2016-dis-llmcosta

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
FACULDADE DE MEDICINA 
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA 
 
 
 
 
 
LAURA LICIA MARCOS DA COSTA 
 
 
 
 
TOXICIDADE ORAL AGUDA E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS PRESSÓRICOS 
E RENAIS CAUSADOS PELA QUINONA ONCOCALIXONA A ISOLADA DA 
Auxemma oncocalyx. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2016 
 
1 
 
 
 
LAURA LICIA MARCOS DA COSTA 
 
 
TOXICIDADE ORAL AGUDA E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS PRESSÓRICOS 
E RENAIS CAUSADOS PELA QUINONA ONCOCALIXONA A ISOLADA DA 
Auxemma oncocalyx 
 
 
 
 
Dissertação apresentada à Coordenação 
do Programa de Pós-Graduação em 
Farmacologia do Departamento de 
Fisiologia e Farmacologia da Faculdade 
de Medicina da Universidade Federal do 
Ceará, como requisito parcial para a 
obtenção do título de mestre em 
Farmacologia. 
Orientadora: 
Prof. Drª. Helena Serra Azul Monteiro 
Co-orientadora: 
Prof. Drª. Renata de Sousa Alves 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação 
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca Universitária
Gerada automaticamente pelo módulo Catalog, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
C873t Costa, Laura Lícia Marcos da.
 Toxicidade oral aguda e avaliação dos efeitos pressóricos e renais causados pela quinona oncocalixona A
isolada da Auxemma oncocalyx / Laura Lícia Marcos da Costa. – 2016.
 72 f. : il. color.
 Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2016.
 Orientação: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro.
 Coorientação: Profa. Dra. Renata de Sousa Alves.
 1. Oncocalixona A. 2. Auxemma oncocalyx. 3. Toxicidade aguda. 4. Pressão arterial. 5. Perfusão renal.
I. Título.
 CDD 615.1
2 
 
 
 
LAURA LICIA MARCOS DA COSTA 
 
 
TOXICIDADE ORAL AGUDA E AVALIAÇÃO DOS EFEITOS PRESSÓRICOS 
E RENAIS CAUSADOS PELA QUINONA ONCOCALIXONA A ISOLADA DA 
Auxemma oncocalyx 
 
 
 
 
Dissertação apresentada à Coordenação 
do Programa de Pós-Graduação em 
Farmacologia do Departamento de 
Fisiologia e Farmacologia da Faculdade 
de Medicina da Universidade Federal do 
Ceará, como requisito parcial para a 
obtenção do título de mestre em 
Farmacologia. Área de concentração: 
Farmacologia. 
Orientadora: 
Prof. Drª. Helena Serra Azul Monteiro 
Co-orientadora: 
Prof. Drª. Renata de Sousa Alves 
 
Aprovada em: ____/____/____ 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
________________________________________________ 
Prof.ª Dr.ª Helena Serra Azul Monteiro (Orientadora) 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
________________________________________________ 
Prof.ª Dr.ª Renata de Sousa Alves (Co-orientadora) 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
________________________________________________ 
Prof.ª Dr.ª Daniele Macêdo Gaspar 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
________________________________________________ 
Prof.ª Dr.ª Alice Maria Costa Martins 
Universidade Federal do Ceará (UFC) 
 
3 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 
Aos meus pais, Liduina e Manoel, meu namorado Paulo, e aos meus familiares e demais 
amigos pelo apoio e incentivo nos momentos mais difíceis. 
 
À Prof.ª Dr.ª Helena Serra Azul Monteiro, pelo meu acolhimento como orientanda, por 
todos os conhecimentos compartilhados e confiança em mim depositada para a 
realização do projeto. 
 
À minha co-orientadora Prof.ª Dr.ª Renata de Sousa Alves, pelo grande apoio, desde a 
graduação, grande incentivadora para meu ingresso no mestrado, e pela contribuição 
direta em todos os momentos deste trabalho. 
 
À Prof.ª Dr.ª Otília Deusdênia Loiola Pessoa, que gentilmente cedeu a substância para 
realização do estudo e que muito colaborou no exame de qualificação com ideias e 
sugestões para aprimoramento da escrita deste trabalho. 
 
À Prof.ª Dr.ª Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista, juntamente à equipe do seu 
laboratório, pela colaboração na realização do processamento histológico, leitura e 
interpretação das lâminas, bem como pela grande contribuição na avaliação do texto de 
qualificação. 
 
Aos professores integrantes da banca de defesa, Prof.ª Dr.ª Daniele Macêdo Gaspar e 
Prof.ª Dr.ª Alice Maria Costa Martins, por terem aceitado o convite de prontidão, bem 
como por todas as sugestões feitas para a melhoria do trabalho. 
 
A toda a equipe de professores, pós-graduandos, alunos de iniciação científica do 
LAFAVET-UFC e agregados, com especial agradecimento aos amigos Pedro, 
Adelvane, Natacha, Junior, Alejandra, João Alison, Rafinha, Sílvia Helena, Paloma, 
Dayana e Letícia, pela grande ajuda nos experimentos. 
 
À Universidade Federal do Ceará (UFC) e ao Programa de Pós-graduação em 
Farmacologia, pela oportunidade da realização do trabalho e pelo suporte prestado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
 
RESUMO 
 
Auxemma oncocalyx, da família Boraginaceae, é uma árvore característica do nordeste 
brasileiro conhecida popularmente como "pau branco". A investigação química do 
extrato hidroalcóolico do caule da planta permitiu o isolamento de várias quinonas, 
dentre elas a oncocalixona A (onco-A). Estudos farmacológicos para esta quinona 
apontaram atividade antitumoral, antimitótica, analgésica, antiedematogênica, 
antiagregante plaquetária e antidiabética. Contudo, assim como outras substâncias 
oriundas do metabolismo secundário de plantas, as quinonas podem causar 
consideráveis reações tóxicas. A ausência de dados toxicológicos in vivo da substância e 
seu potencial para utilização clínica motivaram a execução deste trabalho, o qual 
objetivou investigar a toxicidade aguda in vivo da onco-A e avaliar os efeitos 
pressóricos e renais dessa quinona, como possíveis órgãos-alvo de toxicidade. Iniciou-
se com o teste de dose limite estabelecido nos protocolos de nº 420, 423 e 425 da 
OECD, de toxicidade oral aguda, com a administração de onco-A 2000 mg/Kg v.o, em 
camundongos Swiss fêmeas, para determinação da DL50 e observação quanto a sinais de 
toxicidade por 14 dias. Dosagens dos níveis plasmáticos de ureia, creatinina e ácido 
úrico foram realizadas, bem como análise histológica dos principais órgãos (coração, 
pulmão e rim) após 14 dias. A avaliação dos efeitos da onco-A na pressão arterial média 
foi realizada em ratos Wistar machos normotensos anestesiados, submetidos a 
concentrações cumulativas da substância (30, 100, 300 e 1000 µg/Kg) i.v. Os níveis 
plasmáticos de ureia, creatinina, ácido úrico, TGO, TGP, fosfatase alcalina e CK-Total 
foram avaliados nesses animais, além da análise histológica de coração e rins. Para 
avaliação da função renal, ratos Wistar machos foram excisados cirurgicamente e 
perfundidos com solução de Krebs-Henseleit modificada, em três concentrações de 
onco-A (1, 3 e 10 µg/mL). Os dados foram comparados estatisticamente considerando 
p<0,05. A onco-A apresentou uma DL50>2000mg/Kg, indicando ser uma substância de 
baixa letalidade. A substância reduziu a pressão arterial média de forma significativa 
nas duas últimas concentrações (300 e 1000 µg/Kg). O tratamento com onco-A não 
alterou os parâmetros bioquímicos avaliados in vivo. Na perfusão de rim isolado, a 
onco-A aumentou a Pressão de Perfusão (PP) nas três concentrações estudadas, com 
aumento proporcional da Resistência Vascular Renal (RVR). O Ritmo de Filtração 
Glomerular (RFG) apresentou diminuição transitória com onco-A 1 µg/mL, aumento no 
grupo 3 µg/mL, e redução irreversível com 10 µg/mL. O Fluxo Urinário (FU) aumentou 
em todos os grupos estudados, ao passo que os percentuais de transporte tubular total de 
sódio (%TNa), cloreto (%TCl
-
) e potássio (%TK
+
) apresentaram-se reduzidos. A 
análise histológica dos órgãos coletadosnos protocolos realizados evidenciou 
significativa toxicidade da substância. Os resultados encontrados mostraram baixa 
letalidade da substância em uma exposição aguda, entretanto esta induziu alterações 
morfológicas indicativas de dano tecidual, redução da pressão arterial e alterações em 
todos os parâmetros funcionais renais, evidenciando o potencial tóxico desta quinona. 
 
Palavras-chaves: Oncocalixona A. Auxemma oncocalyx. Toxicidade aguda. Pressão 
arterial. Perfusão renal. 
ABSTRACT 
 
ACUTE ORAL TOXICITY AND EVALUATION OF BLOOD PRESSURE AND 
RENAL EFFECTS INDUCED BY ONCOCALYXONE A, QUINONE ISOLATED 
FROM Auxemma oncocalyx 
 
Auxemma oncocalyx belongs to the Boraginaceae family, which is a characteristic tree 
of the Brazil northeastern region and popularly known as "pau branco". The chemical 
investigation of hydroalcoholic heartwood extracts resulted in the isolation of several 
quinones, including oncocalyxone A (onco-A). Pharmacological studies of this quinone 
showed antitumor, antimitotic, analgesic, antiedematogenic, antiplatelet and antidiabetic 
activities. However, such as other substances from plant secondary metabolism, 
quinones can leads toxic reactions. The absence of in vivo toxicological data and the 
possibility of the clinical use led to execution of this study. This study aimed to 
investigate the acute toxicity in vivo of onco-A, blood pressure and renal effects of this 
quinone as potential target organ for toxicity. The experiments started with limit test, 
established in OECD guidelines nº 420, 423 and 425, from acute oral toxicity, when 
onco-A 2000 mg/Kg was administered by gavage in female Swiss mice to determine 
LD50 and signs of toxicity were observed for 14 days. Biochemical levels of urea, 
creatinine and uric acid were mensured, even as histological analysis of the main organs 
(heart, lung and kidney) after 14 days. Effects in mean arterial blood pressure was 
performed in anesthetized normotensive male Wistar rats, underwent to cumulative 
concentrations of the substance (30, 100, 300 and 1000 mg/ Kg) i.v. Plasma levels of 
urea, creatinine, uric acid , SGOT, SGPT, alkaline phosphatase and CK-Total were 
determined in these animals, even as heart and kidney histopathology. To assessment of 
renal fuction, kidneys from male Wistar rats were surgically excised and perfused with 
modified Krebs-Henseleit, in three onco-A concentrations (1, 3 and 10 ug / ml). Data 
were statistically compared considering P<0.05.Onco-A shown LD50> 2000mg / kg, 
indicating low lethality. The substance reduced mean arterial blood pressure 
significantly in the last two concentrations. Onco-A treatment didn't affectedthe 
biochemical parameters analysed in vivo experiments. Histopathological analysis 
showed significative signs of toxicity in all evaluated organs for each performed 
protocols. The isolated kidney perfusion showed an increase in perfusion pressure (PP) 
in all three onco-A concentrations tested (1, 3 and 10 μg / mL), with a proportional 
increase in renal vascular resistance (RVR). Glomerular Filtration Rate (GFR) showed a 
transitional decreased in the group 1 μg / mL, increased in 3 μg / mL, and persistent 
decrease in 10 μg / mL. Urinary Flow (FU) increased in three concentrations tested, 
while percentage of the total tubular transport of sodium (%TNA) chloride (%TCl
-
) and 
potassium (%TK
+
) showed reduction. The results demonstrate that onco-A has low 
lethality on acute exposure, however, promoted many morphological changes 
suggesting tecidual damage, hipotension, and modified all parameters assessed in renal 
perfusion, proving the toxicity potential of this quinone. 
 
Keywords: Oncocalyxone A. Auxemma oncocalyx. Acute toxicity. Blood pressure. 
Renal perfusion. 
6 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
AINES Anti-inflamatórios não esteroidais 
ATC Acute Toxic Classic Method 
BALT Tecido Linfóide Associado a Mucosa 
BioPPQ Pirroloquinolina quinona 
CEPA Comissão de Ética e Pesquisa Animal 
CK-Total Creatina quinase toal 
DL50 Dose letal média 
E.P.M Erro Padrão da Média 
ECA Enzima Conversora de Angiotensina 
EROs Espécies Reativas de Oxigênio 
FDA Food and Drug Administration 
FDP Fixed Dose Procedure 
FU Fluxo Urinário 
GSH Glutationa reduzida 
HE Hematoxilina-Eosina 
IRA Insuficiência Renal Aguda 
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry 
LACT Laboratório de análises clínicas e Toxicológicas 
LAFAVET Laboratório de Farmacologia de Venenos e Toxinas 
LAFIPLAM II Laboratório de Análise Fitoquímica de Plantas Medicinais II 
LRA Lesão Renal Aguda 
MEC Laboratório de Morfologia Experimental e Comparada 
MitoQ Mitoquinona Q 
OECD Organization for Economic Cooperation and Development 
Onco-A Oncocalixona A 
PP Pressão de Perfusão 
RFG Ritmo de Filtração Glomerular 
RVR Resistência Vascular Renal 
SNC Sistema Nervoso Central 
TEM Transição epitelial-mesenquimal 
TGO Transaminase glutâmico-oxalacética 
TGP Transaminase glutâmico-pirúvica 
7 
 
 
 
%T Percentual de Transporte Tubular Total 
UDP Up and Down Procedure 
UECE Universidade Estadual do Ceará 
UFC Universidade Federal do Ceará 
UV-Vis Espectroscopia no ultravioleta visível 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 10 
1.1 Produtos naturais e estudos toxicológicos ....................................................... 10 
1.2 Quinonas: classificação e propriedades químicas .......................................... 11 
1.2.1 Potencial farmacológico/toxicológico das quinonas ......................................... 12 
1.2.2 Oncocalixona A: 1,4-benzoquinona isolada do pau-branco ............................ 13 
1.3 Estudos de Toxicidade Oral Aguda ................................................................ 15 
1.4 Principais alterações biológicas induzidas por substâncias tóxicas ............... 17 
1.4.1 Alterações pressóricas sistêmica ....................................................................... 17 
1.4.2 Alterações na fisiologia renal ........................................................................... 19 
2 JUSTIFICATIVA ............................................................................................. 22 
3 OBJETIVOS ..................................................................................................... 23 
3.1 Geral ................................................................................................................. 23 
3.2 Específicos ......................................................................................................... 23 
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 24 
4. 1 Substâncias utilizadas ....................................................................................... 24 
4.1.1 Onco-A .............................................................................................................. 24 
4.2 Animais experimentais ..................................................................................... 24 
4.3 Desenho experimental ...................................................................................... 25 
4.3.1 Toxicidade oral aguda - Teste da dose limite (2000mg/Kg) ............................... 25 
4.3.1.1 Protocolo experimental ...................................................................................... 25 
4.3.1.2 Dosagens bioquímicas ........................................................................................26 
4.3.2 Efeitos na Pressão Arterial Média de ratos anestesiados ................................... 26 
4.3.2.1 Técnica cirúrgica ................................................................................................ 26 
4.3.2.2 Protocolo experimental ....................................................................................... 27 
4.3.2.3 Dosagens bioquímicas ......................................................................................... 28 
4.3.3 Perfusão de Rim Isolado..................................................................................... 28 
4.3.3.1 Sistema utilizado e solução perfusora .................................................................. 28 
4.3.3.2 Técnica cirúrgica ................................................................................................ 30 
9 
 
 
 
4.3.3.3 Protocolo experimental ....................................................................................... 31 
4.3.3.4 Dosagens bioquímicas ......................................................................................... 32 
4.3.3.5 Determinação dos parâmetros funcionais renais ................................................. 32 
4.4 Análise histológica ............................................................................................. 34 
4.5 Análise estatística .............................................................................................. 34 
5 RESULTADOS ................................................................................................. 35 
5.1 Toxicidade Oral Aguda da onco-A ................................................................... 35 
5.1.1 Observações experimentais, acompanhamento do peso corporal dos animais e 
mensuração da DL50 ...................................................................................................... 35 
5.1.2 Avaliação dos níveis séricos de ureia, creatinina e ácido úrico nos 
camundongos submetidos ao protocolo de Toxicidade Oral Aguda, após os 14 dias 
experimentais ................................................................................................................. 36 
5.1.3 Análise histológica .............................................................................................. 38 
5.1.3.1 Análise histológica do tecido renal (córtex e medula) .......................................... 38 
5.1.3.2 Análise histológica do tecido pulmonar ............................................................... 39 
5.1.3.3 Análise histológica do tecido cardíaco ................................................................ 40 
5.2 Efeitos da onco-A na pressão arterial média de ratos normotensos 
anestesiados ................................................................................................................... 41 
5.2.1 Avaliação dos níveis séricos de ureia, creatinina, ácido úrico, TGO, TGP, 
fosfatase alcalina e CK-total, após a realização do protocolo de pressão arterial 
média .............................................................................................................................. 42 
5.2.2 Análise histológica.............................................................................................. 46 
5.2.2.1 Análise histológica do tecido cardíaco ................................................................ 46 
5.2.2.2 Análise histológica do tecido renal (córtex e medula) .......................................... 47 
5.3 Efeitos da onco-A na perfusão de rim isolado de ratos ................................... 48 
5.3.1 Análise histológica dos rins perfundidos com onco-A ........................................ 56 
6 DISCUSSÃO .................................................................................................... 57 
7 CONCLUSÃO .................................................................................................. 65 
 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 66 
 
10 
 
 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
1.1 Produtos naturais e estudos toxicológicos 
 Os produtos naturais tem sido considerado, ao longo dos tempos, uma 
importante fonte para o desenvolvimento de novos fármacos. Mesmo com as diversas 
estratégias e metodologias disponíveis atualmente para a síntese e descoberta de novas 
moléculas, a química de produtos naturais ainda representa uma área de sucesso, 
historicamente comprovada (VIEGAS JR et al., 2006). 
 O Brasil, por um dos países com a maior biodiversidade do planeta, não pode 
abdicar de sua importância no desenvolvimento e pesquisa de novas substâncias 
isoladas ou sintetizadas a partir de produtos naturais (PINTO et al., 2002). 
 Estima-se que 30% das novas substâncias a serem avaliadas por seu potencial 
terapêutico são de origem natural ou foram desenvolvidos por síntese química planejada 
a partir de produtos naturais. Neste contexto, cabe destacar plantas, fungos, insetos, 
organismos marinhos e bactérias como importantes fontes de substâncias 
biologicamente ativas (VEIGA-JUNIOR; MELO, 2008). 
 Nesta perspectiva, a química dos produtos naturais tem ganhado grande 
notoriedade, e se associado à outras áreas da ciência para a descoberta e aplicabilidade 
desses compostos. Dentre as áreas de essencial interface se encontra a toxicologia, uma 
vez que, uma substância não se exime de efeitos tóxicos por ser de origem natural. Esse 
pressuposto tem sido amplamente considerado, principalmente quando se trata de 
substâncias com potencial terapêutico, na qual esta avaliação é realizada quanto a 
diferentes critérios, para categorização dos riscos de exposição (PUPO; GALLO; 
VIEIRA, 2007). 
 A investigação quanto ao potencial tóxico de substâncias é realizada por meio de 
estudos de toxicidade, nos quais podem ser avaliados, dentre outros aspectos: a relação 
dose-efeito, estrutura química-efeito e os mecanismos envolvidos no estabelecimento e 
desenvolvimento destes efeitos. Esses estudos visam garantir segurança para 
terapêutica, o desenvolvimento de estratégias para redução de toxicidade, a exemplo do 
melhoramento molecular ou de formulação, bem como alternativas para tratamento e 
prevenção desses efeitos (LIMA et al., 2014). 
 
 
11 
 
 
 
1.2 Quinonas: classificação e propriedades químicas 
 Quinonas são consideradas uma importante classe de produtos naturais, sendo 
encontradas abundantemente na natureza em plantas, fungos, bactérias e artrópodes. 
Esta classe química representa uma variada família de metabólitos secundários 
envolvidos em diversos processos químicos e biológicos, destacando-se como 
componentes fundamentais da cadeia de transporte de elétrons e na fotossíntese 
(MONKS et al., 1992; ABRAHAM et al., 2011). 
Os compostos desta classe se caracterizam estruturalmente pela presença de sub-
estruturas redox acopladas a diversos sistemas cíclicos ou heterocíclicos e radicais 
substituintes. Sua classificação depende do tipo de anel quinônico, sendo designadas 
benzoquinonas, naftoquinonas, antraquinonas e fenantraquinonas (Figura 1). 
 
Figura 1 - Estrutura química principal do sistema aromático para classificação das 
quinonas. 
 
Fonte: SOUSA, 2012. 
 
A atividade biológica das quinonas podem ter influência de sua estrutura química, 
como do núcleo quinoide, dos seus substituintes e dos diferentes arranjos isoméricos 
(MONKS; JONES, 2002). 
 As cadeias hidrofóbicas desses compostos permitem sua ligação a membranas 
celulares e proteínas, e suas estruturas de anéis conjugados precisam ser reduzidas para 
12 
 
 
 
se tornarem mais estáveis, funcionando como moléculas aceptoras de elétrons 
(MADEO; ZUBAIR; MARIANNE, 2013). 
A metabolização das quinonas é catalisada por enzimas redutases e realizadas na 
presença de oxigênio molecular, levando a formação de EROs,como o anion radical 
superóxido (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (OH
-
) (MADEO; 
ZUBAIR; MARIANNE, 2013). 
A produção de EROs pode causar dano celular por meio de reações de alquilação 
com lipídeos, proteínas e DNA. Os efeitos citotóxicos destas reações dependem do 
indutor químico, da suscetibilidade do tecido exposto e de outros fatores que 
influenciam a eletroquímica do ambiente (MADEO; ZUBAIR; MARIANNE, 2013). 
 
1.2.1 Potencial farmacológico/toxicológico das quinonas 
 A exposição humana a quinonas pode ocorrer através da dieta, do uso de 
medicamentos ou pela poluição atmosférica (MONKS; JONES, 2002). Há registros, 
desde a antiguidade, de utilização de plantas atualmente conhecidas por conter 
compostos quinônicos como corantes e na medicina popular (BAYEN, et al. 2007). 
Substâncias contidas em plantas como o rhubarb e aloe tem sido usadas como purgantes 
há mais de 4000 anos (BENTLEY; CAMPBELL, 1974). 
 Ao longo da história, vários outros benefícios medicinais foram acrescidos a esta 
classe química, como propriedades antibiótica, antitumoral, antiparasitária, 
anticoagulante, dentre outras (ABRAHAM et al., 2011). Assim, o interesse na pesquisa 
em isolamento e síntese de novos compostos derivados de quinonas vem ganhando 
impacto científico, pelo seu considerável potencial biológico-toxicológico (YAMAGO; 
HASHIDUME; YOSHIDA, 2002). 
 Dentre os fármacos com propriedades anticâncer, as quinonas representam uma 
das maiores classes de agentes antitumorais com fortes candidatos para uso clínico 
(ASCHE, 2005). Entretanto o grande inconveniente destes compostos, como a maioria 
dos quimioterápicos, está relacionado a citotoxicidade não ser direcionada apenas às 
células cancerígenas, o que limita o avanço de muitas pesquisas (COSTA-LOTUFO et 
al., 2002). 
Há ainda quinonas com efeito antioxidante. Um exemplo é a co-enzima Q10 e sua 
forma reduzida, o ubiquinol. Essa quinona é o único antioxidante lipídeo-solúvel 
sintetizado endogenamente, e atua inibindo a peroxidação lipídica (LITARRU; TIANO, 
13 
 
 
 
2007). Outras quinonas podem ainda apresentar comportamento dual: pro-oxidante em 
concentrações micromolares e anti-oxidante quando em doses sub-micromolares, como 
é o caso da MitoQ e plastoquinonas, as quais apresentam ação específica a nível 
mitocondrial (SKULACHEV et al., 2009). 
Em suma, os compostos dessa classe podem ser tóxicos ou protetores em 
diferentes sistemas biológicos. onde vários fatores devem ser considerados em relação a 
sua bioatividade, tendo apenas começado a serem explorados (MADATHIL et al., 
2012). 
 
1.2.2 Oncocalixona A: 1,4-benzoquinona isolada do pau-branco 
 A Auxemma oncocalyx TAUB. pertencente a família Boraginaceae. Conhecida 
popularmente como pau branco, a árvore é característica da Caatinga, no nordeste 
brasileiro, onde apresenta distribuição mais expressiva no estado do Ceará. A madeira é 
comumente usada para fins de construção, devido à sua alta resistência à decomposição. 
 A casca do caule da árvore tem efeito adstringente e utilizada na medicina 
popular para o tratamento de cortes e feridas, sendo esta atividade atribuída a alantoína 
presente em quantidades significativas nas cascas da planta (BRAGA, 2001). 
 
 Figura 2- A. oncocalyx (Pau-branco). 
 
 Fonte: BARRETO et al., 2013. 
14 
 
 
 
 A investigação química dos extratos do cerne do caule de A. oncocalyx resultou 
no isolamento de várias quinonas (PESSOA et al., 1993; 1995), sendo o primeiro 
componente isolado do extrato etanólico denominado oncocalixona A [rel-8α-Hidroxi-
5-hidroximetil-2-metoxi-8αβ-metil-7, 8, 8, 9-tetrahidro-1,4-antracenadiona], 
evidenciado na Figura 3. Esta trata-se de um sólido amorfo de coloração vermelho-
escuro, responsável pela cor do cerne do caule da planta, tendo sido obtida em 
quantidades significativas (PESSOA et al., 1995). 
 
Figura 3 - Estrutura química da onco-A. 
 
 
Fonte: COSTA et al., 2008. 
 
 A onco-A é uma 1,4-benzoquinona conjugada a uma dienona e seu anel α,β-
bisdienônico a confere propriedade oxirredutora (MALTA, 2000). Esta propriedade a 
possibilita funcionar como um aceptor nucleofílico de proteínas, se ligando a 
grupamentos tióis protéicos, conforme evidenciado em experimentos de reação com a 
N-acetilcisteína, bem como levar a produção de espécies reativas de oxigênio, a 
conferindo propriedade pró-oxidante (COSTA et al., 2012). 
 Os efeitos biológicos desta quinona tem sido extensivamente estudados, sendo 
descritas atividades antiedematogênica e analgésica (FERREIRA et al., 2004), 
antidiabética (SIVAGNANAM; KALAIVANAN; RAJAMANICKAM, 2013) e 
antiagregante plaquetária (FERREIRA et al., 2008). 
 Os principais estudos desta substância se destacam na área da oncologia, por esta 
apresentar atividade antiproliferativa em linhagens de células tumorais (LEYVA et al., 
2000), no qual a atividade citotóxica está relacionada a dano direto ao DNA e morte 
celular por apoptose (SBARDELOTTO, 2013). 
 Costa-Lotufo et al. (2002) em um estudo de alterações no desenvolvimento do 
ouriço do mar, um modelo para detecção de citotoxicidade, teratogenicidade e atividade 
15 
 
 
 
antineoplásica de novos compostos, encontrou alta toxicidade da onco-A relacionada a 
sua atividade antimitótica. 
 
1.3 Estudos de Toxicidade Oral Aguda 
 Vários são os fatores que podem influenciar no desenvolvimento de toxicidade 
por exposição a uma substância. Alguns aspectos dependem do sistema biológico, como 
idade, peso corpóreo, gênero, genética, estados nutricionais e patológicos são fatores 
decisivos para a intensidade e manifestação dos sinais tóxicos. Outros fatores estão 
relacionados a concentração, potência, estado de dispersão das partículas na formulação, 
e principalmente à frequência da exposição e via de administração. Também exercem 
influência no grau de toxicidade de substâncias, características de solubilidade nos 
fluídos orgânicos, afinidade e sensibilidade do tecido ou órgão (MACEDO, 2012). 
 No que se refere à frequência de exposição ao agente tóxico, os estudos de 
toxicidade podem ser classificados em agudo, sub-agudo, sub-crônico e 
crônico(PARASURAMAN, 2011). 
 Estudos de toxicidade aguda avaliam uma única exposição a uma substância e o 
aparecimento de alterações biológicas de forma imediata, em até 14 dias após a 
exposição (PARASURAMAN, 2011). 
 Para exposições repetidas à uma substância, utilizam-se os estudos de toxicidade 
sub-aguda e sub-crônica, com duração média de até 28 dias e 90 dias, respectivamente 
(PARASURAMAN, 2011). 
 Quanto a toxicidade crônica, o aparecimento de efeitos tóxicos ocorrem após um 
longo período de tempo de exposição à substância. Para tanto, os estudos experimentais 
de toxicidade crônica tem uma faixa de duração média de 6 a 24 meses 
(PARASURAMAN, 2011). 
 Os testes de toxicidade aguda utilizam em geral três vias de administração: oral, 
dérmica e inalatória. A escolha da via de administração depende das características 
físicas e químicas da substância teste e da via predominante de exposição por humanos. 
A via oral é a mais utilizada para avaliação pré-clinica de novos agentes terapêuticos, 
por ser a via mais comumente utilizada para a administração de fármacos 
(PARASURAMAN, 2011). 
 Em geral, os testes de toxicidade oral aguda são realizados com uma única dose 
administrada no animal, geralmente roedores, por ser o modelo experimental mais 
16 
 
 
 
amplamente difundido, sendo recomendado a utilização de fêmeas, em virtude da maior 
susceptibilidade a efeitos tóxicos no gênero decorrente de suas alterações hormonais 
fisiológicas (HAYES, 2007). 
 Nestes testes, o efeito da dose da substância administrada é observado quanto à 
manifestação de sinais patológicos no animal. Ademais,estes estudos permitem a 
investigação da dose letal média tóxica de uma substância (DL50), que é a dose de um 
agente tóxico, obtida estatisticamente, capaz de produzir a morte de 50% dos animais de 
um grupo experimental (HAYES, 2007). Assim, um agente será tanto mais tóxico, 
quanto menor for sua DL 50. 
 O teste da DL50 foi realizado pela primeira vez em 1927 por Trevan para avaliar 
substâncias que seriam utilizadas por seres humanos como a Digitallis e a insulina. Na 
década de 70, este teste começou a ser empregado amplamente como base de 
comparação e classificação da toxicidade de substâncias, chegando a tornar-se pré-
requisito para a aprovação de novos fármacos, aditivos alimentares, ingredientes, 
cosméticos, produtos domésticos, químicos industriais e pesticidas por grandes agências 
reguladoras, como o FDA (do inglês " Food and Drugs Administration") (STAMMATI 
et al., 2005). 
 A limitação dos estudos para testes de DL50 nesta época se referia ao alto 
número de animais experimentais necessários para a sua realização, o que esbarrava em 
questões bioéticas polêmicas (BOTHAM, 2002). Alternativas à esses métodos foram 
desenvolvidas e estabelecidos protocolos para a minimização da utilização de animais. 
 Os atuais protocolos de toxicidade oral aguda compreendem as diretrizes da 
Organização para Cooperação Econômica e Desenvolvimento (OECD, do inglês 
Organization for Economic Cooperation and Development): diretriz 420 - Teste de 
doses fixas (FDP, do inglês "Fixed Dose Procedure") (OECD, 2001), diretriz 423 - 
Toxicidade aguda de classe (ATC, do inglês "Acute Toxic Classic Method" ) (OECD, 
2001) e a diretriz 425 - Método "Up and Down" (UDP, do inglês "Up and Down 
Procedure") (OECD, 2008). 
 O teste de dose fixa (OECD, 2001) é utilizado para identificar a menor dose que 
causa toxicidade evidente. Neste teste são estabelecidas doses fixas de 5, 50, 300 e 2000 
mg/Kg, 5 animais por dose, e o animal experimental é observado por 14 dias, quanto a 
sua sobrevivência e aparecimento de efeitos tóxicos. Estas doses foram fixadas de forma 
que sejam moderadamente tóxicas, e que doses letais sejam evitadas. 
17 
 
 
 
 O método de toxicidade aguda de classe (OECD, 2001) é similar ao anterior, 
sendo utilizadas as mesmas doses, entretanto contam com apenas 3 animais por dose, 
sendo necessário 2 a 4 doses para a determinação da toxicidade aguda da substância. Da 
mesma forma que o FDP, o ATC é utilizado para identificar a menor dose que causa 
toxicidade evidente. Desta forma, os testes FDP e ATC determinam apenas a faixa 
estimada da DL50, mas não mensuram o valor exato desta. 
 Quanto ao teste "Up and Down"(OECD, 2008), este é assim dominado por conta 
da progressão de doses estabelecidas para o teste. É estabelecido uma dose inicial de 
175 mg/Kg e observado o padrão de sobrevivência do animal em 48 h, e a escolha da 
dose para o próximo animal é feita com base na sobrevivência ou morte do primeiro, na 
qual a dose é aumentada ou diminuída em um fator de 3,2. Este método é o mais 
indicado pelas agências reguladoras por utilizar um menor número de animais. bem 
como por permitir estimar de forma precisa a DL50. 
 Nestes protocolos de toxicidade, está também estabelecido a possibilidade de 
realização do teste de dose limite, no qual se inicia com a maior dose permitida, 
geralmente 2000 mg/Kg, ou excepcionalmente, 5000 mg/Kg. Se o primeiro animal 
morre em 48 h, realiza-se o teste principal. Se o animal sobrevive, continua-se com a 
mesma dose para o próximo animal, sendo o teste finalizado com a sobrevivência de 3 
animais consecutivos na dose limite. 
 A escolha do método deve ser feita com base do entendimento claro da proposta 
e quanto a resposta que se quer ser obtida. 
 
1.4 Principais alterações biológicas induzidas por substâncias tóxicas 
 
1.4.1 Alterações pressóricas sistêmicas 
 A pressão arterial é de extrema importância para uma avaliação inicial e 
estimativa útil do estado cardiovascular (KOEPPEN; STANTON, 2009). Algumas 
classes de fármacos atualmente no mercado, como alguns agentes quimioterápicos, 
apresentam cardiotoxicidade como efeito adverso, e por vezes, seu uso tem restrição em 
pacientes com desordens pressóricas (KALIL FILHO et al., 2011). 
 A pressão arterial é definida como a força que o fluxo sanguíneo exerce sobre as 
paredes dos vasos, sendo determinada diretamente pelo volume sanguíneo e pela 
18 
 
 
 
complacência arterial, os quais são afetados pelo débito cardíaco (frequência cardíaca x 
débito sistólico) e a resistência periférica (KOEPPEN; STANTON, 2009). 
 O ciclo cardíaco conta com dois extremos na pressão arterial: a pressão arterial 
sistólica, e a pressão arterial diastólica, em decorrência de contração e relaxamento 
ventricular, respectivamente. A diferença entre a pressão sistólica e a pressão diastólica 
é denominada pressão de pulso. Outro parâmetro derivado é a pressão arterial média, a 
qual representa a razão entre a área sobre a curva da pressão arterial e a duração do ciclo 
cardíaco. 
 Quando o débito cardíaco se mantém constante, o aumento da resistência 
periférica leva ao aumento da pressão arterial média. Quando a complacência arterial é 
constante, o aumento da resistência periférica leva a aumentos proporcionais da pressão 
sistólica e diastólica, de forma que a pressão de pulso não se altera. Entretanto este 
comportamento linear não existe para a complacência arterial. O aumento da pressão 
arterial média implica na diminuição da complacência arterial e elevação da pressão de 
pulso (KOEPPEN; STANTON, 2009). 
 Alterações na pressão arterial são frequentemente detectadas durante as 
intoxicações agudas. A hipotensão está relacionada à substâncias depressoras do SNC, 
bem como em situações de reação anafiláticas, já a hipertensão pode ser resultado do 
efeito de substâncias vasoativas diretas ou indiretas (SCHNELLMANN, 2008). 
 Muitos xenobióticos com ação pro oxidante estão relacionados ao 
desenvolvimento de toxicidade sistêmica por dano direto às células musculares lisas da 
estrutura vascular, comprometendo a resistência dos vasos, por redução da capacitância 
venosa, destruição de capilares teciduais e angiogênese compensatória 
(SCHNELLMANN, 2008). 
 Para a manutenção da pressão em seus níveis fisiológicos o organismo dispõe de 
mecanismos regulatórios de curto, médio e longo prazos (MOHRMAN; HELLER, 
2011). 
 A ativação de barorreceptores são reflexos rápidos à variação de pressão. Os 
barorreceptores arteriais, receptores de alta pressão, que se localizam no arco aórtico e 
seios carotídeos, ao serem estimulados ativam o núcleo do trato solitário, no bulbo, 
levam a redução da pressão arterial média através do sistema nervoso autônomo. Outros 
receptores periféricos e centrais, assim como os dos centros altos do SNC, como 
hipotálamo e córtex atuam sobre os centros medulares cardiovasculares para a regulação 
da pressão arterial média (MOHRMAN; HELLER, 2011). 
19 
 
 
 
 Como mecanismo compensatório a médio prazo, nos casos de redução dos 
níveis pressóricos tem-se o papel da liberação de renina pelas células justaglomerulares 
renais. A renina está relacionada à conversão do angiotensinogênio em angiotensina I, a 
qual sofre ação da enzima conversora de angiotensina (ECA) para a formação de 
angiotensina II, potente vasoconstrictor que reforça as ações do barorreflexo 
(KOEPPEN; STANTON, 2009). 
 A autorregulação da pressão arterial promovida pelos vasos sanguíneos 
compreendem ajustes a longo prazo e ocorrem a nível endotelial, metabólico e 
miogênico (CONSTANZO, 2014). 
 A resposta do endotélio se dá através de substâncias liberadas por este, o óxido 
nítrico e outros fatores de relaxamento derivado do endotélio, as quais modulam o 
músculo liso vascular, ajustando o tônus vascular de acordo com as mudanças na 
pressão arterial, adaptando os vasos sanguíneos às mudanças na demanda de perfusãodeste (MONCADA, 2006). 
 O controle metabólico é alterado conforme a demanda e /ou necessidade de um 
órgão, ou seja, respostas vasodilatadoras ou vasoconstritoras são efetuadas conforme o 
catabolismo ou anabolismo dos tecidos corporais. Como exemplos de metabólitos 
vasodilatadores produzidos nos tecidos podem ser citados CO2, H
+
, K
+
, lactato e 
adenosina (CONSTANZO, 2014). 
 Por último, tem-se o controle miogênico. Este controle se baseia na propriedade 
que o músculo liso vascular tem de se contrair ou relaxar, de acordo com as alterações 
na pressão transmural. Esta função é atribuída à células altamente especializadas 
contendo canais iônicos e proteínas contráteis e reguladoras. O músculo liso vascular 
controla a resistência periférica total, o tônus arterial e venoso, além do fluxo sanguíneo 
(CONSTANZO, 2014). 
 Interferências nesses processos fisiológicos de autoajuste podem decorrer de 
efeitos tóxicos ocasionados por fármacos, levando a alterações pressóricas agudas, 
redução da eficácia das drogas anti-hipertensivas ou o agravamento de uma hipertensão 
preexistente ( SCHNELLMANN, 2008). 
 
1.4.2 Alterações na fisiologia renal 
 A integridade funcional do sistema renal é vital para a homeostasia do 
organismo, uma vez que os rins constituem a principal rota de excreção de metabólitos, 
20 
 
 
 
regulação do volume de líquido extracelular, composição eletrolítica, manutenção do 
equilíbrio ácido-base, síntese e liberação de hormônios, e metabolismo de substâncias 
(FERGUSON; VAIDYA; BONVENTRE, 2008). 
 Os rins, mais especificamente os néfrons, suas unidades morfofuncionais, são 
responsáveis por filtrar diariamente cerca de 150-180 litros de plasma circulante, 
recebendo aproximadamente 25% do débito cardíaco (BONVENTRE et al., 2011). Este 
fato o faz ser um órgão que entra em contato direto com xenobióticos  substâncias 
químicas ou seus metabólitos  carreados pela circulação sistêmica e livremente 
filtrados, em quantidades relativamente altas (PERAZELLA, 2009). 
 Cada segmento do néfron pode ser alvo específico de agentes tóxicos, em 
virtude de características anatômicas e funcionais particulares de cada segmento. Dentre 
essas particularidades podem ser citadas diferenças quanto ao fluxo sanguíneo, 
transporte e acúmulo de substâncias, propriedades físico-químicas do epitélio, sítios de 
reatividade celular ou molecular, balanço entre reações de bioativação e detoxificação, 
energética celular e mecanismos de reparo celular (SCHNELLMANN, 2008). 
 Uma das manifestações mais comuns de dano nefrotóxico é a Insuficiência 
Renal Aguda (IRA), caracterizada por um abrupto declínio da função renal por redução 
da taxa de filtração glomerular (TFG), levando a um aumento dos níveis séricos de 
compostos nitrogenados, como ureia e creatinina, e de resíduos de hidrogênio 
(SCHNELLMANN, 2008). Há ainda novos marcadores preditores de nefrotoxidade 
aguda, como a dosagem de KIM-1 na urina, entretanto ainda com utilização restrita em 
estudos pré-clínicos. 
 Classificada de acordo com a localização da lesão, a IRA pode ser dividida em 
pré-renal  quando a lesão ocorre em um sistema anterior aos rins; intrarrenal  quando 
a lesão ocorre no próprio rim, afetando os vasos sanguíneos, glomérulos ou túbulos; e 
pós-renal: quando ocorre obstrução do sistema coletor de urina (EATON; POOLER, 
2006). 
 O termo Lesão Renal Aguda (LRA) tem uma abordagem mais ampla, uma vez 
que abrange desde pequenas alterações na função renal secundárias ao dano, até 
situações que necessitam de terapia de substituição renal. Felizmente, na maior parte 
dos casos são danos reversíveis, uma vez que os rins possuem sistemas compensatórios 
e de reparo (SCHNELLMANN, 2008). 
21 
 
 
 
 Mecanismos compensatórios são necessários em virtude da perda de massa renal 
funcional. Como exemplo pode ser citado o aumento da TFG e do fluxo sanguíneo 
glomerular nos néfrons remanescentes não lesados, com proporcional aumento da 
reabsorção tubular de água e solutos, para que o equilíbrio seja mantido e a função renal 
global permaneça normal até que ocorra a reversão do dano (SCHNELLMANN, 2008). 
 Associado a esses mecanismos compensatórios, as células dos néfrons lesados 
podem sofrer morte celular, por necrose ou apoptose, ou serem subletalmente atingidas 
e submetidas a mecanismos de reparo e adaptação. 
 A perda de néfrons pode resultar em aumentos adaptativos nas pressões e nos 
fluxos glomerulares dos néfrons funcionais com vistas ao aumento da TFG de todo o 
rim. Essas alterações podem ocasionar ao longo do tempo glomérulo-esclerose focal e 
ocasionar atrofia tubular e fibrose intersticial, bem como ocasionar danos mecânicos aos 
capilares, afetando sua permeabilidade. (SCHNELLMANN, 2008). 
 A perda de polaridade celular e integridade da junção oclusiva, causada por dano 
direto às proteínas de membrana das células tubulares, gerando o desprendimento de 
células viáveis e nãoviáveis no lúmem tubular pode resultar em formação de cálculo e 
obstrução tubular. 
 Quanto aos principais mecanismos de reparo celular, estes estão relacionados 
com processos de desdiferenciação, proliferação, migração e diferenciação celular. A 
agressão tóxica ao néfron pode induzir desdiferenciação/rediferenciação de células 
epiteliais dos túbulos renais e fibroblastos intersticiais, transformando-os em 
miofibroblastos, num processo caracterizado por deposição de colágeno intersticial e 
recrutamento temporário de macrófagos para regulação da resposta imune e resolução 
do dano. Esse processo tem sido denominado transição epitelial-mesenquimal (TEM) 
(SCHNELLMANN, 2008; PERAZELLA, REILLY JR, 2015). 
 Entre os atores de risco que contribuem com a incidência ou severidade da lesão 
renal podem ser destacados fatores genéticos e hereditários, idade, depleção de volume 
sanguíneo, choque séptico, hipotensão e doença renal preexistente. Uma lesão não 
reversível pode levar a necessidade de implantação de terapia dialítica e transplante 
renal (ZIMNER-RAPUCH et al., 2013). 
 Outros fatores também envolvidos no agravamento da lesão renal incluem 
inibição ou ativação de fatores de crescimento, aumento da deposição de matriz 
extracelular, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), e acúmulo de lipídios na 
membrana (SCHNELLMANN, 2008). 
22 
 
 
 
2 JUSTIFICATIVA 
 Estudos de screening toxicológico tem grande importância para o 
desenvolvimento de novos fármacos e para a extensão da investigação do potencial 
terapêutico para moléculas já existentes (PARASURAMAN, 2011). 
 Apesar dos avanços de metodologias alternativas in vitro, como cultura de 
células, os estudos de toxicidade substâncias em modelo animal ainda não puderam ser 
completamente abolidos, tendo em vista a complexidade da resposta um sistema 
biológico (VALADARES, 2006). 
 Compostos da classe química das quinonas apresentam como grande 
inconveniente o desenvolvimento de toxicidade, relacionadas a efeitos adversos 
sistêmicos e sítio específicos, o que limita o avanço de pesquisas e a restrição de sua 
utilização clínica (MONKS; JONES, 2002; ABRAHAM et al., 2011; MADATHIL et 
al., 2012; BOLTON et al, 2000). 
 Neste sentido, as promissoras possibilidades de utilização da onco-A na 
terapêutica, o conhecimento sobre a toxicidade das quinonas e a ausência de dados 
toxicológicos in vivo para a substância, foram os principais fatores motivadores para a 
execução deste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
 
 
 
3. OBJETIVOS 
3.1 Geral 
Avaliar toxicidade oral aguda e os efeitos pressóricos e renais da onco-A em modelos 
animais in vivo e ex vivo. 
 
3.2 Específicos 
 Investigar a toxicidade oral aguda da onco-A por meio da determinação da DL50 
pelo Teste da dose limite; 
 Estudar os efeitos da onco-A na pressão arterial média de ratos anestesiados; 
 Identificar possíveis alterações em parâmetros bioquímicos séricos(ureia, 
creatinina, ácido úrico, TGO, TGP, fosfatase alcalina e CK-Total) dos animais 
submetidos protocolos de tratamento in vivo com a substância; 
 Avaliar os efeitos da onco-A sobre os parâmetros funcionais renais em um 
modelo ex vivo de perfusão de rim isolado de rato; 
 Caracterizar as alterações histológicas promovidas pela onco-A nos órgãos 
coletados nos protocolos experimentais: rins, coração e pulmão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
 
 
4 MATERIAIS E MÉTODOS 
 
4. 1 Substâncias utilizadas 
 
4.1.1 Onco-A 
 A onco-A foi isolada por cromatografia em gel de sílica a partir do extrato 
etanólico do cerne do caule da A. oncocalyx coletada em Pentecoste - Ceará (COSTA et 
al., 2012). A espécie foi identificada pelo prof. Edson P. Nunes e uma exsicata se 
encontra depositada no Herbário Prisco Bezerra do Departamento de Biologia da 
Universidade Federal do Ceará (Nº. 18459). 
 A preparação do extrato, o método de isolamento e a caracterização química 
foram descritas por Pessoa et al. (1993, 1995). A estrutura deste composto foi 
determinada por meio de técnicas espectrométricas como UV-Vis, infravermelho, 
espectometria de massa e combinação de métodos 1D e 2D de ressonância magnética 
nuclear. 
 A substância foi gentilmente cedida pelo Laboratório de Análise Fitoquímica de 
Plantas Medicinais II (LAFIPLAM II) sob a supervisão da Profª. Dra. Otília Deusdênia 
Loiola Pessoa, para investigação farmacológica. 
4.2 Animais experimentais 
Todos os nossos experimentos foram realizados de acordo com as 
recomendações do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais (CEPA) da Universidade 
Federal do Ceará, sob o número 32/15. 
 Foram utilizados ratos Wistar machos para os experimentos de pressão arterial 
média e perfusão renal, enquanto que para o teste de toxicidade oral aguda foram 
utilizados camundongos Swiss fêmeas, ambos provenientes do Biotério do 
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC. Os animais foram acondicionados 
em caixa de polipropileno, mantidos em ambiente com temperatura controlada de 
22±2°C, luminosidade (ciclo claro/escuro 12/12 horas), umidade e circulação de ar 
controlados, acesso a ração padrão e água “ad libitum”, com jejum prévio de 8h para 
ratos e 2h para camundongos antes do inicio dos protocolos experimentais. 
 
 
25 
 
 
 
4.3 Desenho experimental 
 Inicialmente foi realizado o teste de toxicidade oral aguda para estimação da 
DL50 e identificação de órgãos-alvo, segundo o teste da Dose Limite descrita nos 
protocolos de de Toxicidade oral aguda nº 420, 423 e 425 da OECD. Para avaliação da 
atividade pressórica in vivo da substância, foram realizados experimentos de pressão 
arterial média em ratos anestesiados, com a administração de onco-A in bolus por via 
intravenosa, em concentrações cumulativas da substância. Os ensaios in vivo contaram 
com análise bioquímica de plasma e histopatologia dos principais órgãos. Para a 
avaliação dos efeitos renais, foram realizados experimentos de perfusão de rim isolado 
de rato, a fim de avaliar possíveis alterações nos parâmetros funcionais renais após a 
adição da substância no sistema de perfusão ex vivo. Para todos os experimentos, os 
grupos experimentais tratados com onco-A foram comparados a um grupo controle não 
tratado. As concentrações utilizadas obedeceram a intervalos de meia escala logarítmica 
e foram estabelecidas com base em dados da literatura de estudos com substâncias 
isoladas (SILVA NETO, 2012; OECD, 2008). 
 
4.3.1 Toxicidade oral aguda - Teste da dose limite (2000mg/Kg) 
4.3.1.1 Protocolo experimental 
 Para a realização do Teste da Dose Limite (2000mg/Kg) foram utilizados 
camundongos swiss fêmeas, pesando entre 20 a 25g, submetidos a um jejum prévio de 
2h. 
 A onco-A foi administrada na dose de 2000mg/Kg por uma cânula de gavagem 
em um volume de 2mL/Kg. Com a sobrevivência do primeiro animal em 48h, esta dose 
foi repetida em três animais consecutivos. A interpretação realizada para o teste é que a 
DL50 será maior que 2000mg/Kg se três animais ou mais sobrevivem. Se três animais 
morrem, é realizado o teste principal. 
 Após a administração de cada dose, os animais foram observados por 15, 30 e 60 
minutos bem como após 24 horas e diariamente por um total de 14 dias, quanto a 
presença de sinais indicativos de toxicidade, como alterações físicas ou 
comportamentais que pudesse sugerir que os animais apresentavam um quadro de dor 
ou estresse. 
26 
 
 
 
 A variação de peso corporal foi registrada. Ao final do experimento os animais 
sobreviventes foram anestesiados com cetamina (100mg/Kg) e xilasina (10mg/Kg) para 
coleta de sangue venoso para posteriores análises bioquímicas; bem como a retirada dos 
órgãos (rim, coração e pulmão) para análise histológica. 
 
4.3.1.2 Dosagens bioquímicas 
 Em decorrência de limitações quanto ao volume de plasma de camundongos, 
foram realizadas apenas as dosagens de três parâmetros bioquímicos (ureia, creatinina e 
ácido úrico). As dosagens foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas e 
Toxicológicas (LACT) da Instituição, com kits de reagentes da marca Bioclin, em 
equipamento Mindray BS120. 
 
4.3.2 Efeitos na Pressão Arterial Média de ratos anestesiados 
4.3.2.1 Técnica cirúrgica 
Ratos Wistar machos, pesando entre 250-300 g, foram submetidos a um jejum 
prévio de 8h e anestesiados com cetamina (100mg/Kg) e xilazina (10mg/Kg) para a 
realização do procedimento cirúrgico. 
O primeiro passo do procedimento consistiu na traqueostomia, na qual a traqueia 
foi isolada e uma curta cânula de polietileno (PE 120) inserida, permitindo um fluxo 
respiratório espontâneo e evitando a fácil aspiração de eventuais secreções brônquicas. 
Após a traqueostomia, um cateter de polietileno (PE10 conectado a PE50) 
preenchido com heparina (500 UI.mL
-1
 em salina) foi implantado na aorta abdominal 
para registro da Pressão Arterial Média. Outro também preenchido com heparina (500 
UI.mL
-1
 em salina) foi implantado na veia cava inferior (para administração de drogas), 
ambos 1 cm abaixo da artéria renal, conforme técnica descrita previamente (LAHLOU 
et al., 1999; SIQUEIRA, 2005), ilustrada na Figura 4. 
O cateter aórtico foi então acoplado a um transdutor de pressão piezo-elétrico 
(Braile BXSN) que é acoplado a um sistema de amplificação de sinal com interface 
USB (DATAQ DI-148U), utilizando o software de aquisição de dados WinDaq/Lite 
para o cálculo direto da pressão arterial média. 
 
27 
 
 
 
Figura 4 - (A) Traqueostomia. (B) Localização anatômica da artéria e veia femural e 
posicionamento dos cateteres arterial (vermelho) e venoso (azul).(C) Implantação do 
cateter na artéria e veia femural. (D) Registro da pressão arterial média no sistema de 
aquisição de dados. 
 
 
Fonte: Adaptado de Jersepen, Knupp, Northcott (2012). 
 
4.3.2.2 Protocolo experimental 
Após o acoplamento do cateter da aorta abdominal ao sistema foi permitida a 
estabilização da pressão arterial média por um período de 15 a 20 minutos, o qual foi 
considerado como controle interno, para avaliação da pressão basal do animal, após o 
qual se iniciou o período teste. 
A onco-A foi injetada manualmente in bolus no volume de 0,1 mL, seguido de 
injeção de 0,2 mL de solução salina. Cada animal recebeu uma série crescente de doses 
da onco-A (30, 100, 300 e 1000 µg/Kg) através do cateter intravenoso em intervalos de 
5 minutos cada, e o curso temporal das alterações de pressão arterial média foi 
registrado. 
(B) (A) 
(C) (D) 
28 
 
 
 
Após o período experimental foi realizado eutanasia do animal por 
exsanguinação e laparotomia transversal e longitudinal para coleta de sangue e órgãos 
(coração e rim). O protocolo utilizado encontra-se resumido na Figura 5. 
 
Figura 5 - Representação esquemática do experimento de pressão arterial média. 
 
 
4.3.2.3 Dosagens bioquímicas 
Alíquotas de sangue venoso foramcoletadas para a realização de dosagens 
bioquímicas de creatinina, ureia, ácido úrico, TGO (transaminase glutâmico-
oxalacética), TGP (transaminase glutâmico-pirúvica) e creatina quinase (CK-Total). As 
dosagens foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas (LACT) 
da Instituição, com kits de reagentes da marca Bioclin, em equipamento Mindray 
BS120. 
 
4.3.3 Perfusão de Rim Isolado 
4.3.3.1 Sistema utilizado e solução perfusora 
A técnica da perfusão de rim isolado tem o objetivo de subsidiar um maior 
entendimento dos mecanismos de controle da função renal, de modo a avaliá-lo sem a 
interferência sistêmica (NIZET, 1975). O sistema utilizado consiste em perfusão com 
recirculação em dois subsistemas, inicialmente in situ, e logo em seguida em circuito 
fechado para perfusão in vitro, mantidos em temperatura de 37 ºC (FONTELES et al., 
1983; MONTEIRO; FONTELES, 1999). 
Este sistema permite a manutenção constante de parâmetros funcionais renais 
com utilização de albumina bovina a 6% na solução perfusora. 
A solução perfusora empregada nos experimentos de perfusão renal foi a de 
Krebs-Henseleit modificada concentrada 20x contendo as seguintes substâncias com 
29 
 
 
 
suas respectivas concentrações: 114.0 mM de NaCl; 4.96mM de KCl; 1.24 mM de 
KH2PO4; 0.5 mM de MgSO4.7H2O; 24.99 mM de NaHCO3; 2.10 mM de CaCl2.2H2O; 
3.60 mM de glicose e albumina bovina a 6% peso por volume (FONTELES, 1998). Esta 
solução foi dialisada com albumina, com o objetivo de retirar substâncias contaminantes 
como piruvatos, citratos e lactatos (HANSON; BALLAR, 1968; COHEN; KOOK; 
LITTLE,1977; ROSS, 1978). Após 48 horas de diálise, a solução perfusora foi 
acrescida com 0,15g de inulina. O pH da solução foi ainda ajustado entre os valores de 
7,3 e 7,4. 
As substâncias dialisáveis foram mantidas constantes, com oxigenação adaptada 
ao próprio sistema, a qual consiste em mistura carbogênica com 95% de oxigênio e 5% 
de CO2. A inulina presente na solução perfusora é utillizada para medida do ritmo de 
filtração glomerular. 
 
Figura 6 - Desenho esquemático do sistema de perfusão de rim isolado. 
 
Fonte: Adaptado de LAFAVET-UFC. 
30 
 
 
 
A calibração do sistema foi realizada antes de cada experimento com uma 
solução de cloreto de sódio a 0,9% mantida a 37°C. Foram observados para cada 
unidade da bomba de perfusão (1, 2, 3, 4 e 5) a pressão de perfusão (mmHg), o fluxo da 
solução no sistema (L/min) e o volume de solução coletado em um minuto (mL/min). 
 
4.3.3.2 Técnica cirúrgica 
A técnica cirúrgica utilizada seguiu o método descrito por Balhlmann et al. 
(1967), Nishiitsutji-Uwo et al. (1967), Ross (1978) e Fonteles et al. (1983). 
Ratos Wistar machos (n=6) pesando entre 250-300g foram anestesiados com 
tiopental sódico na dose de 50mg/Kg de peso corporal. A veia femoral foi isolada para a 
administração de manitol (100mg/mL – 3 mL independentemente do peso) a fim de 
facilitar a visualização e a fixação da cânula ao ureter. 
Após assepsia da parede abdominal, procedeu-se a uma laparotomia 
longitudinal e transversal no abdome para uma melhor observação das estruturas 
anatômicas. 
As vísceras foram rebatidas e as gorduras foram divulsionadas para 
identificação do ureter, o qual foi dissecado para inserção de uma cânula de polietileno 
PE-30. A artéria mesentérica superior, artéria renal e a aorta foram identificadas e 
dissecadas. O rim direito foi descapsulado, e o fluxo sanguíneo local da artéria renal e 
aorta foram interrompidos para introdução de uma cânula metálica na artéria 
mesentérica superior até a artéria renal, onde foi fixada. 
Durante o procedimento cirúrgico, uma parte da solução já oxigenada 
(40mL) foi desviada para o sistema de perfusão in situ, com o intuito de perfundir o rim 
ainda in vivo, evitando qualquer isquemia ao órgão. Logo após, o rim foi transportado 
para o sistema de perfusão in vitro, sem a interrupção do fluxo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
 
 
Figura 7 - (A) Identificação das artérias mesentérica e renal. Rim extirpado com artéria 
renal e ureter canulados. (B) Transferência para o sistema de perfusão. 
 
Fonte: LAFAVET – UFC. 
 
4.3.3.3 Protocolo experimental 
Os experimentos foram iniciados após a estabilização e adaptação do órgão às 
novas condições. Após os 30 minutos iniciais, considerados como controle interno, foi 
adicionada a onco-A à solução perfusora no sistema, em três diferentes concentrações, e 
observadas as mudanças nos parâmetros renais até os 120 minutos. Para tal 
monitorização, foram registrados a pressão de perfusão e o fluxo de perfusão em 
manômetro e fluxômetro, respectivamente, simultaneamente as coletas de amostras de 
urina e perfusato de forma intercaladas a cada cinco minutos em um período total de 
120 min, conforme esquematizado na Figura 8. 
Amostras de urina e perfusato foram congeladas a -20 °C para posterior 
dosagem de sódio, potássio, cloreto, inulina e osmolaridade, importantes no cálculo dos 
parâmetros da função renal. 
 
(B) (A) 
32 
 
 
 
Figura 9 - Representação esquemática do experimento de perfusão renal. 
 
 
4.3.3.4 Dosagens bioquímicas 
Com as amostras de urina e perfusato foram realizadas dosagens de sódio, 
potássio e cloreto por meio do dosador de eletrólitos 9180 (Roche, Brasil). A inulina do 
perfusato e da urina foi determinada por hidrólise direta, conforme Walser et al. (1955) 
e Fonteles et al. (1983), com modificações que reduziram as quantidades de amostras e 
reagentes utilizados. A osmolaridade das amostras de urina e perfusato foram medidas 
utilizando um osmômetro (Osmômetro de Pressão a Vapor - modelo WESCOR® Vapro 
5520). 
 
4.3.3.5 Determinação dos parâmetros funcionais renais 
Em posse de todos os dados obtidos, permitiu-se avaliar nos três grupos tratados 
com concentrações em escala logarítmica, os efeitos da substância sobre a pressão de 
perfusão (PP), resistência vascular renal (RVR), ritmo de filtração glomerular (RFG), 
fluxo urinário (FU) e transporte de eletrólitos (Na
+
, K
+
 e Cl
-
), frente ao grupo controle. 
Os cálculos para os parâmetros funcionais renais estão descritos no Quadro 1. 
 
 
 
 
 
33 
 
 
 
Quadro 1 - Cálculos para determinação dos parâmetros funcionais renais. 
1. FU (mL.g
-1
. min
-1
) = Fluxo urinário 
FU = (Peso do volume urinário / Peso do rim esquerdo) x 10 
2. PP (mmHg) = Pressão de perfusão. Leitura em manômetro 
3. RFG (mL.g
-1
.min
-1
) = Ritmo de filtração glomerular 
RFG = (DOU in / DOP in x FU) sendo DOU in = densidade ótica da inulina na urina e DOP in = 
densidade ótica da inulina no perfusato 
4. FPR (mL.g
-1
.min
-1
) = Fluxo de perfusão renal (registrado a cada 10 min/peso do rim/intervalo de 
tempo) 
5. RVR (mmHg/mL.g
-1
.min
-1
) = Resistência vascular renal 
RVR = PP (mmHg) / FPR 
6. FNa
+
 (μEq.g-1. min-1) = Sódio filtrado 
FNa+ = RFG x PNa+ (PNa+ = Concentração de sódio no perfusato) 
7. ENa
+
 (μEq.g-1. min-1) = Sódio excretado 
ENa+ = FU x UNa+ (UNa+ = Concentração de sódio na urina) 
8. TNa
+
 (μEq.g-1. min-1) = Sódio transportado 
TNa+ = FNa+ - ENa+ 
9. %TNa
+
 = Percentual de sódio transportado 
%TNa+ = TNa+ x 100 / FNa+ 
10. FK
+
 (μEq.g-1. min-1) = Potássio filtrado 
FK+ = RFG x PK+ (PK+ = concentração de potássio no perfusato) 
11. EK
+
 (μEq.g-1. min-1) = Potássio excretado 
EK+ = FU x UK+ (UK+ = Concentração de potássio na urina) 
12. TK
+
 (μEq.g-1. min-1) = Potássio transportado 
TK+ = FK+ - EK+ 
13.TK
+
 = Percentual de potássio transportado 
%TK+ = TK+ x 100 / FK+ 
14. TCl- (μEq.g-1. min-1) = Cloreto transportado 
TCl – = FCl – - ECl – 
15. % TCl
-
 = Percentual de cloreto transportado 
% TCl – = TCl – x 100 / F TCl – 
Fonte: MARTINEZ-MALDONADO; OPVA-STITZER, 1978. 
 
 
34 
 
 
 
4.4 Análise histológica 
 Após cada protocolo experimental, os órgãos coletados nos experimentos de 
toxicidade oral aguda (rins, pulmões e coração), pressão arterialmédia (coração e rins), 
e perfusão renal (rins perfundidos e não perfundidos) foram armazenados inicialmente 
em formol tamponado a 10% por 24 h, seguido de armazenamento em álcool 70% até o 
posterior exame histológico. 
Os fragmentos obtidos foram submetidos ao processamento histológico 
convencional: desidratação, diafanização, e, em seguida, cortados em uma espessura de 
3-5μm. Foi realizada coloração de hematoxilina-eosina (HE) e as lâminas analisadas 
através de um microscópio óptico Nikon Eclipse Ni, Software Nis 4.0. 
 Todas as lâminas dos órgãos analisados foram confeccionadas e avaliadas pela 
Profa. Dra. Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista, no Laboratório de Morfologia 
Experimental e Comparada (MEC), da Faculdade de Veterinária da Universidade 
Estadual do Ceará. 
 
4.5 Análise estatística 
 Para análise de dados foi utilizado o software estatístico GraphPad® Prism v6.0. 
O nível de significância utilizado foi *p<0,05. 
Os resultados dos experimentos de Pressão Arterial Média em ratos anestesiados 
foram analisados através dos testes estatísticos (ANOVA e Teste t de Student). 
Para as dosagens bioquímicas realizadas nos experimentos de Toxicidade Oral 
Aguda e de Pressão arterial média, os resultados foram analisados utilizando Teste t de 
Student. 
Nos ensaios de perfusão renal, todas as tabelas e gráficos que avaliaram os 
parâmetros renais foram estudados de acordo com a variável tempo e os dados 
compilados em intervalos de 30min (30, 60, 90 e 120). As diferenças entre os tempos de 
um mesmo grupo foram comparadas utilizando teste t de Student. Já as diferenças entre 
tempos iguais entre os grupos foram comparadas por Análise de Variância Fator Duplo 
(Two-Way ANOVA), seguida de pós-teste de Bonferroni. 
 
 
 
 
35 
 
 
 
5 RESULTADOS 
5.1 Toxicidade Oral Aguda da onco-A 
5.1.1 Observações experimentais, acompanhamento do peso corporal dos animais e 
mensuração da DL50 
 Foi realizado o teste de dose limite estabelecido nos protocolos de nº 420, 423 e 
425 da OECD, de toxicidade oral aguda. Onco-A na dose de 2000mg/Kg foi 
administrada por gavagem no primeiro animal, e após 48h foi verificado a 
sobrevivência deste (Animal 1). Diante deste resultado, foram testados 
consecutivamente 3 animais. Os Animais 2 e 3 sobreviveram aos 14 dias da 
administração, ao passo que o Animal 4 morreu cerca de 2h e 30 min depois da 
gavagem. 
 Destacando-se que três animais consecutivos sobreviveram no teste da dose 
limite, de 2000mg/Kg, estima-se uma DL50 ˃ 2000 mg/Kg (Tabela 1). 
 
Tabela 1 - Dados brutos dos experimentos realizados utilizando o Teste da Dose Limite 
(2000mg/Kg) 
Nº Animal Morte/Sobrevivência 
1 o 
2 o 
3 o 
4 x 
* X = morreu, o = sobreviveu 
Durante o período de experimentação, foi observado que nas primeiras 24 h todos 
os animais tratados com a substância apresentaram urina com a coloração vermelho-
escuro, característica da onco-A, inclusive o animal que morreu. 
Conforme descrito no protocolo experimental, as observações foram realizadas 
em 15, 30, 60 min e 24h após a administração da substância. Entretanto a morte do 
animal 4 foi detectada 2h e 30 min depois, ou seja, após as observações de 60 min, e até 
este tempo não havia sido detectada nenhuma alteração comportamental no animal que 
indicasse toxicidade. Os animais que sobreviveram não manifestaram nenhuma outra 
alteração durante os 14 dias experimentais. 
36 
 
 
 
Os animais sobreviventes foram acompanhados quanto ao peso corporal durante 
os 14 dias de tratamento, conforme evidenciado na Figura 10, apresentando variação 
ponderal compatível com o considerado normal para fêmeas de mesma idade: 21g a 
26,5g de peso médio para 3,5 e 6 semanas de vida, respectivamente (Biotério FCF-
IQ/USP, 2013). 
Quadro 2 - Acompanhamento do peso corporal (g) dos camundongos submetidos ao 
teste de toxicidade oral aguda - Teste da Dose Limite (onco-A 2000 mg/Kg) 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
18
20
22
24
26
28
30
Animal 1
Animal 2
Animal 3
Dias
P
es
o
 d
o
s 
an
im
ai
s 
(g
)
 
 
5.1.2 Avaliação dos níveis séricos de ureia, creatinina e ácido úrico nos camundongos 
submetidos ao protocolo de Toxicidade Oral Aguda, após os 14 dias experimentais 
 
 Os níveis plasmáticos de ureia, creatinina e ácido úrico foram avaliados após 14 
dias. Conforme se verifica nas Figuras 11, 12 e 13, o tratamento com onco-A não 
provocou alterações estatisticamente significativas em nenhum dos parâmetros 
avaliados. 
 
Figura 11 - Níveis plasmáticos de ureia em camundongos tratados com onco-A 2000 
mg/kg, ou tratados com salina (controle), submetidos ao protocolo de toxicidade oral 
aguda. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado. 
Média do valor de normalidade (mg/dL): 53 ± 2,1 (PINHEIRO et al., 1998). 
UREIA
SA
LI
NA
O
NC
O
-A
0
20
40
60
m
g
/d
L
 
37 
 
 
 
Figura 12 - Níveis plasmáticos de creatinina em camundongos tratados com onco-A 
2000 mg/kg, ou tratados com salina (controle), submetidos ao protocolo de toxicidade 
oral aguda. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado. 
Média do valor de normalidade (mg/dL): 1,2 ± 0,08 (PINHEIRO et al., 1998). 
CREATININA
S
A
LI
N
A
O
N
C
O
-A
0.0
0.5
1.0
1.5
m
g
/d
L
 
 
 
 
 
Figura 13 - Níveis plasmáticos de ácido úrico em camundongos tratados com onco-A 
2000 mg/kg, ou tratados com salina (controle), submetidos ao protocolo de toxicidade 
oral aguda. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado. 
Média do valor de normalidade (mg/dL): 1,8 ± 0,33 (DINIZ et al., 2006). 
ACIDO URICO
S
A
LI
N
A
O
N
C
O
-A
0
1
2
3
4
m
g
/d
L
 
 
 
 
 
38 
 
 
 
5.1.3 Análise histológica 
5.1.3.1 Análise histológica do tecido renal (córtex e medula) 
Figura 14 - Fotomicrografias das alterações no tecido renal, induzidas pela onco-A 
(2000mg/Kg), após 14 dias, nos camundongos submetidos ao teste de toxicidade oral 
aguda. Grupo controle sem alterações: córtex (A) e medula (B) normais, objetiva 20x. 
Nos animais tratados com onco-A, observou-se: (C) Degeneração glomerular (seta 
preta) e degeneração tubular hidrópica, com tumefação das células tubulares (setas 
cinzas), objetiva 40x. (D) Atrofia glomerular (seta preta), objetiva 60x. (E) degeneração 
tubular hidrópica (seta preta) e depósito de proteína de Tamm-Horsfall na luz tubular 
(seta cinza), objetiva 40x. (F) Infiltração gordurosa (seta preta) e infiltrado inflamatório 
discreto (seta cinza), objetiva 10x. Coloração HE. Microscópio Nikon Eclipse Nis, 
Software Nis 4.0. 
 
 
. 
 
A B 
C D E F 
39 
 
 
 
5.1.3.2 Análise histológica do tecido pulmonar 
Figura 15 - Fotomicrografias das alterações no tecido pulmonar, induzidas pela onco-A 
(2000mg/Kg), após 14 dias, nos camundongos submetidos ao teste de toxicidade oral 
aguda. (A) Grupo controle sem alterações, objetiva 20x. Nos animais tratados com 
onco-A, observou-se: (B) Hemorragia discreta (seta branca), infiltrado inflamatório(seta 
preta) e edema (seta cinza), nos álveolos pulmonares, objetiva 40x (C) Destaque para a 
hemorragia intra-alveolar (setas pretas), objetiva 60x. (D) Hiperplasia do tecido linfóide 
associado aos brônquios (BALT) (setas pretas), objetiva 10x. (E) Vaso congesto (seta 
branca), hemorragia (seta preta) e atelectasia alveolar (seta cinza), objetiva 20x. 
Coloração HE. Microscópio Nikon Eclipse Nis, Software Nis 4.0. 
 
 
 
A
a 
B 
C D 
E 
40 
 
 
 
5.1.3.3 Análise histológica do tecido cardíaco 
Figura 16 - Fotomicrografias das alterações no tecido cardíaco, induzidas pela onco-A 
(2000mg/Kg), após 14 dias, nos camundongos submetidos ao teste de toxicidade oral 
aguda. (A) Grupo controle sem alterações, objetiva 20x. Nos animais tratados com 
onco-A, observou-se: (B) Presença de vasos sanguíneos congestos (seta preta), objetiva 
40x (C) Área de necrose mais eosinofílica (setas pretas),objetiva 10x. (D) Área de 
necrose, com destaque para as células anucleadas e eosinofílicas (setas pretas), objetiva 
40x. (E) Presença de infiltrado inflamatório (seta branca), edema (seta preta) e necrose 
(seta cinza), objetiva 20x. (F) Destaque para o infiltrado inflamatório (seta branca), 
edema (seta preta) e células necróticas (seta cinza), objetiva 40x. Coloração HE. 
Microscópio Nikon Eclipse Nis, Software Nis 4.0. 
 
 
 
A B 
C D 
E F 
41 
 
 
 
5.2 Efeitos da onco-A na pressão arterial média de ratos normotensos anestesiados 
Administrações consecutivas in bolus de doses crescentes de onco-A (30 µg/Kg, 
100 µg/Kg, 300 µg/Kg, 1000 µg/Kg,) ocasionaram redução significativa da pressão 
arterial média em ratos anestesiados, nas últimas duas doses (300 µg/Kg, 1000 µg/Kg), 
em comparação ao grupo controle, tratado com salina, bem como às médias pressóricas 
antes do tratamento com onco-A e na dose de 30 µg/Kg, conforme ilustrado na Figura 
17. 
 As médias dos grupos controle (n=6) foram (93,01 ± 8,75; 93,18 ± 8,56; 92,32 ± 
9,23; 91,72 ± 9,97; 90,92 ± 10,41) e tratados com onco-A (n=6) nas doses de 30 µg/Kg, 
100 µg/Kg, 300 µg/Kg, 1000 µg/Kg, respectivamente: 87,17 ± 11,60; 83,22 ± 12,62; 
77,24 ± 15,03; 66,66* ± 22,79; 56,46** ± 26,06 (*p<0,05; **p<0,01) 
 
Figura 17 - Efeitos da administração de onco-A, in bolus, na pressão arterial média de 
ratos normotensos anestesiados. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados 
por ANOVA e Teste t de Student, com *p < 0,05 e **p<0,01. 
0 30 10
0
30
0
10
00
50
60
70
80
90
100
Controle
Onco-A
*
**
Dose (g/Kg)
P
re
s
s
ã
o
 A
rt
e
ri
a
l 
m
é
d
ia
 (
m
m
g
H
)
 
 
 
 
42 
 
 
 
5.2.1 Avaliação dos níveis séricos de ureia, creatinina, ácido úrico, TGO, TGP, 
fosfatase alcalina e CK-total, após a realização do protocolo de pressão arterial 
média 
 Os níveis plasmáticos de ureia, creatinina, ácido úrico, TGO (transaminase 
glutâmico-oxalacética), TGP (transaminase glutâmico-pirúvica), fosfatase alcalina e 
CK-Total (Figuras 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24, respectivamente) foram avaliados após os 
experimentos de pressão arterial média, não sendo detectado nenhuma alteração 
significativa nestes parâmetros, quando em comparação com o grupo controle (salina) 
e/ou com a média do valor de normalidade para a espécie. 
Figura 18 - Níveis plasmáticos de ureia em ratos tratados com onco-A administrada in 
bolus, ou salina (controle), após os experimentos de pressão arterial média. Dados 
expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado. Média do valor 
de normalidade (mg/dL): 61,7 ± 1,65 (PINHEIRO et al., 1998). 
UREIA
S
A
LI
N
A
O
N
C
O
-A
0
20
40
60
m
g
/d
L
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
43 
 
 
 
Figura 19 - Níveis plasmáticos de creatinina em ratos tratados com onco-A 
administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos de pressão arterial 
média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado com 
*p < 0,05 em comparação ao grupo controle (salina). Média do valor de normalidade 
(mg/dL): 0,7 ± 0,04 (DINIZ et al., 2006). 
 
CREATININA
S
A
LI
N
A
O
N
C
O
-A
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
 *
m
g
/d
L
 
 
 
Figura 20 - Níveis plasmáticos de ácido úrico em ratos tratados com onco-A 
administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos de pressão arterial 
média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado. 
Média do valor de normalidade (mg/dL): 1,6 ± 0,1 (DINIZ et al., 2006). 
ACIDO URICO
S
A
LI
N
A
O
N
C
O
-A
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
m
g
/d
L
 
 
 
 
 
44 
 
 
 
Figura 21 - Níveis plasmáticos de TGO (transaminase glutâmico-oxalacética) em ratos 
tratados com onco-A administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos 
de pressão arterial média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste 
t não pareado. Média do valor de normalidade (U/L): 78,2 ± 2,62 (DINIZ et al., 2006). 
TGO
S
A
LI
N
A
O
N
C
O
-A
0
50
100
150
U
/L
 
 
 
Figura 22 - Níveis plasmáticos de TGP (transaminase glutâmico-pirúvica) em ratos 
tratados com onco-A administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos 
de pressão arterial média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste 
t não pareado. Média do valor de normalidade (U/L): 59 ± 4,47 (DINIZ et al., 2006). 
TGP
S
A
LI
N
A
O
N
C
O
-A
0
20
40
60
U
/L
 
 
 
 
 
 
45 
 
 
 
Figura 23 - Níveis plasmáticos de fosfatase alcalina em ratos tratados com onco-A 
administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos de pressão arterial 
média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não pareado. 
Média do valor de normalidade (U/L): 166 ± 7,06 (DINIZ et al., 2006). 
 
FOSFATASE ALCALINA
S
A
LI
N
A
O
N
C
O
-A
0
50
100
150
200
U
/L
 
 
 
Figura 24 - Níveis plasmáticos de creatina quinase (CK Total) em ratos tratados com 
onco-A administrada in bolus, ou salina (controle), após os experimentos de pressão 
arterial média. Dados expressos como média ± E.P.M. e analisados por Teste t não 
pareado. Média do valor de normalidade (U/L): 571,7 ± 325,8 (HOOPER et al., 2007). 
 
CKTOTAL
S
A
LI
N
A
O
N
C
O
-A
0
200
400
600
800
U
/L
 
 
 
 
 
 
46 
 
 
 
5.2.2 Análise histológica 
5.2.2.1 Análise histológica do tecido cardíaco 
Figura 25 - Fotomicrografias das alterações no tecido cardíaco, induzidas pela onco-A 
em ratos submetidos ao protocolo experimental de pressão arterial média. (A) Grupo 
controle sem alterações, corte longitudinal e transversal, objetiva 10x. No grupo tratado 
com onco-A, observou-se: (B) Presença de hemorragia (seta preta) e infiltrado 
inflamatório no pericárdio (setas cinzas), objetiva 20x. (C) Área de necrose (setas 
pretas) e infiltrado inflamatório discreto(seta cinza), objetiva 20x. (D) Área de necrose, 
com destaque para as células anucleadas das fibras cardíacas (setas pretas), objetiva 
40x. (E) Presença de vasos sanguíneos congestos (seta preta) e infiltrado inflamatório 
no pericárdio (seta cinza), objetiva 20x. (F) Presença de matriz extracelular e 
fibroblastos (seta preta), objetiva 20x. Coloração HE. Microscópio Nikon Eclipse Nis, 
Software Nis 4.0. 
 
 
 
A 
E F 
D C 
B 
47 
 
 
 
5.2.2.2 Análise histológica do tecido renal (córtex e medula) 
 
Figura 26 - Fotomicrografias das alterações no tecido renal, induzidas pela onco-A em 
ratos submetidos ao protocolo experimental de pressão arterial média. (A) Grupo 
controle sem alterações, córtex renal, objetiva 20x. No grupo tratado com onco-A, 
observou-se: (B) Degeneração tubular hidrópica tubular (seta cinza) e depósito de 
material proteináceo na luz tubular (seta preta), objetiva 40x. (C) Presença de vaso 
sanguíneo congesto (seta cinza), edema intersticial (seta preta) e degeneração tubular 
(seta branca), objetiva 40x. (D) Infiltrado inflamatório moderado na região 
periglomerular (seta preta), objetiva 40x. (E) Fibrose intersticial (seta branca) e 
hemorragia (seta preta), objetiva 40x. Coloração HE. Microscópio Nikon Eclipse Nis, 
Software Nis 4.0. 
 
 
 
A B 
C D 
E 
48 
 
 
 
5.3 Efeitos da onco-A na perfusão de rim isolado de rato 
 Após a administração da onco-A foram observadas alterações na fisiologia renal 
nos parâmetros avaliados. Considerou-se como controle interno o tempo 30min do 
grupo tratado, por ser um período em que ainda não havia sido administrada a onco-A, e 
controle externo o grupo perfundido durante todo protocolo experimental apenas com a 
solução de Krebs-Henseleit modificada. 
 Pode-se observar um aumento na pressão de perfusão (PP) aos 60, 90 e 120min 
nos três grupos estudados (onco-A nas concentrações 1 µg/mL, 3µg/mL e 10µg/mL) 
quando comparados ao controle interno destes grupos, e aumento significativo para os 
tempos 90 e 120min quando comparados ao grupo controle