Genética - Replicação de DNA e PCR

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Beatriz Machado de Almeida 
Replicação de DNA e PCR 
Replicação de DNA e PCR 
Livros recomendados: 1 – SNUSTAD; 2 – THOMPSON. 
Avaliações + Mapa conceitual por tutoria (nota da prática) + 
Caso clínico (questão discursiva) 
Introdução 
Objetivos 
▪ Apresentar o processo de replicação do DNA e os 
seus principais componentes moleculares. 
▪ Caracterizar a técnica de Reação em Cadeia da 
Polimerase (PCR), correlacionando-a com a 
replicação do DNA in vivo. 
▪ Explicar como a técnica de PCR pode ser utilizada 
para o diagnóstico molecular de processos 
infeciosos e patológicos. 
 
• Por que uma célula tem que replicar o seu material 
genético? Divisão celular! Uma célula só replica seu 
material genético se for dividir. 
• A célula filha tem que ter a mesma quantidade de 
material genético – cromossomos da célula mãe. 
• Interfase (fase S): Fase antes da mitose 
propriamente dita. Ocorre a síntese de DNA – 
replicação do material genético. 
 
RT-PCR | RNA------cDNA | Transcriptase reversa 
Replicação semi-conservativa 
Uma fita de DNA 
antiga se divide em 
duas, onde cada uma vai 
servir de molde para 
formar uma nova fita 
de DNA. Logo, uma 
metade da fita é conservada da fita mãe. É por isso 
que se consegue estabelecer vínculos genéticos, como no 
teste de paternidade, árvores filogenéticas, por 
exemplo. 
O processo de replicação se inicia num ponto 
específico! Esses pontos tem uma tendência maior de 
sofrer as rupturas das pontes de hidrogênio. Nesses 
pontos existem zonas ricas em adenina ligada à timina. 
OBS.: 
➢ Entre adenina e timina se tem duas pontes de 
hidrogênio. 
➢ Entre guanina e citosina se tem três pontes de 
hidrogênio. Por isso, quebrar ligação entre GC é 
mais difícil do que entre AT. 
 
• Nos procariotos, o ponto de origem de replicação 
é único. A partir desse ponto, é possível replicar 
toda a molécula. 
• Nos eucariotos, existem pontos diferentes de 
origem de replicação. Esses pontos tem uma 
tendência maior de sofrer as rupturas das pontes 
de hidrogênio. Os múltiplos pontos de origem de 
replicação, quando se encontram, dão origem a 
forquilhas de replicação, formando estruturas 
maiores até que toda a fita seja replicada. 
Abertura da dupla fita 
 
 
Existem enzimas que auxiliam nessa abertura: 
 
▪ Enzima DNAa: Auxiliam no processo de abertura 
das origens de replicação. 
▪ DNA helicase: É quem proporciona a abertura da 
dupla fita. Desfaz a dupla hélice, promovendo a 
 
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Replicação de DNA e PCR 
quebra das pontes de hidrogênio, levando a 
desnaturação. 
▪ Topoisomerases: Atuam desenrolando e relaxando 
a molécula de DNA. 
➢ Girase: Funciona como uma enzima que alivia a 
tensão provocada pela quebra das pontes de 
hidrogênio. 
▪ Proteínas ligadoras 
de fita simples: 
Não abrem a 
molécula de DNA, 
mas fazem a 
manutenção (se 
ligam na estrutura da molécula), mantendo-a 
aberta, evitando a renaturação. Enorme afinidade 
por moléculas de DNA linear e de fita simples. 
DNA polimerase 
Forma o DNA (polímero). Os monômero do DNA, que são 
os nucleotídeos (fosfato, açucar, base nitrogenada), 
fazem ligações fosfodiéster. A DNA polimerase atua 
nas duas fitas de DNA em sentindos opostos. 
 
 
• Enzima que catalisa a adição de nucleotídeos à 
extremidades 3`de uma fita de DNA. 
• Precisa de um molde: A cadeia molde complementar. 
• Mecanismo de polimerização (adição de 
nucleotídeos) é no sentido 5`→ 3` 
• A extremidade 5`termina com fosfato e a 
3`termina com açúcar. Sempre tem um fosfato em 
uma extremidade e açúcar na outra. 
• Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter 
extremidade 3`OH livre). Ela precisa de uma região 
que funciona como substrato – uma hidroxila livre 
na região 3. 
• Possui mecanismo de correção de erros no sentido 
3`→ 5`. 
A diferença da ribose pra desoxirribose é a hidroxila. 
O mecanismo de polimerização do DNA apresenta dois 
problemas: 
1 – A DNA-polimerase 
precisa de um grupo 
3`OH para estender a 
cadeia de DNA. Solução: 
uma enzima chamada 
primase sintetiza um 
PRIMER (10 
nucleotídeos) de RNA que deixa no seu último 
nucleotídeo uma hidroxila livre para poder iniciar o 
processo. Ao final, esse primer é substituído e continua 
a sequência de DNA. 
2 – A enzima DNA-polimerase só sintetiza fitas novas 
da direção 5`→ 3`, fazendo a leitura da fita molde na 
direção 3`→ 5`. As fitas são antiparalelas, por conta 
da polaridade única. Solução: O problema é solucionado 
por uma manobra da enzima. A fita que deveria crescer 
no sentido 3`→ 5`é feita descontinuamente, em 
pequenos pedaços (vários primers), com a DNA 
polimerase trabalhando para trás a partir da 
forquilha de replicação. Os fragmentos de Okazaki são 
fragmentos deixados na fita de baixo. Os fragmentos 
são posteriormente unidos (DNA-ligase), formando uma 
fita contínua. 
 
 
 
Não existe síntese na direção 3`→ 5`!!! 
 
 
Conclusões: 1 – Ocorre na interfase; 2 – É 
semiconservativa; 3 – É bidirecional; 4 – Envolve várias 
enzimas. 
 
 
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Beatriz Machado de Almeida 
Replicação de DNA e PCR 
 
PCR Aula 2 
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 
• Método in vitro de replicação do DNA. 
• Amplifica sequências específicas de DNA: não 
replica o DNA todo, por exemplo, se você quer um 
estudo genético da mioglobina, você estuda só a 
mioglobina. Essa especificidade é garantida por 
oligonucleotídeos iniciadores, os prímers, que se liga 
a sequência complementar, só se ligando na 
sequência específica e em nenhuma outra sequência. 
• Processo realizado em vários ciclos com diferentes 
temperaturas: visam substituir o trabalho das 
enzimas que normalmente atuam no processo in vivo. 
Componentes da PCR 
• DNA a ser 
amplificado. RNA 
também, desde que 
seja convertido em 
DNA. 
• Primers – Forward e 
Reverse: eles vão 
anelar. 
• dNTPs – Nucleotídeos: que serão acrescentados 
pela polimerase na nova fita que está sendo 
formada. Citosina, guanina, adenosina, timina. 
• DNA polimerase 
• MgCl2: algumas enzimas precisam de cofatores para 
poder se ativar. No caso da polimerase, o cofator é 
o cloreto de magnésio. 
• H2O RNASE e DNASE FREE: precisa adicionar 
água, mas ela precisa ser livre de sais e de enzimas, 
pois se vai colocar DNA na reação, essa enzima a 
digeriria, comprometendo o DNA. 
• Tampão = mantém o PH ótimo para atividade da 
enzima. 
Depois de adicionado todos esses, vão para o 
aparelho, termociclador. 
1º fase – desnaturação 
• Quebra das pontes de hidrogênio 
• Aquecimento a mais de 90ºC para a separação da 
dupla fita. Vai fazer o papel da helicase. 
• Separa tanto a fita de DNA original quanto os 
produtos de amplificação. 
2º fase – Anelamento dos primers 
• Hibridização 
• Temperatura varia entre 40 a 70ºC conforme o 
par de primers. O valor da temperatura depende 
muito do tipo de PCR que se está conduzindo, do 
tamanho do primer utilizado, do fragmento que se 
amplifica. Quanto maior o fragmento, mais 
permissiva deve ser a temperatura de anelamento, 
ou seja, mais baixa. Quanto menor o fragmento, 
mais fácil é a amplificação e maior a temperatura 
para que não se tenha a geração de fragmentos 
muito inespecíficos. 
• Determina a especificidade da ligação. Os primers 
são específicos porque eles têm a sequência 
complementar do fragmento. 
 
Quando se fala em processo in vivo, o primer é de RNA. 
Ao final do processo tem a remoção desses prímers de 
RNA, porque o RNA não pode ficar na sequência de 
DNA. Na técnica de PCR não se faz essa remoção. Então 
é desenhado um primer de DNA (tem timina) 
modificando a pentose que era desoxigenada em 
oxigenada, colocando uma hidroxila na posição 3`. 
3º fase – extensão 
• Atividade da Taq DNA polimerase: extraída de 
bactérias que vivem em ambientes termófilos 
(quentes), enzimas menos instáveis e menos 
sujeitas aos processos de desnaturação. 
• Duplicação do DNA: Essa é afase em que a 
polimerase vai fazer a amplificação de fato de um 
novo DNA. 
• Temperatura ótima em torno de 72º C: Quando 
atinge essa temperatura a polimerase começa a 
adicionar as dNTPs. 
 
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Beatriz Machado de Almeida 
Replicação de DNA e PCR 
A cada ciclo vai aumentando em ordem exponencial o 
número de fragmentos. Por mais fragmentos que se 
tenha formado, não é possível visualizar a olho nu o 
DNA ao final do processo. 
Desnaturação (96ºC) → Anelamento dos primers 
(55ºC) → Extensão dos primers (72ºC) 
Repete-se entre 25 e 35 vezes 
Resultados após 1 ciclo: o número de moléculas de DNA 
duplicou. 
Técnicas para visualização 
Eletroforese 
Separação de fragmentos moleculares, mas pode ser 
usado também apenas para a visualização dos 
fragmentos em testes qualitativos. Na técnica, 
adiciona-se corantes específicos às amostras e faz 
com que os fragmentos migrem na matriz do gel. A 
estrutura da eletroforese tem um polo positivo e um 
negativo, e como o DNA é muito negativo, ele migra 
para o polo positivo deixando seu rastro e podendo ser 
visualizado por meio de uma luz. 
Esses pacientes que 
tiveram a presença da 
banda (seta vermelha), 
são pacientes 
infectados. Já os que 
não têm presença de 
banda (seta verde) são 
negativos. 
Tipos de PCR 
• PCR convencional: 
• Nested PCR: amplificação. Submete as bandas 
fraquinhas e uma nova amplificação. 
• PCR em tempo real (qPCR): além de qualitativa, uma 
análise quantitativa. À medida que vai amplificando 
vai gerando gráficos de amplificação para saber se 
está amplificando ou não. Ela é mais rápida, mais 
moderna. Covid-19. 
• RT-PCR: é uma técnica que usa a transcriptase 
reversa antes da amplificação. RNA em DNA e 
depois faz a PCR. 
• PCR Multiplex: amplificar várias regiões gênicas ao 
mesmo tempo em um único tubo de ensaio. Tipo 
dengue, zika e Chikungunya ao mesmo tempo. 
 
Aplicações do Conhecimento 
1 – Diagnóstico de infecções: bactérias, vírus, fungos, 
protozoários. Mais precoce que um Elisa, por exemplo, 
que detecta os anticorpos, já que a janela entre infecção 
e a produção deles leva um tempo; 
 
Nesse caso, tem o marcador de peso 
molecular para saber qual o tamanho 
da banda, cada linha representa um 
tamanho. O DNA é pesado em pares 
de base porque é fita dupla (ex.: o 
fragmento tem 200 pb). Quanto 
maior o fragmento mais em cima ele fica, e quanto 
menor, mais em baixo. 
No controle usa água - C (para saber se está 
contaminada), a amostra do paciente - P, um controle 
negativo - CN e o controle positivo - CP. 
Nesse caso da imagem, a única amostra que apresenta 
banda no gel é o CP, que é o DNA de células que já se 
sabe previamente que está infectada. Então, se o 
paciente estivesse infectado, ele apresentaria uma 
banda na mesma altura da banda apresentada por CP. 
Laudo: não foi detectada, pela técnica de PCR, 
amplificação do gene viral... Não se pode afirmar 100% 
que não há infecção devido ao falso negativo. 
 
2 - Quantificação de DNA ou RNA viral/célula 
hospedeira ou até de genes das células do hospedeiro. 
3 - Diagnóstico de mutações: doenças 
crônicas/genéticas. 
Conclusões 
• A PCR é um processo de replicação do DNA in vitro 
• Amplifica fragmentos específicos do DNA total 
• Ocorre em 3 etapas 
• O papel da maior parte das enzimas é substitúido por 
temperaturas ou reagentes da técnica 
• É aplicada para fins diagnósticos na identificação, 
quantificação e análise de processos 
fisiopatológicos.