Claudius-Cabral

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
CENTRO DE CIÊNCIAS MATEMÁTICAS E DA NATUREZA 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇAO DA CONTAMINAÇÃO POR Salmonella spp. 
EM LINGUIÇAS FRESCAIS COMERCIALIZADAS EM DUAS 
CIDADES DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO – BRASIL 
ANÁLISE DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS 
ANTIMICROBIANOS DOS ISOLADOS 
 
 
 
 
CLAUDIUS COUTO CABRAL 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2013 
 
 
CLAUDIUS COUTO CABRAL 
 
 
 
 
 
AVALIAÇAO DA CONTAMINAÇÃO POR Salmonella spp. 
EM LINGUIÇAS FRESCAIS COMERCIALIZADAS EM DUAS 
CIDADES DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO – BRASIL 
ANÁLISE DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS 
ANTIMICROBIANOS DOS ISOLADOS 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do 
Programa de Pós-graduação em Ciência de 
Alimentos – UFRJ, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do grau de Mestre em 
Ciência de Alimentos 
 
Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rio de Janeiro 
2013 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
C117 
Cabral, Claudius Couto. 
 Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais 
comercializadas em duas cidades do estado do Rio de Janeiro - Brasil: 
análise do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados / 
Claudius Couto Cabral. – Rio de Janeiro: UFRJ/ IQ, 2013. 
 102f.: il. 
 
 Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal do Rio 
de Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Ciência 
de Alimentos, 2013 
 
 Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin. 
 
 1. Lingüiça frescal. 2. Reação em cadeia da polimerase 3. Salmonella 
spp. I. Paschoalin, Vânia Margaret Flosi. (Orient.). II. Universidade 
Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química. Programa de Pós-
Graduação em Ciência de Alimentos. III. Título. 
 
CDD: 664.001 
 
 
 
CLAUDIUS COUTO CABRAL 
 
 
AVALIAÇAO DA CONTAMINAÇÃO POR Salmonella spp. 
EM LINGUIÇAS FRESCAIS COMERCIALIZADAS EM DUAS 
CIDADES DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO – BRASIL 
ANÁLISE DO PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE AOS 
ANTIMICROBIANOS DOS ISOLADOS 
 
 
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do 
Programa de Pós-graduação em Ciência de 
Alimentos – UFRJ, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do grau de Mestre em 
Ciência de Alimentos 
 
Orientador: Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
 
Aprovado em: 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
_____________________________________________ 
Profa. Dra. Vânia Margaret Flosi Paschoalin 
Instituto de Química - UFRJ 
 
 
_____________________________________________ 
Prof. Dra. Selma Gomes Ferreira Leite 
Escola de Química - UFRJ 
 
 
_____________________________________________ 
Prof. Dr. Robson Maia Franco 
Faculdade de Veterinária - UFF 
 
_____________________________________________ 
Dra. Ana Carolina da Silva Carvalho 
Instituto de Química - UFRJ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 
 À ela, sempre guerreira, nunca desistindo frente a pior das intempéries da 
vida, minha mãe, sem a qual eu jamais teria chegado a este momento. Muito 
obrigado. 
 À minha companheira de todos os momentos, tristes e felizes, derrotas e 
vitórias, mais de pobreza do que riqueza, minha namorada e meu grande amor, 
Bianca. 
 À minha orientadora Vânia Paschoalin pela oportunidade concedida em seu 
grupo de pesquisa, toda a paciência, conhecimentos passados e os bons momentos 
proporcionados ao laboratório durante estes dois anos. 
 Ao meu amigo prof. Carlos Conte, pela confiança, toda a ajuda prestada e 
ensinamentos concedidos até meia noite da sexta-feira ou aos sábados de manhã. 
 Aos amigos pesquisadores do “time barracuda”, equipe de pesquisa em 
segurança e higiene do pescado do laboratório 545, Claudio “Zaca” Capella, 
Raphael “Cabritinho” Leonardo, Josiane “Zé” Marília e Ana Carolina “Mala” Carvalho 
pelos inúmeros “brainstorms”, momentos de companheirismo, amizade e risadas 
durante as sextas a noite no mangue e na lapa. 
 Aos colegas pesquisadores, e amigos de laboratório, por toda a amizade, 
solidariedade e bons momentos passados, tornando essa longa caminhada mais 
agradável, Rafael “Bola” Luiz, Filipe “MP” Kayodê, Thiago “Marajá” Álvares, Wilson 
“PB” Rodrigues, Eduardo “Pablito” Mere, Diego “Mamilos” Baião, a técnica Cristiana 
“Cristina” Passinato, a colega Luciana Pacheco Golinelli e a todos os outros 
companheiros aqui não citados, mas de igual importância. 
 Ao colega Marley Gomes do Laboratório de Micobactérias pela disposição em 
ajudar. 
 Às minhas queridas professoras Teresinha Ferreira, Helenita Marques e Maria 
Helena Cosendey, sempre dispostas a me ajudar, assim como ocorreu ao longo do 
meu mestrado, com inúmeras oportunidades concedidas dentro da disciplina de 
Doenças Infecciosas dos Animais Domésticos. Também aos amigos e professores 
Márcio Figueiredo e Robson Maia Franco, ambos de igual importância e sempre 
dispostos a ajudar e passar conhecimentos. A gratidão que tenho por estes amigos 
é imensurável. 
 
 
 À professora Ana Lúcia Vendramini por ter me recebido de braços abertos em 
sua disciplina, me concedendo uma oportunidade de valor inestimável para minha 
formação. 
 E as demais pessoas que por ventura eu não tenha citado aqui, mas que 
participaram com igual importância deste período de minha formação, meu muito 
obrigado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
"O que sabemos é uma gota, o que ignoramos é um oceano." 
 
Isaac Newton, 1687 
 
 
RESUMO 
 
Cabral, Claudius Couto. Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças 
frescais comercializadas em duas cidades do estado do rio de janeiro – brasil. Análise do 
perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados. Instituto de Química, 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2013. 
 
 As linguiças frescais são os produtos embutidos mais consumidos no Brasil. No 
entanto, o uso de matéria-prima contaminada, manipulação inadequada durante o 
processamento e armazenamento inadequado pode representar um perigo para a saúde do 
consumidor. No presente estudo, foi realizada a avaliação da contaminação por Salmonella 
spp. em linguiças frescais comercializadas nas cidades de Niterói e do Rio de Janeiro. Oitenta 
linguiças frescais foram coletadas de 22 diferentes estabelecimentos comerciais nas duas 
cidades. Vinte e uma amostras (27%) estavam contaminadas com Salmonella spp. Dezesseis 
(20%) amostras contaminadas foram detectadas pela PCR combinada com o enriquecimento 
seletivo no caldo Rappaport-Vassiliadis e Tetrationato Hajna, enquanto na microbiologia 
convencional foram detectadas oito amostras contaminadas. As embalagens dos produtos, 
original, modificada ou fora da embalagem, não influenciaram significativamente na 
contaminação por Salmonella spp. visto que amostras em sua embalagem original 
apresentaram 23% de contaminação, enquanto 27% das amostras em embalagens não-
originais ou fora da embalagem estavam contaminadas. Similarmente, a composição da carne 
também parece não influenciar na contaminação por Salmonella spp. de forma significante, 
visto que 20% das linguiças de frango e 29% das linguiças suínas estavam contaminadas. 
Dentre as linguiças suínas, 37% do tipo toscana estavam contaminadas, enquanto que a 
contaminação foi observada em 21% das linguiças de pernil. De oito isolados de Salmonella 
spp. foi realizado o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, onde nenhum dos isolados 
apresentou-se como multirresistentes; a classe dos beta-lactâmicos foi a que teve o maiorpercentual de isolados com resistência (quatro isolados). Considerando-se os resultados 
obtidos, a PCR poderia ser utilizada para a avaliação da qualidade microbiológica durante o 
processamento industrial de linguiças frescais. 
 
 
Palavras-chave: Salmonella spp. Linguiças frescais suína e de frango. PCR. Embalagem. 
Brasil. 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Cabral, Claudius Couto. Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças 
frescais suínas e de frango comercializadas em duas cidades do estado do rio de janeiro – 
brasil. Análise do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados. Instituto de 
Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2013. 
 
 Fresh sausages are the most popular stuffed meat product available in Brazil. 
However, the use of contaminated raw material, unhygienic handling during processing, and 
inadequate storage could be hazardous consumers health, since fresh-sausage processing does 
not include heat treatment and the product may carry several human pathogens such as 
Salmonella spp. To evaluate Salmonella spp. contamination of fresh sausages marketed in Rio 
de Janeiro and Niterói, 80 fresh sausages were collected from 22 stores in both cities. A total 
of 21 sausage samples (27%) proved to be contaminated by Salmonella spp. Sixteen (20%) 
contaminated samples were detected by PCR testing combined with RV or TTH broth 
culturing, whereas conventional microbiological screening detected only 8 (10%). The 
packing conditions of fresh sausages at the retail market, original or replaced packing, or even 
unpacked, did not seem to significantly affect Salmonella spp. contamination, since the 
samples in their original packing showed 23% contamination whereas the contamination rate 
of sausages wrapped in plastic or unpacked was 27%. Similarly, the meat composition did not 
seem to influence Salmonella spp. contamination significantly, since 20% of the chicken and 
29% of the pork sausages proved to be contaminated. The contamination rate of Tuscan-type 
sausages was 37%, while contamination was found in 21% of ham sausages, indicating that 
the cut of pork did not affect the microbiological quality of the fresh sausages. The 
antimicrobial susceptibility test revealed no multiresistance among the isolates, with beta-
lactams being the class with highest resistance rate (4 isolates).The results shown here 
indicate that PCR testing could be a valuable tool for assessing the microbiological quality 
during plant processing of stuffed food. 
 
 
Keywords: Salmonella spp. Fresh pork and chicken sausages. PCR tests. Product packing. 
Brazil. 
 
 
 
 
 
LISTA DE ILUSTAÇÕES 
 
Figura 1: Participação (%) dos produtos cárneos no mercado de frios e 
embutidos no Brasil em 2009 (Fonte: Nielsen, 2012) 
 
15 
Figura 2: Fluxograma das etapas de produção de linguiças frescais 
 
18 
Figura 3: Esquema da proposta de Hoagland (1914) para a conversão do 
nitrato até óxido nítrico em produtos curados 
 
19 
Figura 4: Representação esquemática de um integron de classe 1 
 
30 
Figura 5: Representação esquemática dos protocolos utilizados para a 
determinação do limite de detecção da PCR 
 
36 
Figura 6: Prova da soroaglutinação macroscópica positiva com antígeno 
polivalente somático anti-Salmonella 
 
39 
Figura 7 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos pelo método de 
difusão em disco de Kirby-Bauer em agar Mueller-Hinton 
 
39 
Figura 8: Avaliação da detecção de Salmonella spp. em linguiças 
artificialmente contaminadas 
 
41 
Figura 9: Amplificação de fragmento de 598 pb do gene invA, exclusivo 
de Salmonella spp., em linguiças contaminadas artificialmente e 
submetidas as etapas de pré-enriquecimento primário e enriquecimento 
seletivo 
 
41 
Figura 10: Contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais 
coletadas em Niterói e no Rio de Janeiro 
 
42 
Quadro 1: Parâmetros físico-químicos estabelecidos para linguiças pelo 20 
 
 
Ministério de agricultura, pecuária e abastecimento (MAPA) no país 
(Brasil, 2000). 
 
Quadro 2: Parâmetros microbiológicos estabelecidos para embutidos 
frescais pela ANVISA no país (Brasil, 2000). 
 
21 
Quadro 3: Taxonomia do gênero Salmonella 25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1: Principais agentes etiológicos de surtos de doenças transmitidas 
por alimentos notificadas no Brasil, no período entre 1999-2009 (BRASIL, 
2011b) 
 
24 
Tabela 2: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças 
frescais suína e de frango por microbiologia convencional e por PCR 
associada ao enriquecimento seletivo em RV e TTH. 
 
42 
Tabela 3: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças 
frescais suína e de frango por microbiologia convencional. 
 
42 
Tabela 4: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças 
frescais suína e de frango pela PCR. 
 
43 
Tabela 5: Análise das amostras de número 1 a 30 contaminadas e não-
contaminadas com Salmonella spp. 
 
44 
Tabela 6: Análise das amostras de número 31 a 60 contaminadas e não 
contaminadas com Salmonella spp. 
 
45 
Tabela 7: Análise das amostras de número 61 a 80 contaminadas e não 
contaminadas com Salmonella spp. 
 
46 
Tabela 8: Isolados de Salmonella spp. e seus respectivos perfis de 
susceptibilidade frente a 16 antimicrobianos 
47 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE SIGLAS 
 
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
APT- Água Peptonada Tamponada 
BHI – Brain Heart Infusion 
BPF – Boas Práticas De Fabricação 
CDC – Center of Disease Control and Prevention 
CLSI - Clinical and Laboratorial Standarts Institute 
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz 
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento 
PCR – reação em cadeia da polimerase - “polymerase chain reaction” 
PCR – RV – reação em cadeia da polimerase / Caldo Rappaport-Vassiliadis 
PCR – TT - reação em cadeia da polimerase / Caldo Tetrationato Hajna 
RV/Ra – caldo Rappaport-Vassiliadis / Ágar Rambach 
TT/Ra – caldo Tetrationato Hajna / Ágar Rambach 
RV/H – caldo Rappaport-Vassiliadis / Ágar Hektoen 
TT/H – caldo tetrationato Hajna / Ágar Hektoen 
QRDR – região determinante de resistência a quinolona “Quinolone Resistance Determining 
Region” 
RDC – Resolução de Diretoria Colegiada 
RV – caldo Rappaport-Vassiliadis 
TSI – triple sugar iron – “três açucares e ferro” 
TTH – Caldo Tetrationato Hajna 
UFC – Unidade Formadora de Colônia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO 14 
2 REVISÃO DE LITERATURA 17 
2.1 Elaboração de linguiças frescais 17 
2.2 Microbiologia da carne e derivados e contaminação por Salmonella spp. 21 
2.3 Epidemiologia da salmonelose no Brasil 23 
2.4 Métodos para a detecção de Salmonella spp. 27 
2.5 Resistência aos antimicrobianos em Salmonella spp. 28 
3 JUSTIFICATIVA 31 
4 OBJETIVOS 32 
4.1 Objetivo geral 32 
4.2 Objetivos específicos 32 
5 METODOLOGIA DA PESQUISA 33 
5.1 Microrganismos utilizados e meios de cultura 33 
5.2 Obtenção das amostras 33 
5.3 Extração do DNA 34 
5.4 Condições e parâmetros da PCR 34 
5.5 Determinação do limite de detecção de Salmonella spp.por PCR em caldo de 
cultivo 
35 
5.6 Contaminação artificial de linguiças frescais 35 
5.7 Análise bacteriológica 37 
5.8 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos 38 
5.9 Análise estatística 39 
6 RESULTADOS 40 
6.1 Determinação do limite de detecção da PCR 40 
6.2 Detecção de Salmonella nas amostras de lingüiças frescais analisadas 40 
6.3 Influência da embalagem na contaminação de linguiças frescais por 
Salmonella spp. nas amostras obtidas 
43 
6.4 Ocorrência de amostras positivas de acordo com a composição da linguiça 43 
6.5 Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados 46 
7 DISCUSSÃO 48 
8 CONCLUSÕES 56 
9 REFERÊNCIAS57 
 
 
10 APÊNDICES 72 
APÊNDICE A Resumos publicados no 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia 72 
APÊNDICE B Resumos publicados no XVI Congresso Mundial de Ciência 
e Tecnologia de Alimentos 
75 
APENDICE C Trabalhos completos aceitos para publicação no XII Congresso 
Brasileiro de Higienistas de Alimentos 
77 
APÊNDICE D Artigos submetidos para publicação 83 
APÊNDICE E Análise das amostras coletadas em Niterói e no Rio de Janeiro por PCR 96 
APÊNDICE F Características morfológicas de Salmonella spp. nos meios de cultura 
utilizados para sua identificação. 
101 
 
14 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
 A produção agropecuária brasileira responde atualmente por mais de 35% do produto 
interno bruto do país, com o agronegócio quebrando recordes a cada ano, tendo obtido no 
primeiro semestre de 2011 um superávit de U$ 34,7 bilhões, tendo o setor de carnes 
contribuído com R$1,36 bilhões, um aumento de 18,9% (BRASIL, 2011a). O Ministério da 
Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) estima que até 2021 a produção de carne no 
Brasil irá ser incrementada em 27% (BRASIL, 2011a). O consumo de carnes no Brasil vem 
crescendo, com um consumo per capita estimado de 37,4 kg de carne bovina, 43,9 kg de 
carne de aves e 14,1 kg de carne suína (BRASIL, 2010). O comércio de derivados cárneos 
também segue em ascensão, pois encontra no mercado interno consumidores receptivos a 
novos produtos mais saudáveis e sensorialmente agradáveis (DAGUER et al., 2010). Soma-se 
a isto o incremento do poder aquisitivo da população devido ao crescimento da economia 
brasileira e ascensão das classes sociais. 
 Dentro do comércio de produtos cárneos, as linguiças se destacam, representando 40% 
do mercado de frios e embutidos (FIGURA 1), tendo obtido um crescimento de vendas de 
60% no período entre 2000 a 2008; no entanto, o consumo nacional ainda é baixo, 1,7 kg de 
linguiça/habitante/ano, se comparado a outros países como os Estados Unidos aonde esse 
valor chega a 21 kg/habitante/ano (NIELSEN, 2009). 
 Dentro deste cenário, faz-se necessário o investimento em estudos voltados para o 
aumento da qualidade do produto final, como pesquisas aplicadas ao melhoramento animal, 
transformação da matéria prima, formação de produtos de características sensoriais 
agradáveis, composições centesimais dentro do padrão exigido por legislação e controle de 
qualidade microbiológico de forma a obtenção de produtos dentro dos padrões 
microbiológicos exigidos. 
 Em trabalhos voltados para qualidade higiênico-sanitária destes alimentos, o objetivo é 
a identificação de pontos de risco para a contaminação microbiológica e a minimização 
destes, levando ao consumidor um produto final inócuo (PARDI, 1996). A contaminação por 
microrganismos patogênicos pode ocorrer em diversos pontos ao longo da cadeia alimentar, 
tais como na não observância e cumprimento dos aspectos sanitários envolvidos na criação 
dos animais e de todo o processo de abate, com a qualidade do produto final sendo um reflexo 
da matéria prima utilizada (MAURIELLO et al. 2004). Dentre os produtos cárneos, os 
embutidos possuem algumas características particulares em relação a sua produção que 
15 
 
aumentam as possibilidades de contaminação. São derivados cárneos produtos de salsicharia 
revestidos por um envoltório natural de origem bovina, ovina ou suína, que podem vir a ser 
uma grande fonte de contaminação se o processo de obtenção e posteriormente de 
conservação não for realizado com as devidas precauções higiênico-sanitárias. A carne e os 
aditivos utilizados devem ser de boa qualidade, havendo a necessidade da realização de um 
rígido controle de qualidade por parte dos estabelecimentos produtores (SPRICIGO et al., 
2008). 
 
Figura 1: Participação (%) dos produtos cárneos no mercado de frios e embutidos no Brasil em 2009 
 
 Fonte: NIELSEN, 2012 
 
 A necessidade de rigor higiênico sanitário é maior em produtos frescais, pois estes não 
sofrem processamento térmico; desta forma, a microbiota do alimento não será reduzida em 
nenhum ponto da cadeia de produção, se mantendo até a casa do consumidor, ou mesmo 
aumentando em caso de falhas durante as etapas que devem ser realizadas sob temperatura de 
refrigeração ou de congelamento. Esta necessidade de manter o produto acondicionado de 
forma correta sob temperatura de resfriamento já foi alvo de estudos, e apesar de sua 
importância, os autores relataram ausência de conformidade em diversos estabelecimentos 
comerciais (GARRIDO et al., 2010; JOSHI et al., 2010; IPEM-SP, 2010). 
 
16 
 
 Levando em consideração que as linguiças, apesar de não serem consumidas cruas, são 
frequentemente submetidas a interrupções na cadeia do frio e ao preparo inadequado antes do 
consumo, trata-se de um produto que pode veicular bactérias patogênica, como Salmonella 
spp., representando um risco que não deve ser negligenciado pelas autoridades sanitárias 
(MÜRMANN et al., 2009). 
 Para auxiliar na detecção deste patógeno em linguiças frescais, no presente estudo foi 
avaliada a detecção deste patógeno pela PCR em comparação com a técnica microbiológica 
convencional. Além disso, foi estudada a influência de alguns fatores como a composição da 
carne e a embalagem sobre a contaminação do produto por Salmonella spp. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
2 REVISÃO DE LITERATURA 
 
2.1 Elaboração de linguiças frescais 
 
 No Brasil, as linguiças são definidas como “produto cárneo industrializado, obtido de 
carnes de animais de açougue, adicionados ou não de tecidos adiposos, ingredientes, embutido 
em envoltório natural ou artificial, e submetido ao processo tecnológico adequado” (BRASIL, 
2000). A carne utilizada para a elaboração destes produtos classicamente é a suína, mas 
recentemente linguiças contendo carne de outros animais, como frango e pescado, têm sido 
comercializados, o que é permitido pela legislação, desde que seja informado no rótulo, 
garantindo que o consumidor tenha a possibilidade de conhecer a constituição do produto a 
ser adquirido. Para ser utilizada, a carne deve estar livre de aponevroses, nervos, linfonodos, 
esquírulas ósseas e objetos estranhos, estando esta inicialmente congelada ou resfriada 
(BRESSAN e PEREZ, 2001). Além disso, é adicionada gordura suína, geralmente na forma 
de toucinho, elemento importante do produto, pois confere o sabor e a textura característicos 
do produto (PARDI, 1996). 
 O fluxograma da produção de linguiça frescal encontra-se na FIGURA 2. A carne 
geralmente chega ao estabelecimento congelada em bloco, sendo reduzida a pedaços menores 
em um quebrador de blocos e posteriormente moída; a gordura sofre a moagem em discos de 
maior calibre, de modo que seus grandes pedaços sejam visíveis no produto final. Um 
importante aspecto durante a moagem é a temperatura da carne, pois esta é aquecida, podendo 
levar a desnaturação protéica da matriz gerando um produto final com textura alterada. 
Recomenda-se que a carne seja moída a uma temperatura entre 0ºC e 4ºC (PARDI , 1996). 
Após a moagem, a carne, separada em bateladas, é enviada para a misturadeira, onde são 
adicionados o toucinho e os condimentos, que são utilizados de acordo com o produto final 
desejado pela empresa. Estes ingredientes são previamente pesados, de acordo com a 
formulação do produto, e separados antes de serem adicionados. Também ocorre a adição de 
água gelada durante esta etapa, para evitar o superaquecimento da massa e assim a 
desnaturação protéica da carne, conforme explicado anteriormente 
 
 
 
 
18 
 
Figura 2: Fluxograma das etapas de produção de linguiças frescais 
 
 
 
 Entre os aditivos intencionalmente adicionados à linguiça, destaca-se o nitrato. Este 
composto é reduzido via metabolismo microbiano a nitrito e este posteriormente, em pH 
ácido, se decompõe gerando o óxido nitroso, responsável por conferir a característica 
coloraçãoavermelhada típica de produtos curados. Esta coloração, muito atrativa para o 
consumidor, ocorre pela ligação do óxido nítrico gerado pela redução do nitrito com o ferro 
hêmico da mioglobina da carne, formando a mioglobina óxido nítrico (FIGURA 3). Esta nova 
molécula se submetida ao tratamento térmico, sofre desnaturação formando o nitrosil-
hemocromo, composto responsável pela cor rósea característica da lingüiça cozida 
(HONIKEL, 2010). 
 
19 
 
Figura 3: Esquema da proposta de Hoagland (1914) para a conversão do nitrato até óxido nítrico em produtos 
curados. 
 
 Após a mistura dos ingredientes, a massa é mantida em repouso por cerca de 12h, 
refrigerada, para que se desenvolva a reação de cura. Entende-se como cura o conjunto de 
processos bioquímicos que resultam no desenvolvimento da cor, sabor e textura próprios do 
produto em questão, mediante a adição de sais, aditivos e especiarias, sendo um processo 
tecnológico de grande importância, pois torna o produto mais atrativo para o consumidor 
(TAKAHASHI, 1979). 
 Após a reação de cura, a massa encontra-se pronta para ser embutida. O envoltório 
utilizado para o embutimento de linguiças é do tipo natural, sendo os intestinos de bovinos, 
suínos e ovinos de médio calibre (28-32 mm) os mais utilizados. Após o enchimento da tripa, 
torções são realizadas, em média a cada 10 cm, formando os gomos da lingüiça, este que são 
mantidos através do amarrio, geralmente utilizando-se fio de algodão (barbante). Diversos 
cuidados são necessários nesta etapa, como o cuidado para que não ocorra um enchimento 
excessivo da tripa, que pode causar sua ruptura. Além disso, é importante que o embutimento 
seja realizado sem a incorporação de ar na massa, pois o oxigênio atmosférico reage com a 
gordura da lingüiça, causando sua rancificação o que pode provocar escurecimento de regiões 
adjacentes aos pedaços de gordura, prejudicando principalmente a cor do produto e a 
aceitação pelo consumidor (BRESSAN e PEREZ, 2001). As grandes indústrias atualmente, de 
modo a prevenir este problema, utilizam embutideiras à vácuo e automáticas para a realização 
desta etapa, reduzindo a mão-de-obra necessária e aumentando a velocidade de produção. 
 Decorrida esta etapa, as linguiças são pesadas e embaladas a vácuo com embalagem 
termoencolhível. Estas se retraem e se aderem na superfície dos produtos mediante imersão da 
embalagem em água quente. Os produtos são posteriormente acondicionados em suas 
embalagens secundárias (caixas de papelão) e mantidos em locais adequados sob refrigeração 
(0°C – 4ºC), sendo mantidos na indústria até o momento de sua expedição. As linguiças são 
transportadas até o comercio em caminhões com unidade frigorífica, e nos mercados, são 
20 
 
vendidas na embalagem original, ou em bandeja de poliestireno expandido envolta em filme 
plástico ou a granel (PARDI, 1996). 
 Todo esse procedimento para a elaboração de linguiças frescais deve ser realizado 
obedecendo-se o que preconiza as Boas Práticas de Fabricação (BPF), de modo a garantir a 
qualidade do produto final, preservando a saúde do consumidor e a credibilidade da indústria 
produtora (CHAVES et al., 2000). Durante a etapa de acondicionamento do produto final, são 
retiradas amostras para a realização de análises microbiológicas e físico-químicas para 
verificar se o lote produzido encontra-se dentro dos padrões estabelecidos pela legislação. No 
Brasil, os parâmetros físico-químicos das linguiças frescais são regidas pela Instrução 
Normativa nº4, de 31 de março de 2000 (BRASIL, 2000) e os limites microbiológicos pela 
RDC nº 12 de 2 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001). Os requisitos estabelecidos na legislação 
estão resumidos nos quadros 1 e 2. 
 
Quadro 1: Parâmetros físico-químicos estabelecidos para linguiças frescais pelo Ministério de Agricultura, 
Pecuária e Abastecimento (MAPA) no país (BRASIL, 2000) 
 Frescais Cozidas Dessecadas 
Umidade (máx.) 70% 60% 55% 
Gordura (máx.) 30% 35% 30% 
Proteína (máx.) 12% 14% 15% 
Cálcio (base seca) (máx.) 0,1% 0,3% 0,1% 
 
 Estes parâmetros foram estabelecidos uma vez que as linguiças frescais são produtos 
com grande aceitação pelo consumidor. Desta forma, a fiscalização destes produtos é 
necessária para garantir a qualidade destas matrizes alimentícias, de forma a evitar que o 
produto sofra deterioração microbiana ou que este se torne um veículo para microrganismos 
patogênicos. As bactérias e os fungos, de modo geral, podem se manter viáveis e se 
proliferarem nos alimentos sem causarem alterações sensoriais perceptíveis. (CHAVES et al., 
2000). 
 
 
 
 
 
21 
 
Quadro 2: Parâmetros microbiológicos estabelecidos para embutidos frescais pela ANVISA no país (BRASIL, 
2000). n= número de unidades a serem analisadas, c= número máximo de amostras com valores entre m e M 
permitidas, m= limite mínimo aceitável para um determinado critério microbiológico, M= limite máximo 
aceitável para um determinado critério microbiológico 
Produto Microrganismo 
Tolerância para 
amostra indicativa 
Tolerância para 
amostra representativa 
n c m M 
Embutidos 
frescais 
(linguiças cruas 
e similares) 
Coliformes a 45ºC/g 5 x 10
3
 5 3 5x10
2
 5x10
3
 
Estafilococos 
coagulase positiva/g 
5 x 10
3
 5 2 10
3
 5x10
3
 
Clostrídios sulfito-
redutores a 46ºC/g 
3x10
3
 5 2 5x10
2
 3x10
3
 
Salmonella spp.25g Ausência 5 0 Ausência 
 
2.2 Microbiologia da carne e derivados e contaminação por Salmonella spp. 
 
 A carne é um alimento nobre, rico em nutrientes, especialmente água e proteínas, o que a 
torna um componente importante na dieta humana. No entanto, essa complexidade de 
nutrientes também representa um meio rico para o crescimento microbiano, levando a sua 
degradação, gerando alterações sensoriais indesejáveis para o consumidor, e tornando este 
produto não comercializável (GRAM et al., 2002) Atualmente, uma grande preocupação 
existente por parte das indústrias, dos órgãos fiscalizadores e do próprio consumidor diz 
respeito à presença de microrganismos patogênicos na carne. Estes patógenos podem ser 
responsáveis por diversas síndromes clínicas nos consumidores, algumas mais brandas como 
diarréias auto-limitantes, ou graves como abortamentos, meningoencefalites e septicemias em 
gestantes, crianças e imunodeprimidos, respectivamente (FERNANDES, 2009). Nos produtos 
derivados de carne, como as linguiças frescais, que não recebem tratamento térmico, sua 
microbiota está diretamente ligada a aquela presente na carne utilizada para a sua elaboração 
e/ou em seus aditivos. A presença de Salmonella spp. nos animais de abate, invariavelmente, 
resulta na contaminação do produto final, conforme os estudos de Castagna, (2004) que 
detectaram altos níveis de contaminação da massa utilizada para a elaboração de linguiças em 
estabelecimentos com grande número de animais portadores assintomáticos do patógeno. 
 Em geral, as bactérias patogênicas são mesófilas, incapazes de crescerem em 
temperatura de refrigeração, e assim não possuem importância significativa para a 
deterioração da carne, exceto que ocorra quebra da cadeia do frio; sob baixas temperaturas, a 
decomposição da matriz cárnea se dá principalmente por ação de agentes psicrófilos (JAY, 
22 
 
2005). A microbiota inicial da carne é bastante variada, e seus aspectos qualitativos, 
referentes a diversidade microbiana, e quantitativos, relacionados a carga de microrganismos 
presentes no alimento são resultantes de uma complexa interação entre a microbiota presente 
na pele, pêlos, penas, mucosas e órgãos internos do animal vivo associada a eficácia das 
medidas higiênico-sanitárias aplicadas durante o abate e processamento da carcaça 
(FERNANDES, 2009). Os diferentes processos tecnológicos realizados após o abate do 
animal influenciam diretamente os níveis de contaminação da carne por microrganismos antes 
ausentes, ou no aumento do número de agentes anteriormente presentes,principalmente 
devido à manipulação da musculatura que é realizada a partir da esfola. A principal forma de 
contaminação da carcaça de animais que possuem em seu processamento a etapa de esfola é 
mediante a manipulação pelos funcionários e/ou contato com material fecal, de forma direta 
por rompimento do intestino durante a evisceração, ou indiretamente, através de 
equipamentos contaminados (VAN HOEK et al., 2012) 
 Dentre as bactérias patogênicas, as principais são veiculadas por contaminação fecal, 
como Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Escherichia coli e Salmonella spp. 
sendo que apenas algumas são associadas com o ambiente como Listeria monocytogenes, 
microrganismo psicotrófico e que pode contaminar a carne se presente no ambiente de abate e 
de elaboração dos produtos, como as câmaras de refrigeração (JEMMI e STEPHAN, 2006). O 
trato gastrointestinal, por possuir uma grande carga microbiana, deve receber cuidados 
especiais ao longo do abate evitando assim a contaminação da carcaça com seu conteúdo. A 
oclusão do esôfago, do intestino e a do reto são operações realizadas com a finalidade de 
evitar o extravasamento de conteúdo gastrointestinal para a carcaça. Apesar de ser improvável 
a passagem de bactérias destes órgãos horas após a morte do animal, a evisceração deve ser 
rapidamente realizada, pois a formação de gases decorrentes do metabolismo microbiano 
causa o aumento do volume do estômago e do intestino, facilitando o seu rompimento durante 
a abertura da cavidade abdominal (GILL et al., 1978). 
 Nos suínos, as principais etapas que podem ocasionar a contaminação da carcaça 
durante o processo de abate, devido a ausência de esfola, é a escalda, o chamuscamento, a 
toalete e a limpeza final da carcaça, sendo que estas etapas já foram estudadas por diversos 
autores na tentativa de se determinar quais as melhores técnicas a serem utilizadas em cada 
processo de modo a reduzir a contaminação microbiana da carcaça (GILL, 2009; SPECHA et 
al., 2006; KOTULA et al., 1974). Na cadeia produtiva de carne de frango, a principal etapa 
que favorece a disseminação de microrganismos é a depenagem. Esta ocorre logo após a etapa 
de escalda, que remove até 95% dos contaminantes presentes na superfície da carcaça. 
23 
 
Bactérias presentes na pele e penas, como Staphylococcus spp. e Corynebacterium spp. 
representam os principais gêneros de microrganismos que podem ser disseminados nesta 
etapa, mas outros agentes como os coliformes, Campylobacter spp. e Salmonella spp. também 
podem estar presentes, no caso de carcaças sujas com fezes, estas geralmente oriundas das 
próprias aves (MULDER et al., 1978). 
 Com o advento de biologia molecular, novos e mais completos estudos foram realizados 
na tentativa de se entender melhor a dinâmica de contaminação dos alimentos e dos 
estabelecimentos produtores por Salmonella spp. Através de estudos de tipificação molecular, 
KICH et al. (2011) demonstraram que os principais isolados de linfonodos mesentéricos 
estavam relacionados com isolados da granja e das fezes, havendo pouca relação com os 
isolados do ambiente de abate, apesar da grande diversidade de clones do gênero Salmonella 
encontrados, o que poderia ser resultado de anos de contaminação do ambiente por outros 
animais abatidos no estabelecimento. Em outro estudo, SILVA et al. (2012) não conseguiram 
isolar clones de Salmonella spp. presentes nos suínos locais ou das possilgas de matança em 
carcaças após a escaldagem, apesar do isolamento de outros clones deste patógeno. Esse 
estudo mostrou que a adoção de medidas higiênico-sanitárias é de grande importância para o 
controle da presença e da disseminação de Salmonella spp. 
 
2.3 Epidemiologia da salmonelose no Brasil 
 
 Nos Estados Unidos, estima-se uma prevalência de 1,4 milhões de casos por ano de 
infecções alimentares por Salmonella não-tifoidal (VOETSCH et al., 2004). No Brasil, 
Salmonella spp. é o agente mais comumente envolvido em doenças transmitidas por 
alimentos, presente em 42,5% dos casos (TABELA 1). Dentre os alimentos mais comumente 
envolvidos, as carnes e derivados são a segunda principal forma de veiculação destes 
patógenos (BRASIL, 2011b). Dentre as doenças potencialmente veiculadas por alimentos, a 
salmonelose se destaca no mundo todo, causando surtos associados a diferentes matrizes 
alimentares. 
 Salmonelose é o nome dado a doença resultante da infecção por bactérias do gênero 
Salmonella. Este gênero encontra-se na família Enterobacteriaceae, com apenas duas espécies 
são reconhecidas, S. enterica e S. bongori (REEVES et al., 1989). Dentro da espécie S. 
enterica, encontram-se seis subespécies, sendo que cada uma delas possui centenas de 
diferentes sorovares descritos (QUADRO 3). A subespécie de maior importância é a enterica, 
que engloba a maior quantidade de sorovares descritos, mais de 2000, de um total atual que 
24 
 
ultrapassa os 2500 sorovares. A diferenciação dos sorovares é realizada através da análise de 
três antígenos presentes nos membros do gênero Salmonella: antígeno externo (O), antígeno 
flagelar (H) e o antígeno capsular (Vi) (POPOFF et al., 2004). 
 
 
 
 As bactérias deste gênero possuem ampla distribuição na natureza, sendo capazes de 
infectar um grande número de animais, sejam domésticos, selvagens e mesmo o homem. A 
principal via de infecção para os humanos é mediante a ingestão de alimentos contaminados, 
em especial carnes e ovos (ALVAREZ-ORDÓÑEZ et al., 2010). Geralmente as infecções 
são assintomáticas ou causam diarréia branda e auto-limitante, mas neonatos, crianças, idosos 
e pessoas com o seu sistema imune comprometido, como portadores da síndrome da 
imunodeficiência humana adquirida (AIDS) ou transplantados, constituem um grupo de risco 
podendo desenvolver formas mais severas da salmonelose como a septicêmica ou encefálica 
(HUMPHREY, T., 2004; ICHIKAWA et al., 2009). Em seus estudos, Peresi et al. (1998) 
analisaram 19 surtos ocorridos em São Paulo, onde observaram que surtos envolvendo 
crianças e idosos foram os que apresentaram maior percentual de indivíduos acometidos, 93% 
e 100%, respectivamente, comprovando desta forma que grupos envolvendo indivíduos nestas 
TABELA 1: Principais agentes etiológicos de surtos de doenças transmitidas por alimentos notificadas no 
Brasil no período entre 2000-2011 (BRASIL, 2011b). 
25 
 
faixas etárias são os mais susceptíveis, e o cuidado na preparação dos alimentos destes 
indivíduos deve ser redobrado. 
 
Quadro 3: Taxonomia do gênero Salmonella 
Espécie Subespécies Sorotipos 
S.enterica enterica (I) 
salamae (II) 
arizonae (IIIa) 
diarizonae (IIIb) 
houtenae (IV) 
indica (VI) 
1547 
513 
100 
341 
73 
12 
S. bongori ------------- 23 
Total ------------- 2610 
 
Fonte: GUIBOURDENCHE et al., 2010 
 
 Indivíduos saudáveis que não desenvolvem doença podem se manter como portadores 
assintomáticos do patógeno (GOPINATH et al., 2012). A capacidade do microrganismo em 
se manter em um hospedeiro sem causar doença representa um importante fator de risco se 
este portador for um manipulador de alimentos, uma vez que a triagem de rotina para 
indivíduos portadores assintomáticos de Salmonella em locais de produção de alimentos não é 
realizada rotineiramente. Ilustrando esse cenário, têm-se como exemplo um famoso caso 
ocorrido nos Estados Unidos no início do século XX, envolvendo uma imigrante da Irlanda 
chamada Mary Mallon, mas que ficou conhecida como “Typhoid Mary”. Esta trabalhadora 
era cozinheira e era portadora assintomática de S. Typhi, fato na época inédito para a ciência. 
Devido a sua profissão, ela foi responsável pela disseminação do patógeno para 54 pessoas 
durante nove diferentes epidemias de febre tifóide em que 4 pessoas morreram (BROOKS, 
1996). 
 A principal forma de transmissão da Salmonella spp. ao homem e aos animais é 
mediante a ingestão de água e alimentos contaminados,devido a más condições de higiene ao 
longo do processamento deste ou dos manipuladores no comércio, ou ainda devido ao uso de 
matéria prima contaminada. No Brasil, ovos e produtos feitos a base de ovos tem sua 
26 
 
importância epidemiológica bem definida, e freqüentemente estão envolvidos em surtos de 
salmonelose (BRASIL, 2011b), principalmente devido à capacidade das salmonelas adaptadas 
às aves de contaminarem estes produtos quando a gema do ovo ainda encontra-se em 
formação no ovário das aves (BRADEN, 2006). 
 O papel de outros alimentos ainda continua incerto, apesar de serem relatados como 
envolvidos em surtos de salmonelose. A contaminação de lingüiça frescal suína possui poucos 
relatos no Brasil (LIMA et al., 2011, RALL et al., 2009, SPRICIGO et al., 2008, CHAVES et 
al., 2000 e GALARDA et al., 1991). 
 A entrada de animais já infectados, portadores do patógeno, em estabelecimentos de 
abate é o principal risco para a contaminação da carne e seus derivados (BAPTISTA et al., 
2010). Diversos pesquisadores têm focado seus estudos na identificação de fontes de infecção 
dos animais, antes da chegada aos matadouros ou nestes próprios, de modo a ajudar no 
desenvolvimento e na aplicação de medidas de prevenção da contaminação por Salmonella 
spp. no ambiente industrial, e no controle da infecção dos animais por este agente (SMID et 
al., 2011; VAN HOEK et al., 2012; ALBAN e GOLDBACH, 2005). Além disso, diversos 
matadouros possuem suas “microbiotas endêmicas”, o que facilita a contaminação dos 
alimentos e dificulta o controle deste patógeno (VISSCHER et al., 2011; SORENSEN et al., 
1999). 
 Nos últimos anos, a ocorrência de salmonelose no Brasil e no mundo tem sofrido 
grandes alterações, com a ascensão das Salmonellas não tifoidais como agentes da doença em 
humanos, principalmente devido à contaminação de alimentos por estes microrganismos 
(TAUNAY, 1996, OLSEN et al. 2001). No entanto, ainda ocorre alta prevalência de 
salmonelas tifóides em países em desenvolvimento, como os do continente africano e asiático, 
devido a fatores como menor disponibilidade de serviços de tratamento de água e reduzida 
assistência médica (PARRY et al., 2002). No Brasil, os dados disponíveis sobre casos de 
salmonelose são poucos e deve haver uma subestimação da real incidência da doença no país. 
Estudos realizados no Estado de São Paulo (FERNANDES et al., 2003; TAUNAY et 
al.,1996) mostraram que há alta prevalência das infecções pelo sorotipo Typhimurium, 
seguido de Enteritidis. No entanto, essa distribuição de serotipos varia de acordo com a região 
do país, como demonstrado por Loureiro et al. (2010), que relataram uma alta prevalência de 
S. typhi, demonstrando que regiões sem saneamento básico e outras condições de promoção 
da saúde ainda sofrem com a febre tifóide. 
 
27 
 
2.4 Métodos para a detecção de Salmonella spp. 
 
 Na tentativa de obter-se resultados mais confiáveis e em menor tempo, diferentes 
técnicas têm sido avaliadas pelos pesquisadores. A detecção de Salmonella em alimentos é 
realizada pela microbiologia convencional. No entanto, outras técnicas podem ser utilizadas 
para a detecção deste patógeno, sendo que nos últimos anos, a reação em cadeia da polimerase 
(PCR) tem sido avaliada em diferentes estudos, e em combinação com as etapas de pré-
enriquecimento, tem apresentado sensibilidade superior ao padrão ouro além de poder ser 
realizada em tempos menores (RISSATO 2011, GERMINI 2009, SANTOS 2001). 
 A metodologia tradicional para a identificação destes microorganismos em alimentos 
segue metodologia padronizada pelo Ministério da Agricultura e é amplamente empregado no 
país. Esta consiste basicamente de etapas de pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo, 
isolamento e seleção, identificação bioquímica e soro-aglutinação (BRASIL, 2003). No 
entanto, a técnica é demorada e trabalhosa (cerca de 5-7 dias), pois, necessita de muitos 
reagentes e vidraria, principalmente quando existe a necessidade do processamento de um 
grande número de amostras, como geralmente ocorre nas indústrias de alimentos. Esse prazo 
muitas vezes não atende as necessidades dos órgãos de fiscalização, que em diversas ocasiões 
precisam tomar medidas preventivas rápidas para proteger a saúde do consumidor (GILBERT 
et al., 2003). 
 A aplicação da PCR na detecção de alimentos contaminados, animais e pessoas 
infectadas é uma estratégia utilizada por muitos autores, sendo considerada uma técnica 
rápida e eficiente para a detecção de diversos microrganismos. A rapidez na identificação de 
agentes etiológicos pela detecção do seu DNA, em comparação ao método bacteriológico, 
torna a PCR uma alternativa prática, além de sua alta sensibilidade e especificidade, dentre os 
métodos de diagnósticos disponíveis para a Salmonella spp. (KUMAR et al., 2008). Para a 
detecção de Salmonella spp. em alimentos, a amplificação de seqüências do gene InvA tem 
sido utilizada pelos pesquisadores, por estar presente exclusivamente em microrganismos do 
gênero Salmonella, não gerando falsos-positivos (ASENSI et al., 2008, GALAN et al., 1992). 
 Amostras de alimentos como carne, frango e queijos possuem diversos componentes 
que atuam como inibidores da reação de PCR (WILSON, 1997), sendo necessária a adoção de 
métodos que evitem ou diluam os potenciais inibidores presentes nas matrizes alimentícias 
(ZHAO et al., 2009). A associação da PCR com caldos de pré-enriquecimento e 
enriquecimento seletivo têm sido bastante utilizada pois agem diluindo possíveis inibidores da 
28 
 
PCR além de aumentarem o número de células do microrganismo alvo (OLIVEIRA et al., 
2005). 
 
2.5 Resistência aos antimicrobianos em Salmonella spp. 
 
 Atualmente, a presença de Salmonella spp. e outros microrganismos resistentes a 
antimicrobianos é uma grande preocupação de autoridades sanitárias e pesquisadores em todo 
o mundo. A presença destes patógenos em alimentos possui impacto direto sobre a clínica 
médica humana, especificamente nas medidas terapêuticas adotadas em pacientes vítimas de 
doenças transmitidas por alimentos. Em alguns casos, após o julgamento médico, pode ser 
necessária a utilização de antimicrobianos para o tratamento de casos mais graves, como uma 
salmonelose septicêmica em um paciente imunodeprimido (EUA, 2005). A presença de 
mecanismos de resistência aos antimicrobianos de eleição para estes casos pode por em risco 
a vida do paciente, que pode evoluir para o óbito. Estudos realizados pelo Center of Disease 
Control and Prevention (CDC) nos Estados Unidos revelaram que 22% dos pacientes com 
infecções por salmonelas multirresistentes apresentaram quadro clínico mais grave e 
necessitaram de internação, enquanto apenas 8% das pessoas com infecções por salmonelas 
não-resistentes precisaram de intervenção médica (MOLBAK, 2005). Além disso, estes 
patógenos multi-resistentes podem agir como disseminadores de genes de resistência a 
antimicrobianos para outros microrganismos susceptíveis, e assim ajudar na transferência de 
genes para bactérias de comunidades humanas e de outros animais (PRICE, 2007). 
 Nos Estados Unidos, na Austrália e na Europa, comissões foram formadas com o 
objetivo de monitorar o status da resistência aos antimicrobianos em seus territórios, 
principalmente em patógenos oriundos de amostras humanas (EUROPA, 2012; EUA, 2005; 
AUSTRALIA, 2004). Apesar de não abordarem diretamente patógenos isolados de alimentos, 
tal medida de vigilância é um grande avanço da comunidade cientifica destes locais na 
tentativa de conter a disseminação de microrganismos resistentes. O Brasil não possui sistema 
de vigilância similar, e mais importante e preocupante ainda é o fato de haverem poucos 
estudos com microrganismos oriundos de alimentos. Especificamente com Salmonella spp., 
poucos são os estudos disponíveis na literatura nacional. 
 Os mecanismos de resistência aos antimicrobianos têm sido extensivamenteestudados 
em Salmonella spp. e alguns destes já foram elucidados. O mecanismo mais importante ocorre 
mediante a captação de genes de resistência por elementos genéticos conhecidos como 
integrons (FIGURA 4). Até o presente momento, integrons de classe 1 e classe 2 já foram 
29 
 
descritos em Salmonella spp. e estes contêm diversos cassetes de genes que codificam 
proteínas envolvidas na resistência a antimicrobianos e mesmo a desinfetantes (FLUIT e 
SCHMITZ, 2004; PLOY et al., 1998). Peirano et al. (2006) em seus estudos com isolados de 
Salmonella spp. de origem humana e animal relataram a presença de 55 isolados contendo 
integrons de classe 1 que continham em sua sequencia diversos genes de resistência a 
ampicilina, oxacilina, sulfonamida, aminoglicosídeos e cloranfenicol, tendo sido demonstrado 
que os integrons estavam contidos em plasmídeos de alto peso molecular, o que permitia sua 
disseminação para outros microrganismos. 
 No entanto, os pesquisadores têm voltado sua atenção mais recentemente para os 
mecanismos de resistência envolvendo as fluoroquinolonas, visto que é a classe que contêm 
os antimicrobianos de eleição para uso em infecções causadas por Salmonella spp. (SOUZA 
et al., 2010). O principal mecanismo envolvido, diferentemente das outras classes de 
antimicrobianos, é a alteração das topoisomerases, II e IV, sendo esta mudança decorrente de 
mutações nos genes codificadores destas proteínas, GyrA e ParC, respectivamente (CASIN et 
al., 2003). No gene GyrA, a grande maioria das mutações ocorrem dentro da região que se 
inicia no códon 67 e termina no 106, denominada região determinante de resistência às 
quinolonas ou “Quinolone Resistance Determinant Region – QRDR”, sendo os aminoácidos 
implicados a Ser-83 e Asp-87, que sofrem substituição por uma Phe, Tyr ou Ala no 
aminoácido 83 e uma Gly, Asn ou Tyr no aminoácido 87; essas mutações inicialmente 
ocorrem isoladas, apesar de já terem sido detectadas em salmonelas com resistência total a 
quinolonas (RUIZ et al., 1997). Giroud et al. (1999) demonstraram que as mutações pontuais 
ocorrem e se somam dentro da QRDR conforme a pressão de seleção aumenta sobre o 
patógeno. Esta pressão seria decorrente do uso excessivo e sem critério de antibióticos, na 
clínica humana e na criação animal. Não coincidentemente, nos isolados obtidos de animais, 
os maiores índices de resistência, não somente as quinolonas, mas também a outros 
antimicrobianos, ocorre frente às moléculas disponíveis a mais tempo no mercado, decorrente 
do maior tempo de utilização do fármaco (SPRICIGO et al., 2012; TEUBER, 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
Figura 4: representação esquemática de um integron de classe 1.int = gene da integrase; attl = sítio de 
recombinação; gene cassette = sítio de inserção de novos cassettes contendo genes de resistência; deltaqacE = 
gene de resistência ao brometo de etídeo; sulI = gene de resistência a sulfonamida; orf5 = região sem função 
conhecida 
 
Fonte: adaptado de PLOY et al., 1998 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
3 JUSTIFICATIVA 
 
 As linguiças frescais são produtos que possuem grande aceitação pelo consumidor 
brasileiro devido ao seu baixo custo e boa qualidade sensorial, mas é um produto que pode 
agir como veiculador de patógenos como Salmonella spp. principalmente por não receber 
tratamento térmico durante sua elaboração. Além disso, existe uma deficiência de estudos 
relacionados à contaminação por Salmonella spp. nesta matriz alimentar. Levando-se em 
conta que a microbiologia convencional possui suas falhas, a adoção de técnicas modernas 
mais rápidas e sensíveis, como a PCR, pode ser de grande utilidade para o controle 
microbiológico e a manutenção da qualidade do produto. Observa-se que no Brasil, um estudo 
sobre a aplicação da PCR como técnica diagnóstica para Salmonella spp. é desconhecido. 
 Considerando todos os argumentos expostos, no presente trabalho se propôs a avaliar a 
contaminação de linguiças frescais suína e de frango comercializadas no Rio de Janeiro e em 
Niterói, os dois principais centros urbanos do estado do Rio de Janeiro. Além disso, foi 
realizada a avaliação da PCR para a detecção de Salmonella spp. nesta matriz. Por fim, a 
avaliação de alguns possíveis fatores de risco para a presença deste patógeno, como a origem 
da carne, o tipo de lingüiça e a manutenção da embalagem original ou sua troca nos locais de 
comercialização. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
4 OBJETIVOS 
 
4.1. Objetivo Geral 
 
 Avaliar a contaminação por Salmonella spp. de linguiças frescais, suína e de frango 
nas cidades do Rio de Janeiro e de Niterói. Proceder a identificação fenotípica do perfil de 
susceptibilidade dos possíveis isolados. 
 
4.2. Objetivos Específicos 
 
 Determinar o limite mínimo de detecção de Salmonella spp. da pela PCR em linguiças 
frescais. 
 Comparar o método de PCR com a microbiologia tradicional na detecção de 
Salmonella spp. nestas matrizes alimentares. 
 Avaliar a influência da manutenção da embalagem original da indústria (a vácuo) ou 
sua troca por uma própria do estabelecimento (em bandejas e cobertas por filmes plásticos) ou 
sua comercialização a granel na contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais. 
 Investigar se existe influência da espécie produtora de carne (suíno ou frango) na 
contaminação do produto final por Salmonella spp. 
 Avaliar a influencia do corte suíno sobre a contaminação por Salmonella spp. entre as 
linguiças suínas tipo toscana e de pernil. 
 Caracterização fenotípica do perfil de susceptibilidade dos isolados frente a 16 
antimicrobianos: ácido nalidíxico, amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, amicacina, 
cefalexina, ceftriaxona, ceftazidima, ciprofloxacina, cloranfenicol, doxiciclina, enrofloxacina, 
estreptomicina, levofloxacina, tetraciclina, sulfonamidas e sulfametoxazol + trimetoprim. 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
5 METODOLOGIA DA PESQUISA 
 
5.1 Microrganismos utilizados e meios de cultura 
 
 No presente estudo, para a realização da PCR e das análises microbiológicas, foi 
utilizada uma cepa de Salmonella Enteritidis (ATCC 13076) gentilmente cedida pelo Instituto 
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – FIOCRUZ. Para a análise microbiológica, 
foram utilizados os caldos Rappaport-Vassiliadis (RV), Tetrationato Hajna (TTH) e água 
peptonada tamponada (APT) (Himedia
®
). Para o preparo do caldo RV e da APT, estes eram 
pesados de acordo com a proporção indicada pelo fabricante (mg/L) (Himedia
®
), 
acondicionados em suas respectivas vidrarias e autoclavados a 121ºC/1atm/15min. O caldo 
TTH era hidratado de acordo com as instruções do fabricante (Himedia
®
), fervido em 
microondas até a completa dissolução do meio de cultura e acondicionado em alíquotas de 9 
mL em tubos de rosca esterilizados. Adicionalmente, para cada litro de TTH, era adicionado 
40 mL de solução de iodo iodenado. 
 Dois meios sólidos de cultura foram utilizados neste estudo: ágar Hektoen entérico e 
ágar Salmonella diferencial (Rambach). Ambos eram dissolvidos em água (mg/L) de acordo 
com as instruções do fabricante (Himedia
®
), fervidos em microondas até a completa 
dissolução do meio e envasados a quente em placas de Petri de 90 mm descartáveis dentro de 
fluxo laminar. 
 
5.2 Obtenção das amostras 
 
 Foram coletadas 80 amostras de linguiça frescal, 40 em Niterói e 40 no Rio de Janeiro, 
sendo 29 linguiças de carne de frango, 27 do tipo toscanas e 24 de pernil, em 22 diferentes 
hipermercados do município de Niterói e do Rio de Janeiro, RJ, entre novembro de 2011 a 
junho de 2012. No ato da compra, foi realizado o registro a respeito do tipo de embalagem do 
produto, original utilizada pela indústria ou fora da embalagem original, sendo esta última 
apresentada em outra embalagem ou livre (a granel) no balcão refrigerado, indicando 
manipulação do alimentono estabelecimento comercial. Após sua obtenção no comercio 
local, as amostras foram transportadas refrigeradas em caixa de poliestireno sob temperatura 
de refrigeração em um período máximo de duas horas para o Laboratório de Análises 
34 
 
Avançadas em Bioquímica e Biologia Molecular (LAABBM) no Instituto de Química da 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, onde foram imediatamente processadas. 
 
5.3 Extração do DNA 
 
 As alíquotas para a extração eram previamente centrifugadas a 21.950 g durante 10 
minutos. O sobrenadante era descartado e o precipitado resuspendido em 1 mL de solução de 
NaCl 0,9%, seguido de nova etapa de centrifugação sob as mesmas condições, caracterizando 
a etapa de lavagem do precipitado. Na extração realizada a partir do caldo tetrationato, 
previamente a etapa de lavagem era realizada uma centrifugação a 21.950 g para a 
precipitação do carbonato de cálcio naturalmente presente nesse meio, de modo a prevenir o 
entupimento das membranas do kit de extração. O sobrenadante era então repassado para 
novo microtubo de centrífuga, e centrifugado a 21.950 g durante 10 minutos. O precipitado 
obtido era utilizado para a etapa de lavagem. 
 Terminada a ultima etapa de centrifugação, o precipitado era utilizado para a extração 
do DNA, realizado com o kit Dneasy Blood & Tissue (Qiagen
®
, Hilden, Germany). O DNA 
total foi quantificado por fluorescência utilizando o QuBit dsDNA HS Assay (Life 
Technologies
®
, Carlsbad, USA). 
 
5.4 Condições e parâmetros da PCR 
 
 Para a reação da PCR, foram utilizados como iniciadores os primers (Invitrogen
®
 
Carlsbad, USA) InvA1 (5´ CCT GAT CGC ACT GAA TAT CGT ACT G 3´) e InvA2 (5´ 
GAC CAT CAC CAA TGG TCA GCA GG 3´), conforme descritos por Kapley et al. (2000), 
para a amplificação do gene InvA. Foram utilizados 0.25 μM (Invitrogen
®)
 de cada um dos 
iniciadores, 2,5mM de cloreto de magnésio, 200 mM de cada dinucleotídeo, 2.5 U de 
Platinum Taq (Invitrogen
®
 Carlsbad, USA), 5 μL de tampão 10x e 100 ng de DNA genômico 
total em um volume final de reação de 50 μL. 
 A amplificação foi realizada em termociclador MyCycler Thermal Cycler (Bio Rad
®
), 
em um total de 40 ciclos, precedido de uma etapa inicial de desnaturação a 94ºC durante 30 
segundos, seguido do anelamento a 60ºC durante 30 seg. e extensão a 72ºC durante 2 minutos, 
seguido de uma etapa de extensão final de 72ºC/7 min. Os amplicons gerados eram 
visualizados em fotodocumentador (BioAmerica
®
 Califórnia, USA) após corrida 
35 
 
eletroforética em gel de agarose a 2% (100V, 200 mA por 80 minutos) corado com GelRed 
(Biotium
®
, Califórnia, USA). 
 
5.5 Determinação do limite de detecção de Salmonella spp. por PCR em caldo de cultivo 
 
 De modo a se estabelecer o número mínimo de células que a PCR seria capaz de 
detectar, foram realizados ensaios experimentais com a cepa de Salmonella Enteritidis ATCC 
13076 primeiramente em caldo BHI, e posteriormente com linguiças frescais artificialmente 
contaminadas (FIGURA 5). 
 Após a reativação da cepa ATCC 13076, 200 μL do caldo de cultivo eram diluídos em 
800 μL de solução salina 0,9%, e esta solução final de 1 mL era utilizada para a quantificação 
do número de células em suspensão. Este procedimento era realizado em espectrofotômetro 
SmartPec Plus (Bio Rad
®
) pela absorbância no comprimento de onda de 600 nm. O resultado 
obtido era multiplicado pelo fator de diluição (cinco) para a obtenção do valor final, 
geralmente em torno de 10
8
 UFC/mL. 
 Sabendo-se o número aproximado de células/mL, era realizada em seguida uma 
diluição seriada mediante a adição de 100 μL do caldo em 900 μL de solução salina a 0,9%, 
em microtubos de centrífuga, formando uma solução contendo 10
7
 UFC/mL. A solução era 
então homogeneizada em um agitador de soluções tipo vortex (Phoenix Luferco
®
), e 100 μL 
desta era adicionada em novo microtubo contendo 900 μL de solução salina 0,9%, 
estabelecendo uma solução a 10
6
 UFC/mL. Após agitação, o procedimento era repetido, até a 
obtenção de soluções contendo 1 UFC/mL. Os microtubos contendo essas diluições eram 
agitados e utilizados para a extração do DNA, conforme já descrito, com exceção da primeira 
etapa de lavagem que não era realizada. Após a extração, o DNA obtido era quantificado e 
utilizado para a PCR. 
 
5.6 Contaminação artificial das linguiças 
 
 Para este experimento, uma amostra de lingüiça frescal suína congelada e embalada a 
vácuo foi obtida em um estabelecimento comercial, e submetida a cultura microbiológica para 
averiguação de possível contaminação prévia por Salmonella spp. A amostra obtida foi 
mantida congelada até a confirmação do resultado negativo. 
 
36 
 
Figura 5: representação esquemática dos protocolos utilizados para a determinação do limite de detecção da 
PCR. 1 – Limite de detecção em caldo; 2 – Limite de detecção em linguiças contaminadas artificialmente 
submetidas ao pré-enriquecimento e enriquecimento seletivo 
 
 Para a contaminação artificial, 25g de lingüiça frescal foram obtidos com tesoura 
cirúrgica romba/romba previamente esterilizada e colocados em sacos de homogeneização 
(Interscience
®
) junto a 225 mL de água peptonada tamponada (APT). Em seguida, 1 mL de 
caldo BHI previamente crescido contendo 10
8
 UFC/mL era inoculado a amostra em 
37 
 
suspensão, constituindo na amostra uma contagem total de 10
6
 UFC/mL. Para a obtenção de 
alimentos contaminados artificialmente com menores contagens da cepa de referência, 
diluições contendo 10
7
, 10
6
, 10
5
, 10
4
, 10
3
, 10
2
 e 10
1 
UFC/mL eram preparadas conforme 
descrito anteriormente, e inoculadas em 25 g de lingüiça junto a 225 mL de APT, constituindo 
desta forma amostras contendo 10
7
, 10
6
, 10
5
, 10
4
, 10
3
, 10
2
, 10 UFC / 25 g. Após a obtenção 
destas soluções, 1 mL era obtido e utilizado para a extração do DNA de acordo com os 
procedimentos já descritos. Posteriormente, o DNA extraído era utilizado para a PCR. 
 Foi realizado também o teste do limite de detecção da PCR associado aos caldos de 
enriquecimento seletivo RV e TTH. Primeiramente, foram obtidas suspensões de 25g de 
lingüiça com 225 mL contendo 10
7
, 10
6
, 10
5
, 10
4
, 10
3
,
 
10
2
, 10 e 1 UFC / 25g. Os sacos de 
homogeneização eram então encubados a 37ºC durante 24h. Decorrido este tempo, 1 mL e 
100 μL de cada saco eram repassados para tubos contendo 9 mL de caldo TTH e 9,9 mL de 
caldo RV, respectivamente. O primeiro era incubado a 37 ºC durante 24h, enquanto o segundo 
era incubado a 42ºC durante 24h. Decorrido este período, alíquotas de 1 mL de ambos os 
caldos eram retiradas e utilizadas para a extração do DNA. O DNA obtido era utilizado para a 
reação em cadeia da polimerase. 
 
5.7 Análise bacteriológica 
 
 A partir de cada amostra, 25g foram coletadas de forma asséptica de diferentes pontos 
do alimento dentro de fluxo laminar e com material previamente esterilizado ou descartável. 
A alíquota retirada era colocada em um saco de homogeneização (Interscience
®
) junto a 225 
mL de água peptonada tamponada. Os sacos eram homogeneizados em stomacher (Seward 
Stomacher 400 circulator
®
) por 2 minutos a 230 RPM. Após processados, os alimentos eram 
incubados a 37ºC durante 24 horas com posterior retirada de alíquotas de 1 mL e 100 μL 
passa repasse em 9 mL do caldo TTH e 9,9 mL do caldo RV, respectivamente. O caldo TTH 
era incubado a 37ºC durante 24h, enquanto o caldo RV era incubado a 42ºC por 24h. 
 Após o período de incubação, alíquotas dos dois caldos eram semeadas com alças 
bacteriológicas descartáveis em agar Hektoen entérico e agar Salmonella diferencial 
(Himedia
®
). Nesta etapa ainda, alíquotas de 1 mL de caldo TTH e RV eram obtidas e 
separadas para a extração de DNA. Decorrido novo período de incubação de 24h, as placas 
eram analisadas, e entre 3 a 5 colônias com características suspeitas eram repicadas para o 
agar Triple Sugar Iron(TSI) individualmente, seguido de nova incubação a 37ºC durante 24h. 
As colônias em TSI que apresentavam características bioquímicas compatíveis com 
38 
 
Salmonella spp. eram selecionadas, e as colônias inoculadas em tubos contendo agar 
fenilalanina e caldo uréia, seguido de nova incubação a 37ºC por 24h. A ausência de produção 
de uréase e a não desaminação da fenilalanina caracterizava uma suspeita, cuja colônia era 
enriquecida em ágar triptona de soja (TSA) por 24h a 37ºC para ser submetida a prova da 
soroaglutinação, realizada com soro anti-Salmonella polivalente somático (PROBAC
®
, São 
Paulo, Brazil) (FIGURA 6). Colônias positivas nesta prova eram consideradas como 
pertencentes ao gênero Salmonella. 
 
5.8 Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos 
 
 As cepas isoladas nos meios seletivos de Salmonella foram mantidas congeladas em 
BHI com 20% de glicerol em freezer a -80ºC até momento de uso. Os microtubos contendo os 
isolados eram descongelados em gelo durante 20 minutos, e uma alíquota de 100 μL era 
inoculado em 10 mL de caldo BHI e incubado a 37ºC durante 24h. O caldo BHI contendo as 
células microbianas cultivadas era transferido para solução salina 0,9%, de forma que a 
turvação obtida fosse igual a graduação 0.5 da escala nefelométrica de McFarland, 
correspondente a uma densidade celular de 1,5 x 10
8
 UFC/mL. Após ajuste da concentração 
microbiana da suspensão, esta era plaqueada em ágar Mueller-Hinton. Este era preparado 
especialmente para este teste, tendo sido utilizadas placas de Petri descartáveis de 150 mm. A 
espessura do ágar era de 4 a 5 mm para garantir a perfeita difusão dos antimicrobianos. 
 Após o plaqueamento do cultivo, os discos de antimicrobianos (Sensifar
®
) eram 
colocados com auxilio de uma pinça anatômica previamente esterilizada sobre o ágar. Os 
discos foram posicionados da seguinte forma: um disco central e sete ao redor em um total de 
oito discos por placa (FIGURA 7). Foram testados 16 diferentes antimicrobianos: ácido 
nalidíxico, amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, amicacina, cefalexina, ceftriaxona, 
ceftazidima, ciprofloxacina, cloranfenicol, doxiciclina, enrofloxacina, estreptomicina, 
levofloxacina, tetraciclina, sulfonamidas e sulfametoxazol + trimetoprim. As placas foram 
incubadas a 37ºC durante 24h e então era realizada a leitura dos halos com um halômetro. Os 
valores obtidos eram anotados para posterior comparação com os valores preconizados pelo 
Clinical and Laboratory Standarts Institute. 
 
 
 
 
39 
 
 
 
 
 
5.9 Análise estatística 
 
 Para a análise dos resultados obtidos quanto a sua significância estatística, foi 
realizado o teste de MacNemar para a comparação entre a PCR e a microbiologia 
convencional, e o teste exato de Fisher para a comparação entre as outras variáveis estudadas. 
A concordância entre ambas as técnicas e os dois caldos utilizados foi determinada pela 
análise de concordância kappa. O programa estatístico utilizado foi o XLSTAT 2012. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6: Prova da soroaglutinação 
macroscópica para a confirmação dos isolados 
de Salmonella spp. realizado com antigeno 
polivalente somático anti-Salmonella. 
Figura 7: Teste de susceptibilidade aos 
antimicrobianos pelo método de difusão em disco 
de Kirby-Bauer em agar Mueller-Hinton. 
40 
 
6 RESULTADOS 
 
6.1. Determinação do limite de detecção da PCR 
 
 O teste de limite mínimo de detecção da PCR a partir do DNA genômico obtido da 
linhagem (ATCC 13076) de referência foi de 1 UFC/mL. No entanto, a partir de linguiças 
frescais contaminadas experimentalmente, o limite mínimo de detecção foi de 10
5
 UFC/25g 
(FIGURA 8). Com a realização da etapa de pré-enriquecimento e de enriquecimento seletivo, 
o limite mínimo de detecção foi reduzido e a PCR foi capaz de detectar amostras com 
contaminações iniciais de até 1 UFC/25 g (FIGURA 9). 
 
6.2. Detecção de Salmonella nas amostras de linguiças frescais analisadas 
 
80 amostras de linguiças frescais coletadas em Niterói e no Rio de Janeiro foram 
analisadas por microbiologia tradicional e por PCR para a detecção de Salmonella sp 
(FIGURA 10). Foi encontrada uma prevalência de 26% (21/80) de linguiças frescais 
contaminadas (TABELA 2, TABELA 3 e TABELA 4). 8 das amostras contaminadas (10%) 
foram coletadas em Niterói e 13 no Rio de Janeiro (16%), não havendo diferença significante 
entre as duas cidades (p>0,05). Dentre as 21 amostras contaminadas, 5 foram detectadas 
somente pela análise microbiológica (TABELA 3), 13 por PCR (TABELA 4) e 3 por ambas 
as técnicas (κ
 
= 0,164, p>0,05). Nas tabelas 5, 6 e 7, encontram-se discriminadas as amostras 
detectadas como contaminadas ou livres de Salmonella spp. na PCR e na microbiologia 
convencional. De acordo com o teste de MacNemar, o total de amostras contaminadas 
detectadas por PCR (16) foi significativamente superior ao total de amostras (8) detectadas 
pela microbiologia convencional (Q = 3,556, p<0,05). 
 A combinação da PCR com o cultivo no meio RV ou TTH foi igualmente eficiente, 
com 13 amostras contaminadas detectadas no RV-PCR e 11 no TTH-PCR (p>0,05). O teste 
kappa para os dois caldos foi 0,608. O plaqueamento em ágar Salmonella diferencial permitiu 
mais eficiência na detecção do patógeno (p<0,05) com 8 amostras contaminadas detectadas 
(10%), enquanto que o ágar Hektoen entérico detectou Salmonella spp. em 01 amostra 
(1,2%). Em relação à combinação dos caldos de cultura utilizados em combinação com o agar 
Salmonella diferencial, não houve diferença entre os caldos RV e TTH, com 6 (7,5%) 
41 
 
amostras positivas no primeiro e 4 (5%) no segundo (p>0,05). A única amostra contaminada 
detectada pelo Hektoen entérico ocorreu quanto este foi associado com o caldo RV. 
 
Figura 8: Avaliação da detecção de Salmonella spp. em linguiças artificialmente contaminadas. Os fragmentos 
foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2% (100 V, 200 mA por 80 min.) corado com GelRed. 
Linha 1: Marcador de peso molecular de 100pb; Linha 2: controle positivo (DNA de Salmonella Enteritidis 
ATCC 13076); Linha 3: controle negativo (PCR sem DNA molde); Linha 4: diluição contendo 10
5
 UFC/mL; 
Linha 5: diluição contendo 10
4
 UFC/mL; Linha 6: diluição contendo 10
3
 UFC/mL; Linha 7: diluição contendo 
10
2
 UFC/mL; Linha 8: diluição contendo 10 UFC/mL; Linha 9: diluição contendo 1 UFC/mL. Obs: a análise das 
outras amostras foram incluídas no anexo. 
 
 
 
Figura 9: Amplificação de fragmento de 598 pb do gene invA, exclusivo de Salmonella spp., em linguiças 
contaminadas artificialmente e submetidas as etapas de pré-enriquecimento primário e enriquecimento seletivo. 
Linha 1: marcador de peso molecular de 100pb; Linha 2: controle positivo; Linha 3: branco; Linhas 4: 10
5
 
UFC/mL; Linha 5: 10
4
 UFC/mL; Linha 6: 10
3
 UFC/mL; Linha 7: 10
2
 UFC/mL; Linha 8: 10 UFC/mL; Linha 9: 1 
UFC/mL. 
 
 
 
 
 
42 
 
Figura 10: Contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais coletadas em Niterói e no Rio de Janeiro. A 
PCR em combinação com os caldos RV e TTH foi realizada com primers específicos para o gene InvA. Os 
amplicons foram submetidos analisados por eletroforese em gel de agarose 2% (100 V, 200 mA por 80 min.) 
corado com GelRed. Linha 1: Marcador de tamanho de fragmento de 100 pb; Linha 2: controle positivo (DNA 
de Salmonella Enteritidis ATCC 13076) Linha 3: controle negativo (PCR sem DNA molde); Linha 4 e 5: 
amostra 13, não contaminada; Linha 6 e 7: amostra 32, contaminada, detectada pela PCR em associação com o 
caldo RV e TTH; Linha 8 e 9: amostra 45, contaminada detectada pelo PCR em associação ao caldo RV e não 
detectada pela associação com o caldo TTH. A seta na direita indica o fragmento de 598 pb, específico de 
Salmonella spp. 
 
 
Tabela 2: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais suína e de frango por 
microbiologia convencional epor PCR associada ao enriquecimento seletivo em RV e TTH. 
Composição 
da linguiça 
Amostras 
(contaminadas/total) 
Embalagem 
(contaminadas/total) 
Origem 
(contaminadas/total) 
Original 
Bandeja + 
filme plástico 
A 
granel 
Niterói 
Rio de 
Janeiro 
Frango 6/29 0/4 4/17 2/8 3/16 3/13 
Pernil 5/24 3/7 1/12 1/5 2/10 3/14 
Toscana 10/27 1/6 6/12 3/9 3/15 7/12 
Total 21/80 4/17 11/41 6/22 8/41 13/39 
 
 
Tabela 3: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais suína e de frango por 
microbiologia convencional. 
Composição 
da linguiça 
Amostras 
(contaminadas/total) 
Embalagem 
(contaminadas/total) 
Origem 
(contaminadas/total) 
Original 
Bandeja + 
filme plástico 
A 
granel 
Niterói 
Rio de 
Janeiro 
Frango 3/29 0/4 1/17 2/8 2/16 1/13 
Pernil 4/24 2/7 1/12 1/5 1/10 2/14 
Toscana 1/27 0/6 1/12 0/9 0/15 1/12 
Total 8/80 2/17 3/41 3/22 8/41 13/39 
 
43 
 
Tabela 4: Avaliação da contaminação por Salmonella spp. em linguiças frescais suína e de frango pela PCR. 
Composição 
da linguiça 
Amostras 
(contaminadas/total) 
Embalagem 
(contaminadas/total) 
Origem 
(contaminadas/total) 
Original 
Bandeja + 
filme plástico 
A 
granel 
Niterói 
Rio de 
Janeiro 
Frango 5/29 0/4 3/17 2/8 3/16 6/13 
Pernil 2/24 2/7 0/12 0/5 1/10 1/14 
Toscana 9/27 1/6 5/12 3/9 3/15 6/12 
Total 16/80 3/17 8/41 5/22 7/41 13/39 
 
 
6.3. Influência da embalagem na contaminação de linguiças frescais por Salmonella spp. 
nas amostras obtidas 
 
 Considerando o tipo de embalagem das linguiças nos estabelecimentos comerciais 
(TABELA 2), 17/80 (21%) linguiças encontravam-se em sua embalagem original realizada na 
indústria, enquanto 63/80 (79%) não apresentavam sua embalagem original, sendo que 41/63 
(65%) produtos estavam disponíveis para a compra em bandeja e filme plástico próprio do 
estabelecimento e 22/63 (35%) amostras estavam soltas (a granel) no balcão refrigerador. Das 
amostras em embalagem original 4/17 (23%) foram positivas, enquanto das que não estavam 
em sua embalagem original, 17/63 (27%) foram detectadas com o patógeno, sendo esta 
diferença não significante (p>0,05). Entre os alimentos fora de sua embalagem original, 
também não houve diferença quanto à presença de Salmonella spp. em linguiças mantidas em 
bandejas, com 11/17 (65%) amostras positivas encontrando-se em bandejas com filmes 
plásticos e 6/17 (35%) das amostras contaminadas a granel (p>0,05). 
 
6.4. Ocorrência de amostras contaminadas de acordo com a composição da linguiça 
 
 Não houve diferença significante quanto a composição das amostras estudadas 
(TABELA 2). Do total de 29 linguiças de frango, 6 (20%) estavam contaminadas com o 
patógeno, enquanto 15 (29%) de 51 amostras de carne suína estavam contaminadas (p>0,05). 
Realizando-se uma análise mais detalhada das linguiças suínas, 10/27 (37%) do tipo toscana e 
5/24 (20,8%) de pernil foram confirmadas como contaminadas, caracterizando uma diferença 
não significativa (p>0,05). 
 
 
44 
 
Tabela 5: Análise das amostras de número 1 a 30 contaminadas e não contaminadas com 
Salmonella spp. 
Amostra Composição 
Métodos 
PCR - RV PCR - TT 
Cultura - 
RV/Ra 
Cultura - 
TT/Ra 
Cultura - 
RV/H 
Cultura - 
TT/H 
1 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
2 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
3 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
4 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
5 Toscana Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo 
6 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
7 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
8 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
9 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
10 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
11 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
12 Frango Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo 
13 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
14 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
15 Toscana Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo 
16 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
17 Frango Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo 
18 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
19 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
20 Toscana Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo 
21 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
22 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
23 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
24 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
25 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
26 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
27 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
28 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
29 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
30 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
PCR-RV: enriquecimento seletivo em caldo Rappaport-Vassiliadis seguido por PCR; PCR-TT: enriquecimento 
seletivo em caldo Tetrationato Hajna seguido por PCR; Cultura RV-Ra; associação do caldo Rappaport-
Vassiliadis com o Agar Rambach; Cultura TT-Ra: associação do caldo tetrationato Hajna com o Agar Rambach; 
Cultura RV-H: associação do caldo Rappaport-Vassiliadis com o Agar Hektoen Entérico; Cultura TT-H: : 
associação do caldo tetrationato Hajna com o Agar Hektoen entérico 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
45 
 
Tabela 6: Análise das amostras de número 31 a 60 contaminadas e não contaminadas com 
Salmonella spp. 
Amostra Composição 
Métodos 
PCR - RV PCR - TT 
Cultura - 
RV/Ra 
Cultura - 
TT/Ra 
Cultura - 
RV/H 
Cultura - 
TT/H 
31 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
32 Toscana Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo 
33 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
34 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
35 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
36 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
37 Frango Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo 
38 Pernil Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo 
39 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
40 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
41 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
42 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
43 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
44 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
45 Toscana Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
46 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
47 Toscana Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
48 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
49 Pernil Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo 
50 Pernil Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo 
51 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
52 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
53 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
54 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
55 Frango Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
56 Toscana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
57 Pernil Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo 
58 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
59 Toscana Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo 
60 Pernil Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 
PCR-RV: enriquecimento