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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE MEDICINA CLÍNICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS MÔNICA COELHO ANDRADE AVALIAÇÃO DA ESPESSURA DO RAMO DIREITO DO DIAFRAGMA CRURAL E NÍVEIS DE GRELINA E LEPTINA PLASMÁTICA EM PACIENTES COM DOENÇA DO REFLUXO GASTROESOFÁGICO (DRGE) INFECTADOS COM HELICOBACTER PYLORI FORTALEZA 2019 MÔNICA COELHO ANDRADE AVALIAÇÃO DA ESPESSURA DO RAMO DIREITO DO DIAFRAGMA CRURAL E NÍVEIS DE GRELINA E LEPTINA PLASMÁTICA EM PACIENTES COM DOENÇA DO REFLUXO GASTROESOFÁGICO (DRGE) INFECTADOS COM HELICOBACTER PYLORI Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas do Departamento de Medicina Clínica da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Médicas. Orientador: Prof. Dr. Miguel Ângelo Nobre e Souza. FORTALEZA 2019 MÔNICA COELHO ANDRADE AVALIAÇÃO DA ESPESSURA DO RAMO DIREITO DO DIAFRAGMA CRURAL E NÍVEIS DE GRELINA E LEPTINA PLASMÁTICA EM PACIENTES COM DOENÇA DO REFLUXO GASTROESOFÁGICO (DRGE) INFECTADOS COM HELICOBACTER PYLORI Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Médicas do Departamento de Medicina Clínica da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Médicas. Aprovada em: _____/_____/_____. BANCA EXAMINADORA ________________________________________ Prof. Dr. Miguel Ângelo Nobre e Souza (Orientador) Universidade Federal do Ceará (UFC) ________________________________________ Prof. Dr. Armênio Aguiar dos Santos Universidade Federal do Ceará (UFC) _________________________________________ Prof. Dra. Maria de Fátima Oliveira Universidade Federal do Ceará (UFC) _________________________________________ Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga Universidade Federal do Ceará (UFC) _________________________________________ Prof. Dra. Gardênia Costa do Carmo Centro Universitário Christus https://bv.fapesp.br/pt/pesquisador/178778/marcellus-henrique-loiola-ponte-de-souza/ https://bv.fapesp.br/pt/pesquisador/178778/marcellus-henrique-loiola-ponte-de-souza/ A Deus. À Virgem Maria. Aos meus pais e ao meu noivo. AGRADECIMENTO ESPECIAL A Deus, Alfa e Ômega, princípio e o fim de todas as coisas. Ele me conduziu, amparou e não me permitiu desistir. Agradeço também a virgem Maria, que pela poderosa intercessão fez grandes coisas em meu favor. Aos meus pais, por toda compreensão, auxílio, sacrifícios diários e incentivo a realização desta tese, prova maior de que amor e doação andam de mãos dadas. Ao meu noivo, Pérsio Veloso, por me ouvir, me incentivar e impulsionar. Companheiro na alegria e na tristeza. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Miguel, pela orientação e ensinamentos que me passou ao longo desses anos. Aprendi muito do ponto de vista técnico, mas o maior de todos os ensinamentos foi entender que posso realizar mais coisas do que me achava capaz de fazê-lo. À CAPES, pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio. Aos professores participantes da banca examinadora Profa. Dra. Lúcia Libanez Bessa Campelo Braga, Profa. Dra. Maria de Fátima Oliveira, Profa. Dra. Gardenia Costa do Carmo e Prof. Dr. Armênio Aguiar dos Santos pelo tempo, pelas valiosas colaborações e sugestões. Aos pacientes que participaram desta pesquisa, pela boa vontade e colaboração. Aos meus colegas de laboratório por toda parceria e boa convivência, que tornava mais suave e alegre nosso dia a dia: Patriciane, Éricka, Héltia, Josire, Juliete, Vicente, Patrícia, Edna, Alessandra, Carlos Eduardo e Leonardo. Ao Walber, que além da parceria no laboratório ainda me auxiliou na busca de programas de análise de imagens, o meu muito obrigada. À Tanila, Débora e Nádia que foram minhas companheiras mais próximas, me auxiliavam nas dificuldades e festejavam as alegrias. Obrigada pelos conselhos, paciência e por ficarem no “barco” até o final. A vocês, a minha eterna gratidão. À Diana e ao setor de Unidade de Pesquisa Clínica da Universidade Federal do Ceará por toda cooperação na realização das coletas de sangue dos pacientes. À Ana Flávia por ter me auxiliado na realização dos ELISAS. Ao Dr. Luciano Monteiro pela realização das análises das biópsias bem como ao setor de Patologia da Universidade Federal do Ceará e a residente Priscila. À Michele, Tiago, Felipe e Orleâncio tanto pela realização das análises com biologia molecular como pela paciência em me ensinar o passo a passo de todo o processo na bancada. Às secretárias da pós-graduação, Ivone e Rita, por todo auxílio e boa vontade com que me atenderam todas as vezes que precisei, o meu muito obrigada. “Descobri que há uma harmonia maravilhosa nas verdades complementares da fé e da ciência. O Deus da bíblia é também o Deus do genoma. Deus pode ser encontrado na catedral e no laboratório. Investigando a criação incrível e majestosa de Deus, a ciência pode na verdade ser uma forma de LOUVOR” Francis Collins RESUMO Pacientes com esofagite de refluxo apresentam menor espessura e falha funcional do diafragma crural (DC), fato que fundamenta a possível existência de uma deficiência muscular esquelética em pacientes com DRGE. Além disso, a relação entre Helicobacter pylori e Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) apresenta algumas divergências entre os estudos, fazendo-se necessário maior número de pesquisas capazes de esclarecer esta relação. O objetivo do presente estudo foi avaliar a espessura e ecogenicidade do ramo direito do DC bem como medir os níveis plasmáticos de grelina e leptina em pacientes com DRGE, com e sem infecção por H. pylori. Trata-se de um estudo transversal onde foram incluídos pacientes que apresentaram resultado da fração de tempo total do refluxo ≥ 4,2 na pHmetria de 24h. Realizou-se a coleta de sangue e as amostras foram centrifugadas e armazenas a -80°C até a realização das dosagens da grelina e leptina através de ensaio imunoenzimático (ELISA). A Endoscopia Digestiva Alta (EDA) foi realizada a fim de retirar as biópsias para análise histopatológica, urease e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e em seguida executava-se a ecoendoscopia para captura das imagens do DC. A espessura do músculo foi medida em milímetros e a intensidade média da escala de cinza dos pixels foi considerada como a ecogenicidade. Grupo H. pylori positivo era composto por 9 pacientes, 4 homens e 5 mulheres, com idade média de 41,44 ± 10,77 anos e H. pylori negativo por 21 voluntários, 9 homens e 12 mulheres, com idade média de 48,62 ± 15,56 anos. O empachamento foi mais presente no grupo H. pylori positivo (p = 0,004). Obteve-se níveis mais baixos (p = 0,012) da razão grelina ativa/total no grupo H. pylori positivo (0,43 ± 0,14) em relação ao grupo negativo (0,62 ± 0,19) e níveis mais altos (p = 0,033) de grelina total no grupo infectado (854,10 ± 328,60) em relação ao não infectado (593,20 ± 249,50). Não se observou diferença entre os grupos com relação a grelina ativa (p = 0,892), leptina (p = 0,560) e ecogenicidade (p = 0,365). Com relação a espessura do DC, obteve-se maiores níveis de leptina, escores da atividade inflamatória e escores de H. pylori no grupo com diafragma crural mais fino (≤ 4mm). Apesar daslimitações no que se refere ao tamanho das amostras, este estudo permite concluir que a infecção por H. pylori pode interferir nos níveis de grelina mas não alterou a ecogenicidade do DC. Além disso, verificou-se escores mais elevados de infecção por H. pylori (p = 0,008) e níveis mais altos de leptina (p = 0,027) no grupo com DC mais fino (≤ 4mm). Palavras-chave: Refluxo Gastroesofágico; Helicobacter pylori; grelina; leptina; ecoendoscopia. ABSTRACT Patients with reflux esophagitis have lower thickness and functional failure of the crural diaphragm (CD), a fact that supports the possible existence of a skeletal muscle deficiency in patients with Gastroesophageal Reflux Disease (GERD). In addition, the relationship between Helicobacter pylori and GERD presents some divergences between the studies, requiring a greater number of studies capable of clarifying this relationship. The objective of the present study was to evaluate the thickness and echogenicity of the right branch of CD as well as to measure plasma levels of ghrelin and leptin in patients with GERD, with and without H. pylori infection. This was a cross-sectional study, which included patients who presented a total reflux time fraction of ≥ 4.2 at 24h pHmetry. Blood was collected and the samples were centrifuged and stored at -80°C until ghrelin and leptin dosages were performed by Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Upper Digestive Endoscopy (UDE) was performed to remove biopsies for histopathological analysis, urease and Polymerase Chain Reaction (PCR), and then performed the echoendoscopy to capture the CD images. The thickness of the muscle was measured in millimeters and the mean intensity of the gray scale of the pixels was considered as the echogenicity. H. pylori positive group consisted of 9 patients, 4 men and 5 women, with a mean age of 41.44±10.77 years and negative H. pylori by 21 volunteers, 9 men and 12 women, with a mean age of 48.62±15.56 years. The embedding was more present in the H. pylori positive group (p = 0.004). Lower levels (p = 0.012) of the active/total ghrelin ratio were obtained in the H. pylori positive group (0.43±0.14) compared to the negative group (0.62±0.19) and levels taller (p = 0.033) of total ghrelin in the infected group (854.10±328.60) compared to the uninfected group (593.20±249.50). No difference was observed between groups with respect to active ghrelin (p = 0.892), leptin (p = 0.560) and echogenicity (p = 0.365). With regard to the thickness of the CD, higher levels of leptin, inflammatory activity scores and H. pylori scores were obtained in the group with finer crural diaphragm (≤ 4 mm). Despite limitations in sample size, this study concludes that H. pylori infection may interfere with ghrelin levels but did not alter the echogenicity of CD. In addition, there were higher scores of H. pylori infection (p = 0.008) and higher levels of leptin (p = 0.027) in the group with the finest DC (≤ 4 mm). Keywords: Gastroesophageal Reflux; Helicobacter pylori; ghrelin; leptina; echoendoscopy. LISTA DE FIGURAS Figura 1 Interpretação dos resultados de diferentes exames esofágicos associados a Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE)..................................................... 20 Figura 2 Mapa representando as prevalências de infecção por H. pylori em diferentes populações mundiais.......................................................................................... 24 Figura 3 Processo de formação da grelina........................................................................ 27 Figura 4 Atualização do sistema Sydney de classificação e gradiente de gastrite........... 35 Figura 5 Medida da espessura da porção direita do diafragma crural em imagem de secção transversal captada por ecoendoscopia.................................................... 36 Figura 6 Medida da ecogenicidade da porção direita do diafragma crural em imagem de secção transversal captada por ecoendoscopia............................................... 37 Figura 7 Fluxograma da seleção dos pacientes e divisão dos grupos do estudo................ 41 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Relação entre grelina ativa/total em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados (9 voluntários) e não infectados (21 voluntários) por H. pylori.................................................................................. 48 Gráfico 2 Concentração de grelina ativa em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados (9 voluntários) e não infectados (21 voluntários) por H. pylori.................................................................................. 49 Gráfico 3 Concentração de grelina total em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados (9 voluntários) e não infectados (21 voluntários) por H. pylori.................................................................................. 50 Gráfico 4 Concentração de leptina em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados (9 voluntários) e não infectados (21 voluntários) por H. pylori.................................................................................. 51 Gráfico 5 Medida da espessura do ramo direito (RD) do diafragma crural durante a expiração em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados (9 voluntários) e não infectados (21 voluntários) por H. pylori...... 53 Gráfico 6 Medida da espessura do ramo direito (RD) do diafragma crural durante a inspiração em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados (9 voluntários) e não infectados (20 voluntários) por H. pylori...... 54 Gráfico 7 Ecogenicidade do ramo direito (RD) do diafragma crural durante a expiração em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados (9 voluntários) e não infectados (21 voluntários) por H. pylori............................ 55 Gráfico 8 Ecogenicidade do ramo direito (RD) do diafragma crural durante a inspiração em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados (9 voluntários) e não infectados (20 voluntários) por H. pylori...... 56 Gráfico 9 Correlação entre leptina e média total da espessura do ramo direito do diafragma crural durante a expiração em 30 pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico................................................................................... 61 Gráfico 10 Correlação entre leptina e média total da espessura do ramo direito do diafragma crural durante a inspiração em 29 pacientes com DRGE................. 62 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Classificação endoscópica de Los Angeles....................................................... 21 Tabela 2 Primers utilizados na amplificação dos genótipos de interesse......................... 38 Tabela 3 Perfil demográfico dos pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori........................................... 42 Tabela 4 Achados endoscópicos e escores dos questionários RDQ e RSI nos 30 pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori.............................................................................. 43 Tabela 5 pHmetria de 24h e tratamento prévio contra H. pylori nos 30 voluntários com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori..................................................................................... 44 Tabela 6 Caracterização da dispepsia e constipação intestinal nos 30 voluntários com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori...................................................................................................... 45 Tabela 7 Caracterização da inflamação e atividade inflamatória em pacientes com Doençado Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori...................................................................................................... 46 Tabela 8 Resultados do histopatológico, urease e marcadores moleculares dos nove pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados com H. pylori............................................................................................................ 47 Tabela 9 Resumo dos resultados da grelina ativa, total, ativa/total e leptina em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados (9 voluntários) e não infectados (21 voluntários) por H. pylori............................ 52 Tabela 10 Resumo dos achados de espessura e ecogenicidade do ramo direito do diafragma crural em pacientes com Doença do Refluxo Gastresofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori........................................... 57 Tabela 11 Correlação entre os escores de infecção por Helicobacter pylori com empachamento, inflamação, atividade inflamatória e grelina ativa/grelina total em 30 pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico...................... 58 Tabela 12 Escores de inflamação, atividade, metaplasia, atrofia e presença de H. pylori em pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico de acordo com a espessura do ramo direito do diafragma crural em diferentes sítios da mucosa gástrica................................................................................................. 59 Tabela 13 Avaliação da presença do gene cagA de H. pylori em pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico de acordo com a espessura do ramo direito do diafragma crural................................................................................................ 60 Tabela 14 Grelina e leptina em pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico de acordo com a espessura do ramo direito do diafragma crural........................... 60 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BAR Barreira Anti-Refluxo CNS Conselho Nacional de Saúde DC Diafragma Crural DNA Ácido desoxirribonucleico DRGE Doença do Refluxo Gastroesofágico EDA Endoscopia Digestiva Alta EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético EEI ELISA EXP GOAT HCl H & E H. pylori HUWC IBP IIQ IMC INSP JEG NPY PCR RCF RD TCLE TMI UFC Esfincter Esofágico Inferior Ensaio de Imunoabsorção Ligado a Enzima Expiração Grelina O-aciltransferase Ácido clorídrico Hematoxilina-Eosina Helicobacter pylori Hospital Universitário Walter Cantídeo Inibidor da Bomba de Prótons Intervalo interquartil Índice de Massa Corpórea Inspiração Junção Esofagogástrica Neuropeptídeo Y Reação em Cadeia da Polimerase Força Centrífuga Relativa Ramo Direito Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Treinamento Muscular Inspiratório Universidade Federal do Ceará LISTA DE SÍMBOLOS % Porcentagem ® pg/ml ng/ml nm MHz Marca Registrada Picograma por mililitro Nanograma por mililitro Nanômetro Megahertz SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 18 1.1 Doença do refluxo gastroesofágico (DRGE): Conceito e epidemiologia............. 18 1.1.1 Aspectos clínicos ....................................................................................................... 19 1.1.2 Aspectos anatômicos e o diafragma crural ............................................................. 21 1.2 Helicobacter pylori ................................................................................................... 23 1.2.1 Histórico e características morfológicas.................................................................. 23 1.2.2 1.2.3 1.3 1.3.1 1.3.2 1.4 2 2.1 2.2 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 4 Epidemiologia ........................................................................................................... Diagnóstico e manifestações clínicas ...................................................................... Grelina e leptina ...................................................................................................... Grelina ...................................................................................................................... Leptina ...................................................................................................................... Justificativa............................................................................................................... OBJETIVOS ............................................................................................................ Objetivos gerais ....................................................................................................... Objetivos específicos................................................................................................ METODOLOGIA ................................................................................................... Delineamento, local e período de estudo ............................................................... Aspectos éticos.......................................................................................................... Critérios de inclusão e exclusão ............................................................................. Recrutamento dos pacientes ................................................................................... População ................................................................................................................. pHmetria de 24 horas .............................................................................................. Coleta de sangue ...................................................................................................... Endoscopia Digestiva Alta e coleta de biópsias ..................................................... Estudo histopatológico ............................................................................................ Ecoendoscopia: Medida da espessura e ecogenicidade do diafragma crural..... Extração de DNA e Reação em Cadeia da Polimerase para determinação de diferentes genótipos de H. pylori............................................................................ Dosagem plasmática dos hormônios grelina e leptina ......................................... Análise estatística .................................................................................................... RESULTADOS ........................................................................................................ 23 25 26 26 28 29 30 30 30 31 31 31 31 31 32 32 33 34 34 35 37 39 40 41 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 4.1.9 4.1.10 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 5 6 Pacientes com DRGE infectados e não infectados por H. pylori.......................... Dados demográficos ................................................................................................. Achados endoscópicos e sintomas dos pacientes com DRGE infectados e não infectados por H. pylori............................................................................................. pHmetria de 24h e tratamento prévio contra H. pylori ........................................... Dispepsia e constipação intestinal ........................................................................... Achados histopatológicos .........................................................................................Estudo histopatológico, urease e marcadores moleculares de pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados por H. pylori................. Grelina e leptina ....................................................................................................... Espessura do ramo direito do diafragma crural ..................................................... Ecogenicidade do ramo direito do diafragma crural .............................................. Correlações entre os escores de infecção por H. pylori com empachamento, inflamação, atividade inflamatória e grelina ativa/total.......................................... Pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico divididos de acordo com a espessura do ramo direito do diafragma crural.................................................... Estudo histopatológico de biópsias gástricas em pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico de acordo com a espessura do ramo direito do diafragma crural....................................................................................................... Avaliação dos genes cagA + e cagA- de acordo com a espessura do ramo direito do DC......................................................................................................................... Níveis de leptina e grelina plasmática em pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico de acordo com a espessura do ramo direito do diafragma crural.......................................................................................................................... Correlação entre leptina e espessura do ramo direito do diafragma crural em pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico................................................ DISCUSSÃO ............................................................................................................ CONCLUSÃO ......................................................................................................... REFERÊNCIAS ...................................................................................................... APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO...................................................................................................... APÊNDICE B – RESULTADOS INDIVIDUAIS.................................................. ANEXO A – PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA..... 41 41 42 43 44 46 47 48 53 55 57 59 59 60 60 61 63 68 69 75 77 85 ANEXO B – AVALIAÇÃO CLÍNICA PADRONIZADA ..................................... ANEXO C – QUESTIONÁRIO DE DOENÇA DO REFLUXO ......................... ANEXO D – ÍNDICE DE SINTOMAS DO REFLUXO FARINGO- LARÍNGEO (RSI).................................................................................................... 88 91 92 18 1 INTRODUÇÃO A verdadeira influência da infecção por Helicobacter pylori na patogênese da Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) apresenta algumas divergências entre os pesquisadores, o que torna necessário maior número de estudos controlados que sejam capazes de esclarecer esta relação. Xie et al. (2013) realizaram estudo de revisão buscando justamente verificar a relação entre H. pylori e DRGE e concluíram existir associação negativa entre a infecção bacteriana e a DRGE endoscópica, além disso afirmaram que a erradicação da bactéria pode ser considerada fator de risco para doença do refluxo principalmente em indivíduos asiáticos (XIE et al., 2013). Já Mungan & Şimşek (2017) não verificaram relação entre a presença de DRGE e H. pylori após realizar revisão de literatura. Os autores afirmaram o tratamento efetivo da bactéria não ter impacto sobre o refluxo, apesar de verificar menor frequência de pessoas com esôfago de Barrett e adenocarcinoma de esôfago entre pacientes infectados pela bactéria, principalmente pelo gene cagA. Outra situação importante, foi a consideração de tratamento antibacteriano principalmente entre os indivíduos que necessitam fazer uso crônico de Inibidor da Bomba de Prótons (IBP), devido a atrofia e/ou metaplasia que estes pacientes apresentam e que pode ser impactada pelo uso a longo prazo do IBP. Assim, os autores concluíram o tratamento contra a H. pylori ser independente da DRGE, com exceção daqueles que necessitam fazer uso de IBP a longo prazo (MUNGAN & SIMSEK, 2017). 1.1 Doença do refluxo gastroesofágico (DRGE): Conceito e epidemiologia O refluxo gastroesofágico (RGE) pode ser descrito como um fenômeno fisiológico de curta duração (< 3 minutos) caracterizado pelo retorno do conteúdo gástrico para o esôfago, normalmente no período pós-prandial, e que em pessoas saudáveis provoca pouco ou nenhum sintoma (VANDENPLAS et al., 2009). Quando ocorre um rompimento destas condições fisiológicas, com estabelecimento de sinais ou sintomas incômodos (possivelmente levando a complicações) que podem interferir na qualidade de vida dos indivíduos, caracteriza-se conceitualmente o quadro de Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) (VAKIL et al., 2006). 19 Com relação a epidemiologia, estudo realizado por El-Serag et al. (2014) em revisão sistemática sobre a DRGE, concluiu-se esta doença ser prevalente em todo o mundo apresentando variações nas prevalências de acordo com a área geográfica. Considerou-se DRGE a presença de pirose e/ou regurgitação pelo menos uma vez por semana (ou por diagnóstico clínico ou segundo a definição de Montreal) e se obteve os seguintes valores de prevalência: 8,8% – 25,9% na Europa, 18,1% – 27,8% na América do Norte, 2,5% – 7,8% no leste da Ásia, 8,7% – 33,1% no Oriente Médio, 23,0% na América do Sul e 11,6% na Austrália (EL-SERAG et al., 2014). Já no Brasil, a incidência da DRGE é de 12% (aproximadamente 20 milhões de pessoas) e compromete de forma importante a qualidade de vida dos pacientes (HENRY, 2014). 1.1.1 Aspectos clínicos A partir da necessidade de padronização do conceito e manifestações associadas a DRGE estabeleceu-se um consenso, realizado em Montreal, a fim de normatizar e facilitar a compreensão entre médicos, pesquisadores e agências reguladoras. Neste consenso, as manifestações da DRGE foram classificadas em esofágicas e extra esofágicas (VAKIL et al. 2006). Também se estabeleceu como sintomas característicos a queimação retroesternal (referida como azia) e a regurgitação. A esofagite de refluxo, mais referida atualmente como esofagite erosiva, foi descrita como a lesão esofágica mais comum (VAKIL et al., 2006; BERSTAD & HATLEBAKK, 1995; KLAUSER et al., 1990). Assim, os pacientes podem ser diagnosticados a partir de sintomas típicos isolados ou pela realização de exames que detectem o refluxo do conteúdo do estômago, como a pHmetria ou monitoramento da impedância ou mesmo por exames que verifiquem as consequências da DRGE (endoscopia, histopatológico, microscopia eletrônica) com presença de manifestações típicas (esofágicas) ou atípicas (extra-esofágicas) (VAKIL et al., 2006). Nesse contexto, um estudo moderno associado ao diagnóstico da DRGE foi descrito recentemente no Consenso de Lyon, e abordou questões como a interpretação de testes esofágicos associados a DRGE, como pode ser verificado na figura 1. 20 Figura 1 – Interpretação dos resultados de diferentes exames esofágicos associados a Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE). Legenda: LA – Los Angeles; TEA – Tempo de Exposição Ácida; IBNM: Impedância Basal Noturna Média; IOPII: Índice de Onda Peristáltica Induzida por Ingestão pós refluxo; JEG – Junção Esôfago Gástrica; CII: Células Inflamatórias Intraepiteliais. Fonte: Gyawali et al., 2018. O monitoramento através da pHmetria de24h é o método mais confiável para se diagnosticar a DRGE, pois avalia diferentes variáveis durante a realização do exame (tempo de pH menor que 4 e número de episódios de refluxo, por exemplo) a partir do incentivo ao paciente de consumir alimentos que possam provocar a manifestação dos sintomas associados a DRGE (RICHTER, 1996). Nesse contexto, também se deve comentar sobre a importância da realização da Endoscopia Digestiva Alta (EDA) a fim de diagnosticar os diferentes graus de gravidade da DRGE. Com intuito de padronizar e facilitar a comunicação entre os profissionais da saúde, estabeleceu-se a classificação endoscópica de Los Angeles, descrita atualmente como o melhor validado, reprodutível e preciso para este fim (SAMI & RAGUNATH, 2013). Este sistema de classificação teve sua forma final publicada em 1999, como pode ser verificado na tabela 1 (LUNDELL et al., 1999). EVIDÊNCIAS CONCLUSIVAS DE REFLUXO PATOLÓGICO EVIDÊNCIAS INCONCLUSIVAS EVIDÊNCIA ADJUNTA OU DE APOIO EVIDÊNCIA CONTRA REFLUXO PATOLÓGICO Esofagite graus C e D de LA Barrett longo Estenose esofágica péptica Esofagite graus A e B de LA Histopatologia (escores) Microscopia eletrônica (CII) Baixa impedância mucosa TEA > 6% TEA 4% - 6% 40 – 80 Episódios de refluxo Associação de sintomas de refluxo Episódios de refluxo > 80 Baixa IBNM e IOPII Baixo PSPWI Hipotensão JEG Hérnia hiatal Hipomotilidade esofágica TEA < 4% Menos de 40 episódios de refluxo ENDOSCOPIA pH ou pH - IMPEDÂNCIA MANOMETRIA 21 Tabela 1 – Classificação endoscópica de Los Angeles Grau A Uma ou mais erosões menores do que 5mm Grau B Uma ou mais erosões maiores do que 5 mm em sua maior extensão, não contínuas Grau C Erosões contínuas (ou convergentes) entre os ápices de pelo menos 2 pregas, envolvendo menos que 75% do órgão Grau D Erosões ocupando pelo menos 75% da circunferência do órgão Fonte: LUNDELL et al., 1999. 1.1.2 Aspectos anatômicos e o diafragma crural O esôfago estende-se desde a faringe até as vértebras C5-C6, na junção esofagogástrica (BOYCE & BOYCE Jr., 1999). Trata-se de um órgão condutor oco formado por camadas mucosa e muscular (tanto liso como estriado) (LOBATO et al., 2001). Tem como função conduzir o alimento da cavidade oral até o estômago além de impedir o retorno do conteúdo gástrico do estômago, contando para isso com a importante participação do esfíncter esofágico inferior (EEI) (BORJA, 2015). Na porção superior apresenta o esfíncter esofágico superior formado por tecido muscular estriado e já na parte inferior o esfíncter esofágico inferior, composto por tecido muscular liso (FIGUEIREDO & JACOB, 2002). Grande parte dos episódios de refluxo se dá durante relaxamento transitório espontâneo e não adequado do EEI em momentos não relacionados com a deglutição ou peristalse do esôfago (ORLANDO, 2008). A barreira anti-refluxo (BAR) é um componente fisiológico que impede o retorno do conteúdo gástrico para o esôfago. Esta barreira apresenta como elementos principais: EEI, o diafragma crural (DC), o ângulo de His e o ligamento freno-esofágico (VANDENPLAS et al., 2009). Destes, pode-se citar como de grande relevância a ação conjunta do EEI e do DC, pois exercem zona de alta pressão na BAR e, consequentemente, evitam ocorrer o contato do conteúdo do estômago com o esôfago (BOECKXSTAENS, 2005). O DC pode ser descrito como espécie de esfíncter externo na junção esofagogástrica (JEG) e dessa forma atua de maneira relevante juntamente a BAR, estando diretamente ligado a DRGE (MITTAL, 1988). Como se trata de um músculo estriado, sua função poderia ser modificada por treinamento muscular inspiratório (TMI) (SOUZA et al., 2013). Outros autores já verificaram o aumento da força do diafragma em outros contextos clínicos (BAILEY et al., 2010; KODRIC et al., 2013). Normalmente, as contrações do DC estão relacionadas com a respiração, por exemplo, na inspiração ocorre um aumento de 10 - 22 20mmHg na pressão da JEG e na inspiração profunda esse aumento é de 50 – 150 mmHg (MITTAL & BALABAN, 1997). Em 2013, Souza et al. realizaram em nosso laboratório um treinamento muscular inspiratório (TMI) em pacientes com DRGE. Avaliou-se através de manometria e pHmetria antes e após o TMI e constatou-se um aumento da pressão da JEG, diminuição da progressão proximal do refluxo gastroesfágico bem como uma redução dos sintomas da DRGE. Este estudo concluiu que alguns pacientes com DRGE podem apresentar falha do DC e que o TMI poderia ser utilizado como tratamento adicional aos métodos já estabelecidos. A pressão inspiratória na JEG é menor em pacientes com DRGE em comparação com indivíduos saudáveis, bem como os doentes não aumentam a pressão na junção mesmo durante esforço inspiratório (SOUZA et al., 2013; SOUZA et al., 2017). Estudos prévios já observaram que pacientes com esofagite apresentavam o DC crural mais fino e com deficiência funcional quando comparados ao grupo controle (sem esofagite), o que remete a uma possível atrofia do músculo esquelético desses pacientes. Os pesquisadores estudaram a porção direita do diafragma crural através de ultrassom endoscópico e verificaram uma diferença significativa entre as espessuras do DC dos pacientes com esofagite (0,37 ± 0,03 cm, n = 20) em comparação com os controles (0,49 ± 0,04 cm, n = 13) (p < 0,02). Estes resultados fundamentam a possibilidade da existência de uma deficiência muscular esquelética do diafragma crural de pacientes com DRGE, o que poderia indicar a necessidade da realização de exercícios físicos como possível forma de tratamento (SOUZA et al., 2017). Borja (2015) realizou estudo transversal em 404 pacientes atendidos pelo setor de endoscopia do Hospital Universitário Walter Cantídio. Buscou medir a pressão inspiratória máxima através do manovacuômetro e relacioná-la com sintomas associados a DRGE. Embora o déficit da pressão inspiratória máxima não tenha apresentado associação com esofagite, pirose e regurgitação, alguns sintomas atípicos como disfagia e excesso de muco na garganta ou nariz se associaram de forma significativa com o déficit da pressão inspiratória máxima. 23 1.2 Helicobacter pylori 1.2.1 Histórico e características morfológicas Em estudo publicado na revista Lancet, Marshall & Warren (1984) relataram a observação de microrganismos em formato de espiral ou bacilos recurvados em quase todos os pacientes com gastrite ou úlcera gástrica, fato que poderia ser possível explicação para a etiologia destas doenças. Em 1985, Marshall et al publicaram um trabalho que buscava cumprir o postulado de Koch. Marshall, que apresentava mucosa gástrica normal, ingeriu uma suspensão de H. pylori, fato que levou ao aparecimento de gastrite detectada através de análise histológica. A partir daí, descreveu-se a bactéria como causadora da gastrite aguda e propôs que outras desordens crônicas poderiam estar associadas ao microrganismo, como por exemplo a úlcera péptica (MARSHALL et al., 1985). Diante de tão importante contribuição científica para o mundo, Marshall e Warren foram agraciados com o prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 2005 (DER WEYDEN, ARMSTRONG & GREGORY, 2005). Etimologicamente, o termo Helicobacter pylori surgiu da raiz das palavras helix, que significa espiral, bacter que é definido como bastonete e por fim, pylorus que se refere à parte inferior do estômago (MURRAY et al., 2006). Trata-se de bactéria gram negativa, com formato encurvado, microaerófilo, medindo cerca de 0,5µm de largura por 3,0µm de comprimento e com formato cocóide em culturas antigas (MARSHALL & WARREN, 1984). A infecção por esta bactéria é considerada uma das mais comuns em seres humanos, podendo ser a responsável por desordens digestivas como a gastrite crônica, úlcera péptica e câncer gástrico (COELHO et al., 2018).1.2.2 Epidemiologia Com relação a epidemiologia, segundo estudo realizado por Eusebi et al. (2014) através de pesquisas em bases de dados (Medline e PubMed) no período de abril de 2013 a março de 2014, verificou-se que a prevalência da bactéria H. pylori pode ser considerada elevada na maioria dos países. Os autores relataram que aproximadamente um terço das populações norte americana e norte europeia estão infectadas enquanto a prevalência na América do Sul, Ásia, sul e leste da Europa é maior que 50%. Além disso, os autores verificaram prevalência mais baixa da infecção em indivíduos mais jovens, fato que pode sugerir redução das taxas de contaminação nas próximas décadas (EUSEBI et al., 2014). Hu, 24 Zhu e Lu (2017) também publicaram recentemente mapa ilustrando as prevalências da infecção por H. pylori ao redor do mundo, como pode ser verificado na figura 2. Figura 2: Mapa representando as prevalências de infecção por H. pylori em diferentes populações mundiais. Fonte: Hu, Zhu e Lu, 2017. Estudo realizado por Rodrigues et al. (2005) avaliou a prevalência de infecção por H. pylori em uma amostra randomizada de uma comunidade de baixa renda da cidade Fortaleza, Ceará. Nesta pesquisa, os autores obtiveram uma taxa de prevalência de 62,9% (384/610) e o valor da taxa de infecção aumentou de forma significativa com a idade (p < 0,0001), sendo 73,3% em voluntários de 11 a 20 anos e 87% naqueles com aproximadamente 60 anos. A pesquisa de H. pylori foi realizada usando 13C-uréia nos indivíduos com menos de 14 anos e e ELISA (Ensaio Imunoenzimático) para aqueles acima desta idade. No que se refere a transmissão, que apresenta influência direta na epidemiologia da doença, pode-se afirmar que a via exata de contaminação permanece indefinida. Apesar disso, estudos indicam que a transmissão pessoa a pessoa através do contato fecal-oral ou oral-oral são as mais prováveis. Além disso, pesquisadores também apontam para a transmissão ambiental, através de alimentos ou água contaminados. O conhecimento destas formas de propagação são de grande relevância pois podem nortear medidas profiláticas e de controle da 25 infecção (MLADENOVA & DURAZZO, 2018). 1.2.3 Diagnóstico e manifestações clínicas No que se refere ao diagnóstico da H. pylori, a EDA é uma técnica invasiva essencial para a coleta de biópsias para realização dos testes rápido da urease, histopatológico e cultura. Já com relação as técnicas não invasivas, pode-se mencionar o teste respiratório com ureia marcada com isótopos de carbono (13C e 14C), pesquisa de anticorpos no sangue através de testes sorológicos ou pesquisa de antígenos em amostras fecais (HpSA) (CUTLER, PRASAD & SANTOGADE, 1998; CHODOS et al., 1988). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é outra técnica que pode ser utilizada para diagnosticar a infecção, embora não seja utilizada na prática clínica, é frequentemente utilizada em instituições de pesquisa, pois evidencia através da análise genética a diferença de patogenicidade entre as cepas bacterianas. Tem como vantagens utilizar diferentes tipos de amostras para análise, como biópsia gástrica, suco gástrico, saliva e fezes. Além disso, requer pequenos fragmentos de amostra para identificar a presença das bactérias (GARZA- GONZÁLEZ et al., 2014). Como pontos desfavoráveis, pode-se citar o alto custo com equipamentos e reagentes necessários a realização da técnica. Com relação as manifestações patológicas, o H. pylori apresenta grande importância clínica na gênese de diferentes alterações gástricas, principalmente correlação com lesões precursoras do câncer gástrico (metaplasia intestinal e gastrite atrófica). Familiares de primeiro grau de pacientes com câncer gástrico tem maior risco de apresentar esta doença. Nesse sentido, Motta (2004) avaliou a presença de lesões precursoras do câncer e infecção por H. pylori em familiares de pacientes com câncer gástrico e em controles (sem história familiar). Segundo os resultados de Motta, a metaplasia incompleta (p = 0,001) e a displasia (p = 0,025) foram mais significantes no grupo com história familiar. O autor concluiu que voluntários com histórico familiar de câncer gástrico tem maior prevalência de alterações histopatológicas confinadas a presença do H. pylori (MOTTA, 2004). Além das já conhecidas alterações gástricas (gastrite, úlcera, câncer), pode-se mencionar o fato da H. pylori estar negativamente associada ao crescimento de crianças infectadas (ERDEMIR et al., 2015). Uma das hipóteses utilizadas para explicar esses achados, seria os efeitos da infecção bacteriana em substâncias como leptina e obestatina, o que sugere a influência da infecção bacteriana com a regulação da homeostase do apetite e da energia (ROMO-GONZÁLEZ et al., 2017). Revisão sistemática realizada por Nweneka & Prentice https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mladenova%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=29458239 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Durazzo%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=29458239 26 (2011) concluiu que os níveis de grelina circulante são significativamente menores em indivíduos infectados em comparação aos não infectados pelo H. pylori (NWENEKA & PRENTICE, 2011). Apesar destes achados, ainda permanecem muitas controvérsias sobre a etiologia do retardo do crescimento e maior número de estudos se faz necessário a fim de esclarecer estas hipóteses. 1.3 Grelina e leptina A grelina e a leptina podem ser consideradas como responsáveis, pelo menos em parte, pelo controle do apetite e consumo energético e a colonização por H. pylori pode interferir nessa regulação. François et al. (2011) realizaram um estudo verificando a influência da erradicação do H. pylori nos níveis séricos de leptina e grelina e constataram que os níveis de grelina acilada pós prandial foram quase seis vezes maiores após a erradicação do que quando comparado com os níveis pré-tratamento (p < 0,005) e os níveis medianos de leptina também aumentaram significativamente (p < 0,001). Assim, os autores puderam concluir que os níveis de leptina e grelina (associados a uma refeição) bem como o IMC (Índice de Massa Corporal) mudaram de forma significativa após tratamento contra H. pylori. Estes achados fundamentam a hipótese de que a infecção bacteriana influenciaria os níveis desses hormônios e consequentemente exerceria efeitos na morfometria corporal (FRANÇOIS et al., 2011). Além disso, alguns estudos apontam para a relação entre leptina e grelina com a DRGE ou mesmo com esôfago de Barrett. Rubenstein et al. (2013) realizou um estudo caso controle e verificou que a leptina foi associada positivamente ao esôfago de Barrett, principalmente em homens com DRGE. Por outro lado, observaram que a grelina foi inversamente associada a DRGE e positivamente associada ao esôfago de Barrett. Assim, o papel da leptina e grelina pode ser de relevância em estudos que envolvam tanto a DRGE como infecções por H. pylori. 1.3.1 Grelina A grelina é um hormônio gastrointestinal que foi identificado pela primeira vez no estômago de ratos por Kojima et al. (1999). Recebeu este nome devido a sua atividade de promover o aumento da secreção do Hormônio do Crescimento, ghre tem raiz Proto-Indo- Europeu, da palavra “crescer” (KOJIMA et al. 1999). A grelina é produzida de forma predominante pelo estômago, entretanto alguns 27 estudos apontam para produção de quantidades inferiores pelo intestino, hipotálamo, hipófise, pâncreas, pulmão, rim e placenta (OSAWA, 2008). Se atribui alguns efeitos fisiológicos a este hormônio, como por exemplo, secreção do hormônio de crescimento, estímulo do apetite, adiposidade, resposta a fome dentre outros (HOUGLAND, 2019). Este hormônio apresenta 28 aminoácidos distribuídos em sequência e é produzido principalmente nas glândulas oxínticas do estômago. Inicialmente,a grelina é expressa como um polipeptídeo que sofre vários processamentos até chegar ao estágio final. A precursora preprogrelina apresenta um peptídeo sinal de secreção que é retirado por uma peptidase de sinal (do retículo endoplasmático) para produzir a progrelina, Em seguida, a progrelina é modificada com ácido octanóico pela enzima GOAT (Grelina O-aciltransferase) formando a acyl progrelina que passa finalmente por uma clivagem proteolítica formando a grelina acylada madura com 28 aminoácidos. Como pode ser verificado na figura 3, a grelina acylada pode sofrer ação de esterases circulantes transformando-se em desacyl grelina (HOUGLAND, 2019; KOJIMA et al. 1999). Figura 3: Processo de formação da grelina. Fonte: Hougland, 2019. 28 1.3.2 Leptina A palavra leptina vem do termo grego leptos, que significa “fina”, oriundo do gene lep (localizado no cromossomo 7) responsável pela transcrição de um peptídeo de 167 aminoácidos e peso molecular de 16kD (DENVER, BONETT & BOORSE, 2011; MUNZBERG & MORRISON, 2015). Trata-se de peptídeo produzido principalmente pelo tecido adiposo e distribuído para a circulação. Apresenta relação diretamente proporcional com o tecido adiposo e sinaliza ao cérebro sobre o armazenamento energético (SCHWARTZ et al., 1996; MUNZBERG & MORRISON, 2015). O jejum reduz os níveis séricos de leptina enquanto a alimentação e obesidade aumentam (AHIMA et al., 1996). A leptina age sobre as células neurossecretoras anorexígenas provocando a secreção do α-MSH (hormônio estimulante de melanócitos), que atua nos neurônios de segunda ordem (localizados no hipotálamo) estimulando a produção de sinais de redução da ingestão e aumento da metabolização. Leptina também tem atuação sobre células orexígenas inibindo o NPY (neuropeptídeo Y), reduzindo o sinal de aumento da ingestão (GUYTON & HALL, 2011). 29 1.4 Justificativa Nosso grupo de pesquisa verificou redução da espessura do ramo direito do DC em pacientes com esofagite de refluxo quando comparado ao grupo controle (sem esofagite). Este estudo foi realizado através da análise de imagens estáticas obtidas através da ecoendoscopia (SOUZA et al. 2017). Além disso, observamos aumento da pressão da JEG bem como redução da progressão proximal do refluxo e dos sintomas associados em pacientes com DRGE após treinamento muscular inspiratório (SOUZA et al. 2013). Esses achados sustentam a hipótese da existência de possível deficiência muscular esquelética no DC destes pacientes. Yang et al (2019) verificaram a leptina ser capaz de induzir perda muscular em um modelo de carcinoma hepatocelular em zebrafish, apontando para a sinalização da leptina como potencial novo alvo terapêutico para pacientes com câncer e perda muscular. Este achado despertou interesse do nosso grupo para pesquisar a possível relação entre leptina e perda muscular do DC em pacientes com DRGE. Além disso, estudos prévios já apontaram para relação entre os hormônios leptina e grelina com DRGE e esôfago de Barrett (RUBENSTEIN et al., 2013). Por tratar-se de pesquisa inovadora onde pouco se conhece a respeito da fisiopatologia da falha do diafragma crural, nosso grupo também buscou estudar a possível influência da infecção por H. pylori em um grupo de pacientes com DRGE. Fundamentando- se para isso justamente na já conhecida relação entre hormônios leptina e grelina e infecção bacteriana (ROMO-GONZÁLEZ et al., 2017; MANTERO et al., 2018; ERDEMIR et al., 2015). Logo, o presente estudo buscou determinar os níveis plasmáticos de leptina e grelina bem como avaliar a espessura e ecogenicidade do ramo direito do diafragma crural em pacientes com DRGE infectados e não infectados pelo H. pylori. 30 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivos Gerais Avaliar a espessura e ecogenicidade do ramo direito do diafragma crural em pacientes com Doença do Refluxo Gastroesfágico (DRGE) com e sem infecção por Helicobacter pylori. Medir os níveis plasmáticos de grelina e leptina em pacientes com Doença do Refluxo Gastroesfágico (DRGE) com e sem infecção por Helicobacter pylori. 2.2 Objetivos Específicos Medir a espessura da porção direita do diafragma crural em indivíduos com DRGE com e sem infecção por Helicobacter pylori. Medir a ecogenicidade da porção direita do diafragma crural em indivíduos com DRGE com e sem infecção por Helicobacter pylori. Verificar os níveis plasmáticos de leptina em pacientes com DRGE com e sem infecção pelo H. pylori. Verificar os níveis plasmáticos de grelina em pacientes com DRGE com e sem infecção pelo H. pylori. Verificar se existe associação entre o gene cagA da bactéria H. pylori com a espessura do ramo direito do diafragma crural. Correlacionar os níveis hormonais de leptina e grelina com as medidas de espessura do ramo direito do diafragma crural em pacientes com DRGE. 31 3 METODOLOGIA 3.1 Delineamento, local e período de estudo Trata-se de um estudo transversal, onde os pacientes foram recrutados no setor de endoscopias e no ambulatório de cirurgia digestiva do Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC) e encaminhados para o Laboratório de Gastroenterologia da Universidade Federal do Ceará (UFC), no Centro de Biomedicina, local onde foi realizado o atendimento inicial destes pacientes. O estudo aconteceu no período de maio de 2017 a novembro de 2018. 3.2 Aspectos éticos A pesquisa foi submetida à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa em Humanos da Universidade Federal do Ceará (UFC), de acordo com as determinações éticas da Resolução do Conselho Nacional de Saúde sobre pesquisas com seres humanos (CNS, 2013), tendo sido aprovada sob o número do parecer 2.048.803. 3.3 Critérios de inclusão e exclusão Foram incluídos pacientes de ambos os sexos, de 23 a 74 anos, com ou sem esofagite de refluxo graus A, B, C ou D (Classificação endoscópica de Los Angeles) desde que apresentassem pHmetria de 24 horas com fração de tempo total de refluxo (%) maior ou igual a 4,2. Foram excluídos pacientes com: Hipotireoidismo não controlado; grávidas (KASAI et al., 2016); portadores de diabetes mellitus (KASAI et al., 2016); obesidade (IMC > 35); distúrbio cognitivo ou psiquiátrico que dificultasse a colaboração com o estudo; insuficiência renal ou hepática (KASAI et al., 2016); estado caquético incluindo câncer avançado (KASAI et al., 2016); tivesse realizado tratamento contra H. pylori há menos de seis meses do estudo e fizesse uso de corticoides orais. 3.4 Recrutamento dos pacientes Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Cirurgia Digestiva e no Setor de Endoscopia do Hospital Universitário Walter Cantídio, Universidade Federal do Ceará. 32 Inicialmente, aplicou-se um questionário de avaliação clínica padronizada contendo questões sobre doenças prévias, medicamentos e hábitos de vida, além de questões envolvendo dispepsia/constipação – Anexo B; em seguida, aplicou-se o Questionário de Diagnóstico do Refluxo (RDQ) – Anexo C (SHAW et al., 2001) e por fim o questionário de Índice de Sintomas do Refluxo laringo-faríngeo (RSI) – Anexo D (BELAVISKY, POSTMA, e KOUFMAN, 2002). Caso o paciente apresentasse esofagite erosiva (graus A, B, C ou D) verificado em laudo endoscópico ou sintomas típicos da DRGE (pirose/regurgitação), este era convidado a participar da pesquisa e, caso aceitasse, assinava o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). Neste primeiro momento, caso o paciente estivesse fazendo uso de: Inibidores da bomba de prótons, bloqueadores do receptor H2 (histamina) e medicamentos que alterem diretamente a motilidade gástrica, por exemplo, domperidona e metoclopramida, se solicitava a suspensão do uso do medicamento para posterior realizaçãodos exames de pHmetria e EDA. Após este contato inicial, era agendado um dia para realização da pHmetria de 24horas e apenas aqueles que apresentassem uma fração de tempo total de refluxo (%) maior ou igual a 4,2 eram incluídos no estudo. 3.5 População Os pacientes com DRGE foram divididos em dois grupos, de acordo com os resultados do histopatológico e urease: Helicobacter pylori positivo (9 pacientes) ou Helicobacter pylori negativo (21 pacientes). O voluntário foi considerado positivo quando apresentou achados de positividade pelo estudo histopatológico (presença da bactéria nas lâminas analisadas microscopicamente) e mudança de cor no teste da urease. 3.6 pHmetria de 24 horas Para a avaliação do refluxo gastroesofágico utilizou-se o aparelho de impedância multicanal intraluminal AL-4 – Alacer Biomédica, São Paulo ou aparelho Ohmega System, MMS-Medical Meansurement Systems B.V., Holanda. Cada aparelho possuía sua sonda específica contendo sensor de pH e antes de cada exame procedeu-se a calibração do equipamento seguindo as instruções conforme software do equipamento. 33 Após localização do EEI por manometria esofágica de alta resolução, realizou-se a sondagem do paciente com o cateter de impedanciopHmetria por via transnasal, sob anestesia tópica, de forma que o sensor de pH fosse posicionado 5 cm acima do bordo superior do esfíncter esofágico inferior. Depois de fixada a sonda, marcava-se o tempo e o exame era iniciado com o objetivo de verificar o conteúdo refluído do estômago para o esôfago durante aproximadamente 24 horas. Em seguida, eram prestadas as devidas orientações ao paciente (recomendava-se que realizasse pelo menos 4 refeições durante o período do exame) e entregue um diário, onde o voluntário deveria anotar os horários, quantidade e descrição dos alimentos ingeridos. Por fim, recomendava-se ao paciente que anotasse os horários de mudanças de decúbito e quaisquer sintomas que por ventura pudesse sentir durante o período do exame. No dia seguinte, o voluntário comparecia ao laboratório de Gastroenterologia para retirada da sonda. Os exames eram gravados no coletor portátil e os valores medidos transferidos e armazenados em um banco de dados para posterior análise. 3.7 Coleta de sangue Após confirmação da DRGE través da pHmetria de 24h, o paciente foi convidado a comparecer a Unidade de Pesquisa Clínica da Universidade Federal do Ceará a fim de realizar a coleta de sangue para dosagem de leptina e grelina. O paciente comparecia ao laboratório em dia e horário previamente agendados e com tempo médio de jejum de 12 horas, sendo a coleta realizada no período da manhã. Na sala de coleta, iniciava-se o procedimento de coleta das amostras de sangue em tubos devidamente etiquetados contendo EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid). Em seguida, os tubos eram homogeneizados e submetidos a centrifugação a 2500 RCF, por 15 minutos a 4°C para a retirada do sobrenadante (segundo orientações da bula do kit de ELISA Millipore Corporation® para dosagem dos analitos de interesse). O material biológico foi mantido em gelo durante todo transporte e armazenado em tubos tipo eppendorf® até que fosse estocado em freezer a -80°C para posterior análise. 34 3.8 Endoscopia Digestiva Alta e coleta de biópsias A coleta de biópsias foi realizada a partir da padronização de um mapa que foi seguido durante toda a realização deste estudo (modificação protocolo de Dixon et al. 1996). Foram retirados cinco fragmentos de biópsia para análise histopatólogica (antro pequena curvatura, antro grande curvatura, incisura angular, corpo pequena curvatura e corpo grande curvatura), dois para PCR (antro pequena curvatura e corpo pequena curvatura) e um para urease (antro grande curvatura). Com relação a urease, a biópsia coletada era imediatamente adicionada em tubo contendo ureia e indicador de pH e a leitura da coloração era feita após 24h. Considerou-se positivo os casos onde houve mudança da cor amarela para vermelho e negativo quando o líquido permanecia amarelo (DAS et al., 1987). 3.9 Estudo Histopatológico As biópsias gástricas (antro pequena curvatura – AP; antro grande curvatura – AG; incisura algular; corpo pequena curvatura – CP; corpo grande curvatura - CG) coletadas durante a endoscopia foram conservadas em formol até que fossem encaminhadas e transportadas para o setor de patologia da Universidade Federal do Ceará. Todas as lâminas foram analisadas de forma cega e por um único médico patologista (L. M. F.) do setor de Patologia da Universidade Federal do Ceará. A coloração utilizada em todas as lâminas foi a Hematoxilina-Eosina (H&E). Foram avaliados os seguintes critérios no estudo microscópico: Inflamação (células mononucleares), atividade inflamatória (neutrófilos), metaplasia, atrofia e presença ou não de Helicobacter pylori. Atribuiu-se escores de acordo com a intensidade dos achados, a saber: Normal (0), leve (1), moderado (2) e marcado (3). Os critérios avaliados no presente estudo estão de acordo com protocolo de Dixon et al. (1996), como pode ser verificado na figura 4. 35 Figura 4: Atualização do sistema Sydney de classificação e gradiente de gastrite. Fonte: DIXON et al., 1996. 3.10 Ecoendoscopia: Medida da espessura e da ecogenicidade do diafragma crural Os pacientes foram submetidos a realização de uma ecoendoscopia no Serviço de Endoscopia do Hospital Universitário Walter Cantídio e com o mesmo avaliador em todas os procedimentos (M. A. N. S.). Foi utilizado equipamento ecoendoscópio com transdutor radial (SU-8000; Fujifilm Corporation, Tóquio, Japão) com 11 mm de diâmetro. Após a intubação esofágica, o transdutor de ultrassom foi mantido na junção esofagogástrica de forma a se visualizar a porção crural do diafragma entre a parede do esôfago e a aorta. O DC foi identificado anterior a aorta e em imagens estáticas de seções transversais ao longo do comprimento crus direito para definir a “espessura” do diafragma crural de cada indivíduo (figura 5), em duas imagens captadas durante a expiração e duas na inspiração (protocolo modificado de NOBRE, 2014). As imagens endoscópicas foram analisadas por um outro avaliador (M. C. A.), que não saiba a qual grupo correspondia cada uma das imagens, num ensaio cego. Foi utilizado como ferramenta de medida de comprimento um software de análise DICOM 36 (RadiAnt® Viewer 64bit) e considerada a média de três medições, em pontos aproximadamente equidistantes, como pode ser verificado na figura 5 (protocolo modificado de NOBRE, 2014). Figura 5: Medida da espessura da porção direita do diafragma crural em imagem de secção transversal captada por ecoendoscopia. Fonte: Própria, 2019. A ecogenicidade foi definida como a média da intensidade da escala de cinza em todos os pixels da região de interesse (protocolo modificado de NOBRE, 2014). A análise foi realizada com as mesmas imagens utilizadas para medir a espessura tanto na inspiração como na expiração do ramo direito do diafragma crural e utilizando um programa de processamento de imagens, o Image J. Este programa é baseado no sistema de processamento de imagens Java inspirado NHI Image, e tem sido aplicado em diferentes tipos de análises inclusive estudos envolvendo neurociência (IMAGE J.NET, 2019; AAKALU et al., 2001). A medida da ecogenicidade foi realizada em aproximadamente toda a extensão do diafragma crural captada pela imagem (ROI – Region of interest), e apresentava área variável de acordo com cada paciente. Utilizou-se ferramenta “freehand selections” do programa Image J, a fim de cobrir toda área referente ao músculo e assim obter a melhor representatividade possível das médias da intensidade da escala cinza em todos os pixels daárea de interesse. Quanto menor o valor numérico mais escuro na escala de cinza, e quanto 37 maior, mais claro. A média dos elementos era então calculada e definida no presente estudo como sendo o grau de ecogenicidade do ramo direito do diafragma crural (protocolo modificado de NOBRE, 2014). (Figura 6). Figura 6: Medida da ecogenicidade da porção direita do diafragma crural em imagem de secção transversal captada por ecoendoscopia. Fonte: Própria, 2019. 3.11 Extração de DNA e Reação em Cadeia da Polimerase para determinação de diferentes genótipos de H. pylori Foi realizada a extração de DNA (ácido desoxirribonucleico) de duas biópsias gástricas de cada paciente (antro pequena curvatura e corpo pequena curvatura) utilizando o Kit de extração QIAmp DNA Mini kit #51306 QUIAGEN, seguindo as normas e recomendações dos fabricantes no que se refere ao processamento, análise e interpretação dos resultados. As biópsias foram inicialmente processadas pela adição de tampões e trituradas em equipamento com lâminas rotativas Polytron®, para que em seguida as amostras fossem incubadas em banho-maria a 56° por 24h. No dia seguinte, após a digestão do material, procedeu-se a etapa de lise celular e por fim as eluições em coluna. O material foi analisado e quantificado no espectrofotômetro NanoDrop® a fim de avaliar a quantidade de DNA extraído. As amostras foram congeladas a -20°C até a realização da Reação em Cadeia da 38 Polimerase (método qualitativo). Após a etapa de extração, o DNA extraído foi amplificado em termociclador (My Cycler – Bio-Rad, USA®) pela ação da enzima Go Taq® Green Master Mix (Promega®) e da adição de primers específicos de interesse (tabela 2), sendo que as reações ocorreram de forma separada para cada marcador. As amostras amplificadas foram posteriormente adicionadas em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio, para realização da corrida eletroforética. Em seguida, o gel foi processado em transluminador com luz ultravioleta para visualização das bandas e interpretação dos resultados. Para controle de cada análise e para monitorar possíveis contaminações, utilizou-se um controle positivo e um negativo para cada marcador genético utilizado. Tabela 2: Primers utilizados na amplificação dos genótipos de interesse. PRIMER SEQUÊNCIA (5’ – 3’) PARES DE BASE REFERÊNCIA Cag A – F Cag A - R VacA s1 – F VacA s1 - R VacA s2 – F VacA s2 - R ATAATGCTAAATTAGACAACTTGAGCGA TTAGAATAATCAACAAACATCACGCCAT ATGGAAATACAACAAACACAC CTGCTTGAATGCGCCAAAC ATGGAAATACAACAAACACAC CTGCTTGAATGCGCCAAAC 298pb 259pb 286pb Covacci & Rappuoli, 1996 Atherton et al. 1995 Atherton et al. 1995 VacA m1 – F VacA m1 - R GTAATGGTGGTTTCAACACC TAATGAGATCTTGAGCGCT 290pb Atherton et al. 1995 VacAm2 – F VacAm2 - R GGAGCCCCAGGAAACATTG CATAACTAGCGCCTTGCAC 352pb Atherton et al. 1995 Fonte: Própria, 2019. 39 3.12 Dosagem plasmática dos hormônios grelina e leptina A avaliação hormonal foi realizada pelo ensaio ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsorção Ligado a Enzima). Utilizou-se os kits Human Ghrelin (Active) EZGRA-88K (Millipore Corporation®) para dosagem de grelina ativa; Human Ghrelin (Total) EZGRT-89K (Millipore Corporation®) para dosagem de grelina total; Human Leptin EZHL-80SK (Millipore Corporation®) para dosagem de leptina. Com relação dosagem da grelina ativa, realizou-se ensaio ELISA tipo sanduíche, com a detecção de moléculas de grelina ativa nas amostras de plasma dos pacientes através de reação com mistura de anticorpos de captura e detecção (1:1). Aguardava-se duas horas em um agitador de placas de microtitulação (temperatura ambiente) para que a reação ocorresse. Posteriormente, foi feita a lavagem dos poços da placa de ELISA e em seguida se realizou a adição da enzima peroxidase, que deveria ficar 30 minutos em agitador de placas. Após realizar as lavagens dos materiais não ligantes, adicionou-se o substrato 3,3’,5,5’-tetra-metilbenzidina e através da monitorização da cor, se observou a intensidade da reação para que se pudesse adicionar solução ácida e finalizar o ensaio. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro à 450nm. Na dosagem de grelina total se realizou um ensaio ELISA tipo sanduíche, com a detecção de moléculas de grelina nas formas ativa e des-octanoíl através de reação com mistura de anticorpos de captura e detecção (1:1). Em seguida, procedeu-se a realização dos mesmos passos já mencionados na dosagem da grelina ativa, com adição da enzima peroxidase e substrato bem como as lavagens dos materiais não ligantes. Por fim, após finalizar a reação com adição de solução ácida, a leitura da absorbância foi feita em espectrofotômetro à 450nm. Para a dosagem da leptina, o tipo de ensaio foi ELISA tipo sanduíche e procedeu-se a captura de moléculas de leptina a partir anticorpo policlonal de coelho anti- leptina humana imobilizado na placa de microtitulação. Aguardou-se por duas horas a ligação dos antígenos e anticorpos em agitador de placas a temperatura ambiente. Em seguida, lavou- se os poços da placa e se adicionou um anticorpo de detecção (30 minutos em agitador). Após remover a solução residual, se adicionou a enzima peroxidase (30 minutos no agitador de placas) seguida por lavagens e por fim, adição do substrato 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina. Através da monitorização da cor, se observou a intensidade da reação para que se pudesse adicionar solução ácida e finalizar o ensaio. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro à 450nm. 40 3.13 Análise estatística As variáveis quantitativas contínuas foram representadas por média ± desvio padrão e os escores dos questionários RDQ e RSI por mediana e intervalo interquartil. Na análise entre os grupos H. pylori positivo e negativo os dados foram analisados quanto a normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk e, caso apresentassem distribuição normal, foram avaliados pelo Teste t não pareado e os não paramétricos pelo teste Mann Whitney. Nas análises de associação para dados categóricos utilizou-se o Teste Exato de Fischer e para avaliar as correlações utilizou-se teste de Spearman. Foram considerados significativos os resultados com valor de p < 0,05. 41 4 Resultados 4.1 Pacientes com DRGE infectados e não infectados por H. pylori Inicialmente, foram recrutados 44 pacientes dos quais 13 foram excluídos por apresentar fração de tempo total de refluxo menor que 4,2 na pHmetria de 24 horas e 1 por extravio do exame de ecoendoscopia. Obtendo-se a amostra final de 30 voluntários, sendo 9 do grupo H. pylori positivo e 21 do H. pylori negativo, como pode ser verificado esquematicamente pelo fluxograma abaixo. Figura 7: Fluxograma da seleção dos pacientes e divisão dos grupos do estudo. Fonte: Própria, 2019. 4.1.1 Dados demográficos O grupo H. pylori positivo era composto por 9 voluntários (4 homens e 5 mulheres) com média de idade de 41,44 ± 10,77 anos (média ± desvio padrão) e IMC de 28,82 ± 3,43 Kg/m2. Já o grupo negativo tinha 21 pacientes (9 homens e 12 mulheres) com idade média de 48,62 ± 15, 56 anos e IMC de 27,36 ± 2,45 Kg/m2. Estes achados demonstram 42 a semelhança entre os grupos no que se refere a distribuição por sexo, idade, peso, altura e IMC, como pode ser verificado na tabela 3. Tabela 3: Perfil demográfico dos pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori. GRUPOS GRUPO H. pylori POSITIVO (n = 9) GRUPO H. pylori NEGATIVO (n = 21) p Gênero (masculino/feminino) 04/05 09/12 Idade(anos) 41,44 ± 10,77 48,62 ± 15,56 0,220 Peso (Kg) 71,50 ± 9,45 70,57 ± 13,35 0,852 Altura (metros) 1,58 ± 0,07 1,60 ± 0,13 0,590 IMC (Kg/m2) 28,82 ± 3,43 27,36 ± 2,45 0,196 Fonte: Própria, 2019. Legenda: Os dados estão representados por média ± desvio padrão, exceto para a variável gênero apresentada em número absoluto. Teste t não pareado. 4.1.2 Achados endoscópicos e sintomas dos pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori A comparação das variáveis endoscópicas nos grupos H. pylori positivo e negativo não apresentaram diferença (p = 0,795), tabela 4. A mediana dos escores do questionário de sintomas de refluxo (RDQ) no grupo positivo foi de 37 (7,5 – 45) e no negativo de 21 (11,5 – 29,5), não apresentando diferença significativa. Com relação ao questionário de sintomas de refluxo laringo-faríngeo (RSI), obteve-se mediana de 21 (5 – 30) no grupo positivo e 16 (9 – 24) no negativo, não sendo considerada diferença significativa, como pode ser observado na tabela 4. 43 Tabela 4: Achados endoscópicos e escores dos questionários RDQ e RSI nos 30 pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori VARIÁVEIS GRUPO H. pylori POSITIVO (n=9) GRUPO H. pylori NEGATIVO (n=21) p Endoscopia Digestiva Alta 0,795a Sem esofagite 3 (33,33%) 3 (14,29%) Esofagite não erosiva 0 2 (9,52%) Grau A1 0 3 (14,29%) Grau B1 3 (33,33%) 6 (28,57%) Grau C1 2 (22,22%) 5 (23,81%) Grau D1 0 1 (4,76%) Esôfago de Barrett 1 (11,11%) 1 (4,76%) Questionários RDQ2 (Mediana e IIQ) 37 (7,5 – 45) 21 (11,5 – 29,5) 0,319b RSI3 (Mediana e IIQ) 21 (5 – 30) 16 (9 – 24) 0,635b Fonte: Própria, 2019. Legenda: 1 – Classificação de Los Angeles; 2 – Questionário de Diagnóstico do Refluxo (RDQ); 3 – Índice de Sintomas do Refluxo laringo-faríngeo (RSI). IIQ: Intervalo interquartil. Teste exato de Fischera e teste Mann Whitneyb. 4.1.3 pHmetria de 24h e tratamento prévio contra H. pylori A média da fração de tempo total (%) de refluxo detectado pela pHmetria de 24h no grupo positivo foi de 11,63 ± 4,92 e no grupo negativo de 10,01 ± 4,67, não se verificando diferença entre os grupos (p = 0,399). Com relação ao tratamento prévio contra H. pylori, foi perguntado aos voluntários se tinham realizado tratamento contra a bactéria antes de iniciar o estudo. No grupo H. pylori positivo 4 pacientes já haviam sido tratados e 5 não. No grupo negativo, 13 foram tratados e 8 não. Segundo o teste Exato de Fischer não houve diferença significativa 44 entre os grupos (p = 0,443), como se observa na tabela 5. Assim, 17 pacientes já haviam sido tratados previamente (4 H. pylori positivo; 13 H. pylori negativo) e 5 eram positivos e nunca haviam sido tratados. Logo, 22 indivíduos tiveram infecção no passado ou no momento de realização da pesquisa, correspondendo a uma prevalência de 73,3% de infecção por H. pylori. Tabela 5: pHmetria de 24h e tratamento prévio contra H. pylori nos 30 voluntários com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori. VARIÁVEIS GRUPO H. pylori POSITIVO (n=9) GRUPO H. pylori NEGATIVO (n=21) p pHmetria 24h (fração tempo total - %) 11,63 ± 4,92 10,01 ± 4,67 0,399a TRATAMENTO H. pylori 0,443b Sim 4 (44,44%) 13 (61,90%) Não 5 (55,56%) 8 (38,10) Fonte: Própria, 2019. Legenda: Fração de tempo total está representada por média ± desvio padrão. Os dados de tratamento contra H. pylori estão representados por números absolutos e porcentagens. Testes t não pareadoa e Exato de Fischerb. 4.1.4 Dispepsia e constipação intestinal No que se refere ao empachamento, os nove (100%) pacientes do grupo positivo referiram empachamento enquanto 12 (57,14%) do grupo negativo não apresentavam este sintoma, o que representa uma diferença significativa entre os grupos, p = 0,004. Já com relação a constipação intestinal, 3 (33,33%) do grupo positivo apresentavam este sintoma e 6 (66,67%) não, enquanto 3 (14,29%) do grupo negativo eram constipados e 18 (85,71%) não (p =0,329), como deve ser verificado na tabela 6. 45 Tabela 6: Caracterização da dispepsia e constipação intestinal nos 30 voluntários com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori. VARIÁVEIS GRUPO H. pylori POSITIVO (n=9) GRUPO H. pylori NEGATIVO (n=21) p EMPACHAMENTO 0,004 Sim 9 (100%) 9 (42,86%) Não 0 (0%) 12 (57,14%) Frequência empachamento > 0,99 < 1 vez/sem 0 0 1 vez/sem 1 (11,11%) 1 (4,76%) 2-4 vezes/sem 3 (33,33%) 2 (9,52%) 5-7 vezes/sem 5 (55,56%) 6 (28,57%) CONSTIPAÇÃO 0,329 Sim 3 (33,33%) 3 (14,29%) Não 6 (66,67%) 18 (85,71%) Frequência evacuação 0,07 < 1vez/sem 1 (11,11%) 0 1vez/sem 2 (22,22%) 1 (4,76%) 2 vezes/sem 1 (11,11%) 1 (4,76%) 3 vezes/sem 0 0 >3 vezes/sem 5 (55,56%) 19 (90,48%) Fonte: Própria, 2019. Legenda: Os dados estão representados por números absolutos e as respectivas porcentagens. Teste Exato de Fischer. 46 4.1.5 Achados histopatológicos Com relação a inflamação (células mononucleares), existe diferença significativa entre os grupos H. pylori positivo e negativo (p = 0,004) de acordo com a intensidade dos achados. No grupo positivo 4 pacientes apresentaram inflamação leve e 5 moderada, enquanto no grupo negativo 20 tinham inflamação leve e 1 moderada. No que se refere a atividade (neutrófilos), a diferença entre os grupos também foi importante (p < 0,01), com 3 pacientes apresentando atividade leve, 4 moderada e 2 marcada no grupo positivo. Já no negativo todos os pacientes (21) tinham atividade normal. Na metaplasia intestinal, 2 pacientes do grupo negativo e 2 do positivo apresentaram metaplasia leve, sem diferença significativa (p = 0,563). Com relação a atrofia, 1 voluntário do grupo negativo e 1 do positivo mostraram atrofia leve, diferença não significativa (p = 0,517). Tabela 7: Caracterização da inflamação e atividade inflamatória em pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados e não infectados por H. pylori. VARIÁVEIS GRUPO H. pylori positivo (n = 9) GRUPO H. pylori negativo (n = 21) p INFLAMAÇÃO 0,004 Normal 0 0 Leve 4 20 Moderado 5 1 Marcado 0 0 ATIVIDADE < 0,01 Normal 0 21 Leve 3 0 Moderado 4 0 Marcado 2 0 Fonte: Própria, 2019. Os dados estão representados por números absolutos. Teste de Fischer. 47 4.1.6 Estudo histopatológico, urease e marcadores moleculares de pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados por H. pylori De acordo com a tabela 8, pode-se verificar que os resultados da patologia e urease corroboram com relação a presença de H. pylori. Os demais 21 pacientes foram negativos em ambos os métodos. Já com relação ao genótipo do gene cagA, 5 pacientes foram positivos para a presença deste gene e os demais 25 foram negativos. A expressão do genótipo do gene vacA foi a seguinte: (3) vacAs1m1, (1) vacAs2m2, (1) vacAs1s2m1, (3) vacAs1m1m2, (1) vacA s1s2m1m2. Os demais 21 pacientes foram negativos para o gene vacA nos alelos estudados (s1, s2, m1 e m2). Tabela 8: Resultados do histopatológico, urease e marcadores moleculares dos nove pacientes com Doença do Refluxo Gastroesofágico (DRGE) infectados com H. pylori. PCR Paciente Patologia Urease cagA vacAs1 vacAs2 vacAm1 vacAm2 APS POS POS POS POS NEG POS NEG VBC POS POS NEG NEG POS NEG POS CWSF POS POS NEG POS POS POS NEG ALO POS POS NEG POS NEG POS POS FIIF POS POS POS POS NEG POS NEG MLRR POS POS POS POS NEG POS NEG JWSA POS POS POS POS NEG POS POS AMMM POS POS NEG POS POS POS POS FQR POS POS POS POS NEG POS POS Fonte: Própria, 2019. PCR: Reação em Cadeia da Polimerase.
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