Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Programa de Pós-Graduação EAD UNIASSELVI-PÓS Autoria: Profa. Dra. Marcela Stefanini Ferreira Tsuboy CENTRO UNIVERSITÁRIO LEONARDO DA VINCI Rodovia BR 470, Km 71, no 1.040, Bairro Benedito Cx. P. 191 - 89.130-000 – INDAIAL/SC Fone Fax: (47) 3281-9000/3281-9090 Reitor: Prof. Hermínio Kloch Diretor UNIASSELVI-PÓS: Prof. Carlos Fabiano Fistarol Equipe Multidisciplinar da Pós-Graduação EAD: Carlos Fabiano Fistarol Ilana Gunilda Gerber Cavichioli Jóice Gadotti Consatti Norberto Siegel Camila Roczanski Julia dos Santos Ariana Monique Dalri Marcelo Bucci Revisão Gramatical: Equipe Produção de Materiais Diagramação e Capa: Centro Universitário Leonardo da Vinci – UNIASSELVI Copyright © UNIASSELVI 2019 Ficha catalográfica elaborada na fonte pela Biblioteca Dante Alighieri UNIASSELVI – Indaial. T882g Tsuboy, Marcela Stefanini Ferreira Genética e biologia molecular forense. / Marcela Stefanini Fer- reira Tsuboy. – Indaial: UNIASSELVI, 2019. XXX p.; il. ISBN 978-85-7141-323-8 1. Genética forense. - Brasil. II. Centro Universitário Leonardo Da Vinci. CDD 614.1 Impresso por: Sumário APRESENTAÇÃO ............................................................................5 CAPÍTULO 1 Introdução À Genética E Biologia Molecular Forense ..........7 CAPÍTULO 2 Introdução À Genética E Biologia Molecular Forense ........47 CAPÍTULO 3 Introdução À Genética E Biologia Molecular Forense ........85 APRESENTAÇÃO Prezado aluno, este livro apresenta o conteúdo a ser estudado na disciplina Genética e Biologia Molecular Forense, do seu curso de Investigação Forense e Perícia Criminal. A Genética e Biologia Molecular Forense é a Ciência que usa as ferramentas genéticas nas perícias criminais. É usada principalmente para identificar pessoas desaparecidas, inocentar ou comprovar a autoria de um determinado crime, mas também pode ser utilizada no combate à biopirataria. No Capítulo 1 você terá a oportunidade de relembrar os conceitos importantes da Genética e Biologia Molecular, para que possa entender as técnicas envolvidas na identificação por DNA dos indivíduos. Em seguida, você estudará sobre os vestígios biológicos. Os vestígios biológicos são materiais de origem biológica (sangue, sêmen, pelos etc.) coletados do local do crime para posterior análise genética dos envolvidos na investigação do crime e, vai ajudar a estabelecer, por exemplo, quantas pessoas estavam naquele local e quem eram elas. É importante você notar que há procedimentos operacionais padrões para a coleta e documentação destes vestígios, para que eles tenham sua integridade física mantida e para que seja respeitada a cadeia de custódia. No terceiro e último capítulo, você vai relembrar a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizada para a amplificação e análise do DNA das amostras biológicas, e estudará sobre os marcadores moleculares utilizados para a identificação dos indivíduos. Você perceberá que quando se trabalha com Biologia Molecular todo cuidado é pouco, começando pelo ambiente onde será realizado o experimento de PCR. É necessário um pessoal muito bem treinado para que a amostra não seja contaminada e para que não ocorram resultados falsos, uma vez que estes serão determinantes na investigação criminal. Neste capítulo você também estudará sobre os Bancos de Dados e perfis de DNA que foram criados a partir do grande volume de informação gerado depois que a Genética e a Biologia Molecular foram incorporadas na rotina de investigação dos crimes. Você verá, também, que o Reino Unido e os Estados Unidos foram pioneiros na criação destes bancos e conhecer como é a situação do Brasil. Será que existe um banco de dados assim aqui também? Com todas essas informações, creio que você, caro aluno, terminará essa disciplina pronto para discutir os aspectos envolvidos na Genética Forense e estimar sua aplicabilidade no cotidiano da investigação criminal. Com certeza a compreensão e o uso destas ferramentas te ajudarão a estabelecer, de maneira cada vez mais eficaz, a conexão autor-local do crime-vítima. Bons estudos! Profa. Dra. Marcela Stefanini Ferreira Tsuboy CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE A partir da perspectiva do saber-fazer, neste capítulo você terá os seguintes objetivos de aprendizagem: Compreender conceitos-chave da Genética e Biologia Molecular para entendimento das técnicas utilizadas na identifi cação por DNA. Discutir os conceitos da Genética e Biologia Molecular envolvidos na identifi cação por DNA. Avaliar as situações onde a identifi cação genética pode ser aplicada. 8 Genética e Biologia Molecular Forense 9 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 1 CONTEXTUALIZAÇÃO Imagine a seguinte situação: depois de uma semana exaustiva de trabalho e estudo, você, caro aluno, está descansando assistindo a um seriado na sua plataforma de streaming favorita. O ilustre personagem desta série, Dr. Hannibal Lecter, é abordado por um agente do FBI durante um de seus famosos e elegantes jantares. O agente, já desconfi ado de Lecter, pede ao mesmo para levar um pouco da comida que está sendo servida no jantar, com a desculpa de que tem outro compromisso, mas que mesmo assim gostaria de provar as delícias servidas ali. A verdade é que, o agente do FBI está desconfi ado de que Lecter serve carne humana em seus jantares. Pois bem, você deve estar se perguntando, tirando o fato de que a série é um suspense policial, o quê isso tem a ver com nosso curso? E com Genética? A resposta, caro aluno, é que tem tudo a ver! Você tem ideia de como o agente do FBI vai comprovar se aquelas amostras de carne têm origem humana? Se você respondeu: “utilizando as ferramentas da Genética”, você está certo! Você sabe exatamente como isso é feito? É disso que se trata nosso estudo. É claro, essa situação tirada do seriado é só um exemplo de como a Genética Forense pode ajudar a desvendar crimes. Ao longo dos capítulos estudaremos situações reais e entenderemos como, afi nal, a Genética consegue esclarecer crimes e identifi car autoria. Para começar, neste capítulo, precisamos relembrar defi nições básicas da Genética e Biologia Molecular. Sem entender estes fundamentos, a compreensão de como a identifi cação por DNA funciona fi cará comprometida. Por isso, vamos estudar a estrutura do DNA e do genoma, as leis da hereditariedade, os polimorfi smos genéticos e o DNA mitocondrial. Ainda, conheceremos o projeto Genoma Humano e o que ele proporcionou à sociedade. A partir do entendimento destes conceitos, poderemos avaliar o potencial das ferramentas da Genética e Biologia Molecular na área forense. 10 Genética e Biologia Molecular Forense 2 FUNDAMENTOS BÁSICOS DE GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR Nesta seção, vamos relembrar alguns conceitos de Genética e Biologia Molecular importantes para a compreensão da análise forense por DNA. Abordaremos tópicos como a estrutura do DNA e do genoma e quais regiões do DNA permitem traçar o perfi l genético que identifi ca uma pessoa. 2.1 ESTRUTURA DO DNA E DO GENOMA Popularmente, o DNA tem sido chamado de o “código de barras da vida”. De fato, apesar da molécula de DNA ser construída com os mesmos componentes, cada pessoa ou organismo vai gerar um “código de barras” ou um perfi l diferente ao ser analisado em nível molecular. O DNA, ou ácido desoxirribonucleico, é formado por duas longas cadeias de nucleotídeos, retorcidas em forma de dupla hélice. Os nucleotídeos são formados por três elementos: o grupo fosfato (-PO4), um açúcar (chamado desoxirribose) e uma base nitrogenada. A base nitrogenada pode ser adenina (A), guanina (G), citosina (C) ou timina (T) e consistem nas “famosas letras” do DNA (A, G, C, T) (Figuras 1 e 2). FIGURA 1 – OS NUCLEOTÍDEOS SÃO OS “BLOCOS DE CONSTRUÇÃO”DA MOLÉCULA DE DNA FONTE: Griffi ths et al. (2009) 11 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 Nucleotídeos que formam a molécula de DNA. Repare os três elementos: o grupo fosfato (-PO4), a desoxirribose e uma das bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina ou guanina). FIGURA 2 – A DUPLA HÉLICE: SENTIDO 5’3’ E LIGAÇÕES QUÍMICAS FONTE: Champe, Harvey e Ferrier (2006) 12 Genética e Biologia Molecular Forense Ligação fosfodiéster e sentido 5’3’ da molécula de DNA (a). Duas cadeias de nucleotídeos ligadas por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas (b). Agora imagine que essas cadeias têm bilhões de nucleotídeos e elas se retorcem para formar a característica dupla hélice de DNA (c). Na Figura 2 ainda podemos observar como é construída essa cadeia de nucleotídeos. Cada nucleotídeo se liga entre si através das ligações fosfodiéster, o que resulta no sentido 5’3’ da molécula de DNA: O grupo hidroxil (-OH) ligado ao carbono 3 da desoxirribose de um nucleotídeo forma uma ligação fosfodiéster com o fosfato do outro nucleotídeo que está ligado ao carbono 5 da desoxirribose. Portanto, cada fi lamento do DNA está disposto de maneira antiparalela, ou seja, um fi lamento em sentido 5’3’ e outro em sentido 3’5’. Cada um dos fi lamentos da molécula de DNA é mantido por meio de interações chamadas pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas. As bases nitrogenadas, por sua vez, interagem de acordo com uma regra chamada complementariedade, ou seja, adenina se pareia com timina (A.T) e citosina se pareia com guanina (C.G). O pareamento de adenina e timina se dá por meio de duas pontes de hidrogênio e, o pareamento de citosina com guanina, por meio de três. Estas propriedades do DNA são importantes para o processo de replicação e, portanto, de transmissão dos genes. Você sabia que a descoberta da dupla hélice de DNA rendeu o prêmio Nobel aos pesquisadores que a publicaram? Foi em 1962 e foram reconhecidos por tal descoberta, o geneticista americano James Watson e o físico inglês Francis Crick. E você já ouviu falar sobre Rosalind Franklin? Os experimentos dela foram cruciais para essa descoberta. Foi ela quem conseguiu a imagem de difração de raios-X do DNA, que sugeria a estrutura em hélice e que foi determinante para o modelo proposto por Watson e Crick. (a) (b) 13 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 Fotos de James Watson e Francis Crick com seu modelo de DNA (a) e de Rosalind Franklin (b). FONTE: <http://www.nature.com/scitable/content/ne0000/ne0000/ ne0000/ne0000/6537318/Rosalind_Franklin_SMALL_1.jpg>. Acesso em: 23 out. 2018. Se você quer saber mais sobre a história da descoberta da estrutura do DNA, leia o livro A Dupla Hélice, escrito por James Watson. Ele conta de maneira bem direta e às vezes irônica, como nasceu a ideia sobre a estrutura helicoidal do DNA. No livro fi ca claro o papel de Rosalind Franklin naquele momento revolucionário da Ciência e, você vai ver que por trás da fama há uma verdadeira história de rivalidade e ambição. O DNA é a molécula que armazena e transfere a informação genética através das gerações e, essa função torna possível o trabalho realizado pela Genética Forense na identifi cação dos indivíduos e na determinação de parentesco, por exemplo. Foram os trabalhos do biólogo austríaco Gregor Mendel, com ervilhas, que estabeleceram as bases para as leis da hereditariedade. A Primeira Lei de Mendel pode ser enunciada da seguinte maneira: “cada caráter é determinado por fatores que se separam na formação dos gametas, indo um fator do par para cada gameta”. O que Mendel chamou de fator, mais tarde foi chamado de gene. O gene pode ser defi nido como um segmento de DNA composto por uma região transcrita e uma sequência reguladora necessária à produção de um produto funcional. Em outras palavras, o gene é uma sequência do DNA que codifi ca e regula a síntese de proteínas. Podemos ver pela Figura 3 que o gene eucarioto (como os de humanos) possui regiões denominadas íntrons e regiões denominadas éxons, além de regiões que regulam o início e o fi m da transcrição, ou seja, formação do RNA mensageiro que, posteriormente, será traduzido em proteína. 14 Genética e Biologia Molecular Forense FIGURA 3 – REPRESENTAÇÃO DO GENE FONTE: <https://bit.ly/2DcFjvP>. Acesso em: 21 out. 2018. Estrutura do gene eucarioto: possui regiões que expressam RNA mensageiro, que formarão proteínas (éxons), regiões não codifi cantes de proteínas (íntrons) e regiões de regulação de início e fi m da expressão gênica. Com os experimentos realizados, Mendel observou que havia um fator (gene) que era expresso de maneira dominante e um que era latente (recessivo). As formas desse fator (gene) foram, posteriormente, chamadas de alelos. A primeira lei de Mendel nos diz também que um indivíduo é homozigoto quando este possui um par de alelos idênticos ou é heterozigoto quando possui um par de alelos diferentes (Figura 4). FIGURA 4 – ALELOS, INDIVÍDUOS HOMOZIGOTOS E HETEROZIGOTOS FONTE: Adaptado de Passarge (2001) Diferença entre homozigoto e heterozigoto. O indivíduo é homozigoto quando este possui um par de alelos idênticos (neste caso, AA ou aa) ou é heterozigoto quando possui um par de alelos diferentes (neste caso Aa). “A” representa um gene que possui duas formas: “A” e “a”. A Segunda Lei de Mendel surgiu a partir dos estudos de Mendel com as ervilhas que diferiam em duas características e é conhecida como a lei da distribuição independente: os alelos de genes diferentes se distribuem de 15 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 maneira independente uns dos outros. Ou seja, se dois ou mais eventos são independentes, a chance que ocorram ao mesmo tempo vai ser defi nida pelo produto de suas probabilidades separadas. Esta regra é conhecida como “regra do produto ou regra da multiplicação” e é importante, por exemplo, para analisar se há vínculo genético familiar, de acordo com a estatística (NRC, 1992 apud BONACCORSO, 2005, p. 32). O DNA está contido no núcleo das células eucariotas, como as dos humanos, de maneira difusa, porém quando ocorre o processo de divisão celular (mitose ou meiose) o DNA se condensa em seu maior nível de compactação, que conhecemos como cromossomos. É na meiose que ocorre a formação dos gametas e que os genes vão se segregar de acordo com as leis de Mendel, ou seja, de maneira independente. No caso dos humanos, temos 46 cromossomos, sendo que 23 deles são de origem materna e os outros 23 de origem paterna (Figuras 5 e 6). Durante o processo de compactação do DNA, ele se associa a proteínas chamadas histonas e pode ser chamado de cromatina. O termo eucromatina se refere a regiões do DNA que estão menos condensadas e o termo heterocromatina, à regiões que estão mais compactadas. FIGURA 5 – NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO DO ORGANISMO FONTE: Griffi ths et al. (2009) Do organismo ao DNA. Lembre-se que os cromossomos correspondem ao DNA em sua forma mais compactada, presente durante a divisão celular. 16 Genética e Biologia Molecular Forense FIGURA 6 –CARIÓTIPO HUMANO FONTE: Goodwin, Linacre e Hadi (2007) Cromossomos humanos. São 22 pares de cromossomos autossomos e 1 par de cromossomos sexuais (em destaque), ou seja, que determina o sexo do indivíduo. Nos homens, como neste caso, encontramos o cromossomo X e Y. Nas mulheres, temos dois cromossomos X. Além do DNA nuclear, existe o DNA mitocondrial (mtDNA), contido nas mitocôndrias e que possui forma circular (Figura 7). O DNA mitocondrial é de origem materna e é útil na investigação forense. Além de permitir traçar a linhagem materna e possuir várias cópias (100 a 10.000 cópias/célula), contém regiões de polimorfi smo que identifi cam uma pessoa, e é mais resistente à degradação que o DNA localizado no núcleo. Porisso é frequentemente usado em grandes desastres, como queda de aviões, explosões e incêndios. Pode ser usado o termo haplótipo para se referir ao mtDNA, porque ele possui somente a herança materna, ou seja, é haploide. Em 2016, cientistas descobriram que o mtDNA paterno é degradado por uma enzima chamada endonuclease G, que é liberada quando as mitocôndrias paternas perdem a integridade da sua membrana durante a fertilização. Além disso, também ocorrem autofagia e destruição de proteínas mitocondriais paternas por parte materna (ZHOU et al., 2016). 17 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 É importante lembrar que sempre houve um debate a cerca da origem exclusivamente materna do mtDNA. Um artigo recém-publicado mostrou que, nos indivíduos analisados, houve transmissão biparental do mtDNA, ou seja, receberam o mtDNA tanto da mãe quanto do pai. Os autores salientam que o dogma central da herança mitocondrial materna permanece válida, entretanto, deve-se ter em mente que, em casos excepcionais, o mtDNA paterno também pode ser passado aos fi lhos (LUO et al., 2018). Nos humanos, o mtDNA possui 16.569 pb e 37 genes. Apresenta-se como uma dupla fi ta circular, sendo que uma das fi tas é rica em guanina (fi ta pesada ou H-strand) e a outra fi ta é rica em citosina (fi ta leve ou L-strand). Dos 37 genes, 28 encontram-se na fi ta pesada e os outros 9 na fi ta leve. Os genes estão envolvidos na produção de energia, estoque de ATP e produção de RNA transportador e RNA ribossômico. A região chamada de D-loop é a que possui interesse para a identifi cação humana, pois é uma região de extrema variação que acumula muitas mutações. Trata-se de uma sequência de nucleotídeos que não codifi ca proteínas, porém controla a síntese de RNA e DNA. FIGURA 7 – O DNA MITOCONDRIAL FONTE: Chinery e Hudson (2013) 18 Genética e Biologia Molecular Forense Esquema representando o DNA mitocondrial. O mtDNA é uma molécula dupla e circular de DNA. O círculo de fora representa a cadeia pesada e o círculo de dentro a cadeia leve. O termo genoma pode ser defi nido de maneira bem simples, como “a coleção de todos os genes de um organismo” (GRIFFTHIS, 2009, p. 27). Outros dizem que o termo representa o total de genes presente no genoma haploide (ou seja, em uma das cópias do total de DNA). Cada espécie possui seu genoma único e a quantidade total do genoma haploide (valor C) também é espécie-específi ca. Era de se esperar que à medida que aumenta a complexidade dos seres vivos, o valor de C aumentaria. Isso é verifi cado em grande parte da natureza, entretanto, há espécies relacionadas que possuem genoma muitas vezes maior que a outra. Ainda, sabemos que existem espécies com valor C maior que o de humanos. Este fato é conhecido como o paradoxo do valor C, ou seja, é a impossibilidade de correlacionar diretamente o tamanho do genoma com a complexidade dos organismos. Isto, como veremos, é consequência da presença de sequências de DNA repetitivo no genoma dos eucariotos. Tais sequências repetitivas foram observadas em experimentos clássicos de cinética de renaturação do DNA, porém, comprovadas e melhores entendidas após o sequenciamento realizado pelo Projeto Genoma Humano, divulgado no início dos anos 2000. Hoje sabemos que o genoma humano possui um número muito menor de genes do que o esperado pelos cientistas. Estima-se que sejam de 20.000 a 25.000 genes, isto é, menos de 1,5%, do total de pares de bases do DNA, codifi ca alguma proteína, e somente 5% contém elementos que regulam e infl uenciam a expressão dos genes nos diferentes tecidos do corpo. As sequências de DNA de cópia única (ou seja, sequência de nucleotídeos que é representada somente uma vez) correspondem a cerca de 20% do genoma total. A maior parte do nosso DNA (mais de 50%) consiste do DNA repetitivo. As sequências repetitivas ajudam a manter a estrutura do cromossomo e são variáveis entre os indivíduos. Estas geram polimorfi smos que são extremamente úteis para a Genética Forense. Dentre as sequências de DNA repetitivo, existem as que estão dispersas pelo genoma e podem ser classifi cadas como: • Short Interspersed Elements (SINEs): a sequência Alu SINE (300 pb), por exemplo, contém mais de 1 milhão de cópias espalhadas pelo genoma e corresponde à aproximadamente 10% do mesmo. • Long Interspersed Elements (LINEs): a sequência LINE1 é a mais comum e está presente pelo genoma mais de 900.000 vezes. O seu tamanho varia entre 6000 a 8000 pb. 19 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 • Long Terminal Repeats (LTRs). • Transposons. Essas sequências repetitivas dispersas são originadas por transposição, ou seja, elas se movem de um lugar ao outro do genoma e, portanto, teriam papel importante na evolução dos genomas eucariotos e em sua regulação gênica. Em publicações mais antigas, alguns autores referem-se ao DNA repetitivo como o “DNA lixo”, porém hoje sabemos que tal defi nição é errônea. Outra classe de DNA repetitivo é o DNA repetitivo in tandem, isto é adjacente um ao outro. Tais sequências podem ser classifi cadas em: • DNA satélite: receberam essa denominação pelo fato de formarem bandas satélite durante a centrifugação por gradiente em cloreto de césio (Figura 8). São regiões repetitivas normalmente encontradas perto dos centrômeros dos cromossomos. • Minissatélites ou Variable Number Tandem Repeats (VNTRs): são unidades repetidas de DNA com 10-100 pb (em média 30pb), que resultam de inserção in tandem (Figura 9). • Microssatélites ou Short Tandem Repeats (STRs): correspondem a sequências curtas (2 a 6 bases) repetidas in tandem, sendo que a maioria das unidades de repetições é de dinucleotídeos (Figura 10). FIGURA 8 – DNA SATÉLITE FONTE: Adaptado de Passarge (2001) Centrifugação em gradiente de cloreto de césio mostrando a formação da banda principal de DNA e das bandas de DNA satélite. 20 Genética e Biologia Molecular Forense FIGURA 9 – DNA MINISSATÉLITES FONTE: Adaptado de Passarge (2001) Minissatélites (VNTRs): a fi gura apresenta os dois alelos de determinada região de minissatélite. Cada bloco representa uma unidade de repetição que pode possuir de 10 a 100pb. O primeiro alelo possui 3 unidades de repetição e o segundo alelo possui 6 unidades de repetição. FIGURA 10 – DNA MICROSSATÉLITES FONTE: Adaptado de Passarge (2001) Microssatélites (STRs): a fi gura apresenta os dois alelos de determinada região de microssatélite composta por unidade de repetição do tipo (CA) (citosina e adenina). O primeiro alelo possui 3 unidades de repetição e o segundo alelo possui 5 unidades de repetição. As sequências de minissatélites (VNTRs) e microssatélites (STRs) são as mais utilizadas na Genética Forense. Os indivíduos podem ser diferenciados pelo número de repetições que possuem em cada unidade de repetição destes marcadores, o que resulta em tamanhos de alelos diferentes (Figuras 11 e 12). A herança do número de repetições obedece às Leis da hereditariedade estabelecidas por Mendel, tal como a de qualquer outro polimorfi smo usado com fi ns forenses (CORTE-REAL; VIEIRA, 2015). É importante salientar que, mesmo que duas amostras tenham o mesmo perfi l para um determinado tipo de marcador molecular, não signifi ca, obrigatoriamente, que elas possuam a mesma origem. Os resultados obtidos são analisados estatisticamente e leva-se em conta a frequência populacional de cada polimorfi smo que foi testado. 21 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 FIGURA 11 –DETECÇÃO DE POLIMORFISMO DO TIPO STR FONTE: Adaptado de Passarge (2001) Detecção de polimorfi smo de STRs (microssatélites). O primeiro alelo possui menos unidades de repetição do tipo (CA) e o segundo possui mais unidades de repetição. Após realização da PCR e eletroforese, o alelo 1 é observado mais abaixo no gel eo alelo dois mais acima, devido à diferença de tamanho entre os dois. 22 Genética e Biologia Molecular Forense FIGURA 12 – COMPARAÇÃO DE PERFIS GENÉTICOS PARA RESOLUÇÃO DE CRIME E INVESTIGAÇÃO DE PATERNIDADE FONTE: (a) <https://evolution.berkeley.edu/evolibrary/images/news/ dnafi ngerprints.gif>; (b) Snustad, 2013. Acesso em: 21 out. 2018. (a) (b) À esquerda temos o perfi l de DNA de três suspeitos e da amostra da cena do crime (a). À direita, temos o perfi l de DNA para a resolução de um caso de paternidade, com amostras da mãe, da criança e dos dois possíveis pais (b). Ao comparar as bandas de DNA, concluímos que o suspeito 2 é o culpado pelo crime e o homem 2 é o pai da criança. Já sabemos que, nós humanos, compartilhamos 99.9% do nosso DNA uns com os outros. O que causa a variação entre os indivíduos é produto de inserção, deleção, duplicação e polimorfi smos, de tamanho e do tipo SNPs (polimorfi smo de nucleotídeo único), em nosso genoma. A análise genética forense busca produzir um perfi l de DNA que seja o mais discriminatório possível e, portanto, quanto 23 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 maior o grau de polimorfi smo, menor a chance de existir dois indivíduos com a mesma sequência. Goodwin (2007) elenca algumas propriedades importantes das sequências de DNA que considera ideal para a análise genética forense: • Alto grau de polimorfi smo. • Caracterização fácil e barata. • Produz perfi l que seja simples de interpretar e fácil de comparar entre laboratórios. • Não deve sofrer pressão seletiva (em termos evolutivos, a pressão seletiva é um conjunto de condições ambientais que favorece determinados genes em relação a outros). • Ter taxa de mutação baixa (GOODWIN, 2007, p. 11, tradução nossa). A frequência populacional de um gene ou de um polimorfi smo é usada em análises estatísticas realizadas nas técnicas de determinação do perfi l genético para fi ns forenses. Por exemplo, se o polimorfi smo analisado for muito frequente, signifi ca que vários indivíduos poderiam ter cometido o crime que está sendo investigado. Se, no entanto, for um polimorfi smo pouco encontrado, serão maiores as chances de que as duas amostras (do local do crime e do investigado) tenham se originado na mesma pessoa. Por isso que as regiões de DNA analisadas para fi ns forenses não devem sofrer pressão seletiva e ter taxa de mutação baixa. Esses eventos alteram a frequência de polimorfi smos de um gene. Como estamos vendo neste capítulo, as sequências analisadas nas investigações forenses são aquelas de DNA não codifi cador, uma vez que as regiões de DNA codifi cadoras de proteínas são praticamente idênticas entre os indivíduos, pois foram conservadas ao longo do processo evolutivo. Tal fato desmistifi ca o argumento, muitas vezes apresentado, de que se pode inferir a predisposição de um determinado indivíduo para desenvolver certa doença a partir da análise de amostras biológicas, circunstância que poderia ser aproveitada por seguradoras ou por empregadores para rejeitar contratos, por exemplo. Para fi car claro, o termo “polimorfi smo” (do grego, poli “muitas”, morfos “formas”) refere-se à ocorrência de variação genética em uma população para um ou mais lócus cujo alelo mais raro apresenta frequência de pelo menos 1% na população. Os polimorfi smos das regiões repetitivas do DNA, ou também chamadas regiões hipervariáveis, podem ser agrupados em dois tipos: polimorfi smos de sequência e polimorfi smos de tamanho. 24 Genética e Biologia Molecular Forense Os polimorfi smos de sequência são aqueles onde os nucleotídeos são diferentes em determinada região de DNA, devido à substituição, deleção ou adição de bases nitrogenadas, porém a maioria deles ocorre por mutações pontuais, como no caso dos SNPs (polimorfi smo de nucleotídeo único) (Figura 13). FIGURA 13 – POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO OU SNP FONTE: Adaptado de Passarge (2001) SNP ou polimorfi smo de nucleotídeo único (Single Nucleotide Polymorphism). A fi gura apresenta os dois alelos de determinada região de SNP onde temos a substituição de uma Adenina do alelo 1 por uma Guanina no alelo 2. Os polimorfi smos de tamanho referem-se aos gerados pelas regiões de minissatélites (VNTRs) ou microssatélites (STRs) e acabam possuindo tamanho diferente quando analisados devido ao número de unidades de repetição que cada indivíduo possui. No Capítulo 3 estudaremos mais profundamente como estas sequências repetitivas, especialmente VNTRs e STRs, são detectadas e analisadas para identifi cação dos indivíduos nas situações mais comuns da investigação criminal. 1 Relembre os conceitos e complete o quadro: Gene: Alelo: Homozigoto: Heterozigoto: Cromossomos: Genoma: Polimorfi smo: Microssatélites: Minissatélites: 25 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 3 O PROJETO GENOMA HUMANO O Projeto Genoma Humano (PGH) contribuiu bastante para o entendimento da organização do genoma. Foram as tecnologias recém-desenvolvidas (DNA recombinante, clonagem, sequenciamento, PCR etc.) nas décadas de 1970-1980 que impulsionaram o avanço do conhecimento genético. Foi nessa época que os cientistas começaram a discutir sobre a possibilidade de sequenciar todo o DNA humano e, em 1990, foi lançado o Projeto Genoma Humano. Foi estabelecido o ano de 2005 para se atingir os objetivos iniciais do projeto: mapear todos os genes, determinar a sequência de nucleotídeos de todos os cromossomos, construir um mapa físico detalhado de todo o genoma, além de desenvolver ferramentas de análise dos dados e estabelecer medidas sobre os possíveis problemas éticos, legais e sociais. Para alcançar tão ambiciosos objetivos, foi criada uma organização entre cientistas de todo o mundo. Conhecida como HUGO (Human Genome Organization), contava com cientistas de diversos países, porém com liderança dos Estados Unidos. James Watson foi um dos primeiros coordenadores do projeto. Já no ano de 1992 foram publicados os primeiros resultados do projeto: o mapa físico dos cromossomos Y e 21, e um mapa de RFLP do cromossomo X e dos outros 22 cromossomos autossomos. Enquanto o trabalho de mapear os genes avançava, o trabalho de sequenciá-los estava atrasado. Em 1998, John Craig Venter, geneticista-bioquímico e empresário americano, anunciou que havia formado sua própria companhia (Celera Genomics) para sequenciar o genoma em apenas três anos. Isso trouxe preocupação aos coordenadores do consórcio internacional e acabou por acelerar o término do sequenciamento do genoma humano. A criação da empresa de Venter também motivou o ex-presidente americano Bill Clinton e o ex-primeiro ministro da Inglaterra Tony Blair a fazerem uma declaração conjunta, em maio de 2000, de que toda a informação sobre o genoma humano deveria ser pública. Tal fato levou à cooperação entre Venter e Francis Collins (coordenador do PGH naquela época) e os dois apresentaram, em conjunto, um rascunho do genoma em uma cerimônia na Casa Branca ainda no ano 2000. 26 Genética e Biologia Molecular Forense FIGURA 14 – CERIMÔNIA DE ANÚNCIO DO RASCUNHO DO GENOMA HUMANO FONTE: <http://images.the-scientist.com/content/fi gures/images/ yr2000/jul24/ap_clinton.jpg>. Acesso em: 23 out. 2018. Da esquerda para a Direita: J. Craig Venter, Bill Clinton e Francis Collins. No ano seguinte, nos dias 15 e 16 de fevereiro, as revistas Nature e Science publicaram os resultados do sequenciamento do genoma humano. Dentre os dados publicados naquela ocasião, podemos destacar: • Genoma humano é 25 vezes maior que o genoma da Drosophila (mosca da fruta) e da Arabidopsis (herbácea) (organismos-modelo usados em muitos estudos de Genética). • Genoma humano é 8 vezes maior que a soma de todos os genomas que haviam sido sequenciados até aquele momento. • Existem apenas de 25.000 a 30.000 genes (o número estimado previamenteera de 50.000 a 120.000). A empresa Celera encontrou 26.383 genes. • Cerca de 60% de todas as proteínas previstas possuem similaridades com proteínas das outras espécies que haviam tido seu genoma sequenciado; sendo que 40% das proteínas compartilham similaridades com a Drosophila e o Caenorhabditis elegans (outro organismo-modelo; verme da família Nematoide). • Das 1278 famílias de proteínas previstas, apenas 94 são específi cas dos vertebrados. O restante evoluiu a partir de domínios de proteínas de ancestrais distantes na evolução como os procariotos e os eucariotos unicelulares. • Os éxons (sequências que codifi cam proteínas). Os íntrons representam 24%, sendo que 75% destes estão em regiões de DNA intergênicas (entre os genes) e 44% são derivados de transposons. 27 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 O projeto Genoma Humano foi ofi cialmente concluído no ano de 2003, juntamente com as comemorações dos 50 anos da descoberta da estrutura do DNA. Depois disso, os dados publicados pelas revistas Nature e Science ainda foram complementados e, em 2004, 99% do DNA de eucromatina estava sequenciado. O número estimado de genes que codifi ca proteínas diminuiu para 22.287. Além dos genes que codifi cam as proteínas, precisamos lembrar que existem aqueles que codifi cam RNAs (tRNA, rRNA, snRNA, microRNA). Em 2007 e 2008, respectivamente, J. Craig Venter e James Watson (Figura 15) se tornaram as primeiras pessoas no mundo a terem seu genoma sequenciado. FIGURA 15 - J. CRAIG VENTER E JAMES WATSON, CIENTISTAS QUE MUDARAM A GENÉTICA FONTE: <http://blogs.nature.com/indigenus/fi les/2012/07/ DSC_43511.jpg>. Acesso em: 23 out. 2018. Após a fi nalização do PGH, Francis Collins e colaboradores organizaram novos projetos. Um deles, chamado de ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements), que tem por objetivo identifi car os elementos funcionais do genoma, ou seja, aqueles que regulam a expressão gênica. Este projeto ainda está em andamento e informações podem ser obtidas no endereço eletrônico: https://www. encodeproject.org/. Graças ao projeto, a maior parte dos genes já possui pelo menos uma função bioquímica associada. Hoje o ENCODE está em sua quarta fase, e não só os elementos do genoma humano estão sendo estudados, como também os de outros organismos modelo. Outro consórcio derivado do PGH, que ainda está em andamento é o HUPO (Human Proteome Organization). Este também conta com a colaboração de cientistas de diversos países e o objetivo é o 28 Genética e Biologia Molecular Forense de determinar a estrutura e função de todas as proteínas que são codifi cadas pelo genoma humano. Projetos como o HapMap (Haplotype Map) e o 1000 Genomes foram desenvolvidos para estudar a variação do genoma entre os indivíduos. O HapMap mapeou os polimorfi smos do tipo SNPs, e o 1000 Genomes estudou o DNA de pessoas de várias partes do mundo, entre 2008 e 2015, para catalogar a variação genética entre a população humana. Faça uma busca sobre o Projeto Genoma Humano na internet e veja as notícias e os artigos científi cos da época de sua publicação. Você também pode pesquisar quais outros organismos tiveram seu genoma sequenciado e qual a implicação disto para a sociedade. Será que o Brasil já participou de algum projeto Genoma? FONTE: <http://science.sciencemag.org/content/331/6017/ 546.2.full>.Acesso em: 15 jan. 2019. Capas da revista Nature e Science com a publicação do sequenciamento do genoma humano (fevereiro de 2001). Diante de tantos dados que foram gerados e que ainda continuam sendo obtidos, quais foram e quais serão os benefícios para a sociedade? Qual a importância de se conhecer a estrutura e funcionamento dos genomas? 29 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 Primeiramente, quando determinamos a sequência do DNA de um indivíduo e comparamos com outros da mesma espécie, podemos conhecer regiões que são variáveis e regiões que defi nem características que são essenciais a esses sujeitos e que normalmente não sofrem tanta variação. A partir dessa informação, podemos tirar conclusões a respeito do processo de evolução dessa espécie e gerar meios de diferenciação entre os indivíduos, o que, como sabemos, é o pilar da Genética Forense. No caso dos humanos, ainda, ajuda no entendimento dos processos migratórios que ocorreram no planeta e na determinação da ancestralidade. Um estudo publicado no fi nal de 2018 mostra como a análise genética reconstruiu a história do povoamento das Américas. Todos já ouviram falar sobre o fóssil Luzia, que foi encontrado em Lagoa Santa (Minas Gerais). A teoria dizia que o continente americano foi povoado por dois grupos que migraram do nordeste da Ásia. Um dos grupos (supostamente como o de Luzia) tinha traços africanos e australianos, e o outro tinha traços ameríndios. Com a análise de DNA extraída dos fósseis descobriu-se que, na verdade, todas as populações americanas descendem de um único grupo que chegou ao continente pelo estreito de Bering há 20 mil anos. Além disso, os resultados mostraram que o povo de Lagoa Santa não possui nenhuma conexão genética com os grupos da África e da Austrália e sim com um grupo denominado “cultura Clóvis”, que se estabeleceu na América do Norte e depois migrou para o sul do continente. Portanto, o povo de Luzia era ameríndio e uma nova reconstrução facial foi feita para representar Luzia, desta vez com traços que lembram os primeiros habitantes brasileiros. FIGURA 16 – A ANÁLISE DE DNA PODE MUDAR A HISTÓRIA DO INÍCIO DAS CIVILIZAÇÕES NO BRASIL FONTE: <https://jornal.usp.br/wp-content/uploads/2018/11/20181108_00_ cranio_luzia2.jpg>. Acesso em: 11 nov. 2018. 30 Genética e Biologia Molecular Forense Reconstruções do rosto de Luzia, fóssil achado em Lagoa Santa. À esquerda, nova reconstrução e à direita, reconstrução antiga, com fortes traços africanos. O conhecimento gerado pelo sequenciamento dos genomas pode ser aplicado nas mais diversas áreas da sociedade. Percebe-se que é mais notado pela população em geral, em situações de teste de paternidade e resolução de crimes. Na Medicina, conhecer o genoma e sua regulação ajuda a buscar mais profundamente as causas das doenças, traz diagnóstico mais preciso e terapias mais efi cazes. Aliado à farmacogenômica possibilita ao paciente um tratamento personalizado. Há também a possibilidade de entender a infl uência de fatores ambientais aos quais estamos expostos, e de prevenir doenças ao saber se existe predisposição à determinada enfermidade. Um dos exemplos mais conhecidos pelos leigos é o caso do câncer de mama. Em 2013, a atriz Angelina Jolie decidiu se submeter à dupla mastectomia preventiva após descobrir que possui o gene BRCA1 com mutação que predispõe ao desenvolvimento do câncer de mama. As empresas de biotecnologia dos mais diferentes setores se benefi ciaram, e se benefi ciam, com o sequenciamento do genoma de várias espécies, além da humana. Isso possibilitou, por exemplo, avanços no desenvolvimento de novos fármacos e vacinas, desenvolvimento de novas variedades de plantas de interesse comercial, criação de animais mais produtivos e resistentes às doenças, entre outros. O conhecimento gerado pelo estudo do genoma de microrganismos, por exemplo, é útil para o desenvolvimento de técnicas para controle de resíduos, biorremediação, produção de energia e processos industriais. O sequenciamento dos genomas também foi importante para o nascimento da chamada Era das Ciências Ômicas. São áreas de estudo onde são aplicadas as tecnologias mais modernas. O termo “ômica” é derivado do sufi xo “oma” e signifi ca “conjunto de”. A partir disto, podemos defi nir as seguintes áreas de estudo: • Epigenômica: estuda as modifi cações epigenéticas, isto é, qualquer atividade reguladora de genes que não envolvem mudanças na sequência do DNA, e que pode persistir por uma oumais gerações. • Transcriptômica: estuda conjunto dos RNA mensageiros transcritos pelos genes por determinada célula em determinado momento. • Proteômica: estuda o conjunto de proteínas que foi produzida por determinada célula em determinado momento. • Metabolômica: estuda o conjunto de metabólitos que foi produzido por determinada célula em determinado momento. 31 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 FIGURA 17 – VISÃO GERAL DAS CIÊNCIAS “ÔMICAS” FONTE: A autora Anteriormente foi citado a farmacogenômica, ela estuda a relação dos fármacos com o nosso DNA, ou seja, você tem a possibilidade de administrar o fármaco que melhor se encaixa com o perfi l de genes de uma determinada pessoa. Você já se perguntou por que determinado remédio funciona para uma pessoa, mas para a outra não? Isso ocorre devido aos polimorfi smos dos genes de metabolização e excreção de drogas do nosso organismo. Um exemplo de prática clínica da farmacogenômica é a sua aplicação na escolha do medicamento a ser utilizado para tratar o câncer de mama. Dependendo do tipo do receptor encontrado nas células mamárias, determinada droga é indicada ou não. No artigo de Westbrook e Stearnes (2013) conseguimos entender com clareza essa relação entre o perfi l genético e a prescrição de determinada droga para o tratamento de câncer de mama. Por exemplo, o trastuzumabe é um medicamento para tratamento deste tipo de câncer, porém é indicado em casos onde existe o receptor HER2 nas membranas das células. Isso ocorre porque este medicamento é um anticorpo e, portanto, precisa se ligar no receptor celular para que ocorra o efeito desejado (diminuir a proliferação das células tumorais). A nutrigenômica é outra área de estudo que surgiu na era das ciências “ômicas”. Ela explora como os nutrientes modulam a expressão dos genes, afetando assim as rotas metabólicas e a homeostasia do organismo. Busca a prevenção de doenças através de uma dieta personalizada. Além da nutrigenômica, temos a nutrigenética, que tem como objetivo elucidar o efeito da variação genética no que se refere ao papel da dieta na prevenção e desenvolvimento de doenças nas diversas populações, ou seja, estuda como os alimentos são aproveitados pelo 32 Genética e Biologia Molecular Forense organismo e já foi demonstrado que existem diferenças étnicas em como isso acontece. É importante ter em mente que: hoje não importa só sequenciar o genoma de um determinado organismo, devemos buscar ferramentas para entender as interações que resultam no fenótipo fi nal. Como vimos, são infi nitas as possibilidades de benefícios gerados à sociedade devido ao sequenciamento dos genomas. Entretanto, devemos prestar atenção também aos dilemas éticos, legais e sociais já levantados e que possam surgir. O PGH tinha uma comissão somente para discutir esses aspectos (tradução nossa da página Human Genome Project Archive - https:// web.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/index.shtml. (tradução nossa da página Human Genome Project Archive - https://web.ornl.gov/ sci/techresources/Human_Genome/elsi/index.shtml). • Sobre a privacidade e confi dencialidade da informação genética de um indivíduo: Quem vai possuir e controlar a minha informação genética? O princípio da confi dencialidade médica também seria aplicada? • Acesso à informação genética por instituições comerciais, empregadores, escolas, entre outros: Quem deve ter acesso aos meus dados genéticos? Posso ser prejudicado por possuir algum gene que predispõe a alguma doença? • Impacto psicológico e discriminatório devido à constituição genética: Como a informação genética pode afetar nossas percepções de nós mesmos e da sociedade? • A correta integração com a prática clínica por meio de pessoal bem treinado: é importante que os profi ssionais da saúde sejam preparados para orientar os pacientes sobre testes genéticos, temas sobre reprodução etc. • Incertezas relacionadas a testes genéticos: Será que devo mesmo fazer o teste e descobrir se tenho maior suscetibilidade para desenvolver alguma doença? E se essa doença ainda não possui tratamento? • Comercialização de novas tecnologias com direito de propriedade: É correto patentear o DNA de um organismo e tirar proveito comercial? • Aspectos ambientais e de saúde relacionados aos organismos geneticamente modifi cados (OGM): Será que os OGM são realmente ruins para a saúde humana e para o ambiente? 33 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 4 APLICAÇÕES DA IDENTIFICAÇÃO POR DNA A revolução da Genética e Biologia Molecular na área forense teve seu início na década de 1980, época em que as principais técnicas moleculares foram desenvolvidas. Tempos depois, tais técnicas se revelaram de grande importância e acabaram por deixar os muros acadêmicos e mudaram as histórias de pessoas nas mais diferentes situações civis e criminais. O perfi l de DNA (DNA fi ngerprint) foi utilizado pela primeira vez em 1985 em um caso de disputa imigratória no Reino Unido e salvou um jovem garoto de ser deportado (JEFFREYS et al., 1985). Já em 1988, também no Reino Unido, o primeiro criminoso foi condenado em um caso de homicídio e estupro a duas garotas utilizando o DNA como evidência (GOODWIN et al., 2007). Além de encontrar o culpado pelo crime, o resultado da análise de DNA excluiu outro que era tido como suspeito. Entre os avanços que culminaram na incorporação das técnicas moleculares, na área forense, destacam-se: a análise de polimorfi smos de mini e microssatélites, o aprimoramento da técnica de PCR e o sequenciamento de DNA. A técnica de PCR foi desenvolvida em 1983 por Kary Mullis e revolucionou a Genética Molecular e todas as áreas de estudo derivadas dela. Tamanha importância foi reconhecida em 1993 quando Mullis foi laureado com o Prêmio Nobel de Química. Em poucas palavras, o método consiste em sintetizar DNA in vitro. É importante, pois consegue aumentar a quantidade de DNA de uma amostra para posterior análise. Isso é extremamente importante, por exemplo, nos casos forenses. Kary Mullis introduziu ao protocolo o uso da enzima Taq DNA polimerase, das sequências de nucleotídeos iniciadoras (primers) e das variações de temperatura controladas. A enzima Taq DNA polimerase foi isolada de um microrganismo (Thermus aquaticus) que vive em fontes termais e, portanto, resistente a altas temperaturas (isso foi essencial para a padronização da técnica de PCR). Os primers são sequências curtas de nucleotídeos que direcionam qual região do DNA vai ser amplifi cada. Já as variações de temperatura são importantes para desnaturar o DNA, para o anelamento dos primers e a extensão da molécula de DNA (mais detalhes sobre a técnica serão abordados no capítulo 3). 34 Genética e Biologia Molecular Forense FIGURA 18 – KARY MULLIS, O “PAI DA PCR” FONTE: <https://www.karymullis.com/img/pcr3.jpg>. Acesso em: 22 out. 2018. Kary Mullis recebendo o prêmio Nobel de Química em 1993. É outra personalidade que mudou a história da Genética. Anteriormente ao uso das técnicas moleculares, a análise de marcadores sanguíneos (incluindo o sistema ABO) era o procedimento padrão nos laboratórios e a Genética estava presente de maneira indireta nessas análises. Karl Landsteiner, em 1900, observou que os indivíduos poderiam ser separados em diferentes grupos de acordo com o tipo sanguíneo. Em 1915, Leone Lattes publicou um livro onde descreveu o uso da tipagem do sistema ABO para resolver um caso de paternidade. Associado à investigação do sistema ABO, também foram incorporados a análise do sistema MN, Rh e do sistema de histocompatibilidade (HLA), que trouxe grande contribuição para a Medicina Forense, por possuir grande poder de discriminação dos indivíduos. Em 1987, nos Estados Unidos, o caso People vs. Castro levantou o questionamento sobre a qualidade das análises de DNA. A partirdisto, foram tomadas medidas para garantir o maior grau possível de uniformização e qualidade das análises nos laboratórios forenses. Tal padronização, aliado aos avanços tecnológicos destas décadas, fi zeram da análise de DNA uma ferramenta confi ável e robusta nas Ciências Forenses. De fato, a identifi cação de indivíduos pelo DNA tornou-se uma ferramenta indispensável na investigação de crimes e é aceita em tribunais do mundo todo. A análise molecular estabelece um vínculo irrefutável entre determinada pessoa e a sua presença na cena do crime. Roewer (2013, p. 1, tradução nossa) defi ne o DNA fi ngerprint como “a comparação do DNA nuclear da célula de uma pessoa com aquele identifi cado de maneira biológica na cena de um crime ou com o DNA de outra pessoa, nos casos onde o propósito é de identifi cação ou exclusão”. 35 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 São vantagens do uso da identifi cação por DNA na investigação forense: • Possibilidade de extração do DNA de qualquer amostra biológica, mesmo que em pequena quantidade (sangue, saliva, cabelo, sêmen, urina, qualquer tecido ou fl uido corporal). • Alto poder discriminatório. • Alta sensibilidade da técnica. • Estabilidade química da molécula de DNA, resistente aos fatores externos ambientais. • Possibilidade de separar o DNA das células espermáticas de qualquer outro DNA celular (extremamente importante em casos de crime sexual). Neste caso é utilizado um protocolo de lise diferencial para separar o DNA do esperma daquele que não é proveniente dele. Primeiramente usa-se uma solução que vai lisar somente as células epiteliais e em seguida, um segundo tampão, capaz de lisar as membranas dos espermatozoides. Apesar das vantagens listadas, devemos lembrar que toda amostra biológica retirada do local do crime deve ser coletada, transportada, armazenada e analisada por pessoal especializado para que não sejam produzidos resultados falso-positivos ou falso-negativos. Como estamos vendo, a identifi cação por DNA é extremamente útil e já faz parte do cotidiano das investigações criminais, pois tem aplicação em quaisquer que seja o crime: • Identifi cação de pessoas desaparecidas ou cadáveres carbonizados, mutilados, em estado de decomposição e abandonados. • Homicídios. • Crimes sexuais (estupro, atentado violento ao pudor). • Roubos e furtos. • Casos de aborto provocado. • Sequestros e tráfi co de pessoas. • Estabelecer relação entre o instrumento que causou alguma lesão e a vítima. Um jornal da região de Brasília reportou que até o mês de junho do ano de 2016, 38% das amostras, que a equipe de peritos havia analisado geneticamente, eram provenientes de estupro, seguido por homicídio (34% dos casos). Os outros casos eram de roubo e identifi cação de cadáveres. Na área cível, os testes genéticos são realizados para reconhecimento de paternidade. 36 Genética e Biologia Molecular Forense FIGURA 19 – PRINCIPAIS CASOS ONDE A ANÁLISE DE DNA É APLICADA FONTE: A autora Casos mais comuns onde a identifi cação de DNA (DNA fi ngerprint) é realizada: crimes de homicídio, crimes sexuais e testes de paternidade. A identifi cação por DNA é uma ferramenta extremamente importante em situações com vítimas de desastres em massa, de causas naturais ou intervenção humana, tais como quedas de aeronave, atentados, incêndios, explosões, naufrágios, terremotos, maremotos, entre outros. Quando ocorreu o atentado terrorista ao World Trade Center, nos Estados Unidos em 11 de setembro de 2001, nem os melhores centros forenses do país estavam preparados para a enorme demanda de identifi cação genética de pessoas que teriam que fazer. Antes deste ataque, “o uso do DNA para identifi cação de vítimas não passava de 500 pessoas” em casos de quedas de avião (Biesecker et al., 2005, p. 1122, tradução nossa). No caso do ataque ao World Trade Center, o número de vítimas era desconhecido e as amostras de DNA eram provenientes de fragmentos totalmente contaminados com material inorgânico (restos dos prédios) e bactérias, o que comprometeu e atrasou o trabalho de isolamento do DNA. Anos depois, as vítimas ainda estão sendo identifi cadas, como o relatado pelo jornal Telegraph em 2017. Até o momento desta notícia, haviam sido identifi cadas 1641 vítimas, o que signifi ca que 40% das pessoas que morreram neste ataque ainda permanecem sem identifi cação. Ao longo desses anos, novos métodos foram desenvolvidos e incorporados pela análise de DNA forense e, o mesmo fragmento de osso está sendo analisado mais de uma vez, conta o repórter. 37 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 Na época do ataque terrorista, formou-se um grande grupo colaborativo para identifi cação das vítimas e contava com o Gabinete do chefe de Medicina de Nova York (OCME), o Departamento de Polícia do Estado de Nova York (NYSP), laboratórios privados de análise genética, empresas desenvolvedoras de software de análise, além de um grupo com especialistas forenses: bioinformatas, estatísticos, doutores em biologia molecular e genética populacional. Para a análise do DNA dos fragmentos, inicialmente foi selecionado o painel de 13 STRs (microssatélites) já previamente estabelecido para casos forenses. Entretanto, novas estratégias foram incorporadas devido ao alto grau de degradação do DNA das amostras: uso do DNA mitocondrial; uso de mini-STR, que correspondem às mesmas sequências STRs analisadas, porém com regiões de amplifi cação menores; uso de marcadores do tipo SNPs. Todos esses se mostraram úteis e ajudaram na identifi cação das vítimas (Biesecker et al., 2005). FIGURA 20 – ATENTADO AO WORLD TRADE CENTER: PARA IDENTIFICAR AS VÍTIMAS UTILIZOU-SE ANÁLISE DE DNA FONTE: <https://static01.nyt.com/images/2010/02/11/nyregion/11worldtrade_337- span/11worldtrade_337-span-articleLarge.jpg>. Acesso em: 24 out. 2018. Foto aérea tirada após o atentado ao World Trade Center, em 2001. Milhares de vítimas foram identifi cadas pelo DNA fi ngerprint. Vítimas de desastres antigos também podem ser identifi cadas pela análise de DNA. Em 2002, cientistas do Canadá identifi caram os restos mortais de um bebê que estava no navio Titanic. Ele era conhecido como “a criança desconhecida” e o seu DNA foi relacionado ao de parentes vivos que moram na Finlândia. No Brasil, a identifi cação de pessoas por análise de DNA também é realizada e o trabalho fi ca sob-responsabilidade da Polícia Técnico-Científi ca. São noticiados quase que diariamente casos de crimes ou desastres que foram 38 Genética e Biologia Molecular Forense solucionados com a ajuda do DNA fi ngerprint. Inclusive, quando o avião do ex- candidato à Presidência Eduardo Campos sofreu um acidente, em 2014, a análise de DNA precisou ser realizada. A Genética Forense no Brasil iniciou-se na área acadêmica no fi nal da década de 1980, onde, a partir de pesquisas realizadas nas universidades, os testes genéticos começaram a ser oferecidos para fi ns de reconhecimento de paternidade e, em alguns casos, para resolução de crimes. Em 1994, foi criado o primeiro laboratório de Genética Forense no Brasil, localizado no Instituto de Criminalística do Distrito Federal. Após, foram criados os laboratórios das Polícias Científi cas de São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Paraíba e Rio Grande do Sul. Foi também em 1994, que o primeiro caso utilizando Genética Forense foi apresentado em tribunais do nosso país, porém a análise do DNA foi realizada nos Estados Unidos quando dois peritos de Brasília foram enviados para lá com objetivo de analisar amostras de dois crimes (ALVES, 2009). A Rede Integrada de Genética Forense (RIGF) foi criada em 2009 e é coordenada pela Secretaria Nacional de Segurança Pública, e tem por objetivo propiciar o intercâmbio de perfi s genéticos de interesse da Justiça, obtidos em laboratórios de perícia ofi cial.Para isso, a RIGF também estabeleceu protocolos e procedimentos operacionais padrões entre os seus integrantes. 4.1 GENÉTICA FORENSE E ANÁLISE DE AMOSTRAS NÃO HUMANAS A “Genética Forense está incorporando a análise de amostras não humanas, ou seja, provenientes de animais, plantas ou microrganismos” (ARENAS et al., 2017, p. 1). Em 2007, o periódico Forensic Science International: Genetics já demonstrou a importância das amostras não humanas à área, ao reconhecê-la como parte importante da Genética Forense, que por sua vez foi defi nida como: “a aplicação da genética a materiais humanos e não humanos (estudando- se características herdadas e variações inter e intraespecífi cas de variação na população) para resolução de confl itos legais” (LAUNCHING, 2007, p.1). As análises de DNA, no caso de amostras provenientes de animais, geralmente são para resolver crimes e casos cíveis como: ataque de cachorros e ursos; identifi cação de cavalos de corrida; determinação do sexo de aves; casos onde o animal é testemunha de crimes (chamado de testemunha silenciosa) e, 39 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 principalmente, em crimes contra a vida selvagem, onde são vítimas os grandes felinos, javalis, elefantes, entre outros. A resolução de casos como estes também mostra a importância da genética forense na aplicação de leis de proteção da vida selvagem. No Brasil, tem grande importância no combate à biopirataria. Visto que o tráfi co de animais é o terceiro mais rentável em nosso país, a inclusão de novas metodologias no combate desse tipo de crime é de extrema importância. Carvalho (2013) publicou um relato de caso onde utilizou as ferramentas moleculares para identifi cação das aves, cujos ovos e indivíduos imaturos haviam sido apreendidos. Ele descobriu que se tratava de 17 espécies, incluindo o papagaio-galego, a arara vermelha grande e o periquito rei. FIGURA 21 – ANIMAL COM DOENÇA DA VACA LOUCA: A ANÁLISE GENÉTICA TAMBÉM É ÚTIL PARA IDENTIFICAR A ORIGEM DE DOENÇAS FONTE: <http://www.revistaveterinaria.com.br/2016/08/16/o-mal- da-vaca-louca-no-brasil/>. Acesso em: 15 jan. 2019. A doença da vaca louca, quando atingiu os Estados Unidos e Canadá, teve sua origem descoberta por meio da análise genética. As amostras provenientes de plantas podem ser analisadas geneticamente para ajudar a elucidar casos de apreensão de drogas (como maconha e ópio) para identifi cação de sua origem; importação e comercialização de espécies exóticas e ameaçadas de extinção; detecção de extração ilegal de madeira; bioterrorismo (por exemplo, ataques com ricina) e para estabelecer a ligação entre a vítima e o suspeito em uma cena de crime. Já as análises forenses de amostras microbiológicas geralmente são para identifi cação do microrganismo em questão e de sua origem. As aplicações incluem: biocrimes e bioterrorismos; surtos e transmissão de patógenos; liberação de agente biológico ou toxina; geolocalização; estimativa de tempo pós-morte; 40 Genética e Biologia Molecular Forense investigação epidemiológica para acompanhar a dinâmica de surtos de doenças, sua origem e rotas de transmissão. Na área de alimentos, a análise genética ajuda a detectar substituições fraudulentas e a garantir as escolhas do consumidor com relação à sua saúde (no caso de pessoas alérgicas, por exemplo), suas preferências alimentares e crenças religiosas. Os marcadores genéticos são aplicados para identifi cação dos alimentos e adulterações, confi rmação de origem, presença de alérgenos, toxinas ou organismos geneticamente modifi cados (OGM). Como no caso dos humanos, são utilizadas sequências de STRs, mtDNA e SNPs para comparação e identifi cação dessas amostras. Porém, o acesso à informação genética é mais limitado, uma vez que geralmente não possuem uma “coleção de amostras representativas da espécie [...], o acesso a amostras de alta qualidade não está disponível para várias espécies e é mais difícil de obter fi nanciamento para esses tipos de estudo” (ARENAS et al., 2017, p. 9). 4.2 GENÉTICA FORENSE E NOVAS TECNOLOGIAS Como podemos perceber, a cada ano, novas tecnologias vêm sendo desenvolvidas e incorporadas na área forense. A técnica de sequenciamento de nova geração (NGS) é uma plataforma que permite analisar simultaneamente múltiplas sequências de interesse forense em milhões de fragmentos de DNA. Com isso gera resultados em menor prazo de tempo e possibilita maior sensibilidade para a análise genética dos indivíduos. Com esta técnica, até mesmo marcadores epigenéticos podem ser utilizados para investigação forense e podem ajudar a distinguir gêmeos monozigóticos, predizer o tipo de tecido de determinada amostra biológica e determinar a idade do doador de DNA (YANG et al., 2014, p. 193). Empresas de biotecnologia já estão trabalhando no desenvolvimento e aprimoramento de equipamentos capazes de fazer o exame de DNA no local do crime. Estas máquinas acompanham kits que diminuem as etapas tradicionais do processamento do DNA, desde o seu isolamento, até a PCR e a eletroforese. Uma destas plataformas é a RapidHit (Figura 22 – fabricante Thermo Scientifi c). 41 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 GURA 22 – RAPIDHIT: EQUIPAMENTO PORTÁTIL PARA ANÁLISE DE DNA FONTE: <https://www.thermofi sher.com/br/en/home/industrial/forensics/ human-identifi cation/forensic-dna-analysis/dna-analysis/rapidhit-id- system-human-identifi cation.html>. Acesso em: 12 dez. 2018. RapidHit: este equipamento possui um cartucho (a) onde deve ser inserido o Swab com o esfregaço bucal. Posteriormente, o cartucho é inserido na máquina (b), onde é feita a lise das células, a extração, amplifi cação e eletrofores do DNA para gerar o perfi l genético do indivíduo. No link, pode ser visto um vídeo com o seu funcionamento. Quando testadas, essas máquinas foram capazes de gerar perfi s de STRs a partir de amostras de sangue e esfregaço bucal, porém não apresentaram resultados satisfatórios com amostras de DNA degradadas ou pouco concentradas, como as que frequentemente são encontradas nos locais de crimes. Outra tecnologia bastante interessante é o Retrato Falado Molecular. Como o próprio nome diz, seria feito um retrato falado da pessoa a partir do seu DNA. Para isso são usados os polimorfi smos do tipo SNPs, pois são apontados como marcadores de ancestralidade biogeográfi ca e, portanto, poderiam indicar possíveis traços físicos com potencial aplicação nas investigações forenses, auxiliando a reduzir a lista de suspeitos e na identifi cação de restos mortais (Figura 23). No site da empresa, existem dados de resolução de crimes reais utilizando essa tecnologia. 42 Genética e Biologia Molecular Forense FIGURA 23 – RETRATO FALADO MOLECULAR GERADO POR ANÁLISE DE SNPS FONTE: <https://snapshot.parabon-nanolabs.com>. Acesso em: 12 dez. 2018. Imagem mostrando o painel gerado com predição fenotípica de um voluntário usando o kit Parabon® SnapshotTM DNA Phenotyping, Ancestry & Kinship Analysis (a) e sua fotografi a (b). 5 ALGUMAS CONSIDERAÇÕES Nesta primeira parte da disciplina Genética e Biologia Molecular Forense relembramos conceitos básicos de Genética que são importantes para entender as técnicas e as aplicações da identifi cação por DNA na área forense. Vimos como as tecnologias, descobertas na década de 1970 e 1980, foram importantes para impulsionar o lançamento e desenvolvimento do Projeto Genoma Humano. Este, por sua vez, revolucionou a Ciência e trouxe aplicações nas mais diversas áreas de estudo, benefi ciando a sociedade em diversos aspectos. Os cientistas que participaram de tais conquistas são hoje reconhecidos mundialmente e, pelo menos três deles, foram laureados com o Prêmio Nobel. Apesar da maior parte das aplicações da tecnologia de DNA fi ngerprint ser voltada para o uso em amostras provenientes de humanos, devemoster em mente que há outras situações que o DNA fi ngerprint pode ser usado, inclusive com amostras de outras espécies (animais, plantas, microorganismos). Além disso, caro aluno, não se esqueça da origem dos marcadores moleculares 43 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 mais utilizados nessas investigações, ou seja, as regiões de DNA repetitivo, principalmente as denominadas microssatélites ou STRs. Ao fi nal do seu estudo, espero que você tenha relembrado os principais conceitos da Genética, principalmente os marcadores moleculares, para que você seja capaz de compreender, discutir e avaliar como é feita a identifi cação genética e em quais situações ela pode ser aplicada. No próximo capítulo estudaremos quais são os vestígios biológicos importantes para a Genética Forense. Veremos que eles não podem ser coletados de qualquer maneira, por pessoal não treinado, para que não ocorra comprometimento da análise genética que será realizada. Após este capítulo, veremos, em detalhes, os procedimentos laboratoriais usados na prática da investigação forense. REFERÊNCIAS ALVES, E. G. Direitos fundamentais e limitações necessárias: aplicação do exame pericial do DNA para a identifi cação de pessoas. 2009. 53f. Dissertação (Especialização em Ordem Jurídica e Ministério Público) - Fundação Escola Superior do Ministério Público do Distrito Federal e Territórios, Brasília, 2009. ARENAS, M. et al. Forensic genetics and genomics: Much more than just a human affair. Plos Genetics, California, v. 13, set. 2017. https://doi.org/10.1371/ journal.pgen.1006960. Acesso em: 14 jan. 2019. BIESECKER, L. G. et al. DNA identifi cations after the 9/11 World Trade Center attack. Science, Nova York, v. 310, p.1122-1123, nov. 2005. https://www. unboundmedicine.com/medline/citation/16293742/Epidemiology__DNA_ identifi cations_after_the_9/11_World_Trade_Center_attack_. Acesso em: 14 jan. 2019. BONACCORSO, N. S. Aplicação do exame de DNA na elucidação de crimes. 2005, 193f. Dissertação (Mestrado em Medicina Forense) – Faculdade de Direito da Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005. CARVALHO, C. B. The use of DNA barcoding to identify feathers from illegaly tradead birds. Brazilian Journal of Forensics Sciences, Medical Law and Bioethics, São José do Rio Preto, v.2, p.326-332, dez. 2013. http://www.ipebj. com.br/forensicjournal/download.php?arquivo=97. Acesso em: 14 jan. 2019. 44 Genética e Biologia Molecular Forense CHAMPE, P. C.; HARVEY, R. A.; FERRIER, D. R. Bioquímica ilustrada. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. CHINERY, P. F.; HUDSON, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin, Oxford, v. 106, p. 135–159, jun. 2013. https://academic.oup.com/bmb/ article/106/1/135/323715. Acesso em: 14 jan. 2019. CORTE-REAL, F.; VIEIRA, D. N. Princípios de Genética Forense. Coimbra: Universidade de Coimbra, 2015. http://dx.doi.org/10.14195/978-989-26-0957-7. Acesso em: 14 jan. 2019. GOODWIN, W.; LINACRE, A.; HADI, A. An introduction to Forensic Genetics. West Sussex: John Wiley & Sons Ltd, 2007. GRIFFITHS, A. J. et al. Introdução à genética. 9. ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009. JEFFREYS, A. J.; BROOKFIELD, J. F.; SEMEONOFF, R. Positive identifi cation of an immigration test-case using human DNA fi ngerprints. Nature, [s.l.], v. 317, p. 818–819, out. 1985. https://www.nature.com/articles/317818a0. Acesso em: 14 jan. 2019. LAUNCHING forensic science international daughter journal in 2007: forensic science international: genetics. Forensic Science International: Genetics, San Diego, v. 1, n.1, p. 1-2, mar. 2007. https://www.fsigenetics.com/article/S1872- 4973(06)00002-0/pdf. Acesso em: 14 jan. 2019. LUO, S. et al. Biparental inheritance of mitochondrial DNA in humans. Proceedings of the National Academic Science of USA (PNAS), v. 115, p. 13039- 13044, nov. 2018. https://www.pnas.org/content/115/51/13039/tab-article-info. Acesso em: 14 jan. 2019. PASSARGE, E. Color Atlas of Genetics. 2. ed. New York: Georg Thieme Verlag, 2001. ROEWER, L. DNA. Fingerprinting in forensics: past, present, future. Investigative Genetics, v. 4, p. 22, nov. 2013. https://investigativegenetics. biomedcentral.com/articles/10.1186/2041-2223-4-22. Acesso em: 14 jan. 2019. SNUSTAD, P. D.; SIMMONS, M.J. Fundamentos de Genética. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. 45 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 1 U.S. DEPARTMENT OF ENERGY. Human Genome Project. Washington DC, nov. 2017.http://www.ornl.gov/hgmis> Acesso em: 19 jan. 2019. WESTBROOK, K.; STEARNES, V. Pharmacogenomics of breast cancer therapy: an update. Pharmacology Therapy, v. 139, p.1-11, jul. 2013. https://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/23500718. Acesso em: 14 jan. 2019. YANG, Y.; XIE, B.; YAN, J. Application of Next-Generation Sequencing technology in forensic science. Genomics Proteomics Bioinformatics, v. 12, p. 190-197, out. 2014. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1672022914001053. Acesso em: 14 jan. 2019. ZHAO, X. C. et al. Isolating sperm from cell mixtures using magnetic beads coupled with an anti-ph-20 antibody for forensic DNA analysis. Plos One, v.11, p. 7, jul. 2016. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal. pone.0159401. Acesso em: 14 jan. 2019. ZHOU, Q. et al. Mitochondrial endonuclease G mediates breakdown of paternal mitochondria upon fertilization. Science, v. 353, p. 394-399, jul. 2016. http:// science.sciencemag.org/content/353/6297/394. Acesso em: 14 jan. 2019. 46 Genética e Biologia Molecular Forense CAPÍTULO 2 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE A partir da perspectiva do saber fazer, neste capítulo você terá os seguintes objetivos de aprendizagem: Descrever os principais tipos de vestígios biológicos utilizados na identifi cação por DNA dos indivíduos. Identifi car quais são os vestígios biológicos que permitem a análise por DNA. Avaliar e empregar os procedimentos operacionais padrões com a amostra biológica para que sua integridade física seja mantida durante a coleta e conservação. 48 Genética e Biologia Molecular Forense 49 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 2 1 CONTEXTUALIZAÇÃO Caro aluno, você está lembrado da situação que discutimos no início do Capítulo 1? Comentamos sobre um episódio da série Hannibal, mais especifi camente sobre a cena onde um agente do FBI visita Hannibal Lecter em um dos seus famosos jantares e lhe pede uma amostra da comida que foi servida. O intuito do agente era obter provas de que a carne que Lecter servia era de origem humana. Entretanto, vimos que o agente não tomou os devidos cuidados para não contaminar a amostra que ele coletou. Na vida real, portanto, os peritos devem seguir procedimentos operacionais padrão (POPs) para que se evite contaminação, degradação e falta de documentação adequada com as amostras encontradas em um local de crime ou, ainda, aquelas que foram coletadas para testes de paternidade e outras situações. Neste capítulo veremos justamente como fazer isto, quais são os principais vestígios biológicos analisados para fi ns forenses e, o que é e qual a importância da cadeia de custódia. 2 VESTÍGIOS BIOLÓGICOS O estudo dos vestígios constitui um dos pilares da criminalística, uma vez que todo o processo começa a partir dele. Os vestígios biológicos são materiais de origem biológica (sangue, sêmen, pelos etc.) coletados do local do crime para posterior análise genética dos envolvidos na investigação do crime e, vai ajudar a estabelecer, por exemplo, quantas pessoas estavam naquele local e quem eram elas. São fundamentais para a elucidação do crime, com a identifi cação do autor e provas científi cas irrefutáveis frente ao tribunal, na fase processual do inquérito policial, trazendo para a sociedade a sensação de segurança e devida imputabilidadedos autores do fato criminoso (SILVEIRA, 2017). 2.1 FONTES E PRINCIPAIS VESTÍGIOS Uma grande diversidade de amostras biológicas tem sido analisada geneticamente para fi ns forenses, no entanto, as amostras recolhidas nas 50 Genética e Biologia Molecular Forense cenas de crime, muitas vezes, encontram-se degradadas, contêm inibidores ou foram sujeitas a condições ambientais adversas que alteram a estrutura do DNA, diminuindo, assim, a sua qualidade e, consequentemente, reduzindo as chances de sucesso da análise genética. Deste modo, a capacidade de coletar apropriadamente, acondicionar, analisar e preservar as amostras biológicas é crucial para a manutenção da sua integridade. Silva (2014) nos chama atenção para a correta distinção entre os termos “vestígio”, “evidência” e “indício”, pois apesar das diferenças entre eles, é comum a utilização destas palavras como sinônimas. De acordo com Espíndula (2006) os termos são defi nidos assim: • Vestígio é todo objeto ou material bruto encontrado e/ou recolhido no local do crime para ser analisado. • Evidência é o vestígio depois de feitas as análises, onde se constata cientifi camente a sua relação com o crime. • Indício é uma expressão utilizada no meio jurídico, que signifi ca cada uma das informações (periciais ou não) relacionadas com o crime. No Código de Processo Penal, Artigo 239, o indício é defi nido como: “circunstância conhecida e provada, que, tem relação com o fato, autorize, por indução, concluir-se a existência de outra ou outras circunstâncias”. Os vestígios podem ser classifi cados da seguinte maneira (SILVEIRA, 2017): 1. De acordo com a sua relação com o fato: • Ilusórios: estão presentes desde o início das investigações, demandam muito tempo de análise, porém, no fi m, não apresentam relação com o fato. • Forjados: aqueles que o autor do crime prepara para desviar a atenção dos investigadores. • Verdadeiros: aqueles que possuem realmente uma relação com o fato, pois são resultados da ação ou omissão do autor e, cuja interpretação correta ajuda a elucidar o crime. null null 51 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 2 2. De acordo com a sua relação com o autor: • Absolutos: aqueles que permitem estabelecer uma relação direta com o autor do crime. Ex.: impressão digital e sangue. • Relativos: aqueles que possuem relação identifi cável com o autor do crime. 3. De acordo com a sua origem: • Biológicos: materiais de origem biológica como secreções corporais e sangue, entre outros. • Químicos: resultam de transformações na matéria, como no caso de explosões e processamento de drogas. • Físicos/Mecânicos: aqueles onde ocorre uma mudança na forma devido a forças de corpos rígidos ou maleáveis. Como sabemos, o interesse da perícia é encontrar vestígios biológicos que permitam estabelecer a identidade do autor do crime. Estes são, portanto, nosso objeto de estudo neste capítulo, uma vez que são estes que permitem a realização da análise do perfi l genético, pois a partir destas amostras é possível a extração do DNA. Vários tipos de vestígios biológicos podem ser encontrados nos locais de crime (Tabela 1), porém os que são encontrados com maior frequência são manchas de sangue e sêmen. TABELA 1 – VESTÍGIOS BIOLÓGICOS ENCONTRADOS NOS LOCAIS DE CRIME FONTE: Adaptado de Silva (2014, p. 44) Tipos de amostras biológicas que podem ser encontradas no local do crime Exemplos de casos onde podem ser encontradas essas amostras Observações Sangue. Manchas de sangue. Sêmen. Saliva. Urina e fezes. Pelos. Cabelo. Células epiteliais. Homicídio. Crimes violentos. Violação. Tráfi co de pessoas. Exploração sexual. Pode haver riscos associados às amostras. São de fácil contaminação. São de fácil degradação. 52 Genética e Biologia Molecular Forense Outros tipos de vestígios biológicos analisados são: dentes, ossos, unhas e impressões digitais. Podem ser coletados como vestígios presentes no local do crime que está sendo investigado, como de restos mortais e de cadáveres. Em casos extraordinários também pode ser encontrado material de placenta. 2.1.1 Sangue O sangue é a massa líquida contida no aparelho circulatório, que a mantém em movimento regular e unidirecional devido às contrações rítmicas do coração (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). É formado pelas células sanguíneas e pelo plasma. A partir do sangue podem ser retiradas informações como: o grupo sanguíneo, o teor de álcool, a presença de drogas ilícitas, a origem (humana ou de outra espécie), o sentido da agressão (pela forma da gota de sangue). Além disso, é possível efetuar análises toxicológicas e obter o DNA. Em um crime violento, o sangue geralmente é de fácil identifi cação e está em abundância. Em casos onde ele não está tão visível, faz-se o uso de testes presuntivos (ou testes de orientação) para apontar a presença ou ausência de sangue em determinado local, além da dinâmica do crime. Neste caso, são utilizados testes que têm como princípio reações de oxidação que podem detectar a presença de sangue através de cor ou luminescência. O mais conhecido deles faz uso de uma substância chamada luminol. O reagente luminescente reage com o grupo heme da hemoglobina e, após ocorrer reação oxidativa, produz luminescência que é observada por olhos desarmados em ambiente escuro (FILHO; FRANCEZ, 2018). Também pode ser usada a reação das oxidases, onde a água oxigenada vai produzir uma efervescência sobre a mancha quando positivo para a presença de sangue. Nas imagens a seguir, podemos verifi car vestígios de sangue no local no crime, na arma utilizada e na roupa. Também a cena do crime onde foi aplicado o teste do luminol para detectar a presença de sangue, neste caso, a banheira. 53 INTRODUÇÃO À GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE Capítulo 2 FIGURA 24 – VESTÍGIOS DE SANGUE NO LOCAL DO CRIME, NA ARMA UTILIZADA E NA ROUPA FONTE: Lobato (2014, p. 30 e 33) 2.1.2 SÊmen O sêmen é a suspensão de espermatozoides contida no líquido seminal. Antes de secar, o esperma tem odor alcalino muito característico e contém milhões de espermatozoides. Depois de seco, a mancha perde o seu odor, os espermatozoides morrem, adquire uma coloração branco-acinzentada e por vezes amarelada, dando aos tecidos um efeito engomado (ABRAHÃO, 2014). Os crimes sexuais têm uma alta incidência no Brasil. Geralmente o sêmen é encontrado seco, aderido em roupas de cama e peças íntimas e, na forma líquida, em preservativos e na vítima. Na maioria dos casos, a amostra que será examinada é a secreção vaginal da vítima, colhida após o crime ter ocorrido. Diferentes materiais podem ser submetidos à análise: swab vaginal, anal, bucal, roupas e vários tipos de objetos (ABRAHÃO, 2014). No entanto, também pode haver sêmen em peças de vestuário da vítima ou do agressor ou, ainda, no local onde ocorreu a violação, tanto em suportes porosos como não porosos. Podem ser feitos testes de coloração (reações de Florence, Barbério, Corin- Stockis) e dosagem de PSA (Antígeno Prostático Específi co) para indicar a presença de esperma, porém, somente com a visualização dos espermatozoides usando microscópio afi rmamos, com certeza, se tratar de uma amostra de sêmen. Para visualização dos espermatozoides geralmente usa-se a técnica de coloração denominada Christmas Tree (em referência à árvore de Natal), onde as cabeças dos espermatozoides fi cam coradas em vermelho e as células epiteliais em verde. 54 Genética e Biologia Molecular Forense A Figura 25, mostra a fotomicrografi a com amostra de sêmen, onde temos as células epiteliais e entre elas os espermatozoides (indicados pela seta). FIGURA 25 – FOTOMICROGRAFIA COM AMOSTRA DE SÊMEN FONTE: Andrade (2016, p. 130) Assim como o sangue, o sêmen também permite que outras análises possam ser feitas: se a ejaculação foi interna ou externa, origem humana ou não humana,
Compartilhar