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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

PAULO CARVALHO DE PAULA

MORINGA OLEIFERA LAM.: UMA FONTE VEGETAL DE PROTEÍNAS
HIPOGLICEMIANTES E HIPOLIPEMIANTES

FORTALEZA
2017

PAULO CARVALHO DE PAULA

MORINGA OLEIFERA LAM.: UMA FONTE VEGETAL DE PROTEÍNAS
HIPOGLICEMIANTES E HIPOLIPEMIANTES

Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica da Universidade Federal do
Ceará, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor em
Bioquímica. Área de concentração:
Bioquímica Vegetal.

Orientadora: Profa. Dra. Daniele de
Oliveira Bezerra de Sousa

Co-orientadora: Profa. Dra. Ilka Maria
Vasconcelos

FORTALEZA
2017

PAULO CARVALHO DE PAULA

MORINGA OLEIFERA LAM.: UMA FONTE VEGETAL DE PROTEÍNAS
HIPOGLICEMIANTES E HIPOLIPEMIANTES

Aprovada em / / .

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________
Profa. Dra. Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)

_______________________________________________
Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos (Co-orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)

__________________________________________________
Profa. Dra. Norma Maria Barros Benevides
Universidade Federal do Ceará (UFC)

___________________________________________________
Profa. Dra. Adriana Rolim Campos Barros
Universidade de Fortaleza (UNIFOR)

__________________________________________________
Dra. Carla Freire Celedônio Fernandes
Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)

__________________________________________________
Prof. Dr. Ariclécio Cunha de Oliveira
Universidade Estadual do Ceará (UECE)

A Deus.
À minha mãe, Maria do Socorro.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida e por todas as graças a mim concedidas.
À minha mãe, Maria do Socorro, pessoa que mais amo nesse mundo, a
quem devo tudo que sou e que tenho.
À professora Ilka Maria Vasconcelos, mulher que tanto admiro por sua
competência, profissionalismo, zelo pela ciência, bondade e caráter. Mulher
guerreira, pesquisadora exemplar, de admirável inteligência, que eu considero a
maior responsável por essa minha conquista. Meu sincero e eterno agradecimento.
À minha tia, Jacinta Carvalho, minha tia-mãe, a quem eu tanto amo, e à
sua filha, Jamilly Carvalho, minha prima-irmã, que mora dentro do meu coração.
À minha amada, Rochele Batista, por seu amor, sua torcida, incentivo e
permanência ao meu lado nos momentos alegres e também difíceis.
À minha orientadora, professora Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa,
pelos ensinamentos, correções e auxílio nesse momento tão importante para mim.
Aos membros da banca examinadora, Dra. Norma Maria Barros
Benevides, Dra. Adriana Rolim Campos Barros, Dra. Carla Freire Caledônio
Fernandes e Dr. Ariclécio Cunha de Oliveira, por terem aceitado participar da
avaliação do meu trabalho, em meio a tantos compromissos acadêmicos e
particulares.
Ao professor José Tadeu Abreu de Oliveira, pelos valiosos ensinamentos,
pelas maravilhosas aulas e por ter permitido acesso ao seu laboratório para
realização de experimentos; aos seus estudantes, em especial Thiago Fernandes e
Pedro Filho.
À professora Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho, por ter aberto as
portas de seu laboratório para execução de procedimentos experimentais.
À aluna Bella Giselly, por suas contribuições experimentais para
composição desse trabalho.
Aos meus colegas de trabalho do Laboratório de Proteínas Tóxicas
(LabTox): Mariana Reis, Tarcymara Garcia, Nadine Monteiro, Ana Paula, Halisson
Araújo, Yara de Castro e Mayara Melo. Um agradecimento especial a Lucas Dias e
Helen Costa, pela grande auxílio nos experimentos e aos doutorandos Tiago
Deiveson e João Xavier, dois grandes amigos que encontrei nesse período de
Doutorado e cujo vínculo espero manter por toda a vida.

À professora e nutricionista Ana Paula Moreira, por sua compreensão em
determinados momentos, por sua torcida , incentivo, compromisso, auxílio e por tudo
que fez em meu benefício.
À Clarissa Rocha, pela torcida, dicas e conselhos.
A todos os professores e servidores técnico-administrativos que fazem
parte do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular/Programa de Pós-
Graduação em Bioquímica da UFC.

AGRADECIMENTOS

Os trabalhos experimentais que compõem esta tese foram realizados com
o apoio dos seguintes Programas/Instituições:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - através das atividades de capacitação no
ensino e pesquisa em Bioquímica realizadas em parceira com o Laboratório de
Toxinas Vegetais-LABTOX, sob a coordenação da Profa. Dra. Ilka Maria
Vasconcelos, Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais -
BIOPROSPEC, sob a coordenação da Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano
Carvalho e com o Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa, sob a
coordenação do Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira.
UNIVERSIDADE DE FORTALEZA ( UNIFOR) - através de atividades experimentais
executadas no Laboratório de Análise Proteômica do Núcleo de Biologia
Experimental (NUBEX), sob coordenação da Profa. Dra. Ana Cristina de Oliveira
Monteiro-Moreira.
COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE ENSINO
SUPERIOR (CAPES) – Através da concessão de bolsa de pós-graduação ao autor
deste trabalho.
DEMAIS INSTITUIÇÕES DE FOMENTO E APOIO À PESQUISA COMO: CNPq e
FUNCAP, que contribuiram para a melhoria nas condições experimentais e na
formação de recursos humanos dentro do Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica da UFC.

“Dê-me, Senhor, agudeza para entender,
capacidade para reter, método e
faculdade para aprender, sutileza para
interpretar, graça e abundância para falar,
acerto ao começar, direção ao progredir e
perfeição ao concluir.”
(São Tomás de Aquino)

RESUMO

O diabetes mellitus é caracterizado por hiperglicemia e complicações vasculares,
responsáveis por elevada morbimortalidade. Projeções mundiais do aumento no
número de diabéticos já foram divulgadas. Isso justifica a busca de compostos
vegetais hipoglicemiantes, para formulação de fármacos para o tratamento do
diabetes. Nesse contexto, proteínas vegetais são incluídas no arsenal de moléculas
com potencial hipoglicêmico. O presente trabalho teve como objetivo a obtenção de
proteínas hipoglicemiantes do tegumento de sementes e das folhas de Moringa
oleifera, uma planta nativa da Índia. Dessa espécie, uma fração proteica do
tegumento de sementes (Mo-TEG) e uma proteína das folhas (Mo-S3) foram obtidas,
ambas com efeito hipoglicemiante. Mo-TEG apresentou rendimento proteico de
40%, correspondendo a um teor de 0,66 mg de proteína/g de farinha do tegumento.
Tal fração mostrou reação cruzada com o anticorpo anti-insulina humana. Em
camundongos com diabetes induzido por aloxano, Mo-TEG mostrou efeito
hipoglicemiante em curto prazo, após administração intraperitoneal ou oral, com
efeito mais pronunciado pela primeira via (72,3% vs 39,6%, após 5 h da
administração). Ainda pela via intraperitoneal, Mo-TEG melhorou a tolerância à
glucoseadministrada oralmente, gerando redução glicêmica e melhora do perfil
lipídico sérico quando administrada por 10 dias em camundongos diabéticos. Com
relação à proteína das folhas de M. oleifera, Mo-S3 foi purificada por cromatografias
em DEAE-Celulose e Sephacryl S-200, com índice de purificação de 891,53 vezes e
rendimento proteico de 1,04%. Mo-S3 possui massa molecular de 8,6 kDa, revelada
por espectrometria de massas sob condições nativas. Além de apresentar epítopos
antigênicos do tipo insulina, Mo-S3 exerceu efeito hipoglicemiante após
administração intraperitoneal, em dose única ou doses repetidas. Contrariamente a
Mo-TEG, Mo-S3 não mostrou efeito hipoglicemiante por via oral. Mo-TEG e Mo-S3
exerceram efeito hipolipemiante em camundongos diabéticos. Os resultados obtidos
demonstram que proteínas estão incluídas no arsenal de moléculas hipoglicemiantes
presentes em M.oleifera, o que possibilita sua inserção na pesquisa voltada à
produção de drogas para o tratamento do diabetes.

Palavras-chave: Moringa oleifera. Proteínas vegetais hipoglicemiantes. Diabetes
mellitus.

ABSTRACT

Diabetes mellitus is characterized by chronic hyperglycemia associated with vascular
complications, which cause high morbidity and mortality rates. World projections of
the increase in the diabetic number have already been done. This reinforces the
search for hypoglycemic plant compounds in the perspective of their use on drug
formulation for diabetes treatment. In this context, plant proteins have been included
in the arsenal of molecules with hypoglycemic potential. The aim of the present work
was to obtain hypoglycemic proteins from the seed coat and leaves of Moringa
oleifera, a plant native to India. From this species, a protein fraction from the seed
coat (Mo-TEG) and a protein from the leaves (Mo-S3) were obtained, both with
hypoglycemic effect. Mo-TEG showed a protein yield of 40%, corresponding to 0.66
mg protein/g of seed coat flour. Mo-LPI was able to cross-react with human anti-
insulin antibodies. In alloxan-induced diabetic mice, Mo-TEG showed a short-term
hypoglycemic effect after intraperitoneal or oral administration, with a higher effect
through the first route (72.3% vs 39.6% 5 h after the administration). Also by the
intraperitoneal route, Mo-TEG improved the tolerance to orally administered glucose,
exhibiting hypoglycemic effect and improvement of the serum lipid profile when
administered along 10 days to alloxan-induced diabetic mice. Regarding to protein
from M. oleifera leaves, Mo-S3 was purified by DEAE-Cellulose and Sephacryl S-200
chromatography, with a 891.53-fold purification and 1.04% yield. Mo-S3 is a 8.6 kDa
protein as revealed by mass spectrometry under native conditions. In addition to the
presence of insulin epitopes, Mo-S3 showed hypoglycemic effect after intraperitoneal
administration, in a single dose or repeated doses. Conversely, no significant
hypoglycemic effect was observed in diabetic mice when Mo-S3 was orally
administered. Moreover, Mo-TEG and Mo-S3 showed hypolipidemic effect in diabetic
mice. Altogether, these data demonstrate that proteins belong to the set of
hypoglycemic molecules of M.oleifera, which allow their insertion in biomedical
research in order to produce drugs to treat diabetes.

Keywords: Moringa oleifera. Hypoglycemic plant proteins. Diabetes mellitus.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Pessoas com diabetes ao redor do mundo e por região entre
2015 e 2040 ..................................................................................

22
Figura 2 - Sintomas clássicos de diabetes ................................................... 26
Figura 3 - Evolução dos eventos fisiopatológicos até o estabelecimento
de diabetes tipo 2 .........................................................................

29
Figura 4 - Disfunção endotelial como evento promotor da aterosclerose ..... 31
Figura 5 - Modificações epigenéticas induzidas pelo diabetes e
consequente indução e manutenção de disfunção endotelial e
inflamação vascular.......................................................................

33
Figura 6 - Espécies de plantas que apresentam compostos secundários
com atividade hipoglicemiante e potencial antidiabético...............

37
Figura 7 - Plantas com proteínas hipoglicemiantes do tipo insulina ............. 39
Figura 8 - Moringa oleifera Lam .................................................................... 44
Figura 9 - Fluxograma de obtenção de Mo-TEG .......................................... 52
Figura 10 - Sequência de procedimentos executados durante o período
de adaptação dos animais.............................................................

56
Figura 11 - Perfil eletroforético em PAGE-SDS de Mo-TEG submetida
ao tratamento com pepsina ..........................................................

62
Figura 12 - Perfil eletroforético em PAGE-SDS de Mo-TEG submetida
ao tratamento com tripsin .............................................................

63
Figura 13 - Detecção de proteínas do tipo insulina em Mo-TEG .................... 65
Figura 14 - Precipitação de proteínas presentes em Mo-TEG induzida
por zinco .......................................................................................

66
Figura 15 - Efeito da administração intraperitoneal de Mo-TEG, em dose
única, na glicemia de animais diabéticos .....................................

69
Figura 16 - Efeito da administração intraperitoneal de Mo-TEG, em dose
única, na glicemia de animais diabético .......................................

72
Figura 17 - Curva glicêmica referente ao teste oral de tolerância à glucose
em animais diabéticos submetidos à administração
intraperitoneal de Mo-TEG ...........................................................

Figura 18 - Área sob a curva (ASC) referente à curva glicêmica do teste oral
de tolerância à glucose em animais diabéticos submetidos
à administração intraperitoneal de Mo-TEG ................................

75
Figura 19 - Efeito da administração intraperitoneal diária, ao longo de 10
dias, de Mo-TEG ..........................................................................

77
Figura 20 - Efeito da administração intraperitoneal diária de Mo-TEG, por
10 dias, nos níveis séricos de colesterol total ..............................

79
Figura 21 - Efeito da administração intraperitoneal diária de Mo-TEG, por
10 dias, nos níveis séricos da fração lipoproteica HDL ................

80
Figura 22 - Efeito da administração intraperitoneal diária de Mo-TEG, por
10 dias, nos níveis séricos de triacilglicerol ..................................

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Critérios para diagnóstico de pré-diabetes e de diabetes,
segundo American Diabetes Association (2017) ..........................

24
Tabela 2 - Teor de proteínas e rendimento proteico ao longo das etapas de
obtenção de Mo-TEG ...................................................................

61
Tabela 3 - Ocorrências comportamentais durante o período de adaptação
dos camundongos ........................................................................

68
Tabela 4 - Percentual de aumento ou redução glicêmica promovido
pela administração intraperitoneal de Mo-TEG em
camundongos diabéticos ..............................................................

70
Tabela 5 - Percentual de aumento ou redução glicêmica promovido
pela administração por via intrasgástrica de Mo-TEG ..................

73
Tabela 6 - Glicemia dos camundongos submetidos ao teste de doses
repetidas nos dias 6 e 9 do experimento,após
administração de insulina ............................................................

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AGE Produtos finais de glicosilação avançada
ASC Área sob a curva
BCIP 5- bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato
bFGF Fator de crescimento fibroblástico básico
BSA Albu ina sérica bovina
DM Diabetes mellitus
DM 1 Diabetes mellitus tipo 1
DM 2 Diabetes mellitus tipo 2
EGF Fator de crescimento epidermal
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
EROS Espécies reativas de oxigênio
GAD65 Isoforma 65 da descarboxilase do ácido glutâmico
HbA1c Hemoglobina glicada do tipo A1c
HDL Lipoproteína de alta densidade
IA-2 Isoforma 2 datirosina fosfatase associada à insulinoma
IGF-1 Isoforma 1 do fator de crescimento do tipo insulina
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
LDL Lipoproteína de baixa densidade
MCP-1 Isoforma 1 da proteína quimioatrativa de monócitos
NBT Azul de nitro tetrazólio
NF-kB Fator nuclear de transcrição kappa-B
PAI-1 Inibidor do tipo 1 do ativador do plasminogênio
PDGF Fator de crescimentoderivado de plaquetas

PVDF Fluoreto de polivinilideno
SDS Dodecil-sulfato de sódio
SIRT-1 Sirtuína 1
TGF Fator de crescimento transformante
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TOTG Teste oral de tolerância à glucose
UH Unidades de hemaglutinação
VCAM-1 Isoforma 1 da molécula de adesão celular vascular
ZnT8 Isoforma 8 dotransportador de zinco

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................... 18
2 REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................. 21
2.1 Diabetes mellitus: uma doença epidêmica ..................................... 21
2.2 A busca de fontes naturais para o tratamento do diabetes .......... 32
2.2.1 Gallega officinalis ............................................................................. 34
2.2.2 Abelmoschus moschatus ................................................................ 34
2.2.3 Annona squamosa ............................................................................ 35
2.2.4 Pinus pinaster ................................................................................... 35
2.2.5 Salacia oblonga ................................................................................. 35
2.2.6 Croton cajucara ................................................................................. 35
2.2.7 Achyrocline satureioides ................................................................. 36
2.2.8 Outras espécies de plantas com propriedades hipoglicemiantes 36
2.3 Proteínas vegetais hipoglicemiantes: um potencial pouco
especulado ........................................................................................

38
2.3.1 Canavalia ensiformis ........................................................................ 40
2.3.2 Vigna unguiculata ............................................................................. 40
2.3.3 Bauhinia variegata ............................................................................ 40
2.3.4 Momordica charantia ........................................................................ 41
2.3.5 Momordica cymbalaria ..................................................................... 41
2.3.6 Costus igneus ................................................................................... 42
2.3.7 Urtica pilulifera .................................................................................. 42
2.4 Moringa oleifera: seu potencial antidiabético e sua inserção na
pesquisa prospectiva de proteínas hipoglicemiantes ..................

43
3 CONSIDERAÇÕES GERAIS ............................................................. 47
4 OBJETIVOS ....................................................................................... 48
4.1 Geral ................................................................................................... 48
4.2 Específicos ........................................................................................ 48
5 MATERIAIS ........................................................................................ 49
5.1 Material vegetal ................................................................................. 49
5.2 Animais experimentais ..................................................................... 49
5.3 Reagentes químicos ......................................................................... 49

6 MÉTODOS .......................................................................................... 51
6.1 Obtenção de proteínas a partir do tegumento de sementes de
M. oleifera ..........................................................................................

51
6.2 Quantificação de proteínas .............................................................. 51
6.3 Caracterização bioquímica de Mo-TEG .......................................... 53
6.3.1 Avaliação da digestibilidade in vitro ............................................... 53
6.3.2 Avaliação da atividade hemaglutinante .......................................... 53
6.3.3 Ensaio de dot blot ............................................................................. 54
6.3.4 Avaliação da precipitação por zinco ............................................... 54
6.4 Ensaios in vivo para prospecção do efeito hipoglicemiante de
Mo-TEG ..............................................................................................

55
6.4.1 Adaptação dos animais .................................................................... 55
6.4.2 Indução de diabetes experimental .................................................. 55
6.4.3 Prospecção de ação hipoglicemiante - teste de dose única ........ 57
6.4.4 Teste oral de tolerância à glucose .................................................. 57
6.4.5 Prospecção de ação hipoglicemiante – teste de doses repetidas 58
6.4.6 Prospecção de ação hipolipemiante ............................................... 58
6.5 Toxicidade aguda .............................................................................. 59
6.6 Análise estatística ............................................................................. 59
7 RESULTADOS ................................................................................... 60
7.1 Obtenção de proteínas a partir do tegumento de sementes de
M. oleifera ..........................................................................................

60
7.2 Caracterização bioquímica de Mo-TEG .......................................... 60
7.3 Ensaios in vivo para prospecção de efeito hipoglicemiante de
Mo-TEG ..............................................................................................

67
7.4 Toxicidade aguda .............................................................................. 76
8 DISCUSSÃO ....................................................................................... 82
9 ARTICLE ............................................................................................ 89
9.1 Introduction ....................................................................................... 89
9.2 Materials and Methods ..................................................................... 90
9.2.1 Plant material .................................................................................... 90
9.2.2 Animals .............................................................................................. 90
9.2.3 Purification of the hypoglycemic protein from M. oleifera leaves 91

.
9.2.4 Protein determination ………………………………………………… 91
9.2.5 Electrophoretic profile ………………………………………………..... 91
9.2.6 Dot blot assay ……………………………………………………………. 92
9.2.7 Massspectrometry analysis ………………………………………… 92
9.2.8 Hemagglutinating activity …………………………………………… 92
9.2.9 Hemolytic activity ……………………………………………………..... 93
9.2.10 Induction of experimental diabetes ………………………………….. 93
9.2.11 Single dose test in alloxan-induced diabetic mice ……………….. 94
9.2.12 Repeated dose test in alloxan-induced diabetic mice ……………. 94
9.2.13 Statistical analysis ……………………………………………………… 95
9.3 Results ……………………………………………………………………. 95
9.3.1 Purification of Mo-S3 …………………………………………………… 95
9.3.2 Effect of Mo-S3 on fasting blood glucose in alloxan-induced
diabetic mice ……………………………………………………………..

102
9.3.3 Effect of Mo-S3 on signs of chronic hyperglycemia ……………… 102
9.3.4 Effect of Mo-S3 on serum lipids levels ……………………………… 108
9.4 Discussion ……………………………………………………………….. 110
10 CONCLUSÕES ................................................................................... 114

REFERÊNCIAS .................................................................................. 115

1 INTRODUÇÃO

O diabetes mellitus (DM) e suas complicações crônicas representam uma
causa importante de morbimortalidade no mundo atual. Avançando em proporções
epidêmicas, tal enfermidade exigirá do sistema de saúde um rigoroso planejamento
no que se refere às políticas públicas de atendimento e de vigilância de novos
casos, além de um programa intensivo quanto à disponibilização de verbas
financeiras para tal empreendimento (INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION,
2015; AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017).
A morbidade ocasionada pelo DM se deve à hiperglicemia crônica,
evento que caracteriza essa patologia. O aumento dos níveis glicêmicos é devido à
redução total ou parcial da secreção de insulina pelo pâncreas e/ou à diminuição na
ação desse hormônio. Cegueira adquirida, doença renal crônica, neuropatia e
doença aterosclerótica são algumas das complicações associadas ao estado
hiperglicêmico crônico do diabetes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Para minimizar ou evitar a ocorrência de complicações crônicas, ou
mesmo com o intuito de atrasar o aparecimento de tais condições clínicas, faz-se
necessário uma boa adesão do paciente aos tratamentos farmacológico e
dietoterápico, além da adoção de um estilo de vida onde o sedentarismo, tabagismo
e alcoolismo crônico devem ser excluídos (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
DIABETES, 2016). Atualmente, diversos análogos de insulina, produzidos por meio
da tecnologia do DNA recombinante, são utilizados para o tratamento do diabetes
mellitus tipo 1 (DM1). A adesão à administração subcutânea diária desses análogos
é imprescindível para a manutenção do controle glicêmico. Existem também diversas
classes de hipoglicemiantes orais, disponibilizados para o tratamento do diabetes
mellitus tipo 2 (DM2) (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017).
Nesse contexto de tratamento para a manutenção de um bom controle
glicêmico, alternativas complementares têm sido adotadas por diversas culturas,
baseando-se, principalmente, na utilização de plantas. Folhas, sementes e raízes
são utilizadas para consumo direto ou elaboração de chás e produtos naturais que,
quando consumidos, promovem redução gicêmica. Isso tem sido abordado e
justificado em estudos etnofarmacológicos, que comprovaram a eficácia de tais
produtos como agentes hipoglicemiantes, creditando-se tal efeito especialmente aos
metabólitos secundários (COMAN; RUGINA; SOCACIU, 2012).
19

Apesar dos compostos derivados do metabolismo secundário vegetal
terem o maior crédito com relação ao potencial hipoglicemiante, outros metabólitos
incluem-se no arsenal de moléculas promotoras de redução glicêmica, presentes em
diversas espécies de plantas. Apesar da menor divulgação na literatura científica,
em comparação com compostos de outra natureza química, as proteínas
hipoglicemiantes têm ganhado destaque na prospecção de compostos vegetais no
contexto da biotecnologia médica Algumas proteínas vegetais hipoglicemiantes
apresentam, inclusive, características bioquímicas similares às da insulina de
mamíferos, levantando a hipótese de que moléculas do tipo insulina tem sido
conservadas ao longo da evolução biológica (PAULA et al., 2016).
Uma espécie vegetal que se destaca na prospecção de compostos
hipoglicemiantes é a Moringa oleifera Lam. Nativa do nordeste da índia, essa
espécie é utilizada como insumo alimentar habitual nessa região e na África, sendo,
também, usada como alternativa complementar para o tratamento de diversas
doenças, incluindo o DM (GOYAL et al., 2007). Recentemente, nosso grupo de
pesquisa relatou a presença de compostos hipoglicemiantes de natureza proteica
em folhas e tegumento de sementes M. oleifera, o que insere essa espécie no
conjunto de plantas das quais se tem obtido proteínas hipoglicemiantes (PAULA et
al., 2016; PAULA et al., 2017). Nesse sentido, a pesquisa científica a ser relatada na
presente tese é referente a resultados relativos a uma fração proteica obtida do
tegumento de sementes e à purificação de uma proteína hipoglicemiante de folhas
de M. oleifera. Para isso, o trabalho foi guiado pelas seguintes perguntas de partida:
- Além dos efeitos hipoglicemiantes, proteínas do tegumento de sementes
e de folhas de M. oleifera teriam outras propriedades capazes de
contribuir para minimização dos efeitos deletérios associados ao DM?
- A proteína hipoglicemiante purificada de folhas teria características
bioquímicas similares às da insulina de mamíferos?
Assim, a proposta deste trabalho é verificar o potencial hipoglicemiante de
proteínas obtidas do tegumento de sementes e de folhas de M. oleifera, de forma a
contribuir para a elucidação de suas propriedades e possibilidades de aplicação
como agentes terapêuticos no tratamento do diabetes. Visando maior clareza na
abordagem do estudo realizado, a tese foi estruturada da seguinte forma:
20

- Capítulo 1 – Referencial Teórico – Diabetes mellitus e compostos
hipoglicemiantes de plantas;
- Capítulo 2 – Proteínas do tegumento de sementes de M. oleifera como
potenciais agentes hipoglicemiantes e hipolipemiantes;
- Capítulo 3 – Purificação e caracterização uma proteína hipoglicemiante
de folhas de M. oleifera.

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Diabetes mellitus: uma doença epidêmica

Um fator de risco cardiovascular bem descrito na literatura; uma
importante causa de cegueira adquirida, de amputações de membros inferiores e de
considerável morbidade; traços epidêmicos na contabilização e nas projeções de
novos casos. Essas são algumas das características de uma patologia que
impulsiona a pesquisa científica à busca de maior entendimento fisiopatológico: o
diabetes mellitus (DM) (INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION, 2015)
Por definição, o DM consiste em um grupo de condições clínicas que
possuem, em comum, a presença de hiperglicemia, resultante de defeitos na
secreção e/ou ação da insulina. Autoimunidade deflagrada contra as células β
pancreáticas secretoras de insulina é o evento promovedor do diabetes mellitus tipo
1 (DM1), que se caracteriza por deficiência absoluta de insulina e, portanto,
requerendo tratamento com insulina exógena (AMIEL et al., 2015). O outro tipo
clínico de diabetes, mais conhecido e frequente, o diabetes mellitus tipo 2 (DM2),
envolve uma interação de eventos (lesão primária das células β e resistência à
insulina) que regem a deficiência relativa de insulina, ocasionado uma condição
hiperglicêmica de caráter mais assintomático e, dessa forma, mais devastadora
(KAHN; COOPER; PRATO, 2014).
O avanço do DM ocorre em proporções alarmantes e, efetivamente, uma
epidemia de DM está em curso (Figura 1). Isso se deve ao crescimento e
envelhecimento populacional, à maior urbanização, ao aumento da prevalência de
obesidade e sedentarismo e de outros fatores. Estima-seque, atualmente, o número
de diabéticos no mundo fique em torno de 387 milhões, com projeções de 471
milhões em 2035. No Brasil, em 2014, foi estimado que existia cerca de 11,9 milhões
de indivíduos diabéticos, na faixa etária de 20 a 79 anos, com estimativas para 19,2
milhões em 2035 (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2016).

Figura 1 – Pessoas com diabetes ao redor do mundo e por região entre 2015 e 2040

Fonte: International Diabetes Federation, 2015.

O DM é uma importante causa de mortalidade. Estimativas mundiais no
início do século 21 atribuíram cerca de 5,2% dos óbitos ao DM, o que categoriza tal
doença como a quinta principal causa de morte. Na maioria dos países
desenvolvidos, essa doença representa entre a quarta e a oitava causa de óbito.
Dados brasileiros de 2011 indicaram as seguintes taxas de mortalidade por DM
(número de indivíduos por 100 mil habitantes) para a população geral, homens e
mulheres, respectivamente: 33,7; 27,2; 32,9 (ROGLIC et al., 2005); BRASIL, 2014).
Além do impacto na vida dos indivíduos acometidos e dos familiares, o
DM é uma doença onerosa para tais indivíduos e ao sistema de saúde. Os gastos
diretos com DM variam entre 2,5 e 15% do orçamento anual da saúde de um país.
No Brasil, o custo anual referente ao cuidado do paciente diabético é de
aproximadamente 40,3 milhões, sendo 91% em função de internações hospitalares.
Limitações no desempenho profissional por conta de complicações e consequente
perda de produtividade também contribuem para o ônus de gastos desse custo
social (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2016).
Segundo diretrizes atuais, o DM pode ser diagnosticado baseando-se em
critérios de glicemia plasmática, incluindo a glicemia de jejum e/ou a glicemia
plasmática mensurada 2 h após um teste oral de tolerância à glucose (TOTG)
(Tabela 1). A mensuração de hemoglobina glicada (HbA1C) é igualmente apropriada
para tal diagnóstico, embora exista uma imperfeita correlação entre HbA1C e
glicemia média em certos indivíduos (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017).
No caso da glicemia de jejum, o teste deve ser feito após ausência de
ingestão calórica de no mínimo 8 h. O TOTG é performado por meio da ingestão de
uma carga de glucose contendo o equivalente a 75 g de glucose anidra dissolvida
em água. Glicemia de jejum, TOTG e HbA1C também podem diagnosticar indivíduos
com pré-diabetes e numerosos estudos confirmaram que, comparado com os pontos
de corte das medidas de glicemia de jejum e de HbA1C, o TOTG diagnostica mais
pessoas com diabetes (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017).

Tabela 1 – Critérios para diagnóstico de pré-diabetes e de diabetes, segundo
American Diabetes Association (2017)
Parâmetros
Laboratoriais
Diagnóstico
Pré-dibetes Diabetes
Glicemia de jejum 100-125 mg/dL
a
≥ 126,0 mg/dL
Glicemia após 2 h do
TOTG
140-199 mg/dL
b
≥ 200,0 mg/dL
HbA1C 5,7-6,4% ≥ 6,5%
Screening glicêmico na
presença de sintomas
clássicos de
hiperglicemia
_______ ≥ 200,0 mg/dL
a
glicemia de jejum prejudicada
b
tolerância à glucose prejudicada

A sintomatologia do estado hiperglicêmico inclui poliúria (aumento no
volume e frequencia de micção), polidipsia (aumento da sede), polifagia (aumento da
fome), visão turva, aparecimento de feridas com difícil cicatrização e perda de peso,
esse último principalmente no que se refere ao DM1 (Figura 2). No caso do DM1,
tais sintomas tornam-se mais intensos até a procura por auxílio médico e, portanto,
até o período de diagnóstico, não raramente resultando em internamentos
hospitalares por conta de cetoacidose diabética (ATKINSON, 2012). Já para o DM2,
ocorre uma evolução clínica mais assintomática, uma vez que os níveis glicêmicos
em comparação ao DM1 são menores e, portanto, é frequente, no período de
diagnóstico, a ocorrência concomitante de complicações (OZOUGWU, 2013).
A fisiopatologia do DM1 manifesta-se através de eventos autoimunes,
direcionados contra as células β pancreáticas. A quebra dessa tolerância
imunológica é gerada por meio de interações entre componentes genéticos e
ambientais, esses últimos podendo incluir estresse, dieta hipercalórica e
hiperproteica, ingestão de leite de vaca no período anterior aos 6 meses de idade,
nascimento pré-termo e infecções. Esse tipo clínico de diabetes acomete,
usualmente, a faixa etária de crianças e adolescentes, o que justifica a utilização do
termo "diabetes juvenil" para descrever o DM1 (WALLBERG; COOKE, 2013).
O levante imunológico contra as células β pancreáticas inclui
componentes celulares e humorais que, em conjunto, promovem necrose celular. O
componente celular é composto pelo ataque promovido por macrófagos, linfócitos T
e células matadoras naturais, os quais interagem na promoção dessa necrose. A
atividade desse componente celular resulta em um processo inflamatório localizado
nas ilhotas pancreáticas, denominado insulite, no qual está envolvida a secreção de
citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e
interleucina-1 (IL-1). Achados histológicos dessa condição são caracterizada por
uma infiltração de macrófagos nas ilhotas pancreáticas (WALLBERG; COOKE,
2013).

Figura 2 – Sintomas clássicos de diabetes

Fonte: http://www.anad.org.br/

http://www.anad.org.br/
27

O componente humoral é constituído pela presença de autoanticorpos
direcionados contra componentes antigênicos das células β pancreáticas. Títulos
desses autoanticorpos podem ser detectados ainda na fase pré-diabética e podem
constituir-se como potenciais marcadores de lesão dessas células. Alguns exemplos
desses autoanticorpos são aqueles direcionados contra os seguintes componentes
presentes nas células β pancreáticas: ácido glutâmico descarboxilase isoforma 65
(GAD65), tirosina fosfatase associada à insulinoma isoforma 2 (IA-2), transportador
de zinco isoforma 8 (ZnT8) e insulina. O risco do desenvolvimento clínico da doença,
com hiperglicemia evidente, cresce com o aumento do número de autoanticorpos
(KAWASAKI, 2014).
O tempo necessário para se estabelecer uma taxa de necrose suficiente
para o aparecimento dos sintomas no DM1 é muito variável, dependendo dos fatores
ambientais a que se expõe o indivíduo geneticamente predisposto. A perda de 80%
da massa de células β pancreáticas é o limiar para o estabelecimento de
hiperglicemia. Assim, perdas celulares inferiores a 80% ainda permitem a
manutenção de normoglicemia pelas células β pancreáticas residuais ainda não
lesionadas, salientando-se que, o indivíduo, mesmo normoglicêmico, se encontra em
um estágio clínico de pré-diabetes tipo 1 (AKIRAV; KUSHNER; HEROLD, 2008).
O fluxo patológico dos eventos moleculares que direcionam o curso
clínico do DM2 inclui dois fatores-chave: defeitos primários na secreção de insulina e
resistência à insulina. Experimentalmente, tem-se verificado que a lesão primária de
células β pancreáticas é o principal fator envolvido na predisposição genética ao
DM2. Defeitos primários na função secretória de células β pancreáticas já foram
identificados em indivíduos normoglicêmicos, mas com história familiar de DM2
(FONSECA; JOHN-KALARICKAL, 2009; ALSAHLI; GERICH, 2010).
Defeitos primários na função secretória das células β pancreáticas não
são os únicos protagonizadores da evolução clínica para o DM2; a resistência à
insulina também apresenta um papel importante dessa evolução, de forma que ela
pode intensificar a lesão dessas células. Inicialmente, indivíduos com resistência à
insulina mantém-se normoglicêmicos através de uma hipersecreção insulínica
compensatória, o que sobrepuja a própria resistência à ação desse hormônio. Em
indivíduos com histórico familiar de DM2, já foram identificadosdefeitos primários em
algum aspecto da função secretória de células β pancreáticas, mesmo nesse estágio
de hipersecreção (ALSAHLI; GERICH, 2010).
28

O que explica o papel da resistência à insulina na intensificação da lesão
de células β pancreáticas é o cenário bioquímico no qual ela se insere: um estado
inflamatório de baixa intensidade, porém crônico, caracterizado pela liberação de
citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-1 (Figura 3). A própria hiperinsulinemia
compensatória é também um fator lesivo adicional às células β pancreáticas. Dessa
forma, a progressiva lesão dessas células acaba por promover hiperglicemia que
define o DM2 clinicamente instalado. A obesidade é uma condição que é associada
a esse estado inflamatório de baixa intensidade e, por isso, o DM2 é muito frequente
em indivíduos obesos (MCARDLE et al., 2013).
A hiperglicemia prolongada é o fator-chave da geração de complicações
de cunho vascular. Tais complicações podem ser agrupadas em complicações micro
e macrovasculares: as primeiras, correspondendo a comorbidades como retinopatia,
nefropatia e neuropatia diabética e, as segundas, agrupando o leque de desfechos
com plano de fundo aterosclerótico, como infarto agudo do miocárdio, doença
arterial periférica e acidente vascular encefálico. Uma vez que a hiperglicemia é o
elemento mediador de tais complicações, o tratamento do diabetes visa
prioritariamente à manutenção de níveis glicêmicos normais, na maior faixa temporal
possível (FORBES; COOPER, 2013).
São muitos os mecanismos pelos quais a hiperglicemia causa danos em
órgãos-alvo, como olhos e rins. Embora diferentes, um fato comum rege o
mecanismo de lesão dessas vias: o aumento da produção de espécies reativas de
oxigênio (EROs) induzido pela hiperglicemia. Das vias de lesão celular que são
ativadas, podem ser citadas: (1) o aumento da atividade da via dos polióis; (2)
formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs); (3) ativação da proteína
quinase C (PKC) e (4) aumento na atividade da via das hexosaminas (BROWNLEE,
2005).

Figura 3 – Evolução dos eventos até o estabelecimento de DM2 clínico

Fonte: próprio autor.

O diabetes é responsável por grande número de óbitos em virtude de
eventos cardiovasculares, como o infarto agudo do miocárdio. Existem, portanto,
vias de sinalização induzidas pela hiperglicemia não controlada que sustentam o
plano de fundo aterosclerótico responsável por tais eventos (SIRACUSE; CHAIKOF,
2012). Estresse oxidativo e vias de sinalização envolvendo quinases e fatores de
transcrição interagem na promoção de dano vascular, por intermédio de um
processo lesivo e progressivo denominado disfunção endotelial (AVOGARO et al.,
2011). As vias de lesão celular descritas anteriormente também têm relação com a
deflagração do processo inflamatório aterosclerótico (REIS et al., 2008).
A disfunção endotelial é caracterizada por modificações estruturais e
funcionais de artérias, resultando em redução da luz arterial e, portanto, do fluxo
sanguíneo (Figura 4). Tal processo envolve uma série de eventos celulares e
inflamatórios que, pouco a pouco, obstruem o vaso: redução da produção de óxido
nítrico endotelial; aumento na produção de moléculas de adesão como a molécula
de adesão célula vascular (VCAM-1) e de proteína quimioatrativa de monócitos
(MCP-1); diapedese de monócitos para a camada subendotelial e posterior ativação
a macrófagos; produção de citocinas pró-inflamatórias pelos macrófagos e
consequente sustentação do processo inflamatório; produção de fatores de
crescimento pelo endotélio e por macrófagos que induzem a migração de células
musculares lisas da camada média para a camada subendotelial (ALTABAS, 2015).
A hiperglicemia persistente ativa um mecanismo denominado memória
hiperglicêmica vascular, com mudanças epigenéticas que mantém a lesão vascular
mesmo após momentos de posterior normalização glicêmica. A modulação de
eventos epigenéticos como acetilação e metilação pelo ambiente hiperglicêmico
promove dano vascular por ativar estresse oxidativo e vias inflamatórias (EL-OSTA
et al., 2008).

Figura 4 – Disfunção endotelial como evento promotor da aterosclerose

Fonte: (BAYNES; DOMINICZAK, 2010).

O estado diabético promove “down-regulation” do gene da desacetilase
SIRT-1, resultando em aumento da acetilação do promotor do gene para a proteína
adaptadora p66Shc. Ocorre concomitante hipometilação desse promotor induzida
também pelo estado hiperglicêmico. Tais mudanças epigenéticas causam aumento
mitocondrial de espécies reativas de oxigênio que, por sua vez, resulta em redução
da atividade de óxido nítrico endotelial e, consequentemente, redução na produção
de óxido nítrico, fator-chave na disfunção endotelial. O aumento de EROs também
ativa a via do fator nuclear kappa B (NF-kB), o qual induz a produção de moléculas
de adesão e de citocinas pró-inflamatórias, sustentando, assim, a inflamação
vascular (Figura 5) (PANENI et al., 2013).

2.2 A busca de fontes naturais para o tratamento do diabetes

Muitas culturas têm utilizado formas alternativas para o tratamento do DM
e essa abordagem é baseada principalmente na utilização de plantas que exibem
propriedades hipoglicemiantes (PATIENCE; ESTELLA; PHILIP, 2014). Estudos
etnofarmacológicos têm sustentado a utilização de tais plantas na medicina
tradicional para o tratamento do DM, por meio da identificação dos compostos
hipoglicemiantes presentes nas espécies utilizadas e do uso de modelos animais de
diabetes (COMAN; RUGINǍ; SOCACIU, 2012).
Hoje se conhece um vasto arsenal de moléculas isoladas de vegetais que
são capazes de promover, de alguma forma, a redução dos níveis glicêmicos,
apresentando, assim, potencial biotecnológico para utilização como agente
hipoglicemiante. De fato, a existência de alguns fármacos hipoglicemiantes utilizados
atualmente para o tratamento do DM2 apresenta uma relação com a utilização de
plantas, como ervas, para tratar o diabetes e com a atividade investigativa de
elucidação dos compostos vegetais que realizavam tal efeito. Tendo em vista que
diversos fármacos utilizados na terapêutica do diabetes apresentam mecanismos
verificados em compostos vegetais de ação hipoglicemiante, percebe-se a estreita
relação entre a prospecção de tais moléculas e o desenvolvimento de novos
fármacos (LAMBA et al., 2000; QASEEM et al., 2012).

Figura 5 – Modificações epigenéticas induzidas pelo DM e consequente indução e
manutenção de disfunção endotelial e inflamação vascular

Fonte: Paneni et al., 2013.

Os efeitos hipoglicemiantes de extratos de tecidos de plantas são
creditados, principalmente, a substâncias derivadas do metabolismo secundário
vegetal (metabólitos secundários), que constituem moléculas com grande
diversidade e complexidade estrutural, produzidas em pequena escala e
apresentando distribuição mais restrita no reino vegetal. Enquanto as moléculas do
metabolismo primário desempenham funções essenciais no vegetal, tal como
fornecimento de energia e matéria-prima para biossíntese e crescimento, os
metabólitos secundários estão relacionados a funções adaptativas, como as
relacionadas aos mecanismos de defesa química (DORNAS et al., 2009;
GERSHENZON, 2004; NEGRI, 2005).
Em sua maioria, os compostos hipoglicemiantes de plantas pertencem à
classe dos alcalóides e dos flavonoides (PATIENCE; ESTELLA; PHILIP, 2014).
Componentes hipoglicemiantes naturais derivados de plantas também incluem
moléculas da classe das cumarinas, glicosídeos cianogênicos, iridóides,
fenolpropanóides, estilbenos, terpenóides, substâncias sulfúricas e xantonas
(NEGRI, 2005).
A seguir, serão exemplificadas espécies de plantas e seus compostos
hipoglicemiantes.

2.2.1 Galega officinalisA G. officinalis é uma leguminosa da subfamília faboidae, extensivamente
utilizada com propósitos ornamentais e de adubagem. É uma espécie nativa da
Europa, Rússia e Irã, onde se desenvolve em solos úmidos. Seu composto ativo
hipoglicemiante é a galegina, um derivado de guanidina. Historicamente, a
metiformina, um hipoglicemiante oral largamente utilizado no tratamento do DM2, foi
desenvolvida por meio de estudos realizados com a galegina (LUKA; OMONIWA,
2012). Uma fração livre de alcaloide, obtida do extrato de G. officinalis previne
estresse oxidativo em ratos com diabetes (LUPAK et al., 2015).

2.2.2 Abelmoschus moschatus

A. moschatus é uma planta da Ásia e da América do Sul, da família
Malvaceae. Seu princípio ativo hipoglicemiante é a miricetina, da classe dos
35

flavonoides. Estudos in vivo mostraram que a miricetina melhorou a sensibilidade à
insulina em ratos (LIU et al., 2007).

2.2.3 Annona squamosa

A. squamos (ateira) pertence à família Annonaceae, cujo fruto é chamado
de fruta-pinha, pinha ou fruta-do-conde. Seu composto hipoglicemiante, a
quercetina-3-O-glicosídeo, isolada de suas folhas, exerceu efeitos hipoglicemiantes
em modelos animais (PANDA; KAR, 2008).

2.2.4 Pinus pinaster

Popularmente conhecido como pinheiro-bravo, P. pinaster é uma espécie
originária de regiões da Europa e Mediterrâneo. Seu tronco é coberto por uma casca
espessa, da qual são obtidos, proantocianidinas, catequina e epicatequina, com
propriedades hipoglicemiantes e antioxidantes. Extratos aquosos da casca do tronco
exerceram efeitos hipoglicemiantes em ratos diabéticos e em humanos com DM2. As
proantocianidinas de P. pinaster, que são oligômeros de catequinas e epicatequinas,
possuem atividade inibitória de α-glicosidase, similar ao hipoglicemiante oral
acarbose (BEDEKAR; SHAH; KOFFAS, 2010; SCHÄFER; HOGGER, 2007).

2.2.5 Salacia oblonga

Planta arbustiva nativa da índia, a S. oblonga é largamente utilizada na
medicina tradicional para tratar o DM. Seu composto bioativo hipoglicemiante é a
mangiferina, da classe das xantonas. Estudos mostraram que a mangiferina
aumentou a expressão de transportadores de glucose e sua translocação até as
membranas celulares em culturas de células musculares e adiposas, estimulando,
assim, a captação desse monossacarídeo por tais células (GIRÓN et al., 2009).

2.2.6 Croton cajucara

A euforbiácea C. cajucara é uma espécie da região amazônica, utilizada
para o tratamento de diversas doenças. A casca de seu tronco apresenta um
36

composto hipoglicemiante da classe dos diterpenos, a trans-desidrocrotonina, que
mostrou potencial antidiabético em camundongos (SILVA et al., 2001).

2.2.7 Achyrocline satureioides

A. satureioides, popularmente conhecida como macela, macela-do-
campo, macelinha ou macela de travesseiro, é uma erva da flora brasileira. Da
família Asteraceae, tem formação arbustiva e é utilizada na medicina tradicional. O
aquirofurano, um dibenzofurano prenilatado obtido dessa planta, promoveu
significantes reduções glicêmicas em modelos animais (CARNEY et al., 2002).

2.2.8 Outras espécies de plantas com propriedades hipoglicemiantes

Muitas outras espécies vegetais foram listadas na literatura como
apresentando potencial antidiabético. Extratos das folhas de Averrhoa bilimbi e de
Biophytum sensitivum exerceram efeito hipoglicemiante pronunciado em ratos e
coelhos diabéticos, respectivamente (PURI, 2001; PUSHPARAJ; TAN; TAN, 2001).
Extratos ricos em antocianinas obtidos de blueberries foram eficientes na promoção
de redução glicêmica em camundongos diabéticos, apresentando um efeito
secretagogo de insulina em culturas de células β pancreáticas de roedores (GRACE
et al., 2009; JAYAPRAKASAM et al., 2005). A Figura 6 mostra algumas das plantas
aqui descritas.

Figura 6 – Espécies de plantas que apresentam compostos secundários com
atividade hipoglicemiante e potencial antidiabético

Fonte: www.plantamed.com.br
A - Gallega officinalis; B - Abelmoschus moschatus; C - Annona squamosa; D - Pinus pinaster;
E - Salacia oblonga; F - Croton cajucara.

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38

2.3 Proteínas vegetais hipoglicemiantes: um potencial pouco especulado

Embora se tenha dado muito crédito aos metabólitos secundários no
protagonismo da ação hipoglicemiante verificada pela ingestão de extratos vegetais,
pouco se tem discutido sobre observações e dados da literatura que relacionam
ainda mais as plantas ao contexto biotecnológico de utilização no campo da
diabetologia: dados que mostram a existência de proteínas do tipo insulina em
vegetais (XAVIER-FILHO et al., 2003).
Em 1923, logo após a descoberta da insulina em extratos etanólicos de
pâncreas de cães (descoberta da qual Collip participou como um dos
desenvolvedores do método de extração de insulina a partir de pâncreas de cães),
autores reportaram a presença de materiais do tipo insulina em folhas de feijão
verde, alface, cebola verde e folhas de trigo, cujos extratos promoveram reduções
glicêmicas significantes em coelhos normais e em cães pancreatectomizados, após
administração subcutânea (BANTING et al., 1922; COLLIP, 1923).
Nos anos 70, um grupo indiano reportou a presença de insulina em
plantas, patenteando o processo de obtenção de tal material, que se baseava em
extração etanólica-acídica de frutos e sementes da cucurbitácea Momordica
charantia (KHANNA et al., 1976). O produto obtido, que foi denominado
polipeptídeo-p, mostrou atividade hipoglicemiante em gerbos da espécie Meriones
hurrinae, em macacos langures da espécie Presbytis entellus e em humanos com
diabetes. Apesar de tais efeitos insulinomiméticos in vivo, o polipeptídeo-p
apresentou certas propriedades bioquímicas que diferiram das propriedades
presentes na insulina bovina, como massa molecular de cerca de 11 kDa, presença
do aminoácido metionina e ausência de imunoreatividade contra anticorpos anti-
insulina bovina (KHANNA et al.,1981). A partir de então, dava-se início a um novo
período de prospecções acerca de compostos do tipo insulina em vegetais.
A seguir, serão descritas espécies de plantas das quais foram obtidas
proteínas hipoglicemiantes e/ou com características similares às da insulina de
mamíferos (Figura 7).

Figura 7 – Plantas com proteínas hipoglicemiantes do tipo insulina

Fonte: www.plantamed.com.br
A – Canavalia ensiformis; B – Vigna unguiculata; C – Bauhinia variegata; D – Momordica charantia; E
– Momordica cymbalaria; F – Costus igneus; G – Urtica pilulifera.

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40

2.3.1 Canavalia ensiformis

Em 1999, foi reportada a presença de uma proteína do tipo insulina no
tegumento de sementes de C. ensiformis, popularmente conhecida como Jack bean
(OLIVEIRA et al., 1999). Quatro ensaios permitiram sugerir que a proteína em
questão era do tipo insulina: (1) a proteína apresentou mobilidade eletroforética em
tricina-PAGE-SDS similar à da insulina bovina; (2) reagiu com anticorpo antisulina
em ensaio de Western blotting; (3) promoveu redução glicêmica significante em
camundongos com diabetes aloxânico, após injeção intravenosa e (4) apresentou
duas cadeias, idênticas em termos de sequência amino-terminal às cadeias α e β da
insulina bovina. Esse trabalho foi o primeiro a mostrar a presença de uma proteína
do tipo insulina especificamente no tegumento de uma semente.

2.3.2 Vigna unguiculata

Quatro anos após a publicação da presença de uma proteína do tipo
insulina no tegumento de sementes de C. ensiformis, foi reportada a presença do
mesmo tipo de molécula no tegumento de sementes de V. unguiculata, também uma
leguminosa (VENÂNCIO et al., 2003). A presença de epítopos antigênicos do tipo
insulina também foi observada nos frutos sem sementes, mas não no embrião.
Considerandoa expressão de insulina vegetal nos frutos inteiros em função do
tempo após a polinização, os autores verificaram um aumento na concentração até o
16º dia após o evento e uma redução acentuada em 20 dias após a polinização (fase
de abertura do fruto). A partir dessa observação, foi hipotetizado que uma maior
concentração da proteína do tipo insulina nas fases mais iniciais do desenvolvimento
e, portanto, no período em que o fruto se encontrava mais metabolicamente ativo,
poderia ser um indício do papel dessa molécula nesse órgão vegetal.

2.3.3 Bauhinia variegata

A fabacea B. variegata é largamente utilizada na medicina tradicional para
o tratamento do DM. É popularmente conhecida como pata-de-vaca, originária da
Índia e China e muito cultivada no sudeste do Brasil (DUARTE et al., 2007). Além de
41

promover o controle glicêmico, o chá das folhas dessa espécie é utilizado também
para outras propostas medicinais (POKHREL; ADHIKARI; BARAL, 2002;
RAJKAPOOR et al., 2006).
Uma proteína, com massa molecular similar à da insulina bovina foi
purificada a partir de extrato de folhas dessa planta (AZEVEDO et al., 2006). A
proteína, além de ter apresentado reação com anticorpo anti-insulina humana,
promoveu também redução significativa da glicemia em camundongos com diabetes
quimicamente induzido por aloxano. Análises microscópicas mostraram que essa
proteína está localizada nos cloroplastos das células parenquimatosas.

2.3.4 Momordica charantia

Yinchok-Anun et al. (2006) obtiveram uma fração proteica dos frutos de
M. charantia que promoveu o aumento da captação de glucose por miócitos C2C12 e
adipócitos 3T3-L1 e a redução significativa dos níveis glicêmicos de ratos com
diabetes quimicamente induzido por estreptozotocina, após administração
subcutânea.
Também de M. charantia, uma única fração peptídica semipurificada,
denominada MC2-1, promoveu redução glicêmica significativa em camundongos
com diabetes quimicamente induzido por aloxano, após administração por via oral.
Essa fração continha como principais peptídeos aqueles com massas moleculares
entre 1,3 e 6,0 kDa. Posteriormente, um peptídeo hipoglicemiante, denominado
MC2-1-5, com massa molecular de aproximadamente 3,4 kDa, determinada por
MALDI-TOF-MS, foi purificado a partir de MC2-1 (YUAN; GU; TANG, 2008). MC2-1-
5 promoveu importante redução glicêmica em camundongos com diabetes
quimicamente induzido por aloxano, após administração por via oral.

2.3.5 Momordica cymbalaria

A cucurbitácea M. cymbalaria representa outra espécie do gênero
Momordica, utilizada em algumas culturas como erva medicinal para o tratamento do
diabetes (RAO et al., 1999). Uma proteína hipoglicemiante, que foi denominda M.Cy
protein, com massa molecular de 17 kDa, foi purificada a partir de um extrato
hipoglicemiante de frutos dessa planta e apresentou ponto isoelétrico de 5,0,
42

próximo ao da insulina, que é de 5,4 (RAJASEKHAR et al., 2010). Além disso, M.Cy
protein promoveu redução glicêmica somente quando administrada por via
parenteral e não por via oral.

2.3.6 Costus igneus

Uma proteína isolada das folhas de C. igneus (família Zingiberaceae)
apresentou reatividade com anticorpo anti-insulina. A massa molecular da proteína
do tipo insulina purificada, determinada por MALDI-TOFF, foi de 5,7 kDa. Além
disso, a proteína purificada de C. igneus promoveu atividade hipoglicemiante em
camundongos normais e naqueles com diabetes quimicamente induzido por
estreptozotocina, quando administrada por via oral ou intraperitoneal, e induziu
captação de glucose por cultura de células RIN5f responsivas à insulina. Contudo,
um conjunto de propriedades biofísicas indicou que essa proteína é estruturalmente
diferente da insulina recombinante humana (JOSHI et al., 2013). Posteriormente,
ensaio de imunoblot revelou aumento nos substratos de receptor de insulina (IRS-1)
e na translocação de transportadores de glucose dependentes de insulina (GLUT-4)
em direção à membrana de células musculares em cultura, sugerindo que essa
proteína elicita vias de sinalização insulinomiméticas (HARDIKAR et al., 2016).

2.3.7 Urtica pilulifera

Lectinas de plantas são exemplos de proteínas vegetais que já tiveram
efeitos antidiabéticos documentados. Em ratos diabetizados por estreptozotocina,
uma dose de 100 mg/Kg de lectina isolada de semente de U. pilulifera, administrada
por via intraperitoneal, reduziu a glicemia ao longo de 4 semanas de tratamento,
com injeções diárias da proteína. Por outro lado, nos ratos diabéticos não tratados,
foi verificada uma elevação da glicemia ao longo das 4 semanas de estudo
(KAVALALI et al., 2003).
Não se sabe ao certo qual o papel das proteínas do tipo insulina no
vegetal. Outros dados experimentais reforçam a efetiva existência de antígenos do
tipo insulina e de vias de sinalização relacionadas à insulina em vegetais e seu
possível papel na promoção da germinação e desenvolvimento da semente e na
fotossíntese em folhas. É possível que insulina em vegetais tenha um papel
43

anabólico, de desenvolvimento, analogamente ao estímulo anabólico exercido pela
insulina em humanos (PAULA et al., 2016).

2.4 Moringa oleifera: seu potencial antidiabético e sua inserção na pesquisa
prospectiva de proteínas hipoglicemiantes

Nesse contexto de discussão de plantas com potencial antidiabético, a
espécie M. oleifera apresenta um destaque no que diz respeito à presença de uma
diversidade de moléculas hipoglicemiantes: desde metabólitos secundários até
proteínas. Conhecida como a “árvore da vida”, várias partes dessa espécie têm sido
utilizadas no tratamento complementar do diabetes por muitas culturas (PAULA et
al., 2016).
M. oleifera é uma espécie nativa da Índia, popularmente chamada de
moringa, acácia-branca, árvore-rabanete-de-cavalo, cedro, moringueiro e quiabo de
quina. Da família Moringaceae, possui folhas compostas e cresce principalmente em
áreas semi-áridas tropicais e subtropicais (Figura 8). A M. oleifera apresenta de
pequeno a médio porte, com crescimento rápido, sendo capaz de suportar longos
períodos de estiagem e de sobreviver em solos pobres e adaptando-se a uma ampla
faixa de solos, com melhor desenvolvimento em solos neutros ou levemente ácidos
(GOPALAKRISHNAN; DORIYA; KUMAR, 2016).
M. oleifera tem importante valor nutricional, de forma que todas as suas
partes são ricas em tocoferóis, carotenóides, ácido ascórbico e compostos fenólicos,
além de cálcio e potássio. Essa espécie apresenta elevado conteúdo de proteínas
de boa qualidade e de óleos. Folhas e sementes são os seus órgãos com maior
conteúdo de proteínas. Folhas in natura apresentam teor proteico em torno de 6,4-
6,7%. A proteína é o composto encontrado em maior quantidade nas sementes, com
um teor médio de 40% (GALLÃO; DAMASCENO; BRITO, 2006; FERREIRA et al.,
2008; MOURA et al., 2009).

Figura 8 – Moringa oleifera Lam.

Fonte: http://moringamaisvida.com.br/
A – Árvore; B – Folhas; C – Frutos; D – Sementes E – Flores.

http://moringamaisvida.com.br/
45

Muitas propriedades farmacológicas são atribuídas à M. oleifera: ações
anti-inflamatória, hepatoprotetora, antimicrobiana, protetora contra estresse
oxidativo, hipolipidêmica e antidiabética. Tais propriedades embasam a utilização da
M. oleifera na medicina popular para o tratamento de diversas patologias, muitas
delas associadas ao diabetes (GOYAL et al., 2007).
Vários compostos bioativos estão presentes nas folhas de M. oleifera,
incluindo vitaminas, carotenoides, polifenóis, ácidos fenólicos, flavonoides,
alcaloides, glucosinolatos, isotiocianatos, taninos, saponinas, oxalatos e fitatos.
Como já descrito anteriormente, algumas dessas classes de compostos, presentes
em outras espécies vegetais, apresentam propriedades hipoglicemiantes e, assim,parte do potencial que a M. oleifera possui, com relação ao uso no tratamento
complementar do diabetes, deve-se à presença de tais compostos, em especial
alcaloides, polifenóis, isotiocianatos e ácidos fenólicos (LEONE et al., 2015).
São muitos os estudos que discriminam a M. oleifera no que se refere a
propriedades hipoglicemiantes. Extratos aquosos de suas folhas foram efetivos em
reduzir os níveis glicêmicos de ratos diabéticos durante o TOTG. As doses
administradas promoveram reduções significativas após 3 h da administração
intragástrica de solução de glucose, tanto em animais subdiabéticos, como nos
moderadamente diabéticos. O extrato das folhas também promoveu reduções
significativas na glicemia de jejum e na glicemia pós-prandial de ratos severamente
diabéticos, porém com tratamento crônico (JAISWAL et al., 2009).
Isotiocianatos presentes nos frutos da M. oleifera mostraram importante
potencial antidiabético. A incubação de linhagens celulares de células β pancreáticas
com 100 ppm de N-benzil tiocarbamatos, N-benzil carbamatos, benzil nitrilas e benzil
éster, isolados de extratos dos frutos, resultou na liberação de 15-33 ng insulina/mg
proteína, enquanto que a incubação dessas células com 4 mM de glucose (o
principal indutor de secreção de insulina em sistemas vivos) promoveu a liberação
de 4-6 ng insulina/mg proteína (FRANCIS et al., 2004).
Extratos metanólicos dos frutos de M. oleifera sem sementes reduziram a
progressão do diabetes em ratos com diabetes induzido por estreptozotocina,
havendo reduções significativas nos níveis de glucose sérica e concomitantes
aumentos nos níveis insulinêmicos. Desses extratos, foram isolados os fitoquímicos
quercetina e kampferol (GUPTA et al., 2012). Extrato aquoso de folhas de M. oleifera
protegeram ratos normais e diabéticos contra o dano oxidativo induzido pelo estado
46

diabético (JAISWAL et al., 2013). Ainda, extratos das folhas de M. oleifera foram
capazes de reverter de forma considerável danos histopatológicos nas ilhotas
pancreáticas de ratos com diabetes quimicamente induzido (YASSA; TOHAMY,
2014).
Mais recentemente, nosso grupo de pesquisa verificou que proteínas
também estão incluídas no arsenal bioquímico hipoglicemiante presente nos órgãos
de M. oleifera. Um protocolo de obtenção de proteínas do tipo insulina a partir de
tecidos vegetais, baseado em extração etanólica-acídica e subsequente precipitação
das proteínas com acetona, foi utilizado no tegumento das sementes. A fração
proteica obtida, nomeada Mo-SC (M. oleifera seed coat), após administração
intraperitoneal e oral em camundongos com diabetes quimicamente induzido,
promoveu significante redução glicêmica em 5 h após o tratamento e melhorou a
tolerância à glucose administrada por via oral além de ter causado redução
glicêmica ao longo de dez dias de tratamento intraperitoneal. Além disso, por meio
de dot blot utilizando anticorpo anti-insulina humana, Mo-SC mostrou epítopos
antigênicos do tipo insulina (PAULA et al., 2016).
Adicionalmente, nosso grupo de pesquisa verificou em um isolado
proteico obtido de folhas de M. oleifera, nomeado Mo-LPI (M. oleifera leaf protein
isolate), efeito hipoglicemiante e antioxidante em camundongos diabéticos induzidos
por aloxano. Administração intraperitoneal em dose única, na dose de 500 mg/kg,
reduziu a glicemia em 66,4% após 5 h e em 56,2% no sétimo dia ao longo de sete
dias de tratamento intraperitoneal diário, não tendo relação com efeito secretagogo
de insulina. Assim como observado para Mo-SC, Mo-LPI apresentou também reação
com anticorpo anti-insulina (PAULA et al., 2017).
Assim, M. oleifera constitui uma espécie vegetal com importante potencial
para a prospecção de novos fármacos hipoglicemiantes.

3 CONSIDERAÇÕES GERAIS

Proteínas vegetais hipoglicemiantes representam uma importante
classe de moléculas que requerem estudos mais pormenorizados. Presentes em
diferentes espécies e diversos tecidos vegetais, a existência de tais moléculas
evidencia a importância da conservação evolutiva de vias metabólicas associadas
ao metabolismo da glucose e, mais propriamente, ao papel de proteínas com
funções similares à insulina (CHAN; STEINER, 2000). A relevância dessa
conservação durante a evolução pode ser inferida pela presença de tais proteínas
no tegumento de sementes de algumas plantas, o que pode estar associado a
mecanismos de transporte de glucose que auxiliam na germinação (PAULA et al.,
2016). É o caso de proteínas do tipo insulina encontradas no tegumento de
sementes de C. ensiformis (OLIVEIRA et al., 1999) e V. unguiculata (VENÂNCIO et
al., 2003). De fato, insulina humana acelera a germinação de sementes vegetais
(OLIVEIRA et al., 2004).
O presente capítulo trata da obtenção de uma fração proteica obtida do
tegumento de sementes de M. oleifera, denomida Mo-TEG. Aqui serão discutidos os
métodos empregados para sua obtenção, os resultados acerca de sua
caracterização bioquímica e a abordagem experimental que permitiu avaliar seu
potencial hipoglicemiante. Além de apresentar indícios da presença de proteínas do
tipo insulina, Mo-TEG mostrou ter um significativo efeito hipoglicemiante em um
modelo animal (camundongos) com diabetes quimicamente induzido por aloxano.
Tais efeitos foram verificados por administrações em dose única, em doses repetidas
e por meio da análise da tolerância oral à glucose. Soma-se a esse potencial
hipoglicemiante, a propriedade que Mo-TEG apresentou em modificar níveis séricos
de lipídeos em camundongos, inferindo um efeito de atenuação do risco de
aparecimento de complicações cardiovasculares associadas à hiperglicemia crônica.
Estes resultados sugerem o significativo potencial de utilização de Mo-TEG na
pesquisa biomédica voltada para a prospecção e formulação de fármacos a serem
empregados no tratamento do diabetes.

4 OBJETIVOS

4.1 Geral

Caracterizar bioquimicamente uma fração proteica obtida do tegumento
de sementes de M. oleifera, denominada Mo-TEG (Mo: M. oleifera, TEG: tegumento
das sementes), e avaliar seus efeitos sobre parâmetros séricos em camundongos
com diabetes quimicamente induzido por aloxano.

4.2 Específicos

Caracterizar Mo-TEG através da determinação do perfil eletroforético, da
digestibilidade in vitro por proteases gastrointestinais, do potencial de atividade
hemaglutinante, da presença de epítopos antigênicos do tipo insulina e do potencial
para precipitação por zinco;
Prospectar a atividade hipoglicemiante de Mo-TEG a curto e longo prazo
através de ensaios biológicos in vivo usando camundongos com diabetes
quimicamente induzido por aloxano;
Verificar a influência da administração crônica de Mo-TEG nos níveis
séricos de lipídeos de camundongos com diabetes quimicamente induzido por
aloxano;
Avaliar a toxicidade aguda de Mo-TEG para camundongos.

5 MATERIAIS

5.1 Material vegetal

Sementes de M. oleifera foram coletadas de plantas localizadas no
campus do Pici da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, Ceará. As
sementes foram manualmente destegumentadas e o tegumento usado para
obtenção do extrato. A coleta das sementes foi realizada entre os anos de 2013 e
2016, sempre nos meses de setembro a janeiro, período no qual ocorre a frutificação
dessa espécie.

5.2 Animais experimentais

Camundongos albinos Swiss (Mus musculus) machos, pesando entre 30
e 50 g, foram fornecidos pelo Biotério Central da UFC. Os animais foram mantidos
no biotério do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, em caixas de
polipropileno, a 22 C, fotoperíodo de 12 h, com água e ração ad libitum.
Coelho (Oryctolagus cuniculus) albino adulto (linhagem Nova Zelândia) e
ratos (Rattus norvegicus) albino Wistar, mantidos no Biotério do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecularda UFC, foram usados para obtenção de sangue.
Os ensaios envolvendo animais foram aprovados pela Comissão de Ética
em Pesquisa Animal (CEPA) da UFC, com o protocolo de número 55/2012. Todos
os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes para o cuidado de
animais de laboratório preconizadas por essa Comissão.

5.3 Reagentes químicos

Acrilamida, 2-mercaptoetanol, albumina sérica bovina (BSA), aloxano
monohidratado, anticorpo anti-insulina humana produzido em coelho, azul brilhante
de Coomassie G e R, azul de bromofenol, dodecil sulfato de sódio (SDS), ácido
etileno diamino tetraacético, fenilmetanosulfonilfluoreto, N,N’-metileno bisacrilamida,
N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina, pepsina, polivinilpirrolidona e tripsina foram
obtidos da Sigma Chemical Co., St Louis, EUA. Persulfato de amônio e marcadores
50

de massas moleculares foram obtidos da GE Healthcare, USA. Insulina e demais
reagentes usados foram de grau analítico e obtidos comercialmente.

6 MÉTODOS

6.1 Obtenção de proteínas a partir do tegumento de sementes de M. oleifera

Após a destegumentação das sementes, os tegumentos foram
pulverizados com auxílio de moinho de facas. A farinha obtida foi submetida à
extração sob agitação com solução de etanol 60% e ácido sulfúrico 0,05 M, durante
1 h, a 4 ºC. Ao término da extração, o material obtido foi filtrado em pano de trama
fina e o filtrado centrifugado a 15.000 x g, por 30 min, a 4 ºC. O sobrenadante foi
coletado, novamente filtrado em pano de trama fina e seu pH ajustado para 3,0, com
hidróxido de amônio. Em seguida, foram adicionados 4 volumes de acetona gelada
para cada volume de extrato total, deixando-se a mistura em repouso por 18 h, a 4
ºC, de modo que ocorresse a precipitação das proteínas (YIBCHOK–ANUN et al.,
2006). O material precipitado foi coletado por centrifugação sob as mesmas
condições acima, submetido à lavagem com acetona, dialisado (cut-off 2 kDa)
exaustivamente contra água destilada e liofilizado. O material liofilizado consiste na
fração Mo-TEG, denominada anteriormente no item 2.1, deste Capítulo (Figura 9).

6.2 Quantificação de proteínas

A dosagem de proteínas solúveis foi feita pelo método de Bradford (1976).
A uma alíquota de 100 µL do material a ser quantificado, foram adicionados 2,5 mL
do reagente de Bradford. A mistura foi levemente agitada e, após 10 min, foram
realizadas leituras das absorbâncias a 595 nm em espectrofotômetro. A
concentração proteica foi estimada em relação a uma curva padrão, obtida com
diferentes concentrações de BSA.

Figura 9 - Fluxograma de obtenção de Mo-TEG

Fonte: próprio autor.

Tegumento de semente de M.
oleifera
Obtenção da farinha dos tegumentos
Etanol 60% contendo ácido sulfúrico 0,05 M
1 h de agitação
Filtração em pano de trama fina
Filtrado
Centrifugação 15.000 x g, por 30 min, a 4 ºC

Resíduo Sobrenadante
Filtração em pano de trama fina

Extrato etanólico total
Ajuste do pH para 3,0 com NH4OH

Adição de acetona
Repouso por 18 h, a 4 ºC
Centrifugação 15.000 x g, por 30
min, a 4 ºC

Sobrenadante Material precipitado
Lavagem com acetona
Diálise exaustiva contra água destilada
Liofilização

Mo-TEG

6.3 Caracterização bioquímica de Mo-TEG

6.3.1 Avaliação da digestibilidade in vitro

A digestibilidade in vitro de Mo-TEG por proteases comumente
encontradas no trato gastrintestinal de mamíferos foi realizada conforme ensaio
protocolado por Sathe et al. (1997). Para digestão, tanto por tripsina como por
pepsina, a fração proteica foi incubada com a respectiva enzima (proporção de
enzima:substrato de 1:10). O meio reacional consistiu de tampão Tris-HCl 0,1 M, pH
8,1, para digestão por tripsina, e de HCl 0,001 M, no caso da digestão por pepsina.
BSA foi utilizada como proteína controle do processo de digestão. Alíquotas
correspondendo aos tempos de 2 e 4 h de digestão foram tomadas, prontamente
diluídas em tampão de amostra para eletroforese e imediatamente submetidas à
fervura, por 10 min, a fim de parar a reação de digestão. Eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo SDS (17%) (LAEMMLI, 1970) foi realizada para averiguação
da ocorrência de digestão enzimática.

6.3.2 Avaliação da atividade hemaglutinante

Mo-TEG (6 mg/mL) foi submetida a diluições seriadas em tubos de
ensaio, na presença de NaCl 0,15 M. A 200 µL de cada diluição, foi adicionado igual
volume de uma suspensão de hemácias 2%, tratadas ou não com tripsina, obtidas
de coelho, rato e camundongo. Os tubos foram incubados a 37 ºC, por 30 min, e
deixados em repouso por mais 30 min, à temperatura ambiente. Em seguida, os
tubos foram centrifugados a 3.000 x g, por 30 seg, à temperatura ambiente. A
visualização de aglutinados foi feita a olho nu e os resultados expressos em unidade
de hemaglutinação (UH), definida como o inverso da maior diluição da amostra
ainda capaz de aglutinar hemácias (MOREIRA; PERRONE, 1997).
Também foi analisada a influência da adição de tripsina na atividade
hemaglutinante. Inicialmente, amostras contendo 1 mL de sangue foram lavadas três
vezes com NaCl 0,15 M e, em seguida, tripsina foi adicionada na proporção de 1 mg
de enzima para 10 mL da suspensão de hemácias 2%. Essa suspensão foi incubada
por 1 h, a 4 ºC, sob agitação ocasional e centrifugada a 3.000 x g, por 5 min. As
hemácias tripsinizadas foram lavadas novamente com NaCl 0,15 M (6 vezes) e o
54

pélete de células resultantes foi suspenso em NaCl 0,15 M para obtenção de
hemácias a 2% (LIS; SHARON, 1972).

6.3.3 Ensaio de dot blot

Mo-TEG foi avaliada quanto à presença de proteina(s) capaz(es) de
ser(em) reconhecida(s) pelo anticorpo anti-insulina, através do ensaio de dot blot
(TOWBIN; STAEHELIN; GORDON, 1979). Vinte microlitros de Mo-TEG (10 mg/mL)
foram aplicados em membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após secagem
da amostra, os sítios livres de ligação com proteínas foram bloqueados pela
incubação da membrana com solução de bloqueio, consistindo de tampão TBS-T
(tampão Tris-salina contendo Tween-20 0,05%) contendo leite desnatado 5%, por 12
h. Após bloqueio, as membranas foram lavadas com TBS-T e, então, incubadas,
com a solução de anticorpo primário anti-insulina (diluído 250 vezes em TBS-T
contendo leite desnatado 1%), por 3 h, sob leve agitação. Em seguida, as
membranas foram lavadas 5 vezes com tampão TBS-T e, após, incubadas com
solução do anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase
alcalina (diluído 2000 vezes em TBS-T contendo leite desnatado 1%), por 2 h, à
temperatura ambiente. Após lavagem com TBS-T, as membranas foram incubadas
com a solução de revelação 4-nitro-azul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato (NBT/BCIP) até o surgimento de coloração, com a reação interrompida pela
lavagem com água deionizada. Foram utilizados como controles positivo e negativo,
respectivamente, insulina recombinante humana e BSA.

6.3.4 Avaliação da precipitação por zinco

A precipitação de Mo-TEG quando em contato com zinco foi avaliada
como anteriormente (HALLAS-MOLLER; PETERSEN; SCHLICHTKRULL, 1952).
Para isso, Mo-TEG dissolvida em etanol 20% (5 mg/mL) foi misturada com solução
de cloreto de zinco 1 M, nas proporções 1:1; 1:4; 1:8; 1:16 e 1:32, e incubada por 24
h, à temperatura ambiente. O mesmo procedimento foi realizado com insulina
recombinante humana livre de zinco.

6.4 Ensaios in vivo para prospecção do efeito hipoglicemiante de Mo-TEG

6.4.1 Adaptação dos animais

Camundongos foram previamente submetidos a um período de adaptação
(10 dias), os quais passaram pela