2021-dis-cssilva

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
FACULDADE DE MEDICINA 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAROLINY SOARES SILVA 
 
 
 
CARACTERIZAÇÃO ECOEPIDEMIOLÓGICA DE MICOBACTÉRIAS EM 
TRIATOMÍNEOS COLETADOS NO MUNICÍPIO DE SOBRAL-CEARÁ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2021 
 
 
CAROLINY SOARES SILVA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CARACTERIZAÇÃO ECOEPIDEMIOLÓGICA DE MICOBACTÉRIAS EM 
TRIATOMÍNEOS COLETADOS NO MUNICÍPIO DE SOBRAL-CEARÁ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de 
Pós-Graduação em Patologia da 
Faculdade de Medicina da Universidade 
Federal do Ceará, como requisito parcial à 
obtenção do título de Mestre em Patologia. 
Área de concentração: doenças 
infectoparasitárias 
Orientadora: Profª. Dr. Cristiane Cunha 
Frota 
Coorientadora: Dra. Luana Nepomuceno 
Gondim Costa Lima 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 FORTALEZA 
2021 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CAROLINY SOARES SILVA 
 
 
CARACTERIZAÇÃO ECOEPIDEMIOLÓGICA DE MICOBACTÉRIAS EM 
TRIATOMÍNEOS COLETADOS NO MUNICÍPIO DE SOBRAL-CEARÁ 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de 
Pós-Graduação em Patologia da 
Faculdade de Medicina da Universidade 
Federal do Ceará, como requisito parcial à 
obtenção do título de Mestre em Patologia. 
Área de concentração: doenças 
infectoparasitárias 
 
Aprovada em: ___/___/_____ 
 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
_______________________________________ 
Prof. Dra. Cristiane Cunha Frota (Orientadora) 
Universidade Federal do Ceará 
 
_______________________________________ 
Profa. Dra Karla Valéria Batista Lima 
Instituto Evandro Chagas e Universidade Estadual do Pará 
 
_______________________________________ 
Profa. Dra. Rosa Lívia Freitas de Almeida 
Universidade de Fortaleza 
 
_______________________________________ 
Profa. Dra. Maria Jania Teixeira 
Universidade Federal do Ceará 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Primeiramente, gostaria de agradecer a Deus, por toda bondade, proteção 
e ajuda que me foi concedida. 
À minha avó Ana, por todo amor e apoio. Por todos os dias das mães e 
pais. Por todas as idas para me buscar na escola. Por toda felicidade em cada 
conquista. Obrigada por me ajudar a ser a pessoa que sou hoje. 
Aos meus pais, Dora Soares e Rogério, por todo o amor, carinho, 
compreensão e apoio diário. Obrigada por todo o apoio dado, mesmo nos momentos 
mais difíceis. Não existem palavras que expressem toda a gratidão que sinto. 
Ao Gabriel, meu melhor amigo e irmão. Obrigada por ter me apoiado em 
todos os momentos e por nunca me deixar só. Te amo. Espero um dia ter metade da 
sabedoria que você tem. 
Agradeço a minha orientadora Cristiane Cunha pela oportunidade, por toda 
a paciência, pelos conselhos e por todos os ensinamentos nesses cinco anos. Sempre 
serei grata pela oportunidade de trabalhar com a senhora. 
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 
(CAPES) por ter me oferecido uma bolsa no Programa de Pós graduação, que em 
ajudou durante a minha formação. 
À Luana Lima, Karla Valéria e a todos do Instituto Evandro Chagas. 
Obrigada pela ajuda e ensinamentos que foram essenciais para o meu trabalho. 
À Cynara Carvalho e os profissionais do Centro de controle de zoonoses 
de Sobral, pela atenção, receptividade e cuidado com o trabalho que estava sendo 
executado. 
Aos meus colegas do Laboratório de Micobactérias: Lucas, Susy, Paulo 
Rafael, Soraya, Socorro e Thales Candido, por todo o companheirismo e amizade que 
pude construir com cada um de vocês. 
À Gabriela Valentim, que continua me acompanhando, sempre me 
motivando com o seu amor e muita paciência. Obrigada por me ajudar sempre. 
As meninas: Jennifer, Andreia, Renata e Bianca, por toda a amizade e por 
tornarem mais leves os dias mais complicados. Amo vocês. 
Por fim, ao Lupin por todo amor e por estar sempre perto de mim, sendo 
um grande companheiro. 
 
 
RESUMO 
 
INTRODUÇÃO: A família Mycobacteriaceae é formada pelo gênero Mycobacterium e 
mais quatro novos gêneros. Destacam-se as espécies do complexo Mycobacterium 
tuberculosis (CMTB) causadoras da tuberculose (TB), as espécies coletivamente 
chamadas de Micobactérias Não tuberculosas (MNT) causadoras de micobacterioses 
e o agente causador da hanseníase, M. leprae. Estudos realizados em Sobral, Ceará, 
encontraram dentro do perímetro urbano várias espécies de triatomíneos. A 
microbiota intestinal destes insetos é dinâmica e variada, incluindo as espécies do 
gênero Mycobacterium. OBJETIVO: Identificar a presença de micobactérias em 
hemípteros triatomíneos encontrados em residências da área urbana e rural do 
município de Sobral, Ceará. METODOLOGIA: Os triatomíneos utilizados neste estudo 
foram fornecidos pelo Centro de Controle de Zoonoses de Sobral. Os insetos foram 
capturados no período de janeiro de 2019 a abril de 2020 e enviados aos Postos de 
Informação de Triatomíneo instalados nos postos de saúde do município, para 
caracterização taxonômica e armazenamento. Foi realizada a extração do DNA 
genômico dos triatomíneos coletados, seguido da identificação das micobactérias pela 
técnica PRA-hsp65. As amostras de DNA dos triatomíneos PRA-hsp65 positivas 
foram sequenciadas e depois analisadas filogeneticamente. Os endereços dos 
triatomíneos e dos casos de TB diagnosticados em 2018-2019 foram analisados 
espacialmente. RESULTADOS: 167 amostras de triatomíneos foram coletadas, 
destes 41,9% (70/167) foram PRA-hsp65 positivas para o gênero Mycobacterium. 
Foram obtidas sequências de 70% (49/70) das amostras, sendo identificados 12 
gêneros bacterianos, incluindo 9 amostras como do CMTB. A análise espacial 
encontrou dois aglomerados significantes de triatomíneos e um aglomerado dos casos 
de TB. A interpolação espacial indicou tendencia de alto risco de aglomeração 
espacial na sede do município para triatomíneos e casos de TB. CONCLUSÃO: Este 
estudo é o primeiro a descrever o achado de espécies do CMTB em triatomíneos no 
peridomicílio urbano. O conjunto das informações deste estudo poderão ser 
empregados para entender a possível transmissão de micobactérias por triatomíneos, 
e assim ajudar a estabelecer medidas adequadas para a prevenção de 
micobacterioses. 
Palavras-chave: Triatominae. Mycobacterium. Tuberculose. 
 
 
ABSTRACT 
 
INTRODUCTION: The Mycobacteriaceae family is formed by the genus 
Mycobacterium and four new genera. Noteworthy are the species of the 
Mycobacterium tuberculosis complex (CMTB) that cause tuberculosis (TB), the 
species collectively called Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM) that cause 
mycobacteriosis, and the causative agent of leprosy, M. leprae. Studies conducted in 
Sobral, Ceará, found several species of triatomines within the urban perimeter. The 
intestinal microbiota of these insects is dynamic and diverse, including species of the 
genus Mycobacterium. OBJECTIVE: To identify the presence of mycobacteria in 
triatomine hemiptera found in homes of the urban and rural areas of the city of Sobral, 
Ceará. METHODS: The triatomines used in this study were provided by the Sobral 
Zoonoses Control Center. The insects were captured from January 2019 to April 2020 
and sent to Triatomine Information Posts installed at the municipal health posts, for 
taxonomic characterization and storage. Genomic DNA extraction of the collected 
triatomines was performed, followed by identification of mycobacteria using the PRA-
hsp65 technique. DNA samples from PRA-hsp65 positive triatomines were sequenced 
and then phylogenetically analyzed. The addresses of the places where triatomines 
were collected and the residences of TB cases diagnosed in 2018-2019 were spatially 
analyzed. RESULTS: It was collected 167 samples of triatomines, from the total 41.9% 
(70/167) were PRA-hsp65 positive for the genus Mycobacterium. Sequences were 
obtained from70% (49/70) of the samples, being identified 12 bacterial genera, 
including 9 samples as CMTB. Spatial analysis found two significant clusters of 
triatomines and one cluster of TB cases. Spatial interpolation indicated a high-risk 
trend of spatial agglomeration in the county seat for triatomines and TB cases. 
CONCLUSION: This study is the first to describe the finding of CMTB species in 
triatomines in the urban peridomicile. The set of information from this study can be 
used to understand the possible transmission of mycobacteria by triatomines, and thus 
help to establish adequate measures for the prevention of mycobacteriosis. 
 
Keywords: Triatominae. Mycobacterium. Tuberculosis. 
 
 
 
 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
Figura 1 – Estrutura da parede celular das micobactérias ....................... 14 
Figura 2 – Diagrama com o resumo das relações entres os grupos de 
micobactérias ......................................................................... 
 
16 
Figura 3 – Organização de espécies de micobactérias de acordo com a 
sua patogenicidade aos humanos .......................................... 
 
17 
Figura 4 – Estimativa do número de casos novos de tuberculose 
referente ao ano de 2019 ........................................................ 
 
19 
Figura 5 – Incidência de tuberculose no Brasil 2010 – 2019 .................... 20 
Figura 6 – Casos novos e incidência de TB por ano de diagnóstico no 
Ceará, período de 2008 a 2018 .............................................. 
 
21 
Figura 7– Inseto triatomíneo na fase adulta ............................................ 23 
Figura 8 – Triatomíneo da espécie Triatoma brasiliensis ......................... 24 
Figura 9 – Triatomíneo da espécie Triatoma pseudomaculata ................ 25 
Figura 10 – Triatomíneos da espécie Panstrogylus lutzi ............................ 26 
Figura 11 – Triatomíneo da espécie Rhodnius nasutus ............................ 27 
Figura 12 – Vias de infecção dos patógenos transmitidos por 
triatomíneos ........................................................................... 
 
28 
Figura 13 – Mapa municipal de Sobral mostrando sua divisão distrital, 
estado do Ceará ..................................................................... 
 
31 
Figura 14 – Residências próximas à Serra da Meruoca no Município de 
Sobral, Ceará ......................................................................... 
 
32 
Figura 15 – Agente de zoonoses realizando visita à residência no 
município de Sobral, Ceará .................................................... 
 
33 
Figura 16 – Área do peridomicílio para criação de aves domésticas .......... 34 
Figura 17 – Área intradomiciliar favorável para a captura de triatomíneos 
no Município de Sobral, Ceará ................................................ 
 
34 
Figura 18 – Fluxograma com representação da sequência de testes 
utilizados para a detecção de micobactérias em triatomíneos 
 
35 
Figura 19 – Produto de amplificação a partir da região genômica do 
Mycobacterium tuberculosis H37Rv, gene Rv0440 (groEL2) 
codificante da proteína hsp65 (chaperone de 60kDa) ............ 
 
 
37 
Figura 20 – Fluxograma com representação da sequência de testes 
utilizados e os resultados obtidos ........................................... 
 
43 
Figura 21 – Eletroforese em gel de agarose 1,0% com produtos da 
amplificação da região hsp65 de M. tuberculosis .................... 
 
44 
Figura 22 – Eletroforese em gel MetaPhor 4,5% com os produtos da 
digestão enzimática do gene hsp65 (441 pb) .......................... 
 
45 
Figura 23 – Eletroforese em gel MetaPhor 4,5% com os produtos da 
digestão enzimática pelas enzimas BstEII e HaeIII ................. 
 
46 
Figura 24 – Eletroferograma da amostra 65 evidenciando a qualidade do 
DNA analisado no Programa BioEdit Sequence Alignment 
Editor ...................................................................................... 
 
 
49 
Figura 25 - Alinhamento local de uma sequência usando a ferramenta 
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) .......................... 
 
50 
Figura 26 - Alinhamento múltiplo de sequências dos nucleotídeos das 9 
amostras identificadas como complexo M. tuberculosis 
(CMTB) e M. tuberculosis H37Rv ........................................... 
 
 
54 
Figura 27 - Árvore de consenso para 100 “bootstraps” mostrando as 
relações filogenéticas entre sequências de hsp65 de 
micobactérias de triatomíneos de Sobral, Ceará, e a 
sequência da cepa padrão M. tuberculosis H37Rv ................. 
 
 
55 
Figura 28 - Árvore de consenso para 100 “bootstraps” mostrando as 
relações filogenéticas entre sequências de rpoB de 
micobactérias de triatomíneos de Sobral, Ceará, e a 
sequência da cepa padrão M. tuberculosis H37Rv ................. 
 
 
 
56 
Figura 29 - Distribuição das 70 amostras de triatomíneos de acordo com 
a caracterização taxonômica e o local de captura no 
município de Sobral, Ceará, 2021 ......................................... 
 
 
57 
Figura 30 - Distribuição das espécies bacterianas identificadas por 
sequenciamento das 49 amostras de triatomíneos coletadas 
no município de Sobral, Ceará, 2021 ...................................... 
 
 
58 
Figura 31 - Distribuição espacial dos 367 casos de tuberculose 
diagnosticados no período de 2018 a 2019 e do local de 
captura das espécies de triatomíneos identificados pela 
 
 
 
 
caracterização taxonômica no município de Sobral, Ceará, 
2021 ....................................................................................... 
 
59 
Figura 32 - Distribuição espacial do local de captura das nove amostras 
de triatomíneos com detecção positiva para o complexo M. 
tuberculosis no município de Sobral, Ceará, 2021.................. 
 
 
60 
Figura 33 – Mapa espacializando a densidade da localização dos 367 
casos de tuberculose e triatomíneos no município de Sobral, 
Ceará, 2021 ............................................................................ 
 
 
61 
Figura 34 - Mapas da análise exploratória espacial dos 367 casos de 
tuberculose detectados no período de 2018 e 2019 e do local 
de coleta dos triatomíneos, utilizando Índice de Moran Global, 
2021........................................................................................ 
 
 
 
62 
Figura 35 - Mapa de previsão IDW identificando a distribuição de 
tuberculose dos triatomíneos coletados em Sobral, Ceará ..... 
 
63 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 – Iniciadores para amplificação da região hsp65 do DNA de 
Mycobacterium sp................................................................... 
 
38 
Tabela 2 – Condições para amplificação da região hsp65 do DNA de 
Mycobacterium sp................................................................... 
 
38 
Tabela 3 – Condições para amplificação da região rpoB do DNA de 
Mycobacterium sp................................................................... 
 
40 
Tabela 4 – Resultado da identificação das 70 amostras de triatomíneos 
com base nos padrões do PRA-hsp65..................................... 
 
47 
Tabela 5 – Descrição das espécies de triatomíneos das 167 amostras 
analisadas............................................................................... 
 
48 
Tabela 6 – Descrição de espécies de triatomíneos com positividade no 
PRA-hsp65.............................................................................. 
 
47 
Tabela 7 – Descrição do estágio de desenvolvimento dos triatomíneos 
coletados no município de Sobral, Ceará - Brasil.................. 
 
49 
Tabela 8 – Resultado das espécies bacterianas identificadas nas 49 
amostras de triatomíneos determinadas por sequenciamento 
parcial genético....................................................................... 
 
 
51 
Tabela9 – Concordância entre as espécies bacterianas identificadas 
pela técnica PRA-hsp65 e sequenciamento 
................................................................................................ 
 
 
52 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
BAAR Bacilo álcool-ácido resistentes 
CMTB Complexo Mycobacterium tuberculosis 
COVIG Coordenadoria de Vigilância em Saúde (COVIG) 
DNA Ácido desoxirribonucleico 
DPML Departamento de Patologia e Medicina Legal 
HIV Vírus da imunodeficiência humana 
IEC Instituto Evandro Chagas 
KDE Estimativa de densidade do kernel 
MCR Micobactérias de crescimento rápido 
MNT Micobactérias Não Tuberculosas 
OMS Organização Mundial de Saúde 
PCR Reação em Cadeia da Polimerase 
PIT Postos de Informação de Triatomíneos 
PRA Análise de enzimas de restrição 
SESA – CE Saúde do Estado do Ceará 
SINAN Sistema de Informação de Agravos e Notificação 
SVS Secretária de Vigilância Sanitária 
TB Tuberculose 
TBE Tampão Tris/Borato/EDTA 
TE Tampão Tris-EDTA 
NUVEP Núcleo de Vigilância Epidemiológica 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 13 
1.1 Características gerais das micobactérias ................................................ 13 
1.2 Classificação das micobactérias .................................................................. 14 
1.3 Patogenia e transmissão das micobacterioses ....................................... 17 
1.3.1 Complexo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) .............................. 17 
1.3.2 Micobactérias não-tuberculosas (MNT) ................................................ 18 
1.4 Aspectos epidemiológicos ........................................................................ 19 
1.4.1 Epidemiologia da Tuberculose (TB) ................................................... 19 
1.4.2 Epidemiologia das micobacterioses ..................................................... 21 
1.5 Biologia molecular para a identificação de micobactérias ..................... 21 
1.5.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ........................................... 22 
1.5.2 Análise de Restrição – PRA hsp65 ..................................................... 22 
1.5.3 Sequenciamento .................................................................................. 22 
1.6 Triatomíneos ............................................................................................... 23 
1.6.1 Características gerais ......................................................................... 23 
1.6.2 Ecótopos dos triatomíneos................................................................. 24 
1.6.3 Espécies de Triatomíneos existentes no Ceará ................................ 24 
1.7 Transmissão de micobactérias por triatomíneos .................................... 27 
2 JUSTIFICATIVA ................................................................................................ 29 
3 OBJETIVOS ....................................................................................................... 30 
3.1 Objetivo geral ................................................................................................. 30 
3.2 Objetivos específicos .................................................................................... 30 
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 31 
4.1 Delineamento do estudo ............................................................................... 31 
4.2 Caracterização geográfica da origem das amostras .................................. 31 
4.3 Coleta dos triatomíneos ................................................................................ 32 
4.4 Procedimentos laboratoriais ........................................................................ 35 
4.5 Processamento das amostras ...................................................................... 36 
4.6.1 Extração do DNA genômico ....................................................................... 36 
4.6.2 Amplificação da região hsp65 do DNA de Mycobacterium sp. ............... 37 
4.6.3 Identificação molecular por PRA-hsp65 (PCR-Restriction Analysis) 
das micobactérias ............................................................................................ 38 
4.7- Identificação por sequenciamento capilar (método de Sanger) ............... 39 
4.8 Análise filogenética das sequências............................................................ 40 
4.9 Análise espacial ............................................................................................. 41 
4.9.1 Função de Kernel .................................................................................... 41 
4.9.2 Índice de Moran Global ........................................................................... 42 
4.9.3 Método Inverso da Distância Ponderada (IDW) .................................... 42 
5 RESULTADOS .................................................................................................. 43 
5.1 Fluxograma com resultados obtidos para a identificação de 
micobactérias em triatomíneos .......................................................................... 43 
5.2 Detecção e Identificação molecular por PRA-hsp65 .................................. 44 
5.2.1 Detecção da região hsp65 do DNA de Mycobacterium sp .................. 44 
5.2.2 Identificação de micobactérias por PRA-hsp65 ................................... 44 
5.3 Caracterização dos triatomíneos ................................................................. 47 
5.4 Sequenciamento genético ............................................................................ 49 
5.5 Análise filogenética ....................................................................................... 53 
5.6 Análise espacial ............................................................................................. 56 
6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 64 
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 72 
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 73 
APÊNDICE A – ARTIGO SUBMETIDO AO TRANSACTIONS OF THE ROYAL 
SOCIETY OF TROPICAL MEDICINE & HYGIENE .................................................. 86 
 
13 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
1.1 Características gerais das micobactérias 
 
As micobactérias são microrganismos que pertencem à família 
Mycobacteriaceae, domínio Archaea, filo Actinobacteria, classe Actinobacteria, ordem 
Actinomycetales e subordem Corynebacteriaceae (BRITO, 2008). 
Essas bactérias são gram-positivas, possuem formato bacilar, com 
tamanhos que variam de 0,2 a 0,6 µm de largura e 1 a 10 µm de comprimento. 
Apresentam formato ligeiramente curvos ou retos, são aeróbios ou microaerófilos, não 
formam esporos, são imóveis e apresentam tempo de geração lento. Este tempo de 
geração pode variar para cada espécie, sendo as espécies divididas em micobactérias 
de crescimento lento, que apresentam tempo de formação de colônias após 7 dias de 
incubação, e de crescimento rápido, com formação de colônias em menos de sete 
dias (LEÃO, 2004; WILDNER, 2011). 
As espécies pertencentes a este gênero devem apresentar alguns 
requisitos, como: elevado teor de ligações de citosina-guanina, variando em cerca de 
65 a 75% do seu material genético e alta quantidade de conteúdo lipídico que confere 
a capacidade de resistir a descoloração com solução álcool-ácida, sendo assim 
denominados de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR; LEVY-FRÉBAUT & 
PORTAELS, 1992; ROSEMBERG, 2001; LEÃO, 2004) 
A parede celular das micobactérias apresenta um alto teor de lipídeos em 
sua composição, onde cerca de 60% é compostapor ácidos micólicos, que se ligam 
covalentemente aos arabinogalactanos, onde estes se ligam por pontes fosfodiéster 
com os peptideoglicanos (FIGURA 1; BRENNAN, 2003; WILDNER, 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
Figura 1 – Estrutura da parede celular das micobactérias 
 
Fonte: Instituto de Patologia tropical e Saúde Pública – Universidade Federal de 
Goiás (2008). 
 
A união dos componentes da parede, forma uma cobertura que proporciona 
a micobactéria uma barreira impermeável, que confere a estes microrganismos 
resistência à agentes físicos e hidrofobicidade, com consequente resistência à 
desidratação e calor. Além disso, essa bactéria resiste às alterações químicas, como 
mudanças no pH e ações de produtos químicos como cloro e desinfetantes. Essa 
proteção ainda confere resistência a antibióticos, pois muitos são incapazes de 
penetrar nessa complexa parede celular com característica hidrofóbica 
(RASTOGI,1991; BRITO, 2008; SOUTO, 2011). 
 
1.2 Classificação das micobactérias 
 
É conhecido que diversas espécies da família Mycobactereaceae são 
patógenos humanos, como o Mycobacterium tuberculosis, causador da tuberculose 
(TB) e o Mycobacterium leprae, agente etiológico da hanseníase (GUPTA et al., 2018). 
As espécies pertencentes ao gênero podem ser divididas em dois grupos: 
espécies pertencentes ao Complexo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) e outras 
bactérias denominadas de Micobactérias Não Tuberculosas (MNT). Os membros 
CMTB incluem espécies causadoras de doenças no homem, como o M. tuberculosis, 
M. canettii, e M. africanum, assim como outros membros causadores de doenças em 
várias espécies de animais [M. bovis (KARLSON; LESSEL, 1970), M. microti (WELLS, 
15 
 
1937), M. pinnipedii (COUSINS et al., 1993), Dassie bacillus (COUSINS et al., 1994), 
M. mungi (ALEXANDER et al., 2010), M. caprae (ARANAZ et al., 1999), M. orygis 
(VAN INGEN et al., 2012) e M. suricattae (PARSONS et al., 2013)]. 
Em 2018, Gupta e colaboradores realizaram um estudo genômico e 
filogenético, onde procuraram entender as relações dentro do gênero, comparando as 
sequências de 150 espécies de micobactérias. Os autores sugeriram uma 
reclassificação no gênero Mycobacterium e de outros quatro gêneros novos 
(Mycolicibacterium gen. nov., Mycolicibacter gen. nov., Mycolicibacillus gen. nov. e 
Mycobacteroides gen. nov.), que compreendem cinco clados, denominados: clado 
Abscessus-Chelonae; clado Fortuitum-Vaccae, que possui 88 espécies, incluindo M. 
fortuitum e M. vaccae, dentro do gênero Mycolicibacterium; clado Tuberculosis-Simiae 
contendo 86 espécies, dentre elas M. tuberculosis e M. avium pertencendo ao gênero 
Mycobacterium; clado Terrae, com 12 espécies incluídas no gênero Mycolicibacter e 
o clado Triviale que possui três espécies no gênero Mycocilibacillus (FIGURA 2; 
GUPTA et al., 2018). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
Figura 2 – Diagrama com o resumo das relações entres os grupos de micobactérias. 
Fonte: GUPTA et al., (2018) 
17 
 
As micobactérias também podem ser classificadas de acordo com a sua 
patogenicidade nos seres humanos, sendo divididas em três grupos: patogênicas, 
aquelas que causam doença obrigatoriamente, potencialmente patogênicas, que 
podem causar doenças e raramente patogênicas (FIGURA 3; BRASIL, 2008). 
 
Figura 3 – Organização de espécies de micobactérias de acordo com a sua 
patogenicidade aos humanos. 
 Fonte: Secretaria de Vigilância em Saúde (2008). 
 
1.3 Patogenia e transmissão das micobacterioses 
1.3.1 Complexo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) 
 
O CMTB possui diversas espécies potencialmente patogênicas ao homem. 
Dentro deste complexo, se destacam o M. bovis, microrganismo causador da TB 
bovina que também pode infectar humanos; o M. tuberculosis agente responsável pela 
TB em humanos; e M. africanum, agente da TB humana encontrada geralmente em 
indivíduos no continente africano (FIGUEIREDO et al., 2008; WILDNER et al., 2011). 
18 
 
A TB é uma das doenças infectocontagiosas que mais causa óbito em todo 
mundo. A Organização Mundial de Saúde (OMS) declara que a incidência desta 
doença diminuiu em todo o mundo, entretanto, estima-se que em 2018, 
aproximadamente 10 milhões de pessoas foram infectadas pela TB (WHO, 2019). 
Alguns fatores podem favorecer o desenvolvimento da doença: pacientes 
imunocomprometidos, acometidos pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), 
vivendo em condições sociais precárias e aqueles com comorbidades, que 
apresentam maior vulnerabilidade para desenvolver a doença clínica (NARASIMHAN 
et al., 2013). 
Na maioria dos casos a doença acomete os pulmões, causando tosse, 
cansaço e dor torácica. Entretanto, a doença pode acometer outros órgãos do corpo, 
sendo denominada de TB extrapulmonar, podendo atingir rins, meninges, ossos ou 
qualquer outro sítio anatômico (PEREIRA, 2012; SCRIBA; COUSSENS; FLETCHER, 
2017). 
 
1.3.2 Micobactérias não-tuberculosas (MNT) 
 
 As MNT podem causar diversas doenças em seres humanos, onde 
geralmente o pulmão é o órgão mais acometido. Geralmente infecções pelas MNT 
comprometem pacientes pertencentes a um grupo de risco que possuem 
imunodeficiências, como infecção por HIV, sob efeito de quimioterapia e 
transplantados, ou ainda como agentes oportunistas em cirurgias (SEO et al., 2019). 
As espécies associadas à doença pulmonar variam de acordo com a região onde o 
indivíduo está inserido. No Brasil, por exemplo, M. avium e M. abscessus são espécies 
que estão associadas às infecções pulmonares (WILDNER et al., 2011). 
Os sintomas podem ser bastante semelhantes aos da TB, como: tosse 
crônica, fadiga e febre, fazendo com que seu diagnóstico seja dificultado devido à 
similaridade com a TB (ANTUNES et al., 2012; ZELLER; CAMPAINHA; DUARTE, 
2013). 
 As micobacterioses também podem ocorrer na forma extrapulmonar, 
podendo causar meningite, lesões geniturinárias, nódulos e lesões disseminadas. Em 
casos onde a infecção ocorre por inoculação, geralmente existe a formação de 
nódulos na região, podendo evoluir para um processo inflamatório crônico, formando 
abscessos (GUTIERREZ et al., 2001; WILDNER et al., 2011). 
19 
 
Diversos estudos comprovam que o ambiente é a fonte das doenças 
causadas por MNT em seres humanos, onde estas são encontradas na natureza 
principalmente em reservatórios de água, solos, pedras, aerossóis, protozoários e 
animais (MARTIN-CASABONA et al., 2004; HOLANDA et al., 2017). A infecção pode 
acontecer por ingestão de alimentos ou líquidos contaminados, inalação e inoculação 
cutânea direta, no entanto a transmissão entre indivíduos ainda não é confirmada 
(GÓMEZ, 2009). Por não serem transmissíveis de forma direta, a notificação ao 
serviço de saúde não é obrigatória, o que leva a falta de registros oficiais, 
impossibilitando estimar os casos de infecção, mesmo que algumas espécies tenham 
alta patogenicidade (WEISS; GLASSROTH, 2013; CARNEIRO et al., 2018). 
 
1.4 Aspectos epidemiológicos 
 
1.4.1 Epidemiologia da Tuberculose (TB) 
 
A TB possui distribuição mundial, onde em 2019 foi estimada a incidência 
de 10 milhões de casos novos no mundo, destes 7 milhões de casos foram notificados 
(FIGURA 4). Foi estimado que nesse mesmo ano morreram por TB aproximadamente 
1,2 milhão de pessoas HIV negativas e mais de 208 mil HIV-positivos (WHO, 2020). 
 
Figura 4 - Estimativa do número de casos novos de tuberculose referente ao 
ano de 2019. 
Fonte: WHO (2020). 
20 
 
No ano de 2019, foram diagnosticados 73.864 casos novos de TB no Brasil, 
equivalente à 35 casos/100 mil habitantes (FIGURA 5). Devido a heterogeneidade do 
país, alguns estados ser tornam mais evidentes com maiores coeficientes de 
incidência ficando acima de 51 casos/100 mil habitantes, como nos estados do 
Amazonas, Pará e Rio de Janeiro (BRASIL, 2020). 
No Brasil, no ano de 2018, foram registrados 4.490 óbitos em decorrência 
da TB, equivalenteà um coeficiente de 2,2 óbitos/100 mil habitantes. No mesmo ano, 
nove estados registraram um coeficiente de morte próximo ou superior do que é 
registrado no país, dentre elas estão: Rio de Janeiro, Pernambuco e Ceará (BRASIL, 
2020). 
 
Figura 5 – Incidência de tuberculose por faixa etária no Brasil 2010 – 2019. 
 Fonte: SINAN/SVS- MS, 2020. 
 
Conforme a Secretaria de Saúde do Estado do Ceará (SESA-CE), no 
período de 2008 a 2018, foram notificados 39.353 novos casos de TB. A incidência no 
ano de 2018 foi de 42/100 mil habitantes (FIGURA 6). Em 2018, foram notificados 
3.814 casos de TB no estado, onde a maior incidência foi no município de Sobral com 
76,5/100 mil habitantes, seguido por Fortaleza com 65,5/100 mil habitantes (CEARÁ, 
2020). 
21 
 
Figura 6 – Casos novos e incidência de TB por ano de diagnóstico no Ceará, período 
de 2008 a 2018. 
Fonte: SESA/COVIG/NUVEP – Sinan (2019). 
 
1.4.2 Epidemiologia das micobacterioses 
 
Em países como Estados Unidos e Canadá, as micobacterioses são 
consideradas emergentes e assim, apresentam um padrão epidemiológico de 
crescimento inversamente proporcional ao da TB (DALCOMO, 2014; LIN, 2018). 
Diversos estudos mostraram o aumento significativo na detecção de MNT 
no Brasil. Em 2009, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) determinou a 
notificação compulsória das infecções causadas por micobactérias de crescimento 
rápido (MCR; BRASIL, 2009). 
Os números de notificações de infecções causadas por MCR são elevadas, 
no entanto as micobactérias de crescimento lento são as mais comumente isoladas, 
onde ambas causam infecção pulmonar (CARNEIRO, 2017). 
 
1.5 Biologia molecular para a identificação de micobactérias 
 
A identificação de micobactérias usando técnicas como cultura e ensaios 
bioquímicos não é muito sensível e rápida. A utilização de métodos moleculares 
apresenta uma melhor abordagem para a identificação ao nível de espécie, sendo a 
identificação feita diretamente a partir de amostras clínicas, ambientais ou de cultivo 
em meios de cultura. As técnicas como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR- 
22 
 
Polymerase Chain Reaction), PCR seguido de digestão com enzimas de restrição e 
sequenciamento de DNA, possuem uma maior precisão e auxiliam na identificação de 
novas espécies (WILLIANMS et al., 2007; SAIFI et al., 2013). 
 
1.5.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 
Na realização da PCR para a identificação de micobactérias, a região 
amplificada pode ser usada para identificar todas as bactérias pertencentes ao gênero 
ou pode ser específica para o complexo de CMTB. Um dos alvos moleculares usados 
para diferenciar as espécies do CMTB das MNT é o gene que codifica o elemento de 
inserção IS6110 (TORTOLI, 2003; SCHERER et al., 2011). 
Outro gene que vem sendo bastante estudado é o hsp65, pois está 
presente em todas as espécies do gênero Mycobacterium codificando a proteína de 
choque térmico de 65kDa. Esta região é bastante utilizada para a diferenciação de 
espécies de MNT em técnicas moleculares (SAIFI et al., 2013). 
 
1.5.2 Análise de Restrição – PRA hsp65 
 
O PRA-hsp65 (“PCR-restriction enzyme analysis”) consiste na amplificação 
por PCR de parte do gene hsp65, gerando um produto de 441 pb que possui epítopos 
específicos as espécies de micobactérias. Após à amplificação, é realizada a digestão 
com as enzimas de restrição BstEII e HaeIII. Os produtos da digestão são visualizados 
por eletroforese em gel de agarose e as espécies de micobactérias são identificadas 
pelo padrão de restrição, no qual é usado algoritmo de identificação (TELENTI et al., 
1993; CHIMARA et al., 2008). 
 
1.5.3 Sequenciamento 
 
A identificação de micobactérias por sequenciamento se baseia na análise 
da sequência de nucleotídeos de um gene comum ao gênero Mycobacterium e a 
comparação com as sequências disponíveis em bancos de dados. 
Para as técnicas de sequenciamento, os genes específicos mais utilizados 
em micobactérias são o rpoB e hsp65, sendo considerada a técnica padrão ouro para 
a identificação de micobactérias (WILLIAMS et al., 2007). O gene rpoB, responsável 
pela codificação da subunidade beta da RNA polimerase, é o alvo mais utilizado por 
23 
 
ser bastante conservado, provendo uma identificação mais aperfeiçoada de espécies 
após o sequenciamento (CHEMLAL; PORTAELS, 2003; TORTOLI, 2014). 
A análise das sequências é realizada por comparação da sequência 
desconhecida com sequências depositadas em bancos de dados. O GenBank 
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) é um banco de dados público mais utilizado. 
Para isso, é necessário a seleção de sequências confiáveis para a construção de 
banco de dados de hsp65 e rpoB para a identificação das micobactérias. 
 
1.6 Triatomíneos 
 
1.6.1 Características gerais 
 
Os triatomíneos são insetos da subfamília Triatominae (Ordem Hemiptera; 
Família Reduviidae). Esses hemípteros são hematófagos que medem 
aproximadamente 2 a 3 cm. Possuem asas e abdômen achatados e têm cabeça 
alongada com a presença de um aparelho bucal tipo picador-sugador (REY, 2008). 
Esses insetos são conhecidos popularmente como barbeiros, bicudos ou 
“chupões”, pois picam as suas vítimas para se alimentarem enquanto estes dormem 
(FIGURA 7). Ao realizar o repasto sanguíneo, o inseto inocula junto uma substância 
anestésica e anticoagulante o que evita que a pessoa consiga perceber a picada. A 
hematofagia é realizada por todos os estágios do ciclo evolutivo e na fase adulta 
(machos e fêmeas). Na fêmea, o sangue é essencial para a maturação dos ovários 
e oviposição (VASCONCELOS, 2013). 
 
Figura 7 - Inseto triatomíneo na fase adulta 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Vigilância Entomológica da Doença de Chagas (2015). 
24 
 
1.6.2 Ecótopos dos triatomíneos 
Os triatomíneos apresentam diversos ecótopos podendo ser classificados 
como estáveis ou instáveis. Os ambientes estáveis apresentam fontes alimentares 
permanentes que favorecem a sua estabilização, como plantas habitadas por aves, 
roedores e morcegos. Já os ambientes instáveis, como cascas de árvores secas, 
apresentam escassez de alimento e variações de temperatura (VASCONCELOS, 
2013). 
Com a invasão dos homens em ecótopos silvestres, os insetos que eram 
restritos ao ambiente silvestre se adaptaram às habitações humanas, estabelecendo 
três ciclos de transmissão de doenças: silvestre, peridomiciliar e doméstico. As 
transmissões de doenças podem aumentar com a entrada desses insetos nos 
domicílios, principalmente onde existem fontes alimentares, que favorecem o 
surgimento de colônias (COURA; VINAS, 2010). 
 
1.6.3 Espécies de Triatomíneos existentes no Ceará 
 
A espécie Triatoma brasiliensis é uma das mais importantes encontradas 
no nordeste brasileiro (FIGURA 8). Por ser natural da região, ela pode ser encontrada 
em ambientes silvestres (rochas e cavernas), peridomicílio (galinheiros e muros de 
residências) e nos domicílios. Mesmo com a aplicação de inseticidas, estudos 
mostram que após até quatro meses, insetos selvagens voltam a entrar e formar 
colônias nas residências (DIOTAIUTI, 2000). 
 
Figura 8 - Triatomíneo da espécie Triatoma brasiliensis 
 
Fonte: Fiocruz (2019). 
25 
 
O Triatoma pseudomaculata é outra espécie bastante encontrada no 
semiárido do Brasil (FIGURA 9). Essa espécie de caracteriza por sua adaptação a 
altas temperaturas, podendo viver escondida em residências nas partes que recebem 
mais sol, como o telhado (ARGOLO et al., 2008). 
 
Figura 9 - Triatomíneo da espécie Triatoma pseudomaculata 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Laboratório Nacional e Internacional de 
Referência em Taxonomia de Triatomíneos (2014). 
 
Os triatomíneos da espécie Panstrogylus spp. tem sido cada vez mais 
encontrados no estado do Ceará (FIGURA 10). Panstrongylus lutzi é detectado 
abundantemente em municípios como Crateús e Sobral e possuem uma grande 
capacidade de entrarem domicílios, principalmente pela sua grande habilidade de 
invasões através do voo. Além disso, podem formar pequenas colônias no 
peridomicílio. A espécie P. megistus é encontrada principalmente no ambiente 
peridomiciliar, onde as aves domésticas servem como fonte alimentar (ARGOLO et 
al., 2008; VASCONCELOS, 2013). 
 
 
 
 
 
 
26 
 
Figura 10 - Triatomíneos da espécie Panstrogylus lutzi 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Fonte: Laboratório Nacional e Internacional de 
Referência em Taxonomia de Triatomíneos (2014). 
 
 
A espécie Rhodnius nasutus é a quarta espécie mais encontrada no Ceará. 
Na região da Serra da Meruoca, próximo à Sobral, apresenta uma grande infestação 
de insetos dessa espécie principalmente em babaçus e carnaúbas (FIGURA 11). 
Estudos relatam que essa espécie é relatada habitando a região do peri e intra 
domicílio (CAVALCANTE, 2005; DIAS, 2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
Figura 11 - Triatomíneo da espécie Rhodnius nasutus 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Laboratório Nacional e Internacional de Referência em 
Taxonomia de Triatomíneos (2014). 
 
 
 
1.7 Transmissão de micobactérias por triatomíneos 
 
Microrganismos que vivem no intestino de insetos possuem um papel 
importante, pois podem afetar a propriedade de adquirir patógenos de um hospedeiro 
infectado. O patógeno pode ser transportado do inseto para o humano por diversas 
vias: pela saliva contaminada que entra no vaso sanguíneo, pelo contato com as fezes 
depositadas na pele após o repasto e pela ingestão de alimentos contaminados pela 
saliva e/ou fezes de triatomíneos (FIGURA 12; DIAZ et al., 2016; VIEIRA et al., 2018). 
A presença de micobactérias, inclusive de espécies patogênicas, é relatada 
em insetos. Um estudo de Fischer et al. (2001) mostrou o papel de moscas na 
transmissão de micobactérias como Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis e 
Mycobacterium phlei entre rebanhos suínos. Em carrapatos, micobactérias são 
encontradas abundantemente, pode variar a diversidade de acordo com a variação 
geográfica e com a alimentação desses insetos (THAPA; ZHANG; ALLEN, 2019). 
. 
28 
 
Os triatomíneos não apresentam células especializadas para abrigar 
células bacterianas. A microbiota deste inseto vive de forma extracelular no lúmen do 
intestino, onde podem interagir com o protozoário Trypanosoma cruzi e competir por 
nutrientes (RODRÍGUEZ-RUANO et al., 2018). 
 
Figura 12 – Vias de infecção dos patógenos transmitidos por triatomíneos. 
Fonte: Vieira et al., (2018). 
 
Estudos tem demonstrado a presença de micobactérias no microbioma de 
espécies de triatomíneos (GUMIEL et al., 2015; RODRÍGUEZ-RUANO et al., 2018). 
O bacilo da hanseníase (M. leprae) foi demonstrado ser capaz de se multiplicar e ser 
excretado nas fezes, em sua forma viável, de insetos triatomíneos do gênero 
Rhodnius (NEUMANN et al., 2016). É importante ressaltar que os tatus são 
parasitados por barbeiros, onde o primeiro é reconhecido como um reservatório de M. 
leprae e o segundo por ser o agente etiológico da doença de Chagas (PAIGE; 
SCHOLL; TRUMAN, 2002). 
 
 
 
 
 
 
29 
 
2 JUSTIFICATIVA 
 
O município de Sobral apresenta alta incidência das doenças TB e 
hanseníase. Em 2019 apresentou o segundo maior coeficiente de incidência de TB, 
sendo de 76,5 casos/100 mil habitantes e em 2018 um coeficiente de detecção > 40 
casos por 100 mil habitantes, parâmetro de hiperendemicidade (CEARÁ, 2019b; 
CEARÁ 2020b). 
Pesquisas em Sobral revelaram que apesar da TB ser uma doença tratável, 
ainda é alta a sua incidência na região, sendo necessário a busca por novas 
ferramentas de diagnóstico e formas de transmissão que ajudem no controle da 
doença (SOUZA; CUSTÓDIO; MELO, 2019). Uma pesquisa realizada em Sobral, 
identificou a elevada soroprevalência de anticorpos anti-PGL-1 (específico para M. 
leprae) em indivíduos não contactantes de casos de hanseníase (FROTA et al., 2010). 
Ainda em Sobral, também foram identificados tatus contendo o bacilo (FROTA et al., 
2012) e mais recentemente, o bacilo foi detectado em sua forma viável em águas 
ambientais, tendo sido achado com maior frequência em localidades próximas das 
residências de casos de hanseníase (ARRAES et al., 2017). 
No município de Sobral, funciona um programa de controle do vetor da 
doença de Chagas, pois existe um grande número de triatomíneos em ambientes 
domiciliares, circulando nas residências. O Centro de Controle de Zoonoses de Sobral 
criou os PITs (Postos de Informação de Triatomíneos) que recebe dos Agentes de 
Saúde, de forma sistemática, os triatomíneos encontrados e coletados pela 
população. 
O estudo de Parente e colaboradores (PARENTE et al., 2017) demonstrou 
a presença de insetos vetores de T. cruzi em todo o perímetro urbano do município 
de Sobral. Esses insetos apresentam uma microbiota bastante diversificada, 
apresentando bactérias patogênicas, inclusive espécies pertencentes ao gênero 
Mycobacterium (TEOTÔNIO et al., 2019). 
Assim, é importante analisar outras formas de transmissão das 
micobactérias além das formas já descritas na literatura, para que pudessem explicar 
a grande endemicidade destas doenças nesta cidade. 
 
 
 
30 
 
3 OBJETIVOS 
 
3.1 Objetivo geral 
 
Analisar os aspectos ecoepidemiológicos de micobactérias identificadas 
em triatomíneos encontrados em residências da área urbana do município de Sobral, 
Ceará. 
 
3.2 Objetivos específicos 
 
- Identificar as espécies do gênero Mycobacterium nos triatomíneos coletados; 
- Caracterizar as espécies de triatomíneos coletados com identificação positiva para 
as espécies do gênero Mycobacterium. 
- Analisar filogeneticamente as sequências amplificadas com os genes rpoB e hsp65; 
- Analisar aspectos ecoepidemiológicos e espacial da distribuição dos triatomíneos 
encontrados, das espécies bacterianas identificadas, relacionando com casos de 
tuberculose em Sobral. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
4 MATERIAL E MÉTODOS 
 
4.1 Delineamento do estudo 
 
Trata-se de um estudo transversal. Foi realizado no período de 18 meses. 
As coletas foram realizadas no período de janeiro de 2019 a abril de 2020. 
 
4.2 Caracterização geográfica da origem das amostras 
 
As amostras de triatomíneos foram coletadas no município de Sobral, 
situado na região Noroeste do estado do Ceará. Sobral possui 2.122,9 km² de 
extensão, situa-se geograficamente 3º 41’ 10” S e 40º 20’ 59” WGr e está distante 235 
quilômetros de Fortaleza. 
O município é composto pelos distritos de Aprazível, Aracatiaçu, Baracho, 
Bilheira, Bonfim, Caioca, Sede, Jaibaras, Jordão, Patos, Patriarca, Pedra de Fogo, 
Rafael Arruda, Salgado dos Machados, São José do Torto, Taperuaba e Caracará 
(FIGURA 13, IPECE, 2017). 
Figura 13 – Mapa municipal de Sobral mostrando sua divisão distrital, estado do 
Ceará. 
 
Fonte: Própria autora (2021). 
32 
 
O município de Sobral possui diversas serras, como: a Serra da Meruoca, 
que pertence parcialmente ao município; Serra do Rosário, localizada no Distrito de 
Jordão; Serra Verde e Serra das Andorinhas, situada no distrito de Taperuaba 
(FIGURA 14; ANDRADE et al., 2000). 
Os distritos selecionados para a coleta foram escolhidos de acordo com a 
demanda encontrada pelos agentes de zoonoses, que informaram a grande 
quantidade de insetos nas residências e no peridomicílio. 
 
 Figura 14 – Residências próximas à Serra da Meruoca no Município de Sobral, Ceará. 
 Fonte: Própria autora (2021). 
 
 
4.3 Coleta dos triatomíneos 
 
Uma parte dos triatomíneos foram capturados pela própria população de 
Sobral e enviados à um dos 24 PITs instalados nos postos de saúde do município. A 
outra parte dos insetos foi capturada pelos agentes de zoonoses durante suas visitas 
periódicas nas residências dos distritos de Sobral (FIGURA 15). As Figuras 16 e 17 
mostram algumas residências ondeforam encontrados triatomíneos. 
33 
 
Posteriormente à captura, os insetos vivos foram armazenados 
individualmente em frascos estéreis e em seguida encaminhados ao Centro de 
Controle de Zoonoses de Sobral. Antes da dissecção, os insetos foram lavados com 
solução de 0,5% de hipoclorito de sódio e enxaguados 3 com água destilada estéril. 
Em seguida, os insetos foram caracterizados taxonomicamente por um entomologista 
por técnica de dissecção com auxílio de microscópio estereoscópio, aumento de 12 
(LENT; WYGODZINSKY, 1979). Após a identificação, os insetos foram mantidos a 
temperatura de -20ºC até a transferência ao laboratório em Fortaleza. 
Os triatomíneos foram mantidos congelados durante o transporte até o 
Laboratório de Micobactérias do Departamento de Patologia e Medicina Legal (DPML) 
da Universidade Federal do Ceará (UFC). No Laboratório de Micobactérias, os insetos 
foram separados de acordo com a localização da residência em que foram 
encontrados, sexo e estágio de desenvolvimento e devidamente identificados e 
continuaram sendo mantidos a -20ºC. 
 
Figura 15 – Agente de zoonoses realizando visita à residência no município de 
Sobral, Ceará. 
Fonte: Própria autora (2021) 
 
34 
 
Figura 16 – Área do peridomicílio para criação de aves domésticas no município de 
Sobral, Ceará. 
Fonte: Própria autora (2021). 
 
 
 
 
Figura 17 – Área intradomiciliar favorável para a captura de triatomíneos no 
município de Sobral, Ceará. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Própria autora (2021). 
 
 
35 
 
4.4 Procedimentos laboratoriais 
 
A Figura 18 apresenta um fluxograma ilustrando a sequência das análises 
laboratoriais dos triatomíneos analisados. 
 
Figura 18 - Fluxograma com representação da sequência da metodologia utilizada 
para a detecção de micobactérias em triatomíneos 
 
 
Fonte: Própria autora (2021). 
36 
 
4.5 Processamento das amostras 
 
Os insetos foram colocados separadamente em placas de Petri estéreis e 
com o auxílio de bisturi descartável, foi coletada uma amostra do intestino de cada 
inseto (do pró-ventrículo até o reto). Posteriormente a amostra foi fracionada em dois 
microtubos estéreis previamente identificados de 2 mililitros (mL), onde um foi 
encaminhado para o cultivo e o outro foi destinado à extração de DNA. 
 
4.6 Identificação e caracterização molecular dos isolados 
 
4.6.1 Extração do DNA genômico 
 
A extração de DNA seguiu o protocolo de purificação de DNA utilizando a 
técnica de Fenol/Clorofórmio, baseada em publicação anterior (VAN HELDEN et al., 
2001) 
Inicialmente foram adicionados 200 μl de tampão TE (Tris-EDTA) nos 
insetos previamente segmentados. Em seguida, foi adicionado 150 μl de proteinase K 
10 mg/mL (preparada em tampão TE-Tris EDTA pH 8,0) e 30 μl de SDS 20% e em 
seguida foi homogeneizado por ressuspenção da amostra por técnica de pipetagem e 
incubado a 45ºC por overnight (16-18h) em banho seco. Após esta etapa, foi 
adicionado 400 μl de solução de lisozima 50mg/mL (concentração final de 2mg/mL 
dissolvida em tampão TE) e novamente foi ressuspendido com a ponteira e incubada 
a 37ºC por duas horas em banho seco. Posteriormente, foi adicionado ao extrato de 
DNA o mesmo volume da mistura fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e 
misturado gentilmente ~5 vezes por inversão e centrifugado à 6.000 rpm (temperatura 
ambiente) por 10 minutos. A fase superior aquosa foi coletada e transferida para outro 
microtubo. Foi adicionado o mesmo volume de clorofórmio, sendo homogeneizado por 
inversão e seguida centrifugado a 6.000 rpm por 10 minutos (temperatura ambiente), 
onde novamente foi coletada a fase superior aquosa. 
Foi adicionado 1/50 volumes de cloreto de sódio 5M e 2 volumes de etanol 
absoluto ao extrato de DNA. A solução foi homogeneizada por lenta e gentil inversão 
até a formação de uma “nuvem” de DNA. Case não houvesse a visualização, as 
amostras eram incubadas a -20ºC por até 30 minutos. Em seguida, o material foi 
centrifugado a 13.000 rpm por 10 min a 4ºC e o sobrenadante foi desprezado por 
inversão do tubo, restando apenas o sedimento contendo o DNA. O sedimento foi 
37 
 
lavado com 1 mL de etanol 70% e centrifugado a 13.000 rpm por 10 minutos. O 
sobrenadante foi desprezado novamente por inversão do tubo. O tubo foi deixado 
aberto em posição invertida, sobre uma gaze limpa em temperatura ambiente por até 
30 minutos, para que todo o resíduo de etanol pudesse evaporar. 
Por fim, foi adicionado ao sedimento de DNA 75 μL de tampão TE e 
incubado a 65ºC no banho seco até a dissolução completa do material. Após esta 
etapa, a amostra foi centrifugada à 13.000 rpm por 1 minuto e estocada a -20ºC. A 
concentração de DNA obtida nas amostras foi medida em um nanoespectofotômetro 
(Nanodrop 1000, Thermo Scientific) na absorbância de 260 nm. 
 
4.6.2 Amplificação da região hsp65 do DNA de Mycobacterium sp. 
 
O DNA extraído foi amplificado usando iniciadores da região genômica de 
441 pb que codifica a proteína do choque térmico de 65 kDa, comum a todas as 
micobactérias (SCHINNICK, 1987; FIGURA 19). Como controles, foram utilizados 
DNA de M. tuberculosis H37Rv no positivo e para o negativo o DNA foi substituído por 
água ultrapura. Ambos os controles foram realizados em todas as reações. 
 
Figura 19- Produto de amplificação a partir da região genômica do Mycobacterium 
tuberculosis H37Rv, gene Rv0440 (groEL2) codificante da proteína Hsp65 
(chaperone de 60kDa). 
Fonte: Schinnick (1987). Em amarelo: iniciadores Tb11 (5´-accaacgatggtgtgtccat-3´) e Tb12 
(5´- cttgtcgaaccgcataccct-3´), produto de 441pb. Setas indicam o sentido de amplificação, 
localização nucleotídica (nt) 144-585 na região codificante. 
 
A reação de amplificação foi composta de 12,5 μL de Go Taq G2 Green 
Master Mix; 0,5 μL de cada iniciador (50 pmol; TABELA 1); 2 μL do DNA extraído e 
9,5 μL de água ultrapura, completando um volume final de 25 μL. 
 
 
 
38 
 
Tabela 1 - Iniciadores para amplificação da região hsp65 do DNA de 
Mycobacterium sp. 
Iniciadores Sequência (5’ – 3’) Produto 
(pb) 
Tb11 ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT 
 441 pb 
Tb12 CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT 
Fonte: Tellenti et al (1993). 
 
As condições de amplificação são apresentadas na Tabela 2. Todas as 
amplificações foram realizadas no termociclador BIOER GenePro (Bioer). Após o 
término da reação, as amostras foram mantidas a 4ºC no termociclador até serem 
submetidas à eletroforese. Para isso, 10 μL do produto amplificado foi aplicado em gel 
de agarose 1% (Invitrogen®) preparado com TBE x1 contendo brometo de etídio na 
concentração final de 0,5 μg/mL. Também foi adicionado o marcador de peso 
molecular de 100 pb (Promega) para a comparação do tamanho das bandas. A 
eletroforese foi realizada a 90V no equipamento Eletrophoresis Power Supply EPS 
300 (GE Healthcare) e as bandas foram digitalizadas em Imagequant 300 (GE 
Healthcare). 
 
Tabela 2 – Condições para amplificação da região hsp65 do DNA de Mycobacterium 
sp. 
 Temperatura Tempo 
Desnaturação inicial 95ºC 1 minuto 
Desnaturação 94ºC 1 minuto 
Anelamento 65ºC 1 minuto 45 ciclos 
Extensão 72ºC 1 minuto 
Extensão final 72ºC 7 minutos 
Final da reação 4ºC 
Fonte: Leão et al. (2004). 
 
 
4.6.3 Identificação molecular por PRA-hsp65 (PCR-Restriction Analysis) das 
micobactérias 
 
A identificação das espécies de MNT pela técnica PRA-hsp65 seguiu o 
protocolo descrito em Brasil (2008). O produto de amplificação foi submetido a duas 
reações de endorrestrição com as enzimas BstEII e HaeIII. Para a reação com 
enzimas de endorrestrição foram feitas alíquotas de dois volumes de 5µl do produto 
de PCR de cada amostra, para cada uma das enzimas a serem utilizadas. Este volume 
foi transferido para tubos de 1,5 ml e a eles foram adicionados 1,5µl do tampão 
39 
 
específico para cada enzima (tampão O 10X para BstEII e tampão R 10X para 
HaeIII),1µl da enzima de digestão(BioLabs®) e 8,5µl de água ultrapura estéril, para 
um volume final de 15µl. As amostras a serem digeridas pela BstEII foram incubadas 
a 60°C, enquanto as amostras digeridas pela HaeIII foram incubadas a 37°C por 3 
horas em banho seco (Thermo-Shaker, VHD®). 
Os produtos das digestões foram visualizados em gel MetaPhor™ 
(Invitrogen) 4,5%, preparado com tampão TAE 1 x contendo brometo de etídio na 
concentração final de 0,5 μg/mL. Para tanto, no primeiro poço foi colocado 6 μL de 
marcador de 50 pb, seguido das amostras digeridas com a enzima BstEII. Logo após 
estas, foi adicionado o marcador de 25 pb, para melhoria da especificação das bandas 
encontras. Por último, foram adicionadas as amostras digeridas com a enzima HaeIII. 
A eletroforese foi desenvolvida a 60 V no equipamento Eletrophoresis Power Supply 
EPS 300 (GE Healthcare) e as bandas foram digitalizadas em ImageQuant 300 (GE 
Healthcare). 
Os padrões obtidos na digestão com enzimas de endorrestrição foram 
depois comparados com o algoritmo empregado na identificação das micobactérias 
disponibilizado na página eletrônica PRASITE (http://app.chuv.ch/prasite/index.html). 
 
 
4.7- Identificação por sequenciamento capilar (método de Sanger) 
 
O sequenciamento das amostras foi realizado na seção de Bacteriologia do 
Instituto Evandro Chagas (IEC), na cidade de Ananindeua, Pará. Todas as amostras 
identificadas como micobactérias foram submetidas ao sequenciamento parcial do 
gene hsp65 (TELENTI et al., 1993), as que não amplificaram foram sequenciadas com 
o gene rpoB (ADEKAMBI et al., 2003). Os iniciadores estão apresentados na Tabelas 
1 e 3. 
As reações de amplificação para a região do gene rpoB foram realizadas 
utilizando 2,5 μL de glicerol, 1 μL de MgCl2, 1 μL de dNTP, 1 μL de cada iniciador, 5 
μL de tampão da Taq 5x, 0,1 μL da enzima HotStart® Taq DNA polimerase (Qiagen, 
Germantown, MD, EUA) e 2 μL do produto da extração de DNA. 
 
 
 
 
40 
 
Tabela 3 – Condições para amplificação da região rpoB do DNA de Mycobacterium 
sp. 
Iniciadores Sequências 5’ – 3’ Produto (pb) 
Myco-F GGC AAG GTC ACC CCG AAG GG ~723 
Myco-R AGC GGC TGC TGG GTG ATC ATC 
Fonte: Adékambi et al. (2003). 
 
A amplificação foi realizada no termociclador Veriti® (Ampplied Biosystens) 
onde a desnaturação inicial de 2 minutos a 94ºC, 35 ciclos de desnaturação a 95ºC 
por 30 segundos, anelamento a 55ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 30 
segundos e extensão final a 72ºC por 5 minutos. 
Para a reação de amplificação do alvo hsp65 foi utilizado 2,5 μL de glicerol, 
1 μL de MgCl2, 1 μL de dNTP, 1 μL de cada iniciador, 5 μL de tampão da Taq 5x, 0,1 
μL da enzima HotStart® Taq DNA polimerase (Qiagen, Germantown, MD, EUA) e 2 μL 
do produto da extração de DNA. 
A amplificação foi realizada no termociclador Veriti® (Ampplied Biosystens) 
onde a desnaturação inicial de 2 minutos a 95ºC, 35 ciclos de desnaturação a 95ºC 
por 30 segundos, anelamento a 55ºC por 90 segundos e extensão a 72ºC por 90 
segundos e extensão final a 72ºC por 10 minutos. 
Após o término das reações, as amostras foram mantidas a 4ºC no 
termociclador e foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1% (Invitrogen, 
Brasil) corado com SYBR Safe 10.000x (Invitrogen, Brasil). Foi utilizado o marcador 
de peso molecular de 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, Brasil). As bandas foram 
digitalizadas em um transiluminador UV (UVP Biodoc). 
Após a eletroforese, os produtos de PCR foram purificados utilizando o kit 
EasyPure® PCR Purification Kit (Sinapse bioteconologia). O DNA foi sequenciado 
utilizando os mesmos iniciadores e o kit de sequenciamento BigDye® Terminator v3.1 
Cycle Sequencing (Applied Biosystems®). A análise das sequências foi realizada no 
equipamento ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®). 
 
 4.8 Análise filogenética das sequências 
 
As sequências dos isolados foram em seguida analisadas com os softwares 
BioEdit versão 7.2.5 e MEGA versão 10.1.7. As sequências foram inicialmente 
alinhadas com o banco de dados do GenBank (National Center for Biotechnology 
41 
 
Information, NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), usando a ferramenta de busca 
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Em seguida, foi realizado o alinhamento 
múltiplo das sequências com o programa Clustal W Multiple Alignment fazendo 
comparação por pares. A sequência do gene rpoB do M. tuberculosis H37Rv foi 
empregada como referência para a análise filogenética. A árvore filogenética foi obtida 
com as sequências de DNA usando o método “neighbor-joining” com o parâmetro 
Jukes-Cantor no programa MEGA-X versão 10.1.7 (Molecular Evolutionary Genetic 
Analysis, https://www.megasoftware.net/). A análise de inicialização (“bootstrap 
analysis”) com 100 repetições foi realizada para avaliar a topologia da árvore, os 
valores de inicialização acima de 75% foram considerados significantes. 
 
4.9 Análise espacial 
 
Os endereços residenciais no momento do diagnóstico dos casos de TB do 
período de 2018 e 2019 e os endereços dos locais onde foram encontrados os 
triatomíneos, foram georreferenciados com a utilização do Google Earth. Já os dados 
de notificações de TB dos anos de 2018 e 2019 foram retirados do banco de sados 
do Sistema de informação de agravos de notificação (SINAN). 
Os dados georreferenciados foram inseridos na base cartográfica 
digitalizada do município, obtida no site do IBGE, utilizando o Datum oficial do Brasil, 
SIRGAS 2000 (Sistema de Referência Geocêntrico para as Américas), e sistema de 
coordenadas UTM zona 24S. Para a construção dos mapas, os dados das 
coordenadas de cada uma das variáveis foram transferidos para o Excel 2019 e em 
seguida transferidos o programa de código aberto Quantum GIS (QGIS) v. 2.18. 
 
4.9.1 Função de Kernel 
 
O método de alisamento por função Kernel gaussiano é uma técnica não 
paramétrica que promove o alisamento, ou suavização estatística, o que permite filtrar 
a variabilidade de um conjunto de dados, retendo as características essenciais locais 
dos eventos. Estimativa de densidade do Kernel (KDE) é uma técnica que compara o 
número observado de eventos ocorrendo dentro de uma determinada distância de um 
evento com o número esperado destes eventos. A KDE foi utilizada para identificar a 
localização dos clusters para ocorrências de casos de TB e dos triatomíneos 
42 
 
encontrados. Para o KDE, foram usados os seguintes parâmetros: função quadrática, 
cálculo de densidade e raio adaptativo em ambos os temas. 
 
4.9.2 Índice de Moran Global 
 
Os dados também foram avaliados pela medida estatística de 
autocorrelação espacial (Índice de Moran Global), sendo utilizada para avaliar se os 
casos de TB e os triatomíneos encontrados estavam dispersos, agrupados ou 
distribuídos de forma aleatória na área do estudo. O índice é uma estatística espacial 
que avalia a autocorrelação espacial avaliando todo o conjunto de dados e produzindo 
um único valor de saída que varia de -1 a +1, onde o valor positivo indica um padrão 
agrupado, enquanto o negativo indica um padrão disperso. Se o resultado apresentar 
valor de “I” igual zero, é considerado que o padrão é aleatório. 
Para comparar os valores do atributo em uma área com a média dos seus 
vizinhos, foi constituído um gráfico bidimensional dividido em quatro quadrantes 
identificados na legenda: Q1 (alto-alto), Q2 (baixo-baixo), Q3 (alto-baixo) e Q4 (baixo-
alto). 
Os valores determinados pelo Índice de Moran foram visualizados em LISA 
Map. Quando o índice foi maior que 0,05, não existiu autocorrelação e se foi menor 
que 0,05, a correlação foi significativa, sendo classificada em: significância de 0,05 
(95% de confiança), de 0,01 (99% de confiança) e de 0,001 (99,9% de confiança; 
NUNES, 2013). 
 
4.9.3 Método Inverso da Distância Ponderada (IDW) 
 
A magnitude da distribuição foi determinada utilizando o método Inverso da 
Distância Ponderada (IDW) pelos distritosde Sobral. Este método determina que a 
variável mapeada diminui em influência com a distância de sua localização amostrada. 
O IDW determina que os valores mais próximos de zero indicam a inexistência de 
autocorrelação espacial, e quando mais elevado, mais forte será a correlação e assim 
apresenta maior proximidade entre os eventos analisados. 
 
 
 
 
43 
 
5 RESULTADOS 
 
5.1 Fluxograma com resultados obtidos para a identificação de micobactérias 
em triatomíneos 
 
A Figura 20 apresenta um fluxograma ilustrando os resultados obtidos de 
acordo com as fases experimentais do estudo. 
 
Figura 20 - Fluxograma com representação das identificações das amostras de 
triatomíneos de acordo com as metodologias empregadas 
 
Fonte: Própria autora (2021). 
 
 
44 
 
5.2 Detecção e Identificação molecular por PRA-hsp65 
 
5.2.1 Detecção da região hsp65 do DNA de Mycobacterium sp. 
 
No período de janeiro de 2019 a março de 2020, foram analisados 167 
triatomíneos. As amostras foram submetidas às reações de PCR para a amplificação 
da região hsp65 do DNA de Mycobacterium sp. Das amostras analisadas, 58,1% 
(97/167) apresentaram amplificação positiva. A Figura 21 ilustra os produtos de 
aproximadamente 441pb das amostras amplificadas da região hsp65 de M. 
tuberculosis em gel de agarose 1,0%. 
 
Figura 21 – Eletroforese em gel de agarose 1,0% com 
produtos da amplificação da região hsp65 de M. 
tuberculosis 
Fonte: Própria autora (2021). Poços M: marcadores 100 pb; 
poços 1 a 5 representam amostras positivas para o gênero 
Mycobacterium; poço CP: controle positivo com a cepa padrão 
H37Rv M. tuberculosis e poço CN: controle negativo com H2O. 
 
 
 
5.2.2 Identificação de micobactérias por PRA-hsp65 
 
As 97 amostras positivas para hsp65 foram submetidas à digestão com as 
enzimas de endorrestrição HaeIII e BstEII e deste total, 72,2% (70/97) apresentaram 
padrões de bandas correspondentes à digestão (FIGURA 22). 
 
 
 
 
441pb 
45 
 
Figura 22 – Eletroforese em gel MetaPhor™ (Invitrogen) 4,5% com os produtos da 
digestão enzimática do gene hsp65 (441 pb) 
Fonte: Própria autora (2021). Poços M: marcadores de 50 pb (Promega); poços de 1 a 10 
representam amostras de triatomíneos digeridas com as enzimas BstEII e HaeIII; poço CP: 
controle positivo com a cepa padrão H37Rv M. tuberculosis. 
 
 
A análise dos padrões de bandas apresentados após digestão permitiu 
identificar 58,1% das amostras investigadas. As micobactérias pertencentes ao 
complexo M. tuberculosis tipo 1 foram a maioria com 31,4% (22/70). Outras espécies 
também foram detectadas, como M. fortuitum tipo 1 com 17,1% (12/70) e M. 
senegalense 11,4% (8/70; TABELA 4). A Tabela 4 apresenta as espécies identificadas 
com base nos padrões apresentados 
 
46 
 
Figura 23 – Eletroforese em gel MetaPhor™ (Invitrogen) 4,5% com os produtos da 
digestão enzimática pelas enzimas BstEII e HaeIII. 
Fonte: Própria autora (2021). Poços M: marcadores de 50 pb; poços de 1 a 6 representam 
amostras digeridas; poço CP: controle positivo com a cepa padrão H37Rv M. tuberculosis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
47 
 
Tabela 4 – Resultado da identificação das 70 amostras de triatomíneos com base 
nos padrões do PRA hsp65. 
 Padrões de digestão 
Espécies BstEII HaeIII N (%) 
Complexo Mycobacterium 
tuberculosis 
235/115/85 145/130/75 22 (31,4) 
Mycobacterium fortuitum 235/115/85 145/130/75/60 12 (17,1) 
Mycobacterium smegmatis / 
Mycobacterium wolinski 1 / 
Mycobacterium mageritense 1 
235/120/85 145/125/70 9 (12,9) 
Mycobacterium senegalense 235/120/85 180/140/50 8 (11,4) 
Mycobacterium simiae 235/130/85 145/130/0 6 (8,6) 
Mycobacterium gordonae tipo 2 235/115/85 265/130/0 5 (7,1) 
Mycobacterium agri 235/130/85 160/145/60 5 (7,1) 
Mycobacterium wolinsky / 
Mycobacterium senegalense 1 / 
Mycobacterium fortuitum 
235/115/85 145/130/75/60 2 (2,9) 
Mycobacterium triviale tipo 1 440/0/0 170/130/0 1 (1,4) 
Total 70 (100) 
Fonte: Própria autora (2021). 
 
5.3 Caracterização dos triatomíneos 
 
A tabela 5 apresenta a descrição das espécies de triatomíneos das 167 
amostras analisadas, sendo possível analisar que 41,9% (70/167) pertenciam a 
espécie Triatoma pseudomaculata, seguido pelas espécies Triatoma brasiliensis 
32,3% (54/167) e Panstrongylus lutzi 23,3% (39/167). 
De acordo com os dados apresentados na Tabela 6, verificamos que dentre 
os 70 triatomíneos capturados que tiveram detecção de micobactérias pela técnica 
PRA-hsp65, as espécies T. brasiliensis e T. pseudomaculata foram as que 
apresentaram maior frequência com 38,6% (27/70) e 32,9% (23/70) respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
48 
 
Tabela 5 – Descrição das espécies de triatomíneos das 167 amostras analisadas. 
Espécies de triatomíneos N (%) 
Triatoma pseudomaculata 70 (41,9) 
Triatoma brasiliensis 54 (32,3) 
Panstrongylus lutzi 39 (23,3) 
Panstrongylus megistus 2 (1,2) 
Rhodnius nasutus 2 (1,2) 
Total 167 (100) 
 Fonte: Própria autora (2021). 
 
 
Tabela 6 - Descrição de espécies de triatomíneos com positividade no PRA-hsp65 
Espécies de triatomíneos N (%) 
Triatoma brasiliensis 27 (38,6) 
Triatoma pseudomaculata 23 (32,9) 
Panstrongylus lutzi 17 (24,3) 
Rhodnius nasutus 2 (2,8) 
Panstrongylus megistus 1 (1,4) 
Total 70 (100) 
Fonte: Própria autora (2021). 
 
Quanto aos dados sobre o estágio de desenvolvimento dos insetos, 77,1% 
(54/70) estavam na fase adulta e o restante, 22,9% eram ninfas. Foram identificadas 
ninfas somente entre as espécies T. braziliensis (11,1%) e T. pseudomaculata 
(56,5%). Em relação ao sexo, 61,1% (33/54) dos triatomíneos em fase adulta 
pertenciam ao sexo masculino (Tabela 7). Analisando os dados de positividade de 
Trypanosoma cruzi nos insetos analisados, apenas 9,85% foram positivos para 
presença do protozoário. 
 
 
 
 
 
 
 
 
49 
 
Tabela 7 – Descrição do estágio de desenvolvimento dos triatomíneos coletados no 
município de Sobral, Ceará – Brasil. 
 Estágio do desenvolvimento 
 Adulto Ninfa Total 
Espécies de 
triatomíneos N (%) N (%) N (%) 
Triatoma brasiliensis 24 (88,9) 3 (11,1) 27 (38,6) 
Triatoma pseudomaculata 10 (43,5) 13 (56,5) 23 (32,9) 
Panstrongylus lutzi 17 (100) 17 (24,3) 
Rhodnius nasutus 2 (100) 2 (2,8) 
Panstrongylus megistus 1 (100) 1 (1,4) 
Total 54 (77,1) 16 (22,9) 70 (100) 
Fonte: Própria autora (2021). 
 
5.4 Sequenciamento genético 
 
Os experimentos de sequenciamento parcial pelo método de Sanger foram 
realizados no Instituto Evandro Chagas. As análises de identificação e alinhamento 
das sequências foram desenvolvidas no Laboratório de Micobactérias da UFC. 
Do total de 70 amostras identificadas pela técnica PRA-hsp65 como sendo 
micobactérias, em 49 delas foi realizado o sequenciamento parcial genético (FIGURA 
24). As outras 21 amostras não foram sequenciadas por quantidade insuficiente de 
DNA extraído dos triatomíneos. 
A Figura 24 mostra um exemplo de eletroferograma obtido com a amostra 
70, onde são observados picos agudos bem definidos e com distancias regulares, o 
que indica alta qualidade do sequenciamento. E na Figura 25 é mostrado um exemplo 
de identificação de uma sequência alvo usando a ferramenta BLAST (Basic Local 
Alignment Search Tool), o qual compara uma sequência nucleotídica com bancos de 
dados de sequências e calcula a significância estatística da similaridade. 
 
Figura 24 – Eletroferograma de uma sequência parcial da amostra 70 obtida no 
sequenciador automático ABI3100 Prism (Applied Biosystems). 
Fonte: Própria autora (2021). Eletroferograma gerado no programa BioEdit Sequence 
Alignment Editor (BioEdit) v. 7.2.5. 
 
 
50 
 
Figura 25 - Alinhamento local de uma sequência usando a ferramenta BLAST (Basic 
Local Alignment Search Tool). 
Fonte: Própria autora (2021). 
 
 
A Tabela 8 mostra as espécies identificadas nas amostras analisadas por 
sequenciamento. Foram obtidas sequênciasem 49 das 70 amostras de triatomíneos 
PRA-hsp65-positivas (70%), sendo 19 amostras para o gene hsp65 e 30 para o gene 
rpoB. Não houve amostras sequenciadas para ambos os genes. 
Foram identificados por sequenciamento 12 gêneros bacterianos. As 
espécies pertencentes ao gênero Mycobacterium foram detectadas em 18,4% (9/49) 
das amostras, sendo oito M. tuberculosis e um M. africanum. As nove amostras de 
triatomíneos positivas para o CMTB apresentaram identidade variando entre 99,4 e 
93,9%. O gênero Brevibacterium foi o mais frequente, sendo detectado em 24,5% 
(12/49) do total sequenciado, foram eles: Brevibacterium linens (7/49; 14,3%), 
Brevibacterium casei (2/49; 4,1%) e Brevibacterium sp. (3/49; 6,1%). Também foram 
identificados os gêneros Amycolatopsis, Brachybacterium, Corynebacterium, 
Cutibacterium, Dietzia, Gordonia, Kocuria, Microbacterium, Nocardiopsis, 
Streptomyces e Tsukamurella. A Tabela 9 mostra a concordância entre as espécies 
identificadas pelo sequenciamento e a identificação com o padrão obtido com a 
técnica PRA-hsp65. 
 
 
 
 
 
51 
 
Tabela 8 – Resultado das espécies bacterianas identificadas nas 49 amostras de 
triatomíneos determinadas por sequenciamento parcial genético. 
Espécie N (%) 
Mycobacterium tuberculosis 8 (16,3) 
Brevibacterium linens 7 (14,3) 
Cutibacterium acnes 6 (12,2) 
Amycolatopsis sp. 5 (10,2) 
Gordonia terrae 4 (8,2) 
Brevibacterium sp. 3 (6,1) 
Brachybacterium saurashtrense 2 (4,1) 
Brevibacterium casei 2 4,1) 
Corynebacterium glyciniphilum 2 (4,1) 
Dietzia sp. 2 (4,1) 
Microbacterium sp. 2 (4,1) 
Streptomyces ambofaciens 2 (4,1) 
Kocuria sp. 1 (2,0) 
Mycobacterium africanum 1 (2,0) 
Nocardiopsis alba 1 (2,0) 
Tsukamurella tyrosinosolvens 1 (2,0) 
Total 49 (100) 
 
Fonte: Própria autora (2021). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
52 
 
Tabela 9 – Concordância entre as espécies bacterianas identificadas pela técnica 
PRA-hsp65 e sequenciamento. 
Identificação por 
PRA-hsp65 
N (%) Sequenciamento N (%) 
BLAST - 
identidade (%) 
Complexo M. 
tuberculosis 
22 (31,4) 
 M. tuberculosis 6 (8,6) 99,4 - 93,9 
 M. africanum 1 (1,4) 99,7 
 
Corynebacterium 
glyciniphilum 
2 (2,9) 95,7 - 94,4 
 Brevibacterium sp. 2 (2,9) 94,9 - 93,1 
 Brevibacterium linens 1 (1,4) 94,7 
 Amycolatopsis sp. 1 (1,4) 94,8 
 Cutibacterium acnes 1 (1,4) 98,9 
 Gordonia terrae 1 (1,4) 97,6 
 Kocuria sp. 1 (1,4) 92,3 
 Brevibacterium casei 1 (1,4) 91,5 
 Não sequenciado 5 (7,1) - 
M. fortuitum / M. 
senegalense tipo 
1 
12 (17,1) 
 Cutibacterium acnes 2 (2,9) 98,0 - 95,5 
 Brevibacterium linens 2 (2,9) 97,2 - 87,5 
 Amycolatopsis sp. 2 (2,9) 99,0 
 Dietzia sp. 1 (1,4) 92,4 
 Nocardiopsis alba 1 (1,4) 88,4 
 Gordonia terrae 1 (1,4) 91,2 
 Não sequenciado 3 (4,3) - 
M. smegmatis/M. 
wolinski tipo 1/M. 
mageritense tipo 1 
9 (12,9) 
 Brevibacterium linens 3 (4,3) 98,1 - 95,7 
 Brevibacterium casei 1 (1,4) 95,9 
 Brachybacterium 
saurashtrense 
1 (1,4) 99,1 
 Streptomyces 
ambofaciens 
1 (1,4) 98,2 
 Microbacterium sp. 1 (1,4) 84,1 
 Tsukamurella 
tyrosinosolvens 
1 (1,4) 96,2 
 Não sequenciado 1 (1,4) - 
M. senegalense 8 (11,4) 
 Gordonia terrae 1 (1,4) 95,7 
 M. tuberculosis 1 (1,4) 99,2 
 Cutibacterium acnes 1 (1,4) 96,4 
 Brevibacterium linens 1 (1,4) 97,9 
 Amycolatopsis sp. 1 (1,4) 99,3 
 Não sequenciado 3 (4,3) - 
M. simiae / M, 
lentiflavum tipo 1 
6 (8,6) 
 Streptomyces 
ambofaciens 
1 (1,4) 
96,4 
 Microbacterium sp. 1 (1,4) 88,8 
 Dietzia sp. 1 (1,4) 90,7 
53 
 
 Cutibacterium acnes 1 (1,4) 95,0 
 Não sequenciado 2 (2,9) - 
M. agri tipo 1 5 (7,1) 
 M. tuberculosis 1 (1,4) 95,5 
 Brevibacterium sp. 1 (1,4) 90,7 
 Não sequenciado 3 (4,3) - 
M. gordonae tipo 2 5 (7,1) 
 Cutibacterium acnes 1 (1,4) 98,1 
 Amycolatopsis sp. 1 (1,4) 99,2 
 Não sequenciado 3 (4,3) - 
M. wolinsky / M. 
senegalense tipo 
1 / M. fortuitum 
2 (2,9) 
 Brachybacterium 
saurashtrense 
1 (1,4) 
95,4 
 Gordonia terrae 1 (1,4) 92,4 
M. triviale tipo 1 1 (1,4) - 
 Não sequenciado 1 (1,4) - 
Total 70 (100) 70 (100) 
Fonte: Própria autora (2021). 
 
Analisando as espécies de triatomíneos positivos para a detecção de 
micobactérias pertencentes ao CMTB, foram identificadas três espécies, onde a 
espécie P. lutzi foi predominante com 44,4% (4/9), seguida pela espécie T. brasiliensis 
com 33,3% (3/9) e T. pseudomaculata com 22,2% (2/9). Além disso, 77,8% (7/9) 
desses insetos eram triatomíneos adultos e 22,2 (2/9) eram ninfas. 
Analisando os dados de positividade de T. cruzi nos insetos analisados por 
sequenciamento, nenhuma das amostras positivas para o CMTB foram positivas para 
a detecção desse protozoário. 
 
5.5 Análise filogenética 
 
Os alinhamentos múltiplos entre sequências identificadas como CMTB e a 
regiões dos genes rpoB e hsp65 da cepa referência M. tuberculosis H37Rv é 
apresentada na Figura 26. A maioria das sequências apresentou alinhamento com 
elevada semelhança à sequência de M. tuberculosis H37Rv. A amostra 122 apesar 
de ter visualmente uma maior divergência no alinhamento múltiplo (FIGURA 26-B), 
apresentou identidade no BLAST de 99,4% com a espécie M. tuberculosis. 
 
 
54 
 
Figura 26 - Alinhamento múltiplo de sequências dos nucleotídeos das 9 amostras 
identificadas como complexo M. tuberculosis (CMTB) e M. tuberculosis H37Rv. 
 
 
Fonte: Própria autora (2021). Analisados com a ferramenta Clustal W Multiple Alignment. 
A. gene hsp65 (GroEL2). B. gene rpoB (Rv0667). 
 
As Figuras 27 e 28 apresentam as árvores filogenéticas entre as nove 
sequências identificadas como pertencentes ao CMTB e a sequências dos genes 
hsp65 e rpoB da cepa referência M. tuberculosis H37Rv. As amostras 137, 135 e 143 
55 
 
apresentaram elevada conservação com o gene hsp65 (FIGURA 27). As sequências 
obtidas com os iniciadores do gene rpoB apresentaram maior variabilidade em relação 
à cepa padrão (FIGURA 28). As sequências identificadas como M. africanum (MYCOF 
33) e amostra MYCOF 122 apresentaram maior distância em relação à cepa padrão. 
 
Figura 27 – Árvore de consenso para 100 “bootstraps” mostrando as relações 
filogenéticas entre sequências de hsp65 de micobactérias de triatomíneos de Sobral, 
Ceará, e a sequência da cepa padrão M. tuberculosis H37Rv. 
 
 
Fonte: Própria autora (2021). A árvore é baseada na comparação de uma sequência de 
411 pb do gene hsp65 do M. tuberculosis, usando o método “neighbor-joining” com o 
parâmetro Jukes-Cantor no programa MEGA-X versão 10.1.7 (Molecular Evolutionary 
Genetic Analysis, https://www.megasoftware.net/). Valores de % bootstrap são indicados 
em cada ramo da árvore. A distância entre duas cepas é a soma dos comprimentos dos 
ramos da árvore entre elas. 
 
 
 
56 
 
Figura 28 – Árvore de consenso para 100 “bootstraps” mostrando as relações 
filogenéticas entre sequências de rpoB de micobactérias de triatomíneos de Sobral, 
Ceará, e a sequência da cepa padrão M. tuberculosis H37Rv. 
 
 
Fonte: Própria autora (2021). A árvore é baseada na comparação de uma sequência de 
723 pb do gene rpoB do M. tuberculosis, usando o método “neighbor-joining” com o 
parâmetro Jukes-Cantor no programa MEGA-X versão 10.1.7 (Molecular Evolutionary 
Genetic Analysis, https://www.megasoftware.net/). Valores de % bootstrap são indicados 
em cada ramo da árvore. A distância entre duas cepas é a soma dos comprimentos dos 
ramos da árvore entre elas. 
 
 
5.6 Análise espacial 
 
A análise exploratória espacial foi executada com a construção dos 
seguintes mapas: 
a) distribuição espacial das 70 amostras de triatomíneos coletadas de 
acordo com a caracterização taxonômica e o local de captura (FIGURA 29); 
b) distribuição espacial das espécies bacterianas identificadas por 
sequenciamento das 49 amostras de triatomíneos (FIGURA 30); 
c) distribuição espacial dos 367 casos de TB detectados no período de 
2018 (N= 184) à 2019 (N=183) e do local de captura dos 70