagem e sepsia das mãos e demais hábitos de higiene, em locais de fácil visualização, incluindo 
as instalações sanitárias e lavatórios. Não devem fumar, falar desnecessariamente, cantar, 
assobiar, espirrar, cuspir, tossir, comer, manipular dinheiro ou praticar outros atos que possam 
contaminar o alimento, durante o desempenho das atividades. Devem usar cabelos presos e 
protegidos por redes, toucas ou outro acessório apropriado para esse fim, não sendo permitido o 
uso de barba. As unhas devem estar curtas e sem esmalte ou base e durante a manipulação, 
devem ser retirados todos os objetos de adorno pessoal e maquiagem. 
Os manipuladores devem ter asseio pessoal, apresentando-se com uniformes compatíveis 
à atividade, conservados e limpos. Os uniformes devem ser trocados, no mínimo diariamente e 
usados exclusivamente nas dependências internas do estabelecimento, devem ser de cor clara; 
sem bolsos na altura da cintura; sem botões ou estes devem estar protegidos; as calças devem ser 
feitas com cintos fixos ou com elástico e devem ser mantidos em bom estado e limpos. Os 
sapatos devem ser de borracha ou outro material impermeável, tipo bota ou calçado semelhante, 
sem aberturas. As roupas eobjetos pessoais devem ser guardados em um local específico e 
reservado para esse fim (BRASIL, 2004). 
 
24 
 
 
2.6 Importância do controle microbiológico nos alimentos 
 Os micro-organismos patogênicos estão presentes no solo, trato intestinal de animais, 
entre outros ambientes, portanto é provável que as matérias-primas de origem animal e vegetal 
veiculem micro-organismos patogênicos. Estes patógenos devem ser identificados e controlados a 
fim de evitar surtos de DTA (FRANCO; LANDGRAF, 2002). 
Dentre os micro-organismos patogênicos mais importantes estão os grupos produtores de 
toxinas, como, por exemplo, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium 
botulinum, Vibrio cholerae, Bacillus cereus e fungos filamentosos; e aqueles que causam 
infecções como a Salmonella sp., Escherichia coli, Shigella sp., Vibrio parahaemoliticus, 
Campilobacter sp., Listeria monocytogenes e Yersinia sp. (FRANCO; LANDGRAF, 2002). 
Quando os alimentos apresentam modificações das suas características organolépticas, 
podendo apresentar sabor e odor desagradáveis, são classificados como alimentos deteriorados. 
Essa deterioração é resultado da multiplicação indesejável de micro-organismos capazes de 
produzir compostos voláteis durante seu metabolismo, os quais são detectados pelo olfato e 
paladar humanos. Apesar de não causarem obrigatoriamente distúrbios gastrointestinais, essas 
características são indesejadas pelo consumidor, sendo este um problema de qualidade e não de 
segurança dos alimentos (FORSYTHE, 2013). 
É importante estimar a carga microbiana na superfície das mãos de manipuladores e 
alimentos, e avaliar também os efeitos dos métodos de sanitização realizados (LAGAGGIO; 
FLORES; SEGABINAZI, 2002). 
O controle microbiológico dos alimentos tem crescido muito, principalmente, para atender 
às exigências do mercado em relação à importação e exportação, exigência de consumidores e 
dos órgãos de fiscalização (RIBEIRO et al, 2005). 
As bactérias patogênicas de origem alimentar são na grande maioria aeróbias mesófilas, 
portanto, a análise deste grupo é indicativa da qualidade sanitária do alimento. Estes micro-
organismos crescem em condições de temperaturas de 37ºC, semelhantes a do corpo humano, os 
quais encontram ambiente propício para seu crescimento nas mãos dos manipuladores e nos 
alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 2002). 
Segundo a ICMSF - International Commission on Microbiological Specifications for 
Foods (1984) - o número de micro-organismos aeróbios mesófilos (contagem em placa) 
encontrados em alimentos, é um dos indicadores microbiológicos de qualidade mais comumente 
25 
 
 
utilizados, indicando se a limpeza, a desinfecção e o controle da temperatura durante o processo 
de tratamento industrial, transporte e armazenamento foram realizados de forma adequada. Esta 
determinação permite também obter informações referentes às alterações incipientes dos ali-
mentos, sua provável vida de prateleira, e a falta de controle no descongelamento ou desvios na 
temperatura de refrigeração adequada. 
A análise microbiológica deve ser realizada criteriosamente para garantir um resultado 
confiável, permitindo desta forma uma avaliação da conformidade do produto com o seu Padrão 
de Identidade e Qualidade. Os produtos que não estiverem de acordo com o critério 
microbiológico deverão ser reprovados e descartados (FRANCO; LANDGRAF, 2002). 
 
26 
 
 
2.7 Pescado 
Pescado engloba todos os animais aquáticos, marinhos ou de água doce, que são 
utilizados como alimento do homem, os quais podem ser consumidos diretamente ou 
aproveitados para a industrialização (PHILIPPI, 2003). 
De acordo com o Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem 
Animal do Ministério da Agricultura (RIISPOA) em seu Artigo 439, o pescado, in natura, pode 
ser classificado como fresco, resfriado, ou congelado. Entende-se por "fresco" o pescado dado ao 
consumo sem ter sofrido qualquer processo de conservação, a não ser a ação do gelo. O pescado 
classificado como "resfriado" deve ser devidamente acondicionado em gelo e mantido em 
temperatura entre -0,5ºC e -2ºC. O pescado congelado é aquele tratado por processos adequados 
de congelação, em temperatura não superior a -25ºC (BRASIL, 1952). 
É considerado um alimento de alta digestibilidade, mas também um dos mais perecíveis. 
Desde o momento em que é retirado da água, inicia-se uma série de modificações e alterações 
que podem impedir sua comercialização, tanto como alimento para ser consumido de modo 
direto, quanto como matéria prima para ser industrializada (MEDEIROS, 2014). 
 
2.8 Conservação do Pescado 
Os peixes deverão ser acondicionados sob refrigeração a bordo, o mais rápido possível, 
sendo aplicadas também as boas práticas de higiene para uma operação mais segura (SENAI, 
2000). O processo de refrigeração, em temperaturas entre -1ºC e 10ºC, não apresenta ação 
esterilizante, apenas retarda as atividades microbianas já existentes e impede o surgimento de 
novos agentes deteriorantes (CORDEIRO et al, 2007). 
No congelamento são utilizadas temperaturas mais baixas do que na refrigeração, assim, 
inibindo o crescimento microbiano por desaceleração do processo metabólico. O pescado 
conservado sob condições estéreis e a temperaturas de congelamento não se deteriora mesmo 
após várias semanas de estocagem (VIEIRA, 2003). 
É usual a conservação com a utilização de gelo picado misturado intimamente com o 
pescado. O ideal é que este alcance temperatura de 0ºC, até sua comercialização ou que sejam 
adotadas medidas destinadas a preservá-lo. Uma delas é a eliminação da cabeça, cauda, 
barbatanas e a extração das vísceras para efetuar um congelamento a – 20 ºC, forma em que pode 
ser comercializado (SALINAS, 2002). 
27 
 
 
A vida útil do pescado é determinada pelas reações enzimáticas e pelo número de espécies 
de micro-organismos presentes, fatores estes dependentes de sua microbiota natural e pelo modo 
de manuseio desde sua captura até a estocagem, fatores estes relacionados com as boas práticas 
de manipulação. Outro fator determinante da vida útil do pescado é a temperatura de estocagem 
(NEIVA, 2008). 
Estudos sobre a microbiota presente na superfície de peixes mostraram que os micro-
organismos deteriorantes mais frequentes são Pseudomonas sp. (32 - 60%), Alteromonas sp. (32 
a 60%), Moraxella sp. (18 a 37%) e Acinetobacter sp. (18 a 37%) (JAY, 2005; VIEIRA, 2003). 
Hoffmann e colaboradores (1999), realizaram um estudo em São José do Rio Preto, SP, 
onde foram coletadas 11 amostras de pescados comercializados na região, realizadas análises 
microbiológicas e por fim, os resultados foram correlacionados com os padrões existentes na 
legislação. Os resultados evidenciaram que 99% das amostras dos produtos foram 
comercializados em condições higiênico-sanitárias insatisfatórias e potencialmente capazes de 
causar DTA. De acordo com os autores a maioria das amostras apresentou contagem de 
Staphylococcus aureus acima do padrão estabelecido pela legislação brasileira. 
 
2.9 Aspectos microbiológicos de pescados 
 Os pescados, em geral, apresentam musculatura, órgãos e liquido corporal livres de 
contaminação. No entanto, as regiões de contato direto, como pele, guelras e vísceras podem 
apresentar contaminação, principalmente por bactérias. A multiplicação de micro-organismo é 
favorecida, principalmente pelo aumento de temperatura do ambiente marinho (OGAWA, 1999). 
O pescado é um dos alimentos mais suscetíveis à degradação, principalmente pela 
atividade microbiana. As alterações de sabor, odor, textura e cor indicam o nível de frescor ou 
decomposição causado, principalmente, pela atividade microbiana. A velocidade de 
decomposição será influenciada diretamente pelo nível de contaminação inicial e condições de 
armazenamento como umidade, temperatura e atmosfera. Este último pode ser considerado ponto 
crítico de controleno processo de produção de pescados (FRANCO & LANDGRAF, 2008). 
A deterioração do pescado ocorre pela autólise, oxidação, atividade bacteriana ou pela 
combinação destes processos. O processo de autólise ocorre devido à ação de sucos digestivos, de 
natureza ácida, carregados de enzimas proteolíticas, que migram para os tecidos musculares, após 
a morte. Essas enzimas atuam sobre os tecidos, provocando sua decomposição e facilitando a 
28 
 
 
disseminação de micro-organismos, elas ainda perfuram as vísceras, extravasando material 
contaminado. A oxidação das gorduras produz alterações de aroma e/ou coloração do produto 
(Jay, 2005). 
O pescado possui uma microbiota natural composta por Pseudomonas, Aeromonas, 
Moraxella, Shewanella, Flavobacterium, Vibrio e Micrococcus. Dentre estas, as mais importantes 
na deterioração do pescado são Pseudomonas, Aeromonas, e Shewanella. Esses gêneros são 
importantes não só pela sua natureza psicrotrófica, mas principalmente pela capacidade que têm 
de utilizar, para o seu desenvolvimento, substâncias nitrogenadas não-proteicas. Estes compostos 
são obtidos a partir das reações enzimáticas que ocorrem após a morte do pescado (Franco & 
Landgraf, 2008). 
Uma vez esgotados os substratos não-protéicos as bactérias metabolizam as proteínas 
ocasionando alterações mais profundas, como o amolecimento dos tecidos, aumento da 
concentração de compostos de odor nauseante (Franco & Landgraf, 2008). 
Um dos principais pontos críticos de controle para a produção de pescados a ser 
considerado, são os procedimentos adotados a bordo após a pesca, já que o número de bactérias 
pós-captura pode aumentar na ordem de 10
5
 a 10
6
 bactérias/cm
2
. 
Dentro da cadeia produtiva do pescado existem muitas fontes de contaminação, que 
modificam a microbiota original. As fontes de contaminação a se considerar são: evisceração 
realizada de qualquer maneira, não resfriamento do produto imediatamente após a pesca, lavagem 
inadequada, uso de equipamentos sem assepsia, transporte inadequado, manipulação humana em 
mercados, peixaria (Ogawa, 1999). 
Além disso, conforme mencionado anteriormente, o pescado fresco pode ser influenciado 
por hábitos não higiênicos dos manipuladores, podendo comprometer a qualidade higiênico-
sanitária do alimento. O consumo de pescado in natura representa um grande risco à saúde 
coletiva, por não haver as barreiras térmicas (cocção) para eliminação de micro-organismos do 
alimento e assim garantir sua inocuidade. Os manipuladores precisam estar atentos às práticas de 
manipulação para evitar que a contaminação externa deste produto atinja a carne (Martins, 2006; 
Lima, 2010). 
 
2.10 Staphylococcus Coagulase Positiva (SCP) 
Dentro do gênero Staphylococcus são descritas 32 espécies, sendo que somente 5 delas 
29 
 
 
são capazes de produzir a coagulase, uma enzima extracelular que coagula o plasma sanguíneo, 
sendo assim denominadas como Staphylococcus coagulase positiva (SCP) (SILVA; GANDRA, 
2004). 
Durante muitos anos, Staphylococcus aureus foi considerada a única espécie de seu 
gênero capaz de produzir enterotoxinas e a enzima coagulase. Posteriormente as espécies 
Staphylococcus hyicus e Staphylococcus intermedius também foram consideradas produtoras 
sendo inclusive incriminadas em surtos de intoxicação alimentar. Devido a grande semelhança 
fenotípica, a legislação brasileira foi modificada, passando a estabelecer a pesquisa e enumeração 
de SCP, ao invés da enumeração de S. aureus (SILVA; GANDRA, 2004). 
Os alimentos envolvidos em surtos de DTA devem, na investigação epidemiológica, ser 
coletados e examinados para Staphylococcus spp. O diagnóstico deve ser feito com base em 
levantamento do quadro clínico e histórico de ingestão de alimentos suspeitos, entrevistando-se 
vítimas e demais pessoas envolvidas que possam deter informações relevantes, além da utilização 
de técnicas laboratoriais de isolamento e identificação do micro-organismo. Resultados positivos 
em doentes e no alimento confirmam o diagnóstico (FERREIRA, 2006). 
De acordo com a Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de 2003 (BRASIL, 2003) do 
MAPA, a identificação de Staphylococcus coagulase positiva em alimentos consiste basicamente 
em etapas de cultura em ágar Baird-Parker, seleção de colônias suspeitas e identificação destas 
mediante provas bioquímicas. 
A produção de coagulase é uma importante característica utilizada na identificação do S. 
aureus, portanto a legislação brasileira preconiza a pesquisa de Staphylococcus coagulase 
positiva (SCP) como indicativo de S. aureus. Intoxicação alimentar por estafilococos é uma 
doença causada pela ingestão de alimentos contaminados com enterotoxina produzida por 
bactérias deste gênero. A bactéria é considerada, para fins de análise microbiológica, com 
potencial para produção de enterotoxinas em alimentos quando é considerado coagulase positiva 
(BRASIL, 2001; MARTINS, 2006). 
Existem testes sorológicos e moleculares para determinar a enterotoxigenicidade do S. 
aureus isolado de alimentos. Métodos para separação e detecção de toxinas em alimentos têm 
sido desenvolvidos e utilizados para melhorar o diagnóstico da doença. A fagotipagem pode ser 
útil quando o micro-organismo viável pode ser isolado de um alimento incriminado, de vítimas e 
de portadores suspeitos tais como manipuladores de alimentos. O isolamento de micro-
30 
 
 
organismos de um mesmo fagotipo de fezes ou vômito de duas ou mais pessoas confirmam o 
diagnóstico (FERREIRA, 2006). 
Segundo Neto e colaboradores (2002) uma incidência apreciável destes micro-organismos 
tem sido detectada, principalmente em produtos de origem animal submetidos à intensa 
manipulação. 
 
2.11 Staphylococcus aureus 
O Staphylococcus aureus é uma bactéria esférica (cocos) que aparece aos pares no exame 
microscópico, em cadeias curtas ou em cachos similares aos de uva. É Gram positiva, anaeróbia 
facultativa ou aeróbia, com faixa de crescimento de 7ºC a 48ºC e crescimento ótimo em 
temperatura entre 35ºC a 37ºC, caracterizando um micro-organismo mesófilo (FORSYTHE, 
2002; SANTOS, 2006). 
 
Figura 1. Staphylococcus aureus - www.hivwebstudy.org 
 
Pode ser encontrado frequentemente em fômites ou colonizando humanos e animais, onde 
pode ser encontrado na pele, narina, períneo, axilas, vagina, entre outras regiões do corpo. 
Estima-se que esteja presente nas fossas nasais de 20% a 40% de humanos saudáveis, 
classificando-se assim como portadores assintomáticos (KONEMAM et al, 2001). Os 
manipuladores de alimentos, se portadores assintomáticos, se não seguirem corretamente as BPF, 
poderão disseminar este micro-organismo durante o processo de preparo dos mesmos (SILVA; 
GANDRA, 2004). 
A doença não ocorre pela ingestão da bactéria em si, e sim pela ingestão de toxinas pré-
formadas no alimento, as enterotoxinas. O período de incubação é muito rápido, de 30min a 8h 
após a ingestão do alimento contaminado. Os sinais clínicos são caracterizados por vômitos, 
https://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0CAYQjB1qFQoTCM26pf3Vq8cCFYGKkAodrVsDig&url=http%3A%2F%2Fwww.hivwebstudy.org%2Fcases%2Fdermatologic-manifestations%2Fmethicillin-resistant-staphylococcus-aureus-mrsa-skin-and-soft&ei=vX7PVY3oJ4GVwgStt43QCA&bvm=bv.99804247,d.Y2I&psig=AFQjCNE64zOqWGpEDc10gaaN9DWjRbGB2A&ust=1439747738790083
31 
 
 
náuseas, diarreias brandas a intensas, salivação, sudorese e desidratação, variando com o grau de 
sensibilidade do indivíduo, da concentração de enterotoxinas e da quantidade de alimento 
contaminado ingerido (FRANCO; LANDGRAF, 2008). 
Não é uma doença fatal e a recuperação dos pacientes pode ocorrer em um ou dois dias 
após o início dos sintomas. Seu diagnóstico é dificultado devido à semelhança com outras 
intoxicações e toxinfecções (GERMANO; GERMANO, 2008). 
Os alimentos mais envolvidos na contaminação pelo S. aureus são aquelescom elevado 
teor de umidade e alta concentração de proteínas. (NASCIMENTO, 2013). 
 
2.12 Identificação de Staphylococcus aureus em alimentos 
Entre as espécies produtoras da enzima coagulase, Staphylococcus aureus é a espécie que 
mais prevalece em surtos de DTA. Devido ao risco que sua presença em alimentos oferece à 
saúde pública, diversos países estabeleceram como parte das ações de fiscalização sanitária de 
órgãos governamentais, a obrigatoriedade de sua pesquisa (SILVA; GANDRA, 2004). 
A RDC n°12 da ANVISA (BRASIL, 2001) estabelece o limite máximo de 10
3
UFC/g de 
produto para SCP em pescado fresco e para pratos prontos para o consumo a base de pescados e 
similares crus, como o sushi e o sashimi o limite é de 5x10³ UFC/g. 
As técnicas tradicionais de microbiologia de alimentos fundamentam-se na utilização de 
testes morfológicos e bioquímicos para a identificação de gêneros e espécies. As técnicas 
microbiológicas rotineiramente utilizadas são realizadas por crescimento em meios de cultura 
seletivos complementadas por testes bioquímicos diferenciais, baseados em sua maioria, na 
expressão de enzimas específicas, usados em conjunto com testes sorológicos (GANDRA et al, 
2008). 
De acordo com a Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de 2003, do Ministério da 
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), a identificação de S. aureus em alimentos 
consiste basicamente de etapas de cultivo em agar Baird-Parker, seleção de colônias suspeitas e 
identificação destas mediante provas bioquímicas. No entanto, a técnica apresenta algumas 
desvantagens: ser demorada e trabalhosa, pois necessita de muitos reagentes e vidrarias; 
geralmente é necessário o processamento de um grande número de amostras, conforme exigência 
na indústria de alimentos; além do risco de interpretações errôneas dos resultados. 
Nas últimas décadas, foram desenvolvidos testes moleculares para a detecção, 
32 
 
 
identificação e caracterização de bactérias patogênicas em alimentos. Dentre essas, técnicas 
baseadas na reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) (BOER E BEUMER,1999; 
MALORNY et al, 2003) que amplificam sequencias específicas do genoma do patógeno ou 
organismo alvo. Pequenas quantidades de sequências de DNA específicas são enzimaticamente 
amplificadas até que sejam obtidas milhões de cópias da sequência alvo (KONEMAM et al, 
2001). O teste de PCR é rápido, sensível e inequívoco. 
A rapidez na identificação de agentes etiológicos pela detecção do seu DNA, em 
comparação ao método preconizado pela microbiologia convencional, torna a PCR uma 
alternativa prática, além de sua alta sensibilidade e especificidade, dentre os métodos de 
diagnósticos disponíveis para Staphylococcus aureus em alimentos. 
Em conjunto, também podemos citar a técnica de eletroforese, pulsed field gel 
eletrophoresis - PFGE, que é apropriada para separar grandes fragmentos de DNA, por meio da 
reorientação do DNA em gel pela ação de campos elétricos alternados (MAGALHÃES et al, 
2005). Esta técnica é reconhecida como padrão ouro para identificação de linhagens bacterianas, 
como S. aureus, possibilitando uma comparação do perfil clonal das cepas isoladas de alimentos 
e manipuladores, por exemplo (SHIMAMURA E MURATA, 2011). 
Nos últimos anos as técnicas de biologia molecular auxiliaram muito na elucidação da 
taxonomia do gênero Staphylococcus, permitindo relacionar ou comparar os resultados dos testes 
fenotípicos e genotípicos. Entre esses métodos, a análise comparativa da sequência de 
determinados genes de macromoléculas conservadas tem sido empregada para a classificação de 
micro-organismos. Um exemplo dessas macromoléculas é o RNA ribossomal, essencial para a 
sobrevivência dos organismos, e altamente conservado entre as bactérias. O sequenciamento do 
gene do RNA ribossomal 16S tem sido extensivamente usado com finalidade taxonômica e 
filogenética (BECKER et al, 2004) e é considerado o método de referência para a identificação 
bacteriana (NOLTE & CALIENDO 2003). As sequências encontradas são comparadas com 
aquelas depositadas em bancos de dados, como o do National Center for Biotechnology 
Information - NCBI (BECKER et al, 2004). 
 
2.13 Resistência a antimicrobianos 
Segundo Jay (2005), os agentes antimicrobianos são substâncias de origem biológicas 
e/ou sintéticas que produzem toxicidade seletiva sobre micro-organismos. 
33 
 
 
Os antibióticos e drogas afins, em conjunto denominados agentes antimicrobianos, são 
utilizados no tratamento de doentes que sofrem de doenças infecciosas. Desde a década de 1940, 
essas doenças e as mortes causadas por elas reduziram significativamente. No entanto, essas 
drogas têm sido usadas tão amplamente e por tanto tempo que os organismos infecciosos estão 
desenvolvendo mecanismos de adaptação a eles, tornando as drogas menos eficazes. (CDC, 
2014) 
A resistência aos antibióticos é a capacidade que, micro-organismos como bactérias, 
vírus, fungos e parasitas, desenvolvem para resistir aos efeitos das drogas. Isso significa que esses 
germes não morrem e o seu crescimento não é parado com a administração desses fármacos 
(CDC, 2014). 
As bactérias resistentes são mais comuns em ambientes onde os antibióticos são usados 
com muita frequência, como por exemplo, em serviços de saúde, na comunidade, e na produção 
de alimentos de origem animal. 
Tavares (2000) descreveu que a resistência aos antimicrobianos é um fenômeno genético, 
relacionado à existência de genes contidos no micro-organismo que codificam diferentes 
mecanismos bioquímicos que impedem a ação das drogas. A resistência pode ser originada em 
mutações que ocorrem no germe durante seu processo reprodutivo e resultam de erros de cópia na 
sequencia de bases que formam o DNA cromossômico, responsáveis pelo código genético. A 
outra origem da resistência é a importação dos genes causadores do fenômeno, consistindo na 
resistência transferível. Esta resistência faz-se através dos mecanismos de transdução, 
transformação e conjugação e, frequentemente, envolve genes situados em plasmídeos e 
transposons. 
O gênero Staphylococcus é de grande importância devido a sua alta prevalência em 
infecções hospitalares e por apresentar taxas elevadas de resistência a oxacilina e a outros 
antimicrobianos (KAISER et al, 2010). 
No Brasil, S. aureus mostram-se resistentes à penicilina G, ampicilina e amoxicilina em 
mais de 70% das cepas isoladas, seja em ambiente hospitalar ou na comunidade, não sendo mais 
indicado o uso destes antimicrobianos para o tratamento de infecções estafilocóccicas, mesmo 
que benignas e mesmo que procedam do ambiente extra-hospitalar (FARIAS et al, 1997; JAY, 
2005; TAVARES, 2000). 
Os esforços para prevenir infecções resistentes incluem imunização, controle de infecção, 
34 
 
 
uso controlado de antibióticos, ou seja, boas práticas na prescrição, reduzir a disseminação de 
uma pessoa para outra, e proteger o abastecimento de alimentos. 
Micro-organismos resistentes a antimicrobianos são motivo de preocupação para 
autoridades sanitárias e pesquisadores em todo o mundo, principalmente no que tange a elevada 
ocorrência de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) A presença destes patógenos em 
alimentos possui impacto direto sobre a clínica médica humana, especificamente nas medidas 
terapêuticas adotadas em pacientes vítimas de doenças transmitidas por alimentos. 
Uma vez que manipuladores de alimentos podem atuar como reservatório desse micro-
organismo, torna-se importante avaliar o risco de transmissão de cepas com o perfil genético de 
resistência para os alimentos (CERQUEIRA, 2013). Deve ser considerado ainda, que patógenos 
multirresistentes podem agir como disseminadores de genes de resistência a antimicrobianos para 
outros micro-organismos susceptíveis, e assim ajudar na transferência de genes para bactérias de 
microbiotas humanas e de outros animais (PRICE, 2007). 
 
35 
 
 
3. JUSTIFICATIVAO conhecimento de que o consumo de alimentos ricos em ácidos graxos poli-insaturados e 
com baixos níveis de colesterol reduz o risco de doenças cardíacas está alterando os hábitos 
alimentares da população, fazendo com que os consumidores prefiram as carnes brancas, magras, 
e assim contribuindo para aumentar o consumo de peixes e derivados. Aliado a isto, nas últimas 
décadas, o mundo tem presenciado um acelerado processo de globalização dos costumes e 
hábitos alimentares. Houve uma rápida difusão e aceitação de alimentos como o sushi e o 
sashimi, no qual esses pratos à base de pescado cru, que em pouco tempo tornaram-se sinônimo 
de “comida saudável”. 
 No entanto, já existe uma preocupação dos órgãos reguladores e fiscalizadores ligados à 
saúde pública com o crescente consumo desse tipo de alimento, principalmente, pelo fato de ser 
um produto altamente perecível, ser consumido “in natura” e, principalmente, por necessitar de 
maior rigor na implementação e manutenção de condições higiênico-sanitárias adequadas para 
sua preparação e conservação (VIEIRA et al, 2007). 
A segurança alimentar, no que concerne à qualidade do alimento ingerido, precisa ser 
garantida nas preparações de peixe cru, como sushi e sashimi, como preconiza a legislação 
brasileira vigente. Além disso, resultados de análises, com rigor científico e metodológico, 
poderão alertar os responsáveis pela vigilância em saúde. Da mesma maneira, os consumidores 
devem ser avisados sobre os riscos de DTAs associados ao consumo desses alimentos quando 
não preparados de forma adequada. 
Os resultados e conclusões deste estudo poderão contribuir para a criação de normas 
específicas para o preparo adequado destas iguarias, possibilitando assim, melhor norteamento 
para estabelecimentos comercializadores e consumidores. 
36 
 
 
4. OBJETIVOS 
4.1 Objetivo geral 
A proposta deste estudo visou avaliar a qualidade microbiológica quanto à presença de 
Staphylococcus aureus em preparações à base de pescado cru, sushi e sashimi, comercializados 
em três unidades de uma rede de restaurantes não especializados em culinária nipônica dos 
municípios de Niterói e Rio de Janeiro - RJ. Os estabelecimentos comerciais também foram 
avaliados quanto às condições higiênico-sanitárias a que esses alimentos foram submetidos, 
desde a aquisição da matéria-prima até a sua disponibilização para consumo. 
 
4.2 Objetivos específicos 
- Analisar e enumerar Staphylococcus coagulase positiva em amostras de sushi e sashimi 
coletadas em três estabelecimentos comerciais do tipo self-service, não especializados na 
culinária nipônica, nos municípios de Niterói e Rio de Janeiro - RJ. 
- Identificar as cepas de S. aureus entre as colônias típicas e não-tipicas coagulase 
positivas isoladas a partir do pescado cru isoladas por técnicas microbiológicas convencionais, 
por testes de PCR. 
- Pesquisar a presença de cepas de S. aureus em manipuladores de alimentos (sushimen) 
naqueles restaurantes onde forem encontradas amostras contaminadas. 
- Identificar as colônias por sequenciamento parcial do gene rDNA 16S. 
- Analisar a influencia dos manipuladores de alimento (sushimen) na qualidade 
microbiológica das preparações de sushi e sashimi, através da avaliação do perfil clonal de 
linhagens de S. aureus presentes no pescado em comparação às linhagens presentes na mão e 
fossas nasofaringeana e orofaringeana dos manipuladores, por eletroforese em campo pulsado 
(Pulsed-field gel electrophoresis – PFGE). 
- Avaliar as condições higiênico-sanitárias dos estabelecimentos durante as diferentes 
etapas do processamento do alimento - desde a aquisição da matéria-prima, armazenamento, pré-
preparo, preparo, manutenção e distribuição para consumo – através da aplicação de uma lista de 
verificação das Boas Práticas de Fabricação (checklist) elaborada de acordo com os itens da RDC 
nº 216 de 15 de setembro de 2004 - ANVISA. 
37 
 
 
5. MATERIAL E MÉTODO 
5.1 Desenho experimental 
Para esse estudo foram coletas amostras de pescado no período de setembro de 2013 a 
fevereiro de 2014, em três restaurantes do tipo self-service, localizados nos municípios do Rio de 
Janeiro e Niterói. Foram coletadas, de forma asséptica, 31 amostras no total, sendo 11 amostras do 
restaurante 1 (R1), 10 amostras dos restaurantes 2 e 3 respectivamente (R2) e (R3). Essas amostras 
foram provenientes de 3 tipos de peixe: salmão (Salmo salar), atum (Thunnus sp.) e namorado 
(Pseudopercis numida); e divididas em dois grupos: a) produto final - sushi e sashimi antes de sua 
exposição à venda; b) pescado adquirido inteiro (matéria-prima) ou na forma de filé. Também foram 
coletadas amostras provenientes das mãos e fossas nasofaringeana e orofaringeana dos manipuladores 
deste alimento, com auxílio de swabs estéreis que posteriormente foram incluídas em meio de 
transporte Stuart. Todas as amostras foram mantidas sob refrigeração até o momento das análises 
microbiológicas. 
 
5.2 Análise microbiológica e isolamento de SCP em preparados a base de peixe cru (sushi e 
sashimi) e manipuladores 
As análises microbiológicas foram realizadas segundo a Instrução Normativa nº 62, de 26 de 
agosto de 2003 (BRASIL, 2003) do MAPA. Para isso, 25 g de cada amostra foram adicionadas a 225 
mL de solução salina peptonada 0,1% e levadas ao homogeneizador de alimentos Stomacher® 
(Seward Stomacher® 400 circulator, West Sussex, Reino Unido), a 220 rpm durante 2 min. Foram 
efetuadas cinco diluições seriadas a partir desta primeira e 0,1 ml de cada diluição inoculada em ágar 
Baird-Parker. As placas foram incubadas a 36 ± 1ºC por 30 a 48h. Para cada amostra, uma placa 
contendo entre 20-200 colônias foi selecionada e as contagens de colônias típicas e atípicas foram 
registradas separadamente. Em seguida foram selecionadas de três a cinco colônias de cada tipo: 
típicas (T) e atípicas (A), e semeadas em tubos contendo caldo cérebro-coração (BHI), para 
confirmação, e incubadas a 36 ± 1ºC por 24h. A partir da cultura pura em BHI foram realizadas as 
seguintes provas complementares e confirmativas: 
- Prova da coagulase: foi transferido 0,3 ml de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis 
contendo 0,3 ml de plasma de coelho e incubados a 36 ± 1ºC por 6h, onde foi observada a presença ou 
não de coágulos. 
- Coloração de Gram: foram preparados os esfregaços das colônias e em seguida corados pelo 
38 
 
 
método de Gram. A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus 
aureus. A presença de cocos Gram positivos indica a necessidade da realização de testes 
complementares. 
- Prova da catalase: com o auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou 
pipeta de Pasteur, estéreis, foi retirado uma alíquota do cultivo em ágar-estoque e transferido para 
uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%, misturando o 
inoculo ao peróxido. A não formação de borbulhas foi considerada prova negativa para catalase, 
sendo que Staphylococcus aureus é catalase positiva. 
Os mesmos testes foram efetuados para as amostras provenientes de swabs de mãos e fossas 
nasofaringeana e orofaringeana dos manipuladores. 
 
5.3 Testes de PCR para identificação dos isolados 
Testes de PCR foram utilizados para identificação das cepas de S. aureus. A liberação do 
DNA foi realizada por lise térmica, no qual foi utilizado 100µL de TE (Tris 15 mM e EDTA 0,1 mM) 
conforme descrito por Dias e colaboradores (2008). 
A presença do gene femA foi usada como critério de classificação, no qual foi utilizado o 
seguinte par de primer: femAf (5’ AAA AAA GCA CAT AAC AAG CG 3’) e femAr (5’ GAT AAA 
GAA GAA ACC AGC AG 3’), de acordo com Mehrotra e colaboradores (2000). 
Foram gerados amplicons de 132 pb com desnaturação inicial a 94ºC/5min, seguido de 35 
ciclos (desnaturação a 94°C/2min, anelamento a 55ºC/30s e extensão a 72ºC/1min) e extensão final de 
72ºC/7min.As amplificações foram realizadas em termociclador MyCycler Thermal Cycler (Bio Rad, 
Hercules, CA, USA). 
A visualização desses amplicons foi realizada em fotodocumentador Mini Lumi® (TelAvive, 
Israel CA) após corrida eletroforética em gel de agarose a 2% (100V, 200 mA por 80min) corado com 
GelRed (Biotium®, Califórnia, USA). 
 
5.4 Identificação dos isolados por sequenciamento parcial do gene 16S rDNA 
Cepas de SCP que não foram amplificadas pelo gene femA foram submetidas ao 
sequenciamento da região V5 do gene 16SrDNA. As condições da PCR foram realizadas conforme 
descrito por Lee e colaboradores (2007) que amplificavam um fragmento de 240 pb. Os pares de 
primer utilizados foram: 16SrDNAf (5'- CCG CCT GGG GAG TAC G 3') e 16SrDNAr (5'- AAG 
39 
 
 
GGT TGC GCT CGT TGC -3'), desnaturação inicial a 94ºC/3min, seguido de 35 ciclos (desnaturação 
a 94°C/1min, anelamento a 55ºC/1min e extensão a 72ºC/1min) e extensão final de 72ºC/5min. 
Os produtos obtidos foram purificados com kit de purificação (illustra™ GFX™ PCR DNA 
and Gel Band Purification Kit) (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Os produtos de 
PCR foram sequenciados utilizando 20ng de DNA purificado e 13µl dos pares de primer, num 
volume final de 20µl (Applied Biosystems, CA, EUA). Após a amplificação, os produtos foram 
purificados de acordo com o protocolo do kit BigDye Terminator Purificação X™ (Applied 
Biosystems, CA, EUA) e sequenciados num sequenciador de 3130 Genetic Analyzer (Applied 
Biosystems, CA, EUA). Sequências produzidas foram editadas com o software Bio Edit v.7.2.5 
(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html). 
Posteriormente as sequências resultantes foram comparadas com sequências bacterianas 
depositadas na base de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI/BLAST). 
 
5.5 Comparação do perfil clonal de S. aureus por Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) 
Colônias de S. aureus cultivadas em ágar Baird-Parker e identificadas pelas provas bioquímicas e 
pela PCR do gene femA foram embebidas em agarose de baixo ponto de fusão. A parede celular 
bacteriana foi lisada com lisostafina e, após tratamento com proteinase K, submetida a lavagens com 
tampão Tris-EDTA. Posteriormente o DNA foi digerido com endonuclease de restrição SmaI como 
previamente descrito por Vivoni e colaboradores (2005). Os fragmentos foram separados por 
eletroforese em campo pulsado, em gel de agarose a 1,2% em TBE 0,5x, no equipamento CHEF 
DRIII system (Bio-Rad Laboratories, CA, USA), utilizando as seguintes condições: tempo inicial de 
1s, tempo final de 35s por 21h, a 6V/cm. Após a corrida, os géis foram corados em solução 0,5 μg/mL 
de brometo de etídio e documentados em transluminador MiniLumi Bio-Imaging (BioAmerica® 
Califórnia, USA) e analisados com o software BioNumerics (Applied Maths, Kortrijk , Bélgica). O 
padrão de referência S. aureus NCTC 8325 foi incluído na primeira e na última raia de cada gel. A 
semelhança de padrões de bandas foi avaliada por meio do coeficiente de Dice e o dendograma foi 
construído com base nos percentuais de similaridade que foi gerado pelo método UPGMA 
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean). Os isolados que apresentaram coeficiente de 
similaridade ≥ 80% foram considerados do mesmo genótipo e a interpretação visual foi realizada 
usando o critério de Van Belkum e colaboradores (2007). 
 
40 
 
 
5.6 Teste de suscetibilidade dos isolados a agentes antimicrobianos (TSA) 
Alíquotas de cultivo dos isolados, equivalente a 0,5 unidades McFarland, foram plaqueadas 
em meio agar Muller Hinton com uso de swab estéril. Inoculou-se o cultivo líquido, em toda a 
superfície do meio, em pelo menos três sentidos, girando a placa após cada espalhamento. Então, 
foram colocados cuidadosa e assepticamente os discos contendo os agentes antimicrobianos sobre a 
placa, com auxílio de pinça previamente esterilizada. 
Os antibióticos utilizados para o teste foram clindamicina (2g), cefoxitina (30g), 
rifampicina (5g), eritromicina (15g), tetraciclina (30g), vancomicina (30g), ciprofloxacina 
(5g), cloranfenicol (30g), linezolida (30g) e cefepime (30g). 
As placas com os polidiscos foram incubadas a 37ºC por 18h. Após este período, os halos de 
inibição foram mensurados com auxílio de um halômetro. A interpretação do teste foi baseada na 
tabela que determina as medidas padrões dos halos de inibição para cada agente antimicrobiano, 
segundo a classificação: resistente, intermediário e sensível, de acordo com orientações do CLSI 
(NCCLS, 2015). 
 
5.7 Avaliação dos restaurantes estudados quanto aos critérios de Boas Práticas na 
Manipulação dos Alimentos 
Os critérios de Boas Práticas de Fabricação adotados em cada restaurante foram avaliados 
através de uma lista de verificação (Anexo 1) elaborada de acordo com a RDC 216 de 15 de setembro 
de 2004, da ANVISA, a qual estabelece o Regulamento Técnico de Boas Práticas para Serviços de 
Alimentação. Foram avaliados itens relacionados à edificações e instalações; higienização; controle 
integrado de pragas; abastecimento de água; manejo de resíduos; manipuladores de alimentos; 
matérias primas e embalagens; preparação do alimento; armazenamento e transporte; exposição ao 
consumo; documentação, registros e responsabilidade técnica. 
Os restaurantes foram classificados em três grupos de acordo com o percentual de adequação 
obtido utilizando a metodologia adotada por Saccol e colaboradores (2013): Grupo 1 entre 76-100% 
de adequação; Grupo 2 entre 51-75% de adequação e Grupo 3 entre 0- 50% de adequação. 
 
5.8 Análise de dados 
A análise dos dados foi feita por uma planilha eletrônica usando o Excel (Microsft
TM 
Inc) e 
Epi Info 7. Os dados obtidos pelo sequenciamento e PFGE foram analisados utilizando o software 
Bionumerics 2014. 
41 
 
 
5.9 Aspectos éticos 
Previamente ao início dos experimentos, o projeto em questão foi submetido e aprovado pelo 
comitê de ética da Universidade Federal do Rio de Janeiro sob n° 353.290, visto que as análises 
envolvem seres humanos (manipuladores de alimentos) e dependem da aprovação e emissão de um 
termo de consentimento que foi assinado pelo responsável de cada estabelecimento e por cada 
manipulador participante. 
42 
 
 
6. RESULTADOS 
6.1 Análise microbiológica do pescado in natura, preparados a base de peixe cru (sushi e 
sashimi) e manipuladores 
A análise da avaliação microbiológica do pescado in natura e suas preparações demonstrou 
que em todas (100%) as amostras de pescado provenientes dos 03 estabelecimentos (R1, R2 e R3) foi 
detectada a presença de Staphylococcus coagulase positiva (SCP). Destas, 29% (9/31) apresentaram 
contagem de patógenos acima do valor estabelecido pela legislação brasileira - RDC n°12 (BRASIL, 
2001), que tem como limite máximo 5x10
3
 UFC/g, como mostrado na Tabela 1. 
 
Tabela 1. Valores mínimos e máximos em UFC/g, de Staphylococcus coagulase positiva (SCP) 
encontradas em amostras de peixes, filés e preparados (sushi e sashimi) de salmão, atum e 
namorado, coletados em três restaurantes (R1, R2, R3) dos municípios do Rio de Janeiro e 
Niterói, no período de setembro de 2013 a fevereiro de 2014. 
 
Restaurante 
Número 
de 
amostras 
Valores mínimos e 
máximos (UFC/g) 
SCP 
nº e % de 
amostras 
reprovadas 
R1 11 0,3x10² - 1,1 x 10
4
 3 (27%) 
R2 10 9,0x10² - 2,2 x 10³ 0 
R3 10 9,0x10² - 14,1 x 10³ 6 (60%) 
Total 31 - 9 (29%) 
 
As contagens médias de SCP nas amostras de pescado matéria prima, filé e preparado de 
sushi e sashimi, de todos os estabelecimentos estudados foram, respectivamente, de: 4,22x10³ 
UFC/g; 2,59x10³ UFC/g; 4,62x10³ UFC/g; e 3,94x10³ UFC/g. Foi identificado em matéria-prima 
(namorado in natura) contagem de SCP acima do estabelecido pela legislação para alimento 
consumido cru. 
Foram analisadas um total de 9 amostras de atum (Thunnus sp.), 10 amostras de namorado 
(Pseudopercis numida)