Replicação e PCR

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A molécula da hereditariedade precisa ser capaz de se 
replicar e de se expressar. 
 O emparelhamento especifico sugere um possível 
mecanismo de replicação do material genético (Watson e 
Crick). 
A replicação do DNA em eucariotos ocorre na fase S do 
ciclo celular (procariotos duplicam seu DNA quase que de 
forma contínua). 
 
A replicação do DNA ocorre por meio do processo 
semiconservativo. 
Cada fita antiga serve de molde para síntese de uma nova 
fita. 
 
A replicação acontece em regiões chamadas de Origens de 
Replicação, regiões ricas em A e T (menos pontes de 
hidrogênio). 
 Necessidade de abrir as duas fitas de DNA durante o 
processo de replicação. 
 
 
 
 
As pontes de hidrogênio são separadas por uma enzima 
chamada DNA Helicase, formada por várias subunidades de 
uma mesma PTN, que se unem com outras formando a DNA 
Helicase. 
 
 
As topoisomerases (girases) resolvem essa tensão 
cortando as fitas da molécula de DNA, fazendo-a se 
desenrolar, e religando os pontos cortados. O alívio dessa 
tensão requer energia. 
 Pela complementariedade de bases, a fita simples tende 
a parear consigo mesma ou se fecha novamente. 
 
 SSBs – Single Strand DNA Binding Proteins – Proteínas 
ligadoras de DNA de fita simples. 
o Estabilizam o DNA em fita simples, permitindo que este 
seja replicado. 
Genética 
 
Nucleotídeos são adicionados por complementariedade de 
bases. 
A enzima responsável por polimerizar a nova fita de DNA 
é a DNA polimerase, enzima capaz de unir dois nucleotídeos 
através da hidroxila ligada ao carbono 3 da desoxirribose ao 
fosfato ligado ao carbono 5 da desoxirribose do nucleotídeo 
que irá se unir à fita sintetizada (ligação fosfodiéster). A DNA 
polimerase adiciona novos nucleotídeos baseados na fita molde. 
 
A replicação do DNA ocorre a partir de uma fita molde, no 
sentido 5’-3’. 
 
 
 
DNA polimerase 
 Liga os novos nucleotídeos à cadeia (esqueleto açúcar-
fosfato). 
 Necessita de um 3’ -OH para adicionar o novo 
nucleotídeo trifosfato. 
 
1. Precisam de 3’ -OH livre; 
2. Necessitam de um iniciador (primer), a DNA polimerase 
não inicia sem um guia; 
3. Necessitam de íons de Mg2+; 
4. Acrescentam nucleotídeos à fita recém-sintetizada 
obedecendo o pareamento de bases com a fita molde. 
5. Remoção de nucleotídeos: atividade exonucleolítica (3’-5’) 
revisão, correção de erros. 
Primase (RNA primer) 
 A DNA polimerase necessita de uma 3’ -OH para 
catalisar a formação de ligação fosfodiéster entre dois 
nucleotídeos; 
 A primase adiciona um iniciador (primer) complementar à 
sequência de nucleotídeos (ribonucleotídeos) da fita molde 
que fornece, então, a OH necessária. 
 
 
Tipos de DNA polimerases 
 Procariotos – propriedades das DNA polimerases 
bacterianas 
 Pol 1 Pol III 
Polimerização 5’-3’ + + 
Exonuclease 3’-5’ + + 
Exonuclease 5’-3’ + - 
Número de subunidades 1 ≥10 
Tamanho em KDa 103 ~900 
Velocidade de 
polimerização (nt/s) 
16 a 20 nt/s 250 a 1000 nt/s 
 
 Eucariotos - cerca de 13 polimerases já identificadas. 
 DNA polimerase ε e δ: replicação do DNA; 
 DNA polimerase β: reparo de mutações; 
 DNA polimerase α: retirada dos primers; 
 DNA polimerase γ: replicação do DNA nas mitocôndrias. 
 
 A polimerização sempre ocorre no sentido 5’-3’ 
 Fita líder ou contínua - DNA polimerase lê 3’-5’ e 
sintetiza 5’-3’ continuamente; 
 Fita retardada/atrasada ou descontínua - DNA 
polimerase lê fita 5’-3’. A direção da polimerização é 
oposta a direção do crescimento da cadeia. 
 Gera os fragmentos de Okazaki (~1000-2000nt em 
procarioto e ~100-200nt em eucariotos). 
 
Obs: em eucariotos, os fragmentos de Okazaki são mais 
curtos. 100-200nt é aproximadamente o mesmo comprimento 
da repetição do nucleossomo. 
A DNA polimerase I retira os primers com sua atividade 
exonucleolítica 5’-3’. 
Etapas da replicação do DNA 
1. Reconhecimento da origem de replicação por proteínas 
iniciadoras; 
2. Recrutamento da helicase que separa as duas fitas que 
formam a dupla hélice; 
3. Topoisomerases aliviam as tensões causadas na dupla 
hélice depois da abertura das fitas pela helicase; 
4. Proteínas SSBs se ligam à fita simples de DNA impedindo 
que ela se re-anele ou forme estruturas 
intramoleculares, que impediriam a passagem da 
polimerase; 
5. Adição de primers (iniciadores) pela primase; 
6. Adição de novos desoxirribonucleotídeos pela DNA 
polimerase (III em procariotos); 
7. Retirada dos iniciadores pela atividade exonucleolítica da 
polimerase I e a adição de desoxirribonucleotídeos para 
substituir os iniciadores. Atividades exonucleolítica 3’-5’ e 
de polimerização 5’-3’ da DNA polimerase I; 
8. Fragmentos de Okazaki são ligados pela ação da ligase 
que promove a formação de ligações fosfodiéster entre 
os fragmentos de Okazaki da fita descontínua. 
 
PCR (polymerase chain reaction) 
 Replicação “artificial”, in vitro do DNA. 
 
 Para funcionar, uma PCR precisa: 
1. DNA molde; 
2. Desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTP); 
3. Iniciadores ou primers; 
4. DNA polimerase; 
5. Mg2+ (cofator da polimerase); 
6. Tampão da reação. 
 
A utilização da temperatura (aquecimento) simula os 
eventos que ocorrem na célula, sem a necessidade de 
adicionar novas enzimas. 
1. Desnaturação da dupla fita (aproximadamente 95ºC); 
2. Anelamento dos primers (55-60ºC); 
3. Extensão do DNA polimerase (72ºC). 
~ 35 ciclos 
 
 A DNA polimerase de microrganismos termófilos resiste 
aos 95ºC da etapa de naturação do DNA. 
 
Ao fim da PCR, serão geradas aproximadamente 68 
bilhões de cópias de DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
Replicação in vitro (PCR) Replicação in vivo (dentro da célula) 
DNA molde é apenas uma região 
específica do genoma, contendo ou 
não um gene 
DNA molde são todas as 
moléculas de DNA linear da célula 
Ocorre na fase S do ciclo celular 
Primers são adicionados 
(complementares à região de 
interesse) 
Primers são sintetizados pela 
primase 
Separação das fitas de DNA pelo 
calor 
Separação das fitas de DNA pela 
helicase 
Utiliza DNA polimerase resistente 
ao calor 
Utiliza DNA polimerase celular 
que funciona a 37ºC 
DNA replicado várias vezes 
(dependendo de quantos ciclos 
serão realizados. Amplificação 
exponencial. 
As moléculas de DNA da célula 
são replicadas uma vez 
 Ambos precisam de desoxinucleotídeos trifosfatados e 
Mg2+.