Genilton-Alves

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO 
 
GENILTON ALVES DA SILVA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PÃES ENRIQUECIDOS COM FARINHA DE GOIABA COMO 
FERRAMENTA DE ESTUDO DA INCORPORAÇÃO DE 
COMPOSTOS FENÓLICOS EM MELANOIDINAS DE PÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RIO DE JANEIRO 
2015 
 
ii 
 
GENILTON ALVES DA SILVA 
 
 
 
 
 
 
 
 
PÃES ENRIQUECIDOS COM FARINHA DE GOIABA COMO 
FERRAMENTA DE ESTUDO DA INCORPORAÇÃO DE 
COMPOSTOS FENÓLICOS EM MELANOIDINAS DE PÃO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Orientador: Daniel Perrone Moreira 
 
 
 
 
 
 
RIO DE JANEIRO 
2015 
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa 
de Pós-graduação em Ciência de Alimentos do 
Instituto de Química, da Universidade Federal do 
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do título de Mestre em 
Ciência de Alimentos. 
iii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Silva, Genilton Alves da 
 Pães enriquecidos com farinha de goiaba como ferramenta de 
estudo da incorporação de compostos fenólicos em melanoidinas de 
pão / Genilton Alves da Silva -- Rio de Janeiro: UFRJ/IQ, 2015. 
 79f.; il. 
 
 Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal do 
Rio de Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação 
em Química, Rio de Janeiro, 2015. 
 
 Orientador: Daniel Perrone Moreira. 
 
 1. Capacidade antioxidante. 2. Fabricação de pão. 3. 
Fermentação. 4. Reação de Maillard. 5. Melanoidinas. 6. 
Psidium guajava L. I. Perrone, Daniel. (Orient.). III. 
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Química. 
Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos. IV. 
Título. 
iv 
 
Genilton Alves da Silva 
 
 
 
 
PÃES ENRIQUECIDOS COM FARINHA DE GOIABA COMO 
FERRAMENTA DE ESTUDO DA INCORPORAÇÃO DE 
COMPOSTOS FENÓLICOS EM MELANOIDINAS DE PÃO 
 
 
Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira 
 
 
 
 
 
 
Aprovada por: 
 
_____________________________________________ 
 Presidente, Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira, IQ/UFRJ 
 
 
_____________________________________________ 
 Profa. Dra. Cláudia Moraes de Rezende, IQ/UFRJ 
 
 
_____________________________________________ 
 Profa. Dra. Mariana Costa Monteiro, INJC/UFRJ 
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa 
de Pós-graduação em Ciência de Alimentos do 
Instituto de Química, da Universidade Federal do 
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos 
necessários à obtenção do título de Mestre em 
Ciência de Alimentos. 
v 
 
Agradecimentos 
Como já dizia Anitelli: “Sonho parece verdade quando a gente esquece de acordar”. 
Hoje, vivo uma realidade que parece um sonho, mas foi preciso muito esforço, determinação, 
paciência, perseverança, ousadia e maleabilidade para chegar até aqui, e nada disso eu 
conseguiria sozinho. Minha terna gratidão a todos aqueles que colaboraram para que este 
sonho pudesse ser concretizado. 
 Grato a Deus pelo dom da vida, pelo seu amor infinito, sem Ele nada sou. Agradeço 
aos meus pais que são os meus maiores exemplos. Obrigado por cada incentivo e orientação, 
pelas orações em meu favor, pela preocupação para que estivesse sempre andando pelo 
caminho correto. Agradeço a eles por todos os sacrifícios feitos pela minha educação e pelo 
incentivo sempre dado a meus desejos e sonhos. 
À minha irmã por todo amor, carinho, paciência e compreensão que tem me dedicado. 
Obrigado por contribuir com tantos ensinamentos, tanto conhecimento, tantas palavras de 
força e ajuda. Agradeço principalmente por me dar a maior alegria da minha vida que é o meu 
bochechudo Gabriel. 
Ao meu cunhado Leandro que sempre acreditou em mim. Obrigado pelos incentivos e 
pelas palavras de confiança. Também obrigado por ter me dado um sobrinho lindo (rsrs). 
Ao meu ‘avô’ Aloísio que nos deixou, mas sempre estará vivo em nossos corações. 
Obrigado por seus conselhos durante toda a minha vida. 
Ao Professor Daniel que, com muita paciência e atenção, dedicou do seu valioso 
tempo para me orientar em cada passo deste trabalho. Obrigado pela contribuição na minha 
vida acadêmica e por tanta influência na minha futura vida profissional. Quero expressar o 
meu reconhecimento e admiração pela sua competência profissional e minha gratidão por ser 
um profissional extremamente qualificado e pela forma humana que conduziu minha 
orientação. 
 
vi 
 
Ao professor Alexandre pelos conselhos dados durante os seminários e pela orientação 
nas rotinas de análise e atividades do laboratório. 
 
À professora Mariana que no inicio do meu mestrado permitiu a minha participação 
desenvolvimento do pão de goiaba. Obrigado pelos conselhos, dicas e por disponibilizar a 
infraestrutura do CCS. 
 
Aos meus companheiros de laboratório (e de barzinhos) Emília, Ellen, Fabrício, Kim, 
Nívea, Suellen, Laís, Nathália, Andressa, André, Beatriz e Mabel. Obrigado pela paciência, 
pelo sorriso, pelo abraço, pela mão que sempre se estendia quando eu precisava. Esta 
caminhada não seria a mesma sem vocês. 
 
À equipe do LBNA, que direta ou indiretamente me ajudaram nessa caminhada. 
 
Obrigado a todos que, mesmo não estando citados aqui, tanto contribuíram para a 
conclusão desta etapa e para o Genilton que sou hoje. 
 
Agradeço a Deus. 
Agradeço à Vida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vii 
 
RESUMO 
Silva, Genilton Alves. Pães enriquecidos com farinha de goiaba como ferramenta de 
estudo da incorporação de compostos fenólicos em melanoidinas de pão. Rio de Janeiro, 
2015. Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) – Instituto de Química, Universidade 
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015. 
 
Melanoidinas constituem uma classe de compostos que são formados durante o 
processamento térmico dos alimentos através da Reação de Maillard, que ocorre entre 
açúcares redutores e compostos aminados. Esses compostos contribuem para o sabor, aroma e 
cor dos alimentos, principalmente no café e em produtos de panificação. A incorporação de 
compostos fenólicos em melanoidinas de café e a capacidade antioxidante dessas 
melanoidinas têm sido amplamente estudadas, nenhum estudo investigou as melanoidinas de 
pão enriquecidas com farinhas ricas em compostos fenólicos. Esse estudo teve como objetivo 
estudar, pela primeira vez, a incorporação de compostos fenólicos em melanoidinas de pão. 
Para o desenvolvimento do trabalho foram elaborados diferentes pães: pão controle (100% de 
farinha de trigo) e pães de goiaba, na qual foram preparados substituindo a farinha de trigo 
por 10% ou 20% da farinha de trigo por farinha de goiaba, obtida por desidratação do fruto. 
Os pães foram forneados por diferentes intervalos de tempo (37, 47, 57, 67 ou 77 minutos). 
As crostas dos pães foram mecanicamente separadas e enzimaticamente digeridas com 
Pronase E durante 70 h, a 37ºC. O isolamento das melanoidinas foi realizado por 
ultrafiltração, obtendo-se três frações, as quais foram liofilizadas: fração de peso molecular 
elevado, fração de peso molecular intermediário e a fração de peso molecular baixo. Amostras 
da massa dos pães controle e de goiaba foram preparadas com e sem a presença de fermento e 
liofilizadas antes da fase de forneamento. A capacidade antioxidante das frações isoladas foi 
medida por meio dos ensaios FRAP e TEAC. A fermentação afetou significativamente o 
perfil de compostos fenólicos nas massas de pão, na qual seis compostos fenólicos tiveram 
um incremento no seu teor e seis tiveram um decréscimo. O teor de melanoidinas aumentou, 
em média, de 24,1 mg/g a 71,9 mg/g durante o forneamento, mas seu peso molecular 
diminuiu no início do processo e posteriormente aumentou. O enriquecimento do pãobranco 
com farinha de goiaba aumentou a incorporação de compostos fenólicos em até 2,4 vezes. A 
maioria dos compostos fenólicos apresentaram maiores taxas de incorporação do que de 
liberação durante o forneamento, levando a aumentos de 3,3 a 13,3 vezes em fenólicos totais 
ligados às melanoidinas. Os padrões de incorporação sugeriram que hidroxilas fenólicas, mas 
viii 
 
não ligações glicosídicas de compostos fenólicos são clivadas durante o processamento 
térmico. A capacidade antioxidante das melanoidinas dos pães aumentou devido ao 
enriquecimento com farinha de goiaba e a períodos crescentes de forneamento, sendo 
parcialmente atribuída aos fenólicos ligados às estruturas das melanoidinas. Além disso, o 
ensaio FRAP foi mais sensível para medir esse parâmetro do que o ensaio TEAC. A 
incorporação dos compostos fenólicos em melanoidinas de pão foi observado pela primeira 
vez no presente estudo. A capacidade antioxidante das melanoidina de pão foi parcialmente 
atribuída aos compostos fenólicos ligados às estruturas das melanoidinas, sugerindo que 
outras modificações na estrutura das melanoidinas pode desempenhar um papel relevante. 
 
Palavras-chave: capacidade antioxidante; fabricação de pão; fermentação; Reação de 
Maillard; melanoidinas; Psidium guajava L. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ix 
 
ABSTRACT 
Silva, Genilton Alves. Breads enriched with guava flour as a tool for studying the 
incorporation of phenolic compounds in bread melanoidins. Rio de Janeiro, 2015. 
Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) – Instituto de Química, Universidade 
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2015. 
 
Melanoidins are end products generated in the Maillard reaction between reducing sugars and 
compound amino during food thermal processing. These compounds contribute to the flavor, 
aroma and color of foods such as coffee and bakery products. Antioxidant capacity and the 
incorporation of bioactive compounds of melanoidins from coffee have been widely studied, 
but few studies have investigated bread melanoidins, especially in products containing 
phenolic-rich flours. In the present study we aimed at studying, for the first time, the 
incorporation of phenolic compounds into bread melanoidins. Control bread was prepared 
with 100% wheat flour, while guava bread was prepared by partially substituting wheat flour 
by 10% or 20% guava flour, obtained by dehydration of the fruit. Breads were baked for 37, 
47, 57, 67 or 77 minutes. Bread crust were mechanically separated and enzymatically digested 
with Pronase E for 70 h at 37ºC. Isolation of melanoidins was performed by ultrafiltration, 
yielding three fractions, which were freeze dried: high molecular weight fraction, intermediate 
molecular weight fraction and low molecular weight fraction. Dough samples of control and 
guava breads were analyzed with and without yeast and freeze-dried before the baking step. 
The antioxidant capacity of the isolated fractions were measured by FRAP and TEAC assays. 
Fermentation significantly affected phenolics profile of bread doughs. Melanoidins contents 
continuously increased from 24.1 mg/g to 71.9 mg/g during baking, but their molecular 
weight decreased at the beginning of the process and increased thereafter. Enrichment of 
white wheat bread with guava flour increased the incorporation of phenolic compounds up to 
2.4-fold. Most phenolic compounds showed higher incorporation than release rates during 
baking, leading to increases from 3.3- to 13.3-fold in total melanoidin-bound phenolics. 
Incorporation patterns suggested that phenolic hydroxyls, but not glycosidic bonds of 
melanoidin-bound phenolics are cleaved during thermal processing. Antioxidant capacity of 
bread melanoidins increased due to enrichment with guava flour and increasing baking 
periods and was partially attributed to bound phenolics. Moreover, FRAP assay was more 
sensitive to measure this parameter than TEAC assay. The incorporation of phenolic 
compounds into bread melanoidins was observed for the first time in the present study. The 
x 
 
antioxidant capacity of bread melanoidins was partially attributed to bound-phenolic 
compounds, suggesting that other modifications in the structure of melanoidins might play a 
relevant role. 
 
Keywords: antioxidant capacity; bread making; fermentation; Maillard Reaction; 
melanoidins; Psidium guajava L. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xi 
 
PUBLICAÇÕES 
Artigo submetido a periódico 
1. Alves, G.; Perrone, D. Breads enriched with guava flour as a tool for studying the 
incorporation of phenolic compounds in bread melanoidins. Food Chemistry. 2015. 
Resumos publicados em anais de congressos: 
 
 
1. Alves, G.; Perrone, D. Determinação do método de extração das melanoidinas de pão. 
Chem Rio 2014 Symposium, Rio de Janeiro, Brasil, 2014. 
 
2. Alves, G.; Perrone, D. Effect of baking on melanoidins contents and their antioxidant 
capacity in breads incorporated with guava flour. 17th IUFoST World Congress of 
Food Science and Technology, Montreal, Canadá, 2014. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xii 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Capítulo 1 
Figura 1. Esquema da Reação de Maillard proposto por Hodge (1953).................... 19 
Figura 2. Estrutura do hidroximetilfurfural (HMF).....................................................20 
Figura 3. Estrutura da furosina.....................................................................................20 
Figura 4. Estrutura da carboximetilisina (CML) .........................................................21 
Figura 5. Via metabólica do ácido chiquímico ........................................................... 28 
Figura 6. Estrutura dos principais tipos de flavonoides............................................... 30 
Figura 7. Estruturas químicas das principais classes não flavonoides..........................31 
Figura 8. Mecanismo de transferência de hidrogênio.................................................. 33 
Figura 9. Mecanismo de transferência de elétrons....................................................... 33 
Figura 10. Estrutura do ABTS
+
 (2, 2´azinobis 3 etilbenzotiazolino 6 sulfônico)....... 33 
Figura 11. Reação do ensaio de FRAP........................................................................ 34 
Figura 12. Goiaba vermelha (Psidium guajava L.)...................................................... 35 
Figura 13. Distribuição das goiabas nas bandejas da estufa de circulação forçada de 
ar................................................................................................................................... 38 
Figura 14. Pão branco (A) e pão enriquecido com farinha de goiaba (B).................... 39 
 
Capítulo 2 
Figure 1. Time-temperature curves from mixing, fermentation and baking steps of 
bread making. The inner smaller chart shows that the amount of heat transferred to 
doughs during baking (calculated as AUC of baking step) significantly increased with 
longer baking periods (ANOVA, p<0.05).................................................................... 57 
Figure 2. Incorporation patterns of phenolic compounds (μg/g) in melanoidins of 
control bread (■), guava bread 10% (GB10) (■) and guava bread 20% (GB20) (■): 
naringenin incorporation between intermediate (IMWF) and high molecular weight 
fraction (HMWF) melanoidins (A); incorporation of total phenolic compounds (B); 
incorporation patterns of rutin and quercetin, showing no cleavage of glycosidic bond 
(C); two-phase incorporation pattern of ferulic acid (D); incorporation patterns of 
gallic and 3,4-dihydroxybenzoic acid, showing cleavage of phenolic hydroxyl bond 
(E); incorporation pattern of 2,4-dihydroxybenzoic acid (F)...................................... 61 
 
xiii 
 
Figure 3. Antioxidant capacity measured by FRAPand TEAC assays of intermediate 
(IMWF) and high molecular weight fraction (HMWF) melanoidins of control bread 
(■), guava bread 10% (GB10) (■) and guava bread 20% (GB20) (■) baked for 37 to 77 
min. Different letters indicate significant difference between types of breads at the 
same baking time and asterisks indicate significant effect of baking time compared to 
37 min for the same type of bread (two-way ANOVA followed by Dunn’s multiple 
comparison post-hoc test, p<0.05)............................................................................... 64 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
xiv 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Capítulo 1 
Tabela 1. Visão de algumas classes de compostos aromáticos derivados da Reação de 
Maillard ....................................................................................................................... 22 
Tabela 2. Propriedades químicas de melanoidinas investigadas em alimentos.......... 25 
Tabela 3. Resumo das atividades biológicas descritas para melanoidinas.................. 26 
Tabela 4. Fontes alimentares de compostos fenólicos de plantas................................ 29 
 
Capítulo 2 
Table 1. Free and bound phenolic compounds (mg/100g) in wheat and guava 
flours
1
........................................................................................................................... 51 
Table 2. Phenolic compounds (mg/100g) in control and guava bread (GB) dough 
formulations................................................................................................................. 52 
Table 3. Effect of dough fermentation, guava flour enrichment and baking time on the 
relative contents (%) of high (HMWF), intermediate (IMWF) and low molecular 
weight fractions (LMWF)............................................................................................ 53 
Table 4. Phenolic compounds (µg/g) in intermediate molecular weight (IMWF) and 
high molecular weight fractions (HMWF) of control and guava (GB) unfermented and 
fermented bread doughs
1
.............................................................................................. 55 
Table 5. Phenolic compounds (µg/g) in high molecular weight fraction (HMWF) 
melanoidins of control and guava (GB) bread crusts during baking
1
.......................... 59 
Table 6. Phenolic compounds (µg/g) in intermediate molecular weight fraction 
(IMWF) melanoidins of control and guava (GB) bread crusts during baking
1
............ 60 
 
 
 
 
 
 
 
xv 
 
 
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 
 
ABIP Associação Brasileira da Indústria de Panificação e Confeitaria 
ABTS 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt 
AC Antioxidant Capacity 
ANOVA Análise de Variância 
CADEG Centro de Abastecimento do Estado da Guanabara 
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 
CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Arranjo de 
Diodos 
DAD Detector de Arranjo de Diodos 
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid 
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power 
GB Guava Bread 
HMF Hidroximetilfurfural 
HMWF High Molecular Weight Fraction 
HPLC High Performance Liquid Chromatography 
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística 
IMWF Intermediate Molecular Weight Fraction 
LMWF Low Molecular Weight Fraction 
MRPs Maillard Reaction Products 
MW Molecular Weight 
ND Not detected 
PA Produtos de Amadori 
POF Pesquisa de Orçamento Familiar 
RM Reação de Maillard 
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity 
TPTZ 2,4,6-tripyridyl-S-triazine 
TROLOX 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid 
UV Ultravioleta 
 
 
 
xvi 
 
SUMÁRIO 
Capítulo 1 
 1. Revisão bibliográfica ............................................................................................. 18 
 1.1. Visão geral da Reação de Maillard .................................................................... 18 
 1.2. Melanoidinas ..................................................................................................... 23 
 1.3. Compostos fenólicos.......................................................................................... 27 
 1.4. Capacidade Antioxidante ................................................................................... 32 
 1.5. Goiaba (Psidium guajava L.) ............................................................................ 35 
 1.6. Pão ..................................................................................................................... 36 
 2. Objetivos ................................................................................................................. 37 
 3. Materiais e Métodos .............................................................................................. 38 
 3.1. Preparo da farinha de goiaba ............................................................................. 38 
 3.2. Pães .................................................................................................................... 38 
 3.3. Análise de compostos fenólicos livres e conjugados nas farinhas de trigo e 
goiaba ........................................................................................................................... 39 
 3.4. Extração e isolamento das melanoidinas das crostas dos pães .......................... 41 
 3.5. Análise dos compostos fenólicos incorporados nas melanoidinas dos pães ..... 41 
 3.6. Capacidade antioxidante .................................................................................... 42 
 3.7.Análise estatística ............................................................................................ 42 
 
Capítulo 1 
 1. Introduction ........................................................................................................... 18 
 2. Materials and methods .......................................................................................... 45 
 2.1. Standards and chemicals .................................................................................... 45 
 2.2. Breads ................................................................................................................ 45 
 2.3. Analysis of free and bound phenolic compounds in wheat and guava 
flours…......................................................................................................................... 46 
 2.4. Extraction and isolation of bread crust melanoidins ......................................... 41 
 2.5. Analysis of phenolic compounds incorporated in bread crust melanoidins ...... 41 
 2.6. Antioxidant capacity .......................................................................................... 42 
 2.7. Statistical analysis ............................................................................................ 49 
 3. Results and discussion........................................................................................... 49 
 3.1. Wheat and guava flours .................................................................................... 49 
 3.2. Doughs ............................................................................................................. 52 
xvii 
 
 3.3. Baking............................................................................................................... 56 
 3.4. Antioxidant capacity......................................................................................... 63 
4. Conclusions.............................................................................................................65 
5. Referências bibliográficas.......................................................................................6717 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 1 
 
Revisão Bibliográfica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
1.1.Visão geral da Reação de Maillard 
A Reação de Maillard (RM), também conhecida como o escurecimento não 
enzimático, é uma rede complexa de reações, inicialmente investigada em 1912, pelo químico 
francês Louis-Camille Maillard, o qual relatou as reações entre aminoácidos livres com 
açúcares redutores que ocorrem com o aumento da temperatura ao longo do tempo (Maillard, 
1912). No entanto, só em 1953, Hodge apresentou o primeiro esquema de reação global, 
dividido em três fases, no qual foi demonstrado que a química relacionada à RM é de fato 
complexa, englobando não uma via de reação, mas toda uma rede de reações (Figura 1) 
(Hodge, 1953). 
Na fase inicial ocorre a reação entre um açúcar redutor, como a glicose, que se 
condensa com um grupamento amino livre, presente em aminoácidos e peptídeos, resultando 
na formação de um produto de condensação, uma glicosilamina N-substituída. A 
glicosilamina, por rearranjo, origina a base de Schiff, e, posteriormente, os Produtos de 
Amadori (PA) (Hodge, 1953). 
Na fase intermediária, diversos tipos de reações ocorrem, como ciclização, 
desidratação e retroaldolização. Dependendo do pH reacional, os PA são degradados e geram 
compostos altamente reativos. Em pH ácido, a reação segue a via 1,2-enominol, que irá gerar 
hidroximetilfurfural (HMF) ou furfural. Já em pH alcalino, a reação segue a via 2,3-enodiol, 
na qual uma série de compostos de baixo peso molecular são gerados, tais como acetilas, 
diacetilas e piruvaldeído (Hodge, 1953). A degradação de Strecker ocorre nessa etapa e gera 
aldeídos que podem condensar-se com diversos componentes presentes, como fragmentos de 
açúcar, furfurais ou produtos de desidratação (Finot, 2005). Apesar do caminho da degradação 
de Strecker não ser a principal reação de geração de cor, essa via é responsável pela origem 
dos off-flavours geralmente associados com a RM. (Finot, 2005; Morales & Van Boekel, 
1997). 
Na etapa final, os produtos de baixo peso molecular se polimerizam, conduzindo à 
formação, dentre outros compostos, de moléculas nitrogenadas denominadas melanoidinas 
(Hodge, 1953). 
 
19 
 
Figura 1: Esquema da Reação de Maillard proposto por Hodge (1953) 
 
O desenvolvimento do escurecimento ocorre após um período de indução, 
caracterizado pela produção de compostos intermediários incolores fluorescentes 
denominados fluoróforos. Os fluoróforos são considerados precursores do pigmento castanho 
e permitem detectar o progresso da reação antes de ocorrer qualquer mudança visual 
(Matiacevich & Buera, 2006). A fluorescência, a partir da RM, é atribuída a estruturas 
moleculares com ligações complexas entre carbono e nitrogênio, e a contribuição da 
caramelização do açúcar para fluorescência global é insignificante em sistemas contendo 
aminoácidos (Rozycki et al., 2010). 
Além dos compostos fluorescentes outras moléculas são geradas durante a RM, como 
o hidroximetilfurfural (HMF), furosina e o carboximetilisina (CML). O HMF (Figura 2) é 
formado pela degradação de hexoses a temperaturas elevadas e em condições ácidas (Arribas-
Lorenzo & Morales, 2010). 
 
20 
 
Figura 2: Estrutura do hidroximetilfurfural (HMF) 
 
A formação de HMF está diretamente ligada à intensidade do calor aplicado ao 
alimento, e por não estar normalmente presente em alimentos crus e frescos, esse composto é 
considerado um marcador de dano térmico para os produtos que contêm altas concentrações 
de carboidratos (Rufian-Henares & Delgado-Andrade, 2009). Além disso, pode ser utilizado 
para monitorar o processo térmico aplicado aos vários produtos alimentares, tais como 
cereais, massas e produtos de panificação (Rufian-Henares et al., 2006). 
A furosina (ε-N-2-furilmetil-L-lisina) (Figura 3) presente nos alimentos é influenciada 
pelo tipo de tratamento térmico e/ou o tempo de armazenamento (Friedman, 1996). Níveis de 
furosina tendem a diminuir depois de um armazenamento prolongado, ou depois de 
sobreaquecimento para dar origem a outros compostos tais como CML (Delgado-Andrade et 
al., 2005; Friedman, 1996; Rufian-Henares et al., 2009). 
 
 
Figura 3: Estrutura da furosina (ε-N-2-furilmetil-L-lisina) 
 
A furosina é um indicador importante e específico da fase inicial da RM. Esses 
compostos são formados pela interação do grupo ε-amino da lisina com glicose, lactose ou 
maltose resultando respectivamente em frutose-lisina, lactulose-lisina e maltose-lisina com 
consequente perda do grupamento amino no início da RM (Guerra-Hernandez, Corzo & 
Garcia-Villanova, 1999). Por esta razão, a estimativa do dano das proteínas causada pelo 
aquecimento é geralmente baseada na determinação da quantidade de furosina formada 
(Rufian-Henares et al., 2004, Delgado-Andrade, 2005; Guerra-Hernandez et al., 1999). 
21 
A carboximetilisina (N-ε-carboximetilisina) é um indicador dos produtos finais da RM 
e da qualidade nutricional de produtos que sofreram intenso tratamento térmico (Charissou et 
al., 2007) (Figura 4). A CML pode ser formada pela oxidação da furosina, a partir do 
metilglioxal, da peroxidação lipídica ou pelo glioxal, um produto da autoxidação de açúcares 
(Ames, 2008). 
 
 
Figura 4. Estrutura da carboximetilisina (CML) 
 
A RM pode ocorrer também em sistemas biológicos e os seus produtos finais são 
denominados produtos de glicação avançada (AGEs). Os AGEs constituem uma grande 
variedade de substâncias formadas a partir de interações amino-carbonila, de natureza não-
enzimática, entre açúcares redutores ou lipídeos oxidados e proteínas, aminofosfolipídeos ou 
ácidos nucléicos (Goldberg et al., 2004). A via da glicação em organismos vivos está ligada 
ao metabolismo da glicose e da peroxidação lipídica (Nass et al., 2007). 
Os AGEs estão implicados em modificações fisiopatológicas que ocorrem na diabetes 
(Nass et al., 2007), aterosclerose (Xanthis, Hatzitolios, Koliakos & Tatola, 2007) e doenças 
neurodegenerativas (Munch, Foley, Schinzel & Riederer, 1997). Esses compostos podem 
causar danos aos tecidos por modificar a função da proteína devido às alterações em sua 
estrutura (Nass, 2007), modificar o tecido em si, devido às ligações cruzadas (cross-links) 
inter e intra-molecular (Haslbeck et al., 2004), favorecer a formação de radicais livres e 
induzir resposta inflamatória após ligarem-se a receptores específicos (Uribarri et al., 2005). 
Diversos fatores podem interferir na RM. A extensão da RM é proporcional à 
intensidade do tratamento térmico durante o processamento dos alimentos, quando as 
temperaturas podem variar entre 100 e 250 ºC (Gerrard, 2002a). A atividade da água (a reação 
é favorecida entre 0,5 e 0,8), assim como a presença de metais são outros fatores que afetam a 
velocidade da RM (Sherwin & Labuza, 2003). 
Além desses fatores, a composição do alimento também influência na ocorrência da 
22 
RM. O tipo de açúcar redutor interfere na velocidade de reação com os grupamentos amina, 
sendo o açúcar redutor mais reativo a xilose, seguida de arabinose, glicose, maltose e frutose, 
indicando que as pentoses são mais reativas do que as hexoses. Ainda, os açúcares redutores 
diferem na via de escurecimento, sendo que as cetoses são mais reativas para a formação de 
produtos de Heyns, enquanto as aldoses o são para a formação de produtos de Amadori 
(Buera, Chirife, Silva, Resnik & Wetzler, 1987). Além dos açúcares, os tipos de aminoácidos 
também interferem na velocidade de reação. A lisina é a mais reativa quando comparada aos 
outros aminoácidos, devido à presença de grupamentos α e ε-amino em sua estrutura. Na 
sequência, os aminoácidos básicos e não polares (arginina, fenilalanina, leucina, isoleucina e 
valina) são os mais reativos, seguidos dos aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido 
aspártico) (Kwak & Lim, 2004). 
É sabido quea RM é uma das principais reações resultantes do processamento térmico 
dos alimentos. Portanto, seu estudo tem sido um desafio central e importante na indústria de 
alimentos, uma vez que essa reação está relacionada com o aroma, sabor e cor dos alimentos, 
principalmente em processos tradicionais, como a torrefação dos grãos de café e do cacau e o 
forneamento de produtos de panificação e bolos (Gerrard, 2002b). A Tabela 1 apresenta as 
principais classes de compostos de baixo peso molecular que são gerados na fase 
intermediária da RM e que são associados ao flavor e sabor dos alimentos. 
 
Tabela 1: Classes de compostos aromáticos derivados da Reação de Maillard e relacionados 
ao sabor e aroma de alimentos processados termicamente. 
Classe Sabor/aroma Alimentos 
Pirazinas 
Cozido, assado, torrado, 
cereais cozidos. 
Alimentos cozidos em geral 
Alquilpirazinas Nozes, torrado Café 
Alquilpiridinas 
Amargo, adstringente, 
queimado. 
Café, produtos de panificação e 
malte 
Acilpiridinas Cracker-like Cereais 
Pirróis Cereal-like Cereais e café 
Furanos, furanonas, piranonas Doce, queimado, pungente Alimentos cozidos em geral 
Oxazóis nozes, doce Cacau, café e carnes 
Adaptado de Boekel (2006) 
 
 
23 
Alguns compostos produzidos durante a reação, como o metilglioxal, são nocivos devido 
à sua toxicidade e efeito mutagênico (Nagao, Takahashi, Yamanaka & Sugimura, 1999). 
Além disso, existem evidências relativas à implicação da RM na formação de compostos 
carcinogênicos, como a acrilamida (Stadler et al., 2002; Mottram, Wedzicha & Dodson, 
2002). Contudo, não existe um consenso sobre a necessidade de estabelecer limites de 
ingestão de compostos tóxicos gerados na RM. Hufian-Henares et al. (2006) sugerem que o 
consumo deveria se limitar a em torno de 45 mg/kg de peso do indivíduo. Os efeitos 
deletérios desses compostos podem ser diminuídos ou prevenidos pela formação de produtos 
da RM, de natureza antioxidante, como as melanoidinas (Griffith & Johnson, 1957). 
1.2. Melanoidinas 
As melanoidinas são macromoléculas heterogêneas presentes em diversos alimentos 
termicamente processados como café, malte torrado, cereais matinais e produtos de 
panificação (Adams, Borrelli, Fogliano & Kimpe, 2005). Um estudo recente estimou que a 
ingestão de melanoidinas pela população de países ocidentais é de aproximadamente 12,2 g 
por dia, considerando-se todas as fontes dietéticas (Pastoriza & Rufián-Henares, 2014). 
 Essas moléculas são responsáveis pelo desenvolvimento da cor (Rizzi, 1997), podem 
contribuir para a textura dos alimentos e desempenhar um papel na ligação de metais 
nutricionalmente importantes como o zinco e o magnésio (O’Brien & Morrissey, 1997). 
Muitas pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de determinar a estrutura e as 
propriedades químicas das melanoidinas, mas os dados disponíveis na literatura ainda são 
escassos (Rufian-Henares & Morales, 2007a). 
Diferentes hipóteses têm sido propostas para descrever a estrutura-base das 
melanoidinas. A primeira afirma que o esqueleto das melanoidinas seria constituído, 
principalmente, a partir de produtos da degradação de açúcares, polimerizados através da 
condensação de aldopentoses (Kato & Tsuchida, 1981). Já Tressl et al. (1998) propuseram um 
complexo estrutural macromolecular consistindo de unidades de repetição de furanos e 
pirróis, ligados por meio de reações de policondensação. Finalmente, Hofmann (1998) 
identificou cromóforos de baixo peso molecular e postulou que a geração de melanoidinas 
ocorreria por uma reação de reticulação entre essas substâncias de baixo peso molecular e 
biopolímeros de elevado peso molecular, tais como proteínas. 
Uma boa maneira de investigar a reação de escurecimento não enzimático em 
24 
alimentos é a utilização de sistemas-modelo em que os açúcares e os aminoácidos estão sob 
condições reacionais simplificadas (Echavarría et al., 2001). Esses estudos procuram entender 
o desenvolvimento da RM com alteração de uma única variável, tais como o tempo de 
aquecimento, pH e razão dos reagentes (Oh et al., 2006; Carabasa-Giribet & Ibarz-Ribas, 
2000). 
Esses modelos fornecem informações valiosas sobre a formação das melanoidinas, 
porém existem razões para que a pesquisa não deva ser limitada aos sistemas-modelo. A 
principal delas é que esses modelos não assemelham-se à RM em alimentos devido à 
complexidade da composição dos alimentos que não é levada em consideração (Andriot et al., 
2004). Nunes & Coimbra (2007) observaram que a formação das melanoidinas do café 
durante a torrefação teve o envolvimento de diferentes componentes presentes no grão na 
RM, como os polissacarídeos (galactomananas e arabinogalactanas), sacarose (após inversão), 
aminoácidos, proteínas (proteínas da parede celular e de estoque) e ácidos clorogênicos. 
Um estudo sobre a degradação térmica realizado por Adam et al. (2005) em matrizes 
alimentares verificou que as frações isoladas das melanoidinas consistia principalmente de 
compostos gerados a partir de carboidratos e de seus produtos de degradação. Além de 
proteínas, outros componentes dos alimentos foram incorporados na estrutura das 
melanoidinas, bem como, produtos de oxidação lipídica no caso de melanoidinas de polpa de 
tomate processada e compostos fenólicos no caso de melanoidinas de café. 
O isolamento das melanoidinas pode ser realizado com base no seu peso molecular 
sendo as principais técnicas a diálise, cromatografia de permeação em gel e ultrafiltração 
(Fogliano & Morales, 2011). A principal diferença entre os métodos se dá pelo rendimento 
alcançado. Segundo Hofmann (2001), compostos de baixo peso molecular podem reagir 
durante a diálise, originando estruturas de peso molecular mais elevado e com isso o teor final 
de melanoidinas é aumentado. A aplicação de cromatografia de permeação em gel (por 
exemplo, Shephadex G-25) poderia subestimar os níveis de melanoidinas devido à baixa 
quantidade de amostra analisada (Hofmann, 2001). Já a técnica de ultrafiltração tem como 
vantagens ser um método simples, com alto rendimento/taxa da amostra processada e baixa 
contaminação (Echavarría et al., 2001). 
O teor de melanoidinas é muitas vezes determinado “por diferença”, sendo equivalente 
à quantidade que permanece após a subtração dos compostos conhecidos (carboidratos, 
proteínas, cafeína, etc.), a partir do material inicial. Outra maneira de quantificar esses 
compostos é avaliando a sua absorbância a 405 nm, um comprimento de onda escolhido 
arbitrariamente, no qual a intensidade da cor marrom é medida (Bekedam et al., 2006). A 
25 
maioria dos estudos sobre distribuição das melanoidinas no café relata que as frações de peso 
molecular alto e intermediário respondem por 59% no café enquanto a de peso molecular 
baixo representa 41% (Nunes et al., 2007; Bekedam et al., 2007). 
A solubilidade das melanoidinas depende da natureza dos reagentes e do tamanho do 
polímero: aquelas moléculas que têm um peso molecular muito elevado são muitas vezes 
insolúveis (Morales, Somoza & Fogliano, 2012). A Tabela 2 apresenta a solubilidade das 
melanoidinas presentes em diferentes matrizes alimentares. 
 
Tabela 2: Solubilidade das melanoidinas investigados em alimentos 
Alimentos Solubilidade em água Referências 
Café Alta Bekedam et al. (2008) 
Molho de soja Moderada Wang et al. (2007); Homma et al. (1998) 
Pão Baixa Borrelli et al. (2003) 
Nozes e sementes Baixa Açar et al. (2009) 
Cacau Moderada Summa et al. (2008) 
Leite Moderada Calligaris et al. (2004) 
Cerveja preta Alta Rivero et al. (2005) 
Vinagre balsâmico Moderada Falcone & Giudici (2008) 
Vinho doce Moderada Ortega-Heras & Gonzalez-Sanjosé (2009) 
 
Em produtos de panificação, as melanoidinas são formadas por ligações cruzadas entre 
as proteínas do glúten e produtos coloridos da reação de Maillard, estando presentes apenas na 
superfície (casca ou crosta) do produto. As melanoidinasde pães são insolúveis em água, 
sendo eficientemente extraídas em água somente após digestão enzimática (Borrelli & 
Fogliano, 2005; Lindenmeier et al., 2002). 
O impacto das melanoidinas na saúde humana foi historicamente negligenciado, uma 
vez que essas moléculas eram consideradas constituintes alimentares inertes ou anti-
nutricionais. Nos últimos anos, entretanto, têm surgido evidências crescentes de propriedades 
benéficas, tais como a capacidade antioxidante, atividade prebiótica e antimicrobiana (Tabela 
3). 
 
 
26 
 
Tabela 3: Resumo das atividades biológicas descritas para melanoidinas 
Atividade biológica Referências 
Atividade antioxidante Delgado-Andrade et al. (2005), 
Rufiàn-Henares & Morales (2007), 
Borrelli et al. (2002) 
Atividade desmutagênica e antitumoral Kato et al. (1985), 
Inibição da conversão da enzima angiotensina I 
(atividade antihipertensiva) 
Rufiàn-Henares &Morales (2007a) 
Atividade antimicrobiana Rufian-Henares & de la Cueva (2009), 
Rufian-Henares & Morales (2008). 
Prebiótica e modulação da população colônica Ames et al. (1999), Borrelli & Fogliano 
(2005) 
Anticariogênica Daglia et al. (2002) 
 
Rufiàn-Henares & Morales (2007a) observaram, a partir de um estudo in vitro, que as 
melanoidinas presente no café podem inibir a atividade da enzima conversora da angiotensina 
I, o que está relacionado ao controle da pressão arterial. Essa atividade inibitória é 
provavelmente devida aos compostos de baixo peso molecular ligados quimicamente à 
estrutura das melanoidinas. 
Borrelli & Fogliano (2005) relataram que as melanoidinas presentes na crosta do pão 
pode ser metabolizadas/fermentadas pela microflora do intestino grosso humano aumentando 
o crescimento das bifidobactérias, apresentando potencial de atuação prebiótica semelhante a 
das fibras dietéticas. 
Rufián-Henares & Morales (2007b) observaram que a simulação da digestão 
gastrointestinal promoveu a liberação de compostos de baixo peso molecular ligados à estrutura 
das melanoidinas de café. Tais compostos de baixo peso apresentaram uma maior atividade 
antioxidante em comparação aos compostos ligados ionicamente às melanoidinas. Outro estudo 
demonstrou que após 24 h de fermentação in vitro das frações de café de alto peso molecular 
com microrganismos do intestino, aproximadamente 25% da atividade antioxidante inicial 
ainda estava presente (Reichardt et al., 2009). 
Embora a maioria dos mecanismos de ação permaneça obscura, muitas destas 
atividades têm sido atribuídas aos compostos bioativos incorporados à estrutura das 
melanoidinas durante a RM (Fogliano & Morales, 2011). 
Delgado-Andrade et al. (2005a) relataram que compostos fenólicos presentes no café 
27 
se ligam de forma não covalente (ligação iônica) à estrutura das melanoidinas contribuindo 
assim, em parte, para o aumento da atividade antioxidante. Em um outro trabalho do mesmo 
grupo (Delgado-Andrade et al., 2005b) concluiu-se que mais de 50% da atividade 
antioxidante das melanoidinas de café é devido aos compostos de baixo peso molecular que 
ligados de forma não-covalente à estrutura das melanoidinas. Além disso, verificou-se que a 
carga negativa das melanoidinas de café não poderia ser causada somente pelos ácidos 
urônicos presentes na estrutura das arabinogalactanas, mas também por outros grupos 
presentes carregados negativamente, como o ácido quínico (Bekedam et al., 2008). 
Diferentemente de Delgado-Andrade et al. (2005a), Bekedam et al. (2008) observaram 
a incorporação dos ácidos clorogênicos em melanoidinas de café através de ligações 
covalentes, clivadas após o processo de saponificação. Nunes & Coimbra (2007) também 
identificaram e quantificaram compostos fenólicos liberados de frações de alto peso molecular 
do café após fusão alcalina. 
Um estudo realizado por Perrone et al. (2012) observou que os compostos fenólicos 
são incorporados nos estágios iniciais da torrefação do café, sendo parcialmente oxidados e 
degradados em etapas posteriores. Além disso, esse estudo verificou que, apesar de menos de 
1% do teor de ácidos clorogênicos originalmente presente nos grãos de café verde terem sido 
incorporados nas melanoidinas durante a torrefação, o teor de compostos fenólicos ligados às 
melanoidinas aumentou durante esse processo, atingindo 29% do total de compostos fenólicos 
presentes na bebida preparada com grãos de torra escura. 
Outros estudos relaram a diminuição da incorporação dos compostos fenólicos em 
função do tempo de torrefação dos grãos do café (Nunes & Coimbra, 2002; Borreli et al., 
2002). Pino-García et al. (2012) relataram que a diminuição da atividade antioxidante com o 
aumento do tempo de torrefação é devido a uma menor incorporação de compostos de baixo 
peso molecular. 
1.3.Compostos fenólicos 
Os compostos fenólicos são originados do metabolismo secundário das plantas, sendo 
essenciais para o seu crescimento, reprodução e pigmentação. Formam-se em condições de 
estresse como, infecções, ferimentos, radiação ultravioleta, dentre outros (Naczk & Shahidi, 
2004). São substâncias que possuem pelo menos um anel aromático no qual ao menos um 
hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila, e são sintetizados a partir da 
28 
fenilalanina e da tirosina através da via do ácido chiquímico (Figura 5) ( r mer et al., 2003). 
 
 
Figura 5: Via metabólica do ácido chiquímico (Adaptado de r mer et al., 2003). 
 
Os compostos fenólicos são responsáveis por importantes características sensoriais dos 
alimentos e bebidas derivados de plantas, particularmente propriedades de cor e sabor 
(Tabela 4) (Naczk & Shahidi, 2006). Eles também são relacionados a benefícios à saúde 
associados ao consumo de dietas ricas em frutas e vegetais ou bebidas de origem vegetal 
(como chá, café, vinho e sucos naturais) (Rice-Evans, 1996). 
Uma série de benefícios para a saúde, como a redução do risco de desenvolvimento de 
doenças cardiovasculares e diabetes tipo 2 (D’Archivio et al., 2010; Ranheim & Halvorsen, 
2005), mal de Alzheimer (Arendash et al., 2009), mal de Parkinson (Eriksen, Wszolek & 
Petrucelli, 2005) têm sido associados com o consumo de alimentos ricos com compostos 
bioativos. 
 
 
 
 
 
 
29 
Tabela 4: Fontes alimentares de compostos fenólicos de plantas 
Compostos fenólicos Fontes alimentares 
 Ácidos fenólicos 
Ácidos hidroxicinâmicos Café, cenoura, cereais, pêra, cerejas, frutas 
cítricas, sementes oleaginosas, pêssegos, 
ameixas, espinafre, tomate e berinjela 
 
Ácidos hidroxibenzóicos Cereais e oleaginosas 
 Flavonoides 
Antocianinas Amoras, cerejas, uvas e morangos 
Flavonas Frutas cítricas, aipo, salsa e espinafre 
Flavonóis Maçãs, feijão, amoras, alface, cebola, 
azeitona, pimentão, tomates e trigo 
Flavanonas Frutas cítricas 
Flavanóis Maçãs, uvas, cebola e alface 
Isoflavonas Soja 
Xantonas Manga 
 Taninos 
Condensados Maçãs, uvas, pêssegos e pêra 
Hidrolisáveis Romã e framboesa 
Fonte: Naczk & Shahidi (2006) 
 
Os compostos fenólicos apresentam, em sua estrutura, vários grupos benzênicos 
característicos, tendo como substituintes grupamentos hidroxilas (Hernández & Prieto, 1999). 
Esta classe de compostos apresenta uma grande diversidade e divide-se em flavonoides 
(polifenóis) e não-flavonoides (fenóis simples ou ácidos fenólicos) (Cheynier, 2005). 
Os flavonoides possuem uma estrutura básica formada por C6-C3-C6, conhecida 
como difenil propano, com 15 átomos de carbono arranjados em três anéis, identificados 
como A, B e C, e ocorrem naturalmente nos alimentos vegetais, sendo, portanto, componentes 
usuais da dieta humana. Consistem de dois anéis aromáticos interligados por três carbonos 
que geralmente forma uma estrutura heterocíclica oxigenada. O grau de oxidação e o padrão 
de substituição do anel heterocíclico C definem as classes de flavonoides (Figura 6) e dentro 
destas o padrão desubstituição nos anéis A e B determinam os compostos específicos 
(Rhodes, 1996; Rice-Evans, 1996). 
30 
 
Figura 6: Estrutura dos principais tipos de flavonoides 
 
A principal forma em que os flavonoides ocorrem na natureza é na forma glicosídica. 
Quimicamente, os flavonoides são doadores de elétrons, por apresentam estruturas químicas 
conjugadas em anel, ricas em grupos hidroxilas, que têm potenciais ações antioxidantes por 
reagirem e inativarem ânions superóxido, peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio singlete 
(
1
O2) e/ou estabilizar radicais livres envolvidos no processo oxidativo através da hidrogenação 
ou complexação com espécies oxidantes (Jiménez et al., 2009). 
Os compostos classificados de não flavonoides são moléculas geralmente bastante 
simples, tais como os ácidos fenólicos (os quais são subdivididos em ácidos benzóicos e 
ácidos hidroxicinâmicos) e de estilbenos, mas também incluem moléculas complexas 
derivadas a partir deles (por exemplo, oligômeros de estilbeno, galotaninos, elagitaninos e 
ligninas) (Figura 7) (Cheynier, 2005). 
 
 
31 
 
Figura 7: Estruturas químicas das principais classes não flavonoides. 
 
Os ácidos fenólicos tem atuação semelhante aos flavonoides, sequestrando radicais 
livres como principal forma de atuação como antioxidante. Os ácidos hidroxicinâmicos são 
mais ativos em relação à atividade antioxidante do que os ácidos hidroxibenzóicos. Isso se 
deve à dupla ligação do radical presente na molécula dos derivados do ácido hidroxicinâmcio, 
que participa da estabilidade do radical por ressonância do deslocamento do elétron 
desemparelhado (Angelo & Jorge, 2007). 
A distribuição de compostos fenólicos nos tecidos das plantas tanto nos níveis 
celulares quanto sub-celulares não é uniforme. Fenólicos insolúveis são encontrados na 
parede celular, enquanto que compostos fenólicos solúveis estão presentes dentro dos 
vacúolos de células de plantas (Cheynier, 2005). As camadas externas de plantas contêm 
níveis mais elevados de compostos fenólicos que aquelas localizados nas suas partes internas. 
Compostos fenólicos da parede celular, ligados a diversos componentes celulares, contribuem 
para a resistência mecânica das paredes das células, bem como desempenhando um papel 
regulador do crescimento das plantas e morfogênese, na célula, em resposta ao stress, e 
agentes patogênicos (Martínez et al., 2012). 
 
32 
1.4.Capacidade Antioxidante 
Nos últimos anos, pesquisadores e fabricantes de alimentos tornaram-se cada vez mais 
interessados nos compostos fenólicos (Chavan, 2012). A principal razão para este interesse, 
como já foi citado no tópico anterior, é o reconhecimento das propriedades antioxidantes 
desses compostos na prevenção de diversos tipos de doenças. Muitos autores têm 
demonstrado correlação entre a concentração destes compostos e a sua capacidade 
antioxidante (Manach et al., 2004; Zuleta et al., 2007). 
As metodologias para a determinação da capacidade antioxidante em alimentos são 
numerosas e podem estar sujeitas a interferências, como a presença de compostos quelantes 
(Huang, et al., 2005), por isso, atualmente preconiza-se a utilização de duas ou mais técnicas, 
já que nenhum ensaio usado isoladamente para determinar a capacidade antioxidante irá 
refletir exatamente a “capacidade antioxidante total” de uma amostra (Prior, Wu & Schaich, 
2005). 
Devido aos diferentes tipos de radicais livres e as suas diferentes formas de atuação 
nos organismos vivos, dificilmente existirá um método simples e universal pelo qual a 
atividade antioxidante possa ser medida precisa e quantitativamente. Assim, a busca por testes 
mais rápidos e eficientes tem gerado um grande número de métodos para avaliar a atividade 
de antioxidantes naturais pelo uso de uma grande variedade de sistemas geradores de radicais 
livres. (Alves et al., 2010). 
A escolha de um método depende de uma serie de fatores, incluindo a natureza da 
amostra oxidada, o tipo de informação desejada, o tempo disponível para análise e as 
condições do teste (Gray, 1978). Segundo Prior et al. (2005), um método de medição da 
capacidade antioxidante validado deveria: (1) medir a reação que realmente está ocorrendo; 
(2) utilizar uma fonte de radicais de relevância biológica; (3) ser simples; (4) utilizar uma 
metodologia de ponto final com mecanismo definido; (5) possuir instrumentação amplamente 
disponível; (6) apresentar boa repetitividade intra-ensaio e inter-dia; (7) ser adaptável para 
medir antioxidantes hidrofílicos e lipofílicos e utilizar diferentes fontes de radicais livres; (8) 
ser adaptável para a análises de “alto rendimento”. 
Os antioxidantes podem reagir com os radicais livres por dois mecanismos principais: 
por transferência de hidrogênio (por exemplo, o ensaio de ORAC – Oxygen Radical 
Absorbance Capacity) ou por transferência de elétrons (por exemplo, o ensaio de FRAP – 
Ferric Reducing Antioxidant Power). Existem também ensaios em que ambos mecanismos 
ocorrem como o ensaio de TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). O resultado final 
33 
é o mesmo, independentemente do mecanismo, porém a cinética reacional e a potencial 
ocorrência de reações paralelas são diferentes (Prior et al., 2005; Firuzi et al., 2005). 
Os métodos baseados no mecanismo de transferência de hidrogênio medem a 
capacidade de um antioxidante sequestrar os radicais livres através da doação de um átomo de 
hidrogênio (Figura 8). Muitos cientistas acreditam que essa seja a reação através da qual 
muitos antioxidantes atuam (Prior et al., 2005). 
 
X
•
 + AH XH + A
•
 
Figura 8. Mecanismo de transferência de hidrogênio. 
 
Os métodos baseados no mecanismo de transferência de elétrons detectam a capacidade 
do antioxidante em transferir um elétron para reduzir um composto, incluindo metais, compostos 
carbonilados e radicais livres (Figura 9) (Prior et al., 2005; Lemanska et al., 2001). 
 
X
•
 + AH X
-
 + AH
• +
 (1) 
AH
•
+ H2O A
•
 + H3O
+
 (2) 
X
-
 + H3O
+
 XH + H2O (3) 
M(III) + AH AH
+
 + M(II) (4) 
Figura 9. Mecanismo de transferência de elétrons. 
 
O método TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) baseia-se em uma reação 
de transferência de elétrons ou átomos de hidrogênio, no qual se avalia a capacidade do 
antioxidante em sequestrar o radical ABTS
+
 (ácido 2,2’-azinobis-3-etilbenzotiazolino-6-
sulfônico) (Figura 10). Essa captura produz um decréscimo na absorbância a 734 nm (Rufino, 
2008). É utilizado o reagente Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico) 
como antioxidante de referência (análogo hidrossolúvel sintético à vitamina E). (Lemanska et 
al., 2001). 
 
Figura 10: Estrutura do ABTS
+
 (2, 2´azinobis 3 etilbenzotiazolino 6 sulfônico) 
 
 Embora o ensaio de TEAC seja geralmente classificado como uma reação de 
H2O 
34 
transferência de elétrons, o radical ABTS
+
 pode ser neutralizado tanto por redução direta (via 
transferência de elétrons) ou por eliminação do radical (via transferência de átomos de 
hidrogênio) (Prior et al., 2005). 
O método FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) baseia-se no mecanismo de 
transferência de elétrons, sendo o complexo férrico-tripiridiltriazina (Fe
3+
-TPTZ), de cor 
amarelada, reduzido ao complexo ferroso (Fe
2+
-TPTZ), na presença de um antioxidante e em 
condições ácidas (pH 3,6), para manter a solubilidade do ferro (Figura 11). O complexo 
formado por esta reação possui uma coloração azul intensa, com absorbância máxima a 593 
nm (Benzie & Strain, 1996). Em comparação com outros ensaios de atividade antioxidante, o 
ensaio FRAP é simples, rápido, barato e não requer equipamentos especializados (Prior et al., 
2005). 
 
 
Figura 11. Reação do ensaio de FRAP 
 
A capacidade antioxidante dos alimentos é relatada por diversos estudos na literatura. 
Lim et al. (2007), analisou propriedades antioxidantes de váriasfrutas tropicais, na qual foi 
demonstrado que a goiaba e o mamão papaia possuem os maiores teores de antioxidantes, em 
comparação com as 72 frutas investigadas do estudo. 
Daglia et al. (2000) observaram que os compostos de alto peso molecular da bebida do 
café apresentaram elevada AA e que os compostos de baixo peso molecular exibiram elevada 
atividade protetora ex vivo contra a peroxidação lipídica. Moreira et al. (2005) utilizando o 
método de FRAP, observaram uma forte correlação entre os teores de ácidos clorogênicos 
presentes nas bebidas de café e a capacidade antioxidante das mesmas. 
Fe
3+
 - TPTZ + antioxidante redutor Fe
2+
 - TPTZ 
35 
1.5.Goiaba (Psidium guajava L.) 
Psidium guajava L. é uma cultura da família Myrtaceae pertencente ao gênero 
Psidium. P.guajava (Figura 12), originária das zonas tropicais e subtropicais e é considerada 
uma espécie invasora em algumas áreas (Joseph & Priya, 2011). 
 
 
Figura 12. Goiaba vermelha (Psidium guajava L) 
 
A goiaba é um fruto muito cultivado no Brasil, que está entre os principais produtores 
mundiais (Gonzaga, 2012). O seu cultivo no Brasil está concentrado nos estados de São 
Paulo, Pernambuco, Goiás, Rio de Janeiro e Minas Gerais, sendo o cultivar “Paluma” o mais 
plantado (Gouveia et al., 2004). A goiaba é muito popular devido à sua disponibilidade 
durante todo o ano, rico valor nutricional e medicinal, preço acessível, adequação para o 
transporte, manuseio e preferências dos consumidores (Nimisha et al., 2013). Entretanto, sua 
vida útil é curta e seus frutos amadurecem rapidamente, sendo de suma importância o 
desenvolvimento de produtos industrializados para garantir o consumo desta fruta nos meses 
de entressafra. 
O fruto apresenta variações no seu teor de umidade (77 – 86%), fibra bruta (2,8 – 
5,5%), proteína (0,9 – 1,0%), gordura (0,1 – 0,5%), cinzas (0,43 – 0,7%) e carboidratos (9,5 – 
10%) (Mandal et al., 2009). A composição nutricional da goiaba pode variar de acordo com 
alguns fatores, entre eles estão à fertilidade do solo, a época do ano, as condições climáticas, a 
posição do fruto na árvore, a variedade e o estádio de maturação (Siqueira, 2006). 
Estudos sobre a composição dos compostos fenólicos presentes tanto na folha da 
goiabeira quanto no fruto vem sendo relatados pela literatura. Os principais compostos 
fenólicos encontrados na folha da goiabeira são catequina, rutina, quercetina e rutina (Chen et 
al., 2009). Já no fruto, os compostos majoritários são o ácido gálico, catequina, quercetina e 
ácido ferúlico (Wu, Hsieh, Wang, & Chen, 2009). 
36 
1.6.Pão 
O pão é um alimento tradicionalmente consumido pela população mundial, sendo uma 
das principais fontes energéticas da população. Na América Latina, o Brasil fica na quinta 
colocação no que se refere ao consumo de produtos de panificação (ABIP, 2013). Segundo os 
dados da Pesquisa de Orçamento Familiar (POF, 2008 – 2009), do Instituto Brasileiro de 
Geografia e Estatística (IBGE), o consumo per capita de pão de sal foi de 53 g/dia. 
O pão é o produto obtido pelo forneamento, em condições tecnologicamente 
adequadas, de uma massa fermentada ou não, preparada com farinha de trigo e/ou outras 
farinhas que contenham naturalmente proteínas formadoras de glúten ou adicionadas das 
mesmas e água, podendo também conter outros ingredientes (Brasil, 2000). 
A combinação de alimentos ricos em carboidratos refinados com doenças associadas 
ao estilo de vida sublinhou a necessidade de alteração de diversas formulações de alimentos 
para combinar todas as necessidades do dia (Hao & Beta, 2012). O uso de sementes, farinha 
de frutas e fibras alimentares individualmente ou em combinações buscam desempenhar um 
papel importante na elevação do perfil nutricional (Mastromatteo et al., 2015). 
Os ingredientes utilizados na fabricação de pães tradicionais não contêm teores 
relevantes de compostos fenólicos logo não se espera que as melanoidinas desses produtos 
possuam compostos fenólicos incorporados às suas estruturas e que, consequentemente, 
apresentem atividade antioxidante. Em contrapartida, pães enriquecidos com farinhas de 
frutas, como a farinha de goiaba, ricas em compostos fenólicos, em substituição a parte da 
farinha de trigo, com objetivo de agregar valor nutricional, são produtos cujas melanoidinas 
podem possuir compostos fenólicos incorporados. 
A incorporação de compostos fenólicos às melanoidinas do café já é descrita na 
literatura (Borrelli et al.,2002; Bekedam et al 2007; Nunes e Coimbra et al., 2007; Perrone et 
al., 2012; Delgado-Andrade et al., 2005), mas não existem relatos de estudos de incorporação 
de compostos fenólicos em melanoidinas de pão. 
Esse trabalho de investigação é promissor, tanto do ponto de vista do entendimento da 
incorporação de compostos fenólicos às estruturas das melanoidinas, quanto do ponto de vista 
biológico, visto que essas macromoléculas estão presentes em grande quantidade em produtos 
de panificação e apresentam elevado potencial de bioatividade. 
37 
2. OBJETIVOS 
2.1.Geral 
 
Investigar a incorporação de compostos fenólicos presentes na farinha de goiaba na 
estrutura de melanoidinas de pães e correlacionar com a capacidade antioxidante. 
 
2.2.Específicos 
 
a) Determinar os teores de compostos fenólicos na farinha de trigo e de goiaba; 
b) Investigar o efeito do processo fermentativo sobre o teor dos compostos fenólicos 
presente na massa do pão; 
c) Investigar a participação dos compostos fenólicos presentes nas farinhas de trigo e 
goiaba na Reação de Maillard; 
d) Investigar a incorporação dos compostos fenólicos à estrutura das melanoidinas de pão 
em diferentes intervalos de tempo; 
e) Investigar a contribuição da incorporação dos compostos fenólicos na capacidade 
antioxidante das melanoidinas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
38 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1.Preparo da farinha de goiaba 
Amostras de goiaba vermelha (Psidium guajava L.) foram adquiridas no Centro de 
Abastecimento do Estado da Guanabara (CADEG, Rio de Janeiro/RJ) no mês de janeiro de 
2013. As frutas selecionadas de acordo com o grau de maturação ótimo para o consumo foram 
lavadas e sanitizadas em solução de hipoclorito de sódio 100ppm durante 20 minutos. Logo 
após esse período, as frutas foram fracionadas em cubos de 1 cm, dispersas em bandejas e 
alocadas em estufa com circulação forçada de ar (330 drier, FANEM
®
) a 55ºC, durante 22 
horas para completa desidratação (Figura 13). 
 
 
Figura 13. Distribuição das goiabas nas bandejas da estufa de circulação forçada de 
ar. 
 
Posteriormente a desidratação, os frutos secos foram moídos num moinho de 
laboratório (MF 10 de base, IKA
®
 Werke, Staufen, Alemanha) e peneirados para produzir 
farinha com um tamanho de partículas de 20 mesh e armazenadas em sacos plásticos estéreis 
selados a vácuo a -20°C até a sua utilização. 
3.2.Pães 
O pão controle (100% farinha de trigo) foi produzido numa máquina automática de 
pão (BK2000B, Breadman
®
, Middleton, WI) onde foram adicionados os ingredientes na 
39 
seguinte ordem: 171 ml de água filtrada, 12 g de açúcar, 6 g de sal (NaCl), 12 g de manteiga 
sem sal, 300 g de farinha de trigo branca e 3 g de levedura seca (Saccharomyces cerevisiae). 
O processo de preparo do pão na máquina consistiu em três etapas: mistura (30 min), 
fermentação (116 min) e panificação (37, 47, 57, 67 ou 77 minutos) . A temperatura foi 
monitorizada durante todo o processo com um termômetro digital. 
Pães de goiaba (GB) foram preparados seguindo as etapas de preparação do pão 
controle, mas substituindo parcialmente a farinha de trigo com 10% (GB10) ou 20% (GB20) 
de farinha de goiaba (Figura 13). 
 
 
Figura 14. (A) Pão branco e (B) pão enriquecido com farinha de goiaba. 
 
Após a etapa do forneamento, cascasdos pães foram removidas com o auxílio de uma 
faca de cozinha, liofilizadas (Labconco, Kansas City, MO) e moídas em moinho (A11 Basic, 
IKA® Werke, Staufen, Alemanha). Amostras das massas dos pães controle e GB foram 
preparados com e sem levedura e foram submetidas as etapas de mistura e fermentação. Após 
essa etapa, as massas foram liofilizadas. 
Todas as amostras foram preparadas em triplicata e homogeneizadas. 
3.3.Análise de compostos fenólicos livres e conjugados nas farinhas de trigo e goiaba 
A extração de compostos fenólicos livres e conjugados das farinhas de trigo e de 
goiaba seguiram a metodologia descrita por Dinelli et al. (2011) com modificações. 
Resumidamente, 20 mL de etanol: solução gelada de água (80:20, v/v) foram adicionados a 1 
g de amostra para a extração de compostos fenólicos livres. A solução foi agitada em vórtex 
durante 10 min, centrifugada (2500g, 10 min, 10°C, Sorvall ST 16R, Thermo Scientific™, 
A B 
40 
Osterode, Alemanha) e o sobrenadante foi colocado num balão de fundo redondo. O resíduo 
sólido foi extraído novamente seguindo o mesmo procedimento e os sobrenadantes reunidos 
foram evaporados em rotaevaporador (R-215, Büchi®, Flawil, Suíça). O resíduo seco foi 
reconstituído em 10 ml de água e armazenado a -20°C até à análise. 
A extração de compostos conjugados foi realizada utilizando o resíduo sólido 
remanescente, após a extração de compostos fenólicos livres. Em primeiro lugar, realizou-se 
uma hidrólise alcalina com adição de 12 mL de água e 5 mL de NaOH 10 M e manteve esta 
solução sob agitação num agitador orbital (IKA 4000i controlo KS, Staufen, Alemanha) no 
escuro durante 16 h. Após este período, o pH foi ajustado para 2 com HCl concentrado e 
foram adicionados 15 mL de acetato de etila. Após a agitação durante 30s, a mistura foi 
centrifugada (2500g, 5 min, 10°C) e o sobrenadante foi colocado num balão de fundo 
redondo. O procedimento de extração foi repetido duas vezes e os sobrenadantes reunidos 
foram evaporados em rotaevaporador. O resíduo seco foi reconstituído em 10 mL de metanol: 
solução de água (80:20, v/v) e armazenadas a -20°C até à análise. 
A hidrólise ácida foi realizada no resíduo sólido remanescente, após a hidrólise 
alcalina por adição de 2,5 mL de HCl concentrado e incubação num banho de água a 85°C 
durante 30 min. O mesmo procedimento de extração com acetato de etila previamente 
descrito para a hidrólise alcalina foi realizada. O processo inteiro de extração (fenólicos livres, 
alcalinas e de hidrólise ácida) foi realizado em duplicata. Antes da injeção no CLAE, todos os 
extratos foram filtrados através de uma unidade de filtro de 0,45 mm de PTFE (Millipore, 
Barueri, Brasil). 
Os compostos fenólicos foram analisados por CLAE-DAD. O sistema LC (Shimadzu, 
Kyoto, Japão), composto por uma bomba quaternária LC-10ADvp, um forno de coluna CTO-
10ASvp, um 8125 injetor manual (Rheodyne) com um loop de 20 µL e um detector por 
arranjo de diodos SPD-M10Avp (DAD). As separações cromatográficas foram realizadas 
utilizando uma coluna Kromasil
®
 C18 (5 m, 250 mm x 4,6 mm) acoplado a um grupo C-18 
pré-coluna Kromasil
®
 (5 um, 10 milímetros x 3 mm) mantida a uma temperatura constante de 
40°C. O sistema LC móvel consistiu de um gradiente de água com 0,3% de ácido fórmico 
(eluente A), metanol (eluente B) e acetonitrila (eluente C, mantida a 1% durante todo o 
funcionamento), com uma taxa de fluxo constante de 1,0 mL/min. Antes da injeção, a coluna 
foi equilibrada com 81% A. Após a injeção da amostra, esta percentagem diminuiu para 79% 
A em 1 min, 56% em 18 min e 14% em 23 minutos e mantida constante até ao final do 30 
min. Entre as injeções, intervalos de 10 min foram utilizadas para reequilibrar a coluna com 
81% de eluente A. Os compostos fenólicos foram monitorizadas por DAD entre 190-370 nm 
41 
e identificados por comparação dos seus tempos de retenção e espectros de UV com as de 
padrões comerciais. A quantificação foi realizada por calibração externa. Os dados foram 
adquiridos por um software CLAE (Shimadzu Corp., versão 2.00, 2000). Os resultados foram 
expressos em mg de composto por 100 g. 
3.4.Extração e isolamento das melanoidinas das crostas dos pães 
Extração de melanoidinas crosta do pão seguido o procedimento descrito por Borrelli 
et al. (2003). Resumidamente, 1 g de crosta do pão ou massa liofilizadas foi misturada com 
12 ml de tampão 0,2 M Tris-HCl (pH 8,0) contendo 0,35 U/mL de pronase E. A solução foi 
incubada a 37°C durante 70 h. Após centrifugação (3000g, 10 min, 25°C), o sobrenadante 
contendo os produtos hidrolisados foi submetido à ultrafiltração tal como descrito por 
Delgado-Andrade & Morales (2005). Foram utilizados sequencialmente unidades de 
ultrafiltração Amicon com membrana cut-offs 3 kDa e 10 kDa (Millipore, Cork, Irlanda), 
dando origem a três frações, todos os quais foram liofilizadas: fração de alto peso molecular 
(HMWF; MW> 10 kDa), peso molecular intermediário fração (IMWF; 3 kDa <MW <10 kDa) 
e fração de baixo peso molecular (LMWF; MW <3 kDa). 
3.5.Análise dos compostos fenólicos incorporados nas melanoidinas dos pães 
A hidrólise alcalina nas melanoidinas das crostas dos pães de HMWF e IMWF seguiu 
a metodologia descrita por Perrone, Farah, & Donangelo (2012). 750 uL de solução de NaOH 
2 M contendo 2% (w/w) de ácido ascórbico e 20 mM de ácido etilenodiaminotetracético 
(EDTA) foi adicionado a 750 ul de soluções de HMWF ou IMWF em água (10 mg/mL). 
Após incubação durante 1 h a 30 ° C, a mistura foi neutralizada a aproximadamente pH 1 com 
330 mL de HCl 5 M e 20 uL de soluções de cada Carrez e 130 mL de água foram 
adicionados, totalizando um volume total de 2 mL. Após centrifugação (Microspin, 
Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha), o sobrenadante foi analisado por CLAE-DAD, 
conforme descrito no item 3.3. Os resultados foram expressos como ug de composto por g. 
 
42 
3.6.Capacidade antioxidante 
O capacidade antioxidante das soluções em água das frações de HMWF e IMWF (1 a 
2 mg/mL) foram determinadas pelos ensaios de FRAP e TEAC . 
O ensaio de FRAP foi realizado de acordo Benzie & Strain (1996) com pequenas 
modificações. O reagente de FRAP foi preparado misturando 2 mL de solução TPTZ 10 mM 
em HCl 6 M com 2 mL de solução de FeCl3 20 mM e 20 mL de tampão de acetato (pH 3,6) 
300 mM e aquecido a 37°C antes da análise. Vinte microlitros do extrato foram pipetados em 
microplaca de 96 poços, o qual foi colocado no Victor
3
 1420 multilabel contador (Perkin 
Elmer, Turku, Finlândia) com injetor automático. Cento e oitenta microlitros do reagente de 
FRAP foram adicionados automaticamente em cada poço, a placa foi agitada e deixada em 
repouso a 37 °C durante 6 min. A absorbância foi, em seguida, lida a 595 nm. A quantificação 
foi realizada usando uma curva de calibração preparada com FeSO4. Os resultados foram 
expressos como µmol de Fe
+
 
2
 por grama. Cada amostra foi analisada em triplicata. 
O ensaio TEAC foi realizado de acordo Re, et al (1999) com pequenas modificações. 
A solução estoque do radical ABTS foi gerado por reação de K2S2O8 e ABTS durante 12 h a 
16 h antes da utilização. Solução estoque de ABTS foi diluída em água (1:50) a uma 
absorbância de 0,7 ± 0,02 a 720 nm. Dez microlitros do extrato foram pipetados para uma 
microplaca de 96 poços, o qual foi colocado na Victor
3
 1420 contador multilabel com injetor 
automático. 190 µL de solução ABTS foram adicionados automaticamente em cada poço, a 
placa foi agitada e deixada em repouso a 37°C durante 6 min. Amostra absorbância foi lida a 
720 nm e subtraído de absorção em branco solvente. A quantificação foi realizada usando 
uma curva de calibração preparada com Trolox. Os resultados foram expressos como µmol de 
equivalentes de Trolox por grama. Cada amostra foi analisada em triplicata. 
3.7.Análise estatística 
Os dados são expressos como média ± desvio padrão. A análise de variância (two-way 
ANOVA) seguida doteste post de comparação múltipla de Dunn foi utilizado para investigar 
os efeitos do enriquecimento da farinha da goiaba, peso molecular e tempo de forneamento na 
incorporação dos compostos fenólicos e AC das melanoidinas das crostas dos pães. As 
análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism para Windows 
(versão 6.01, GraphPad Software, San Diego, CA). As diferenças foram consideradas 
43 
significativas quando p<0,05. Os coeficientes de correlação de Pearson entre os compostos 
fenólicos incorporados e AC foram calculados com o software Statistica (versão 7.0, StatSoft 
Inc., Tulsa, OK). As diferenças foram consideradas significativas quando p <0,05. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
44 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 2 
 
Breads enriched with guava flour as a tool for 
studying the incorporation of phenolic compounds in 
bread melanoidins 
 
 
 
Artigo submetido a periódico 
 
Alves, G.; Perrone, D. Breads enriched with guava flour as a tool for studying the 
incorporation of phenolic compounds in bread melanoidins. Food Chemistry. 2015. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
45 
1. INTRODUCTION 
 
During the cooking and thermal processing of food products, a whole range of 
browning reactions occurs. The most important of these is the Maillard Reaction, which is 
initiated by the reaction of a reducing sugar with a compound possessing a free amino group. 
As this reaction progresses, a wide variety of Maillard Reaction Products (MRPs) are formed 
by a complex network of simultaneous reactions (Borrelli et al., 2003). MRPs are a mix of 
various compounds of different molecular weights including aldehydes, ketones, dicarbonyls, 
acrylamides, heterocyclic amines (all of which contribute to flavor) and melanoidins (Wang, 
Qian, & Yao, 2011). 
Melanoidins are defined as intermediate to high molecular weight nitrogenous brown 
colored compounds (Hodge, 1953; Lindenmeier, Faist, & Hofmann, 2002), found mainly in 
baking products and coffee. Considering all dietary sources, it is estimated that Western 
populations consume up to 12.2 g of melanoidins per day (Fogliano & Morales, 2011; 
Pastoriza & Rufián-Henares, 2014). Although the impact of melanoidins consumption on 
human health has been historically overlooked, recent evidence suggests that these molecules 
are not inert and may exert some physiological action (Fogliano & Morales, 2011). Studies on 
the characterization and possible biological action of melanoidins have increased over the last 
years (Borrelli & Fogliano, 2005; Langner et al., 2013; Rufián-Henares & Morales, 2007). 
Many of these activities have been assigned to bioactive compounds incorporated into the 
structure of the melanoidins. Delgado-Andrade & Morales (2005) reported that over 50% of 
the antioxidant capacity (AC) of coffee melanoidins was due to low molecular weight 
compounds linked to the melanoidins. In fact, later studies have shown that chlorogenic acids 
present in green coffee are incorporated into the melanoidins backbones during roasting 
(Bekedam, Schols, Van Boekel, & Smit, 2008a; Coelho et al., 2014; Nunes, Cruz, & 
Coimbra, 2012) and that these melanoidin-bound phenolic compounds contribute with up to 
47% of the AC of coffee brews (Perrone, Farah, & Donangelo, 2012). 
Coffee has been the main subject of studies in the field of melanoidins, probably due 
to its high content of melanoidins and contribution to dietary intake, but mostly due to their 
solubility in water. Bread melanoidins, on the other hand, have been less investigated because 
they are water insoluble and therefore must be extracted with organic solvents (Lindenmeier 
et al., 2002) or by the action of specific enzymes (Borrelli et al., 2003) prior to analysis. 
Moreover, to the best of our knowledge, the incorporation of phenolic compounds has never 
been investigated in bread melanoidins. Even though whole cereals contain relevant levels of 
46 
phenolic compounds, most of the bread consumed worldwide is produced with refined flours, 
which contain low levels of these bioactive compounds (Adom, Sorrells, & Liu, 2005). Thus, 
differently from coffee melanoidins, one should not expect white bread melanoidins to 
contain phenolic compounds bound to their structure and therefore to exhibit high AC. 
In recent years, some research has been conducted in the field of wheat bread 
enrichment with plant materials, with the aim of increasing the nutritional value and the 
potential bioactivity of bread products (Dziki, Różyło, Gawlik-Dziki, & Świeca, 2014). 
Contrarily to white bread, it is expected to find phenolic compounds incorporated into the 
melanoidins of these plant-enriched products. In this context, in the present study we 
developed white wheat breads enriched with flour produced from guava (Psidium guajava), a 
tropical fruit rich in phenolic compounds. These guava breads (GB) were used as a tool for 
studying, for the first time, the incorporation of phenolic compounds into bread melanoidins 
and the effect of this incorporation on their AC. 
 
2. MATERIALS AND METHODS 
 
2.1.Standards and chemicals 
 
2,2’-azino-bis(2-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 
2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine (TPTZ), potassium persulfate, (±)-6-hydroxy-2,5,7,8-
tetramethyl-chromane-2-carboxylic acid (Trolox®), pronase E, naringenin, quercetin, rutin 
and 2,4-dihydroxybenzoic, 3,4-dihydroxybenzoic 3,4-dihydroxyphenylacetic, 4-
hydroxyphenyl-acetic, 5-caffeoylquinic, benzoic, caffeic, m-coumaric, p-coumaric, ferulic, 
gallic, rosmarinic, salicylic, syringic and vanillic acids were purchased from Sigma-Aldrich 
Chemical Co. (St. Louis, MO). Sodium carbonate was purchased from Spectrum Chemical 
Manufacturing Corp. (Gardena, CA). Iron (II) sulfate was purchased from Merck KGaA 
(Darmstadt, Germany). All solvents were HPLC grade from Tedia (Fairfield, OH). HPLC 
grade water (Milli-Q system, Millipore, Bedford, MA) was used throughout the experiments. 
 
2.2.Breads 
 
Control bread (white wheat bread) was produced in a domestic bread machine 
(BK2000B, Breadman®, Middleton, WI) by adding in the following order: 171 mL of tap 
water, 12 g of sugar, 6 g of salt (NaCl), 12 g of unsalted butter, 300 g of white wheat flour 
47 
and 3 g of dry yeast (Saccharomyces cerevisiae). The bread making process consisted of three 
stages: mixing (30 min), fermentation (116 min) and baking (for 37, 47, 57, 67 or 77 
minutes). The temperature was monitored during the whole process with a digital 
thermometer probe. 
Guava breads (GB) were prepared following the control bread preparation steps, but 
partially substituting wheat flour with 10% (GB10) or 20% (GB20) of guava flour. For the 
production of guava flour, fruits acquired at Rio de Janeiro’s agricultural central trading were 
washed, sanitized, fractionated in 1 cm cubes and placed in an oven with forced air circulation 
(330 drier, FANEM
®
, Brazil) at 55°C for 22 hours until complete dehydration. Then, dried 
fruits were ground in a laboratory mill (MF 10 Basic, IKA® Werke, Staufen, Germany) and 
sieved to give flour with a particle size of 20 mesh. 
Bread crusts were removed with a kitchen knife, freeze-dried (Labconco, Kansas City, 
MO) and ground in a mill (A11 Basic, IKA
®
 Werke, Staufen, Germany). Dough samples of 
control and GB were prepared with and without yeast and freeze-dried before the baking step 
(after the mixing and fermentations steps). All samples were prepared in triplicate and pooled. 
 
2.3.Analysis of free and bound phenolic compounds in wheat and guava flours 
 
Extraction of free and conjugated phenolic compounds in wheat and guava flours 
followed the methodology described by Dinelli et al. (2011) with modifications. Briefly, 20 
mL of chilled ethanol: water solution (80:20, v/v) were added to 1 g of sample