PARASITOLOGIA CLINICA MATERIAL COMPLETO

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UNIDADE 1.
Cryptosporidium spp.
Patrícia E.R. Marzola
OBJETIVOS DA UNIDADE
· Reconhecer o Cryptosporidium spp;
· Correlacionar o parasito com a doença, incluindo seu histórico, ciclo biológico, epidemiologia, métodos diagnósticos, profilaxia e tratamento;
· Desenvolver os seus conhecimentos de modo que possam relacionar o quadro clínico com os sintomas.
TÓPICOS DE ESTUDO
O parasito: cryptosporidium spp. –
// Histórico
// Biologia
// Ciclo de vida
// Formas de transmissão e prevenção
A doença: criptosporidiose–
// Criptosporidiose
// Tratamento
// Epidemiologia
Métodos de diagnóstico–
// Diagnóstico clínico
// Diagnóstico histológico
// Diagnóstico laboratorial
O parasito: 𝘊𝘳𝘺𝘱𝘵𝘰𝘴𝘱𝘰𝘳𝘪𝘥𝘪𝘶𝘮 spp.
Este material foi elaborado com a intenção de auxiliar na compreensão das parasitoses oportunistas. Nesta unidade, você estudará sobre o Cryptosporidium spp., um complexo de espécies de parasitas intracelulares. 
Esse microrganismo tem um papel importante como agente etiológico de doenças diarreicas em crianças e em adultos imunodeficientes (BENAMROUZ e colaboradores, 2012).
A criptosporidiose foi incluída no relatório da Organização Mundial da Saúde como uma doença negligenciada, sendo a sexta doença parasitária de origem alimentar mais importante. As doenças negligenciadas normalmente ocorrem em países em desenvolvimento, sendo influenciadas pelo clima, pobreza e a falta de acesso a serviços básicos (FAO; WHO, 2014).
CONTINUE
HISTÓRICO
O Cryptosporidium spp. (“esporocisto oculto”) foi descrito pela primeira vez no estômago de ratos autopsiados pelo médico e patologista Ernest Edward Tyzzer, em 1907, e foi posteriormente denominado como Cryptosporidium muris. Em 1911, Léger descreveu a família Cryptosporidiidae após a identificação de outra espécie do mesmo gênero, o C. parvum, parasita de células intestinais de camundongos (DILLINGHAN e colaboradores, 2002).
Por muitos anos, a infecção pelo Cryptosporidium spp. foi considerada infrequente e insignificante (DILLINGHAM e colaboradores, 2002). No campo da veterinária, na década de 1950, relatou-se a associação entre a espécie C. meleagridis com a morbidade e mortalidade em perus. Na década de 1970, identificou-se a presença do C. parvum em bovinos e ovinos, tendo importância econômica pela diarreia neonatal (CHALMERS e colaboradores, 2019).
Em humanos, o Cryptosporidium foi reconhecido pela primeira vez no ano de 1976, em oito pessoas imunocomprometidas. Mas seu destaque foi a partir da década de 1980 e 1990, como causa de diarreia grave em pessoas com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A doença foi nomeada como criptosporidiose ou criptosporidíase (DILLINGHAM e colaboradores, 2002; TZIPORI; WIDMER, 2008).
DICA
No Sistema de Nomenclatura Internacional, utiliza-se “sp.” para citar uma espécie em particular e “spp.” para várias espécies (“spp.” significa “espécies no plural”). Apenas o gênero e a espécie devem ser escritos em itálico; as abreviaturas “sp.” e “spp.” não. Assim, nesta unidade, quando mencionarmos “Cryptosporidium spp.”, estaremos nos referindo ao grupo de espécies e genótipos (algumas espécies não foram descritas, mas têm o sequenciamento genético) pertencentes ao gênero Cryptosporidium.
BIOLOGIA
O Cryptosporidium spp. é um organismo unicelular, eucarionte, pertencente ao domínio Eukarya, à filo Apicomplexa, à classe Sporozoasida (Gregarinomorphea), à ordem Eucoccidiorida (Cryptogregarida), e à família Cryptosporidiidae. Você pode visualizar a hierarquia dessa classificação no Diagrama 1 (CHALMERS e colaboradores, 2019; CUNHA e colaboradores, 2019).
Diagrama 1. Taxonomia abreviada (Cryptosporidiidae)
Possivelmente, você já reparou que existem classificações diferentes do Cryptosporidium ou mesmo de outros seres vivos. Até a década de 1980, com a classificação proposta por Levy, a taxonomia dos seres vivos se baseava fundamentalmente em questões fenotípicas. Mas a análise fenotípica não conseguia responder muitas das questões relacionadas à taxonomia (ADL e colaboradores, 2005). Você consegue imaginar o porquê disso? Reflita um pouco sobre essa questão. 
É importante salientar que os avanços no campo da biologia molecular têm grande impacto na compreensão da biologia do Cryptosporidium spp., podendo alterar inclusive a forma de lidar, diagnosticar e tratar essa parasitose. A partir da década de 1980, houve um aumento gradual no uso de técnicas de análise molecular para classificação, com um boom na década de 2000. A partir disso, os pesquisadores vêm construído um novo sistema de classificação em um modelo que associa a morfologia e a análise molecular, agrupando os seres vivos de acordo com sua semelhança filogenética. Enfatiza-se que esse sistema ainda está em construção, por isso, você possivelmente notará diferenças na classificação dos seres vivos (ADL e colaboradores, 2005; BARTA e colaboradores, 2006).
Ainda nesse sentido, em 2005, a Sociedade Internacional de Protozoologia passou a não recomendar mais o uso do termo “protozoário” em taxonomia. Isso porque, justamente pelas análises moleculares, identificou-se que o grupo que antigamente era chamado de “Protista”, apesar de apresentar características fenotípicas semelhantes (unicelulares, eucariontes), não possuía origem evolutiva comum. Os vários membros desse antigo grupo têm sido hoje realocados em novos grupos, embora alguns ainda estejam sob investigação. Vale mencionar que muitos autores ainda utilizam a nomenclatura genérica “protozoários” para se referirem aos seres unicelulares eucariontes. Mas é importante lembrar que esse termo não tem valor taxonômico (ADL e colaboradores, 2005; BARTA e colaboradores, 2006).
Ainda nesse sentido, em 2005, a Sociedade Internacional de Protozoologia passou a não recomendar mais o uso do termo “protozoário” em taxonomia. Isso porque, justamente pelas análises moleculares, identificou-se que o grupo que antigamente era chamado de “Protista”, apesar de apresentar características fenotípicas semelhantes (unicelulares, eucariontes), não possuía origem evolutiva comum. Os vários membros desse antigo grupo têm sido hoje realocados em novos grupos, embora alguns ainda estejam sob investigação. 
Vale mencionar que muitos autores ainda utilizam a nomenclatura genérica “protozoários” para se referirem aos seres unicelulares eucariontes. Mas é importante lembrar que esse termo não tem valor taxonômico (ADL e colaboradores, 2005; BARTA e colaboradores, 2006).
O grupo Apicomplexa representa hoje os importantes parasitas obrigatórios unicelulares, incluindo os gêneros Plasmodium, Toxoplasma, Isospora, Sarcocystis, Cyclospora e Babesia. Contudo, esse é um grupo polifilético (vários membros sem origem evolutiva em comum por classificação inadequada) que possivelmente também sofrerá modificações nos próximos anos. Quanto ao Cryptosporidium spp., especificamente, existem várias evidências de que ele seja distinto de outros membros do grupo, apesar de ainda ser classificado dessa mesma forma (ADL e colaboradores, 2005; CHALMERS e colaboradores, 2019; LEITCH; HE, 2012).
Os parasitas pertencentes ao grupo Apicomplexa, incluindo o Cryptosporidium spp., apresentam uma organela chamada de complexo apical, constituído de anéis polares, roptrias, micronemas, microtúbulos e conóides. Essa estrutura normalmente está envolvida nas interações parasita-hospedeiro, pois é a responsável pela fixação do parasita na célula hospedeira (BOUZID e colaboradores, 2013; REY, 2018).
Até pouco tempo atrás, esse patógeno era considerado um Coccídeo, mas algumas características genéticas têm aproximado esse gênero à subclasse Gregarinasina. Além de estudos de análise filogenética, com base na sequência do gene que codifica a subunidade pequena do ácido ribonucleico ribossômico ou SSU rRNA, existem características únicas que diferenciam o gênero dos demais Coccidianos, como a resistência aos fármacos, a capacidade de autoinfecção e a localização particular no interior da membrana da célula hospedeira (CHALMERS e colaboradores, 2019).
O gênero Cryptosporidiumconsiste em um conjunto de, pelo menos, 40 espécies de parasitas gastrointestinais intracelulares, capazes de infectar aves, répteis, peixes e mamíferos (TZIPORI; WIDMER, 2008). Originalmente, a atribuição de espécies dentro do gênero Cryptosporidium baseava-se em características fenotípicas, como a especificidade do hospedeiro e a morfologia do oocisto. Contudo, sabe-se hoje que a maioria das espécies de Cryptosporidium apresenta semelhança morfológica. Em função disso, para classificação taxonômica, ou diagnóstico a nível de espécie, são necessários métodos moleculares em conjunto com estudos morfológicos e biológicos (CHALMERS e colaboradores, 2019; LEITCH; HE, 2012; RAMIREZ e colaboradores, 2004; RYAN e colaboradores, 2014). 
Aproximadamente 20 espécies de Cryptosporidium têm potencial de infecção em humanos, mas cerca de 90% dos casos de criptosporidiose humana são provocadas pelo C. hominis e C. parvum. Observe no Quadro 1 as principais espécies de Cryptosporidium, encontradas em infecções em humanos (LEITCH; HE, 2012; RYAN e colaboradores, 2014).
Quadro 1. Espécies de Cryptosporidium encontradas em infecções humanas. Fonte: CUNHA e colaboradores, 2019. (Adaptado).
O Cryptosporidium spp. apresenta duas formas principais, dependo do estágio de vida que se encontra: os oocistos, que são as formas de resistência; e os trofozoítos, que são as formas vegetativas capazes de infectar as células do hospedeiro. O oocisto tem cerca de 4-6 µm, dependendo da espécie, o que representa um terço do tamanho de um cisto da Giardia sp. Em função disso, os oocistos de Cryptosporidium spp. são uma grande ameaça para a indústria de tratamento de água, que utiliza o tamanho do cisto de Giardia sp. como parâmetro. Isso exige critérios cada vez mais rígidos e onerosos para os padrões de turbidez (DILLINGHAM e colaboradores, 2002). Observe na Figura 1 algumas imagens de microscopia do oocisto, com diferentes colorações.
Figura 1. Oocisto de Cryptosporidium spp. Fonte: CDC, 2019a. Acesso em: 08/09/2020. (Adaptado).
Observe que: (1) na seta amarela, o oocisto; na seta vermelha, cistos de Giardia duodenalis. Ambos marcados com anticorpos imunofluorescentes; (2) Oocisto (setas rosa) em montagem úmida. Na seta marrom, levedura; (3) Oocistos de Cryptosporidium parvum corados com ácido-resistente modificado. Contra um fundo azul esverdeado, os oocistos se destacam em uma mancha vermelha brilhante; (4) Oocistos corados com ácido-resistente modificado; (5) Oocistos corados com coloração tricrômica. Com a técnica, os oocistos podem ser detectados, mas não devem ser confirmados, uma vez que esse método é inadequado para um diagnóstico definitivo (oocistos sem coloração). Aqui, os oocistos de Cryptosporidium são representados por setas vermelhas; a seta azul representa a levedura; (6) Oocistos de Cryptosporidium parvum corados com a coloração fluorescente auramina-rodamina. 
CICLO DE VIDA
O patógeno apresenta um ciclo monoxênico, ou seja, tanto o ciclo sexuado quanto o assexuado se sucedem no trato gastrointestinal de um único hospedeiro. Antes de continuar a leitura deste tópico, relembre no Diagrama 2 alguns dos principais conceitos necessários para compreender o ciclo de vida do Cryptosporidium spp. (REY, 2018).
O ciclo assexuado ocorre quando o hospedeiro susceptível ingere o oocisto do Cryptosporidium spp. No trato intestinal, por ação enzimática proteolítica, de sais biliares e por condições relacionadas à redução dióxido de carbono e alteração na temperatura, ocorre a liberação de quatro esporozoítos infectantes. Os esporozoítos liberados deslizam sobre as células intestinais, liberando material do complexo apical. Isso permite que os esporozoítos migrem pela superfície das células hospedeiras e as invadam ativamente (BOUZID e colaboradores, 2013; TAYLOR, 2017).
Dentro da célula hospedeira, cada esporozoíto se desenvolve em um trofozoíto esférico, que sofre merogonia e forma um meronte tipo I, contendo oito merozoítos que são liberados e se fixam novamente à superfície de uma célula epitelial, onde sofrem novamente a merogonia e formam um meronte do tipo I ou um meronte do tipo II. O meronte do tipo II contém quatro merozoítos (BOUZID e colaboradores, 2013; TAYLOR, 2018).
Esses merozoítos (meronte do tipo II), quando liberados, ligam-se novamente à célula epitelial, mas em vez de se desenvolverem em outros merontes, iniciam o processo de gametogonia, produzindo microgamontes ou macrogamontes. Cada microgamonte sofre divisão nuclear e se diferencia para formar até 16 microgametas, que, quando liberados do vacúolo parasitóforo, fertilizam um macrogametócito unicelular que se desenvolveu a partir de um macrogamonte (fertilização) (BOUZID e colaboradores, 2013).
O produto da fertilização, o zigoto, passa por dois ciclos assexuados de esporogonia e produz um oocisto contendo quatro esporozoítos. A parede dos oocistos formados pode ser de dois tipos: espessa ou fina. Os oocistos de paredes espessas são liberados no lúmen do intestino e são excretados nas fezes do hospedeiro. Eles são imediatamente infectantes, permitindo a disseminação da infecção para outros hospedeiros, dando continuidade ao ciclo. Já os oocistos com paredes finas são responsáveis pela manutenção da infecção nas paredes internas, a chamada autoinfecção (BOUZID e colaboradores, 2013). 
Diagrama 2. Estágios de desenvolvimento do Cryptosporidium spp. 
	ASSISTA
No vídeo Cryptosporidium Infected Organoids você poderá visualizar uma animação em que o Cryptosporidium parvum infecta células epiteliais derivadas do intestino delgado e do pulmão humanos. O parasita se propaga dentro das organelas celulares e completa seu ciclo de vida (assexuado e sexual).
FORMAS DE TRANSMISSÃO E PREVENÇÃO
O Cryptosporidium spp. vive no intestino animais infectados (inclusive nos humanos). Cada hospedeiro pode lançar, pelas fezes, milhões de parasitas no ambiente. Essa liberação pode ocorrer logo que os sintomas da criptosporidiose iniciam, podendo durar semanas após o fim da sintomatologia (CDC, 2019b).
Ao relembrar o ciclo biológico desse microrganismo, você deve conseguir compreender a forma de transmissão da doença: pela ingestão dos oocistos do Cryptosporidium spp. Mas de que forma isso pode acontecer? Em geral, a transmissão ocorre pela via fecal-oral pelos seguintes tipos de transmissões:
- Antroponótico: de humano para animal e humano para humano.
- Zoonótico: de animal para humano.
- Entre animais.
- Entre humanos (BOUZID e colaboradores, 2013).
A transmissão envolve o contato com material contaminado por fezes de parasito, incluindo na água (tratada ou não tratada, sendo maior o risco na água não tratada), nos alimentos (especialmente frutas e leite não pasteurizado) e nos objetos (roupas, calçados, fraldas, superfícies contaminadas). Também ocorre por meio da contaminação ambiental, como presença de fezes contaminadas em esgoto, piscinas, água residual, lama e transbordamento após chuvas fortes. Existem relatos na literatura de transmissão por “vetores mecânicos”, que podem ocorrer por baratas, moscas, besouros e escaravelhos (BOUZID e colaboradores 2013).
Outro modo de transmissão é pela inalação de oocistos. Essa forma foi relatada em indivíduos adultos e crianças imunocomprometidas, sendo possivelmente relacionada com a aspiração de vômito contendo o oocisto. Os sintomas, nesses casos, estão associados à via respiratória (laringotraqueíte) e podem ser acompanhados de diarreia leve (BOUZID e colaboradores, 2013). 
De acordo com o Center for Disease, Control and Prevention (CDC, 2019b), nos Estados Unidos, os surtos de diarreia por criptosporidiose estão relacionados principalmente com os seguintes fatores:
 35% - Uso de piscinas coletivas.
15% - Contato com gado.
13% - Cuidado de crianças pequenas infectadas.
A prevenção da criptosporidiose é muito difícil, pois o Cryptosporidium spp. é um parasita extremamente resistente, sendo capaz de sobreviver por longos períodos em diferentes ambientes. Isso dificulta a vigilância e prevenção da doença.
A higiene das mãoscom água e sabão consiste na forma mais eficaz de prevenção, apesar de muitas vezes ser insuficiente pelos inúmeros meios de transmissão indiretos do parasito. É importante mencionar que o Cryptosporidium spp. é resistente ao cloro, álcool e a muitos desinfetantes comerciais à base de aldeído e amônia (CDC, 2019b; CHEN e colaboradores, 2002).
A maioria dos métodos convencionais de tratamento de água não removem nem eliminam efetivamente todos os oocistos. Por isso, são recomendados teste de rotina para avaliar a presença do parasito na água em todas as estações de tratamento (CHEN e colaboradores, 2002).
No Quadro 2, você pode conferir outras importantes formas de profilaxia da doença, que foram divididas em prevenção de contaminação por via hídrica; por via alimentar; e outras formas de prevenção
Quadro 2. Profilaxia da criptosporidiose. Fonte: CDC, 2020b; RAMIREZ e colaboradores, 2004 (Adaptado).
A doença: criptosporidiose
O Cryptosporidium spp. é um parasita oportunista, de importância médica e veterinária, que causa gastroenterite em diversos hospedeiros vertebrados. É considerado tanto como uma doença alimentar quanto por veiculação hídrica. Pode apresentar diferentes graus de patogenicidade e virulência entre suas espécies, assim como a variação na suscetibilidade do hospedeiro à infecção. A imunidade e o nível nutricional dos infectados estão associados com a severidade e evolução da doença. Enquanto nos imunocompetentes a infecção costuma ser branda ou assintomática, nos imunodeprimidos, muitas vezes, há a necessidade de intervenção terapêutica.
Nesta seção, será abordada a patogênese, o tratamento e a epidemiologia da criptosporidiose. Contudo, apesar da magnitude e gravidade da criptosporidiose, sua patogênese ainda é mal compreendida, não existindo uma terapia medicamentosa que seja totalmente eficaz (CHEN e colaboradores, 2002).
CRIPTOPORIDIOSE
Como mencionado, a infecção pelo Cryptosporidium spp. ocorre com a ingestão das formas denominadas oocistos. Após essa ingestão, há um período de incubação que depende de fatores relacionados ao patógeno e ao hospedeiro, variando de 3 a 12 dias. Uma pequena quantidade (1 a 10) de oocistos já é capaz de causar a infecção (CHALMERS e colaboradores, 2019).
Na criptosporidiose, a resposta imunológica está relacionada tanto com a imunidade humoral quanto à inata. A resposta inata, também chamada de celular, ocorre principalmente por resposta inflamatória. As citocinas e quimiocinas aumentam a expressão de ciclo-oxigenase do tipo 2 (COX-2) e, consequentemente, de prostaglandinas. O aumento das prostaglandinas aumenta a produção de mucina, fato que prejudica a invasão celular pelos esporozoítos (SIQUEIRA-BATISTA, 2020; CHECHKLEY e colaboradores, 2015).
No que se refere à imunidade humoral, as células T CD4+ são importantes para o controle da infecção pelo Cryptosporidium spp. Em indivíduos com níveis de CD4+ maiores que 180 células/ml, a doença tende a ser autolimitada. Quando esses níveis são menores, ela tende a ser crônica e, em alguns casos, fulminante. Isso ocorre principalmente em pessoas com HIV ou imunodeprimidas/imunossuprimidas. As células T CD8 têm menor relevância na infecção por Cryptosporidium spp., apesar de serem importantes para a produção de interferon gama (IFN-γ) (CHECHKLEY e colaboradores, 2015).
Normalmente, o parasito não causa uma infecção sistêmica, nem penetra no tecido profundo. A invasão da célula hospedeira restringe-se ao lúmen dos enterócitos, localizados na porção terminal do íleo e proximal do cólon. A infeção induz a morte das células epiteliais, com consequente atrofia das vilosidades. Esse dano pode ser resultado da lesão direta às células epiteliais do hospedeiro, ou pode ser indireto por meio do efeito de células inflamatórias e citocinas recrutadas para o local da infecção. 
Como consequência, ocorre o deslocamento das microvilosidades e a perda da superfície epitelial, causando anormalidades significativas nas funções de absorção e secreção do intestino. A diarreia induzida por Cryptosporidium spp. está associada diretamente com essa absorção intestinal prejudicada e com o aumento da secreção (BOUZID e colaboradores., 2013; CHALMERS e colaboradores, 2019; CHEN e colaboradores, 2019).
Em pessoas imunodeficientes ou imunossuprimidas, o patógeno pode ser encontrado ao longo de todo o intestino e em regiões extraintestinais, como na região biliar e brônquica (CHECHKLEY e colaboradores, 2015). Observe no Quadro 3 as principais formas de manifestação da criptosporidiose.
Quadro 3. Tipos de manifestações da criptosporidiose. Fonte: FLANIGAN e colaboradores, 1992. (Adaptado).
Até o momento, não foram identificados claramente os fatores de virulência específicos do Cryptosporidium spp. Isso ocorre principalmente porque, ao contrário de outros organismos do Filo Apicomplexa, é muito difícil empregar técnicas de cultivo in vitro e genética reversa com esse parasita (CHECHKLEY e colaboradores, 2015).
A infecção pode ser persistente por vários meses. Estudos mostram que os níveis do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) presentes nas fezes de crianças mantêm-se elevados por seis meses subsequentes à infecção. Possivelmente, é em decorrência disso que pode ocorrer a desnutrição e nanismo em crianças com criptosporidiose (SIQUEIRA-BATISTA e colaboradores, 2020).
É importante lembrar que a severidade dos sintomas está diretamente relacionada com a imunidade e o grau de desnutrição do indivíduo. Algumas manifestações atípicas podem ser identificadas em pessoas imunocompetentes e imunodeficientes, como a pancreatite aguda e crônica e a criptosporidiose pulmonar. Em humanos, a criptosporidiose pulmonar pode resultar em insuficiência respiratória e morte (LEITCH; HE, 2012).
TRATAMENTO
Em indivíduos imunocompetentes, os sinais e os sintomas da criptosporidiose são autolimitados e geralmente diminuem em menos de duas semanas. A reidratação oral ou intravenosa é a forma de tratamento mais importante para diminuir os sinais clínicos da criptosporidiose (LEITCH; HE, 2012).
Em casos muito graves de diarreia aquosa, recomenda-se o tratamento sintomático, como reposição de líquidos e eletrólitos e agentes como a octreotida parenteral para reduzir a diarreia. O suporte nutricional pode ser necessário em casos de má absorção grave (LEITCH; HE, 2012).
Nos indivíduos com HIV/AIDS, frequentemente ocorre a melhora da infecção após a adequação da terapia antirretroviral. Contudo, podem ocorrer recidivas, caso a contagem do CD4+ diminua. Dessa forma, sabe-se que a reconstituição imunológica é essencial para a resolução completa da infecção em tais pessoas (LEITCH; HE, 2012).
Inúmeros medicamentos têm sido utilizados nas últimas décadas para tratamento da criptosporidiose, como sinefungina, azitromicina, paromomicina e roxitromicina. Entretanto, apesar do avanço das pesquisas in vitro, nem todos esses esquemas tiveram comprovação de eficácia por meio de ensaios clínicos randomizados. Uma das razões para resistência e ineficácia dos medicamentos é que esse parasita é intracelular, mas se localiza no sítio extracitoplasmático. A hipótese é que as drogas entram no citoplasma da célula hospedeira, mas não conseguem atravessar a membrana do Cryptosporidium spp. (HEWWIT e colaboradores, 2000; LEITCH; HE, 2012).
A nitazoxanida é um medicamento que reduz a duração da diarreia e excreção de oocistos em relação ao placebo. O Food and Drug Administration (FDA) aprovou o uso desse medicamento para o tratamento de diarreia pediátrica causada por C. parvum e Giardia lamblia em crianças de um a 11 anos de idade. No entanto, a segurança e eficácia ainda não foi determinada para pacientes adultos ou imunodeprimidos, mesmo quando usada em altas doses e por períodos prolongados (CUNHA e colaboradores, 2018; RAMIREZ e colaboradores, 2004).
EPIDEMIOLOGIA
A criptosporidiose é altamente prevalente e tem ampla distribuição global. A distribuição varia conforme a área geográfica e as condições socioeconômicas. A prevalência em países em desenvolvimento variaentre 4 a 32%; já nos países desenvolvidos, varia entre 0,6 a 20%. Também existe diferença na prevalência nas zonas urbana e rural, considerando ainda a época do ano (períodos com maior quantidade de chuva). No Brasil, a doença não é de notificação compulsória, como ocorre no Reino Unido ou na Alemanha. Assim sendo, existem poucos dados sobre sua incidência e prevalência (REY, 2018; RYAN e colaboradores, 2014).
Em pessoas com HIV (vírus da imunodeficiência humana), a prevalência da coinfecção com o Cryptosporidium spp. é de 11,2%, o que indica que existem aproximadamente quatro milhões infectados no mundo. Na África e no Haiti, 50% dos indivíduos com HIV têm criptosporidiose (AHMADPOUR e colaboradores, 2020; REY, 2018).
Globalmente, estima-se que a criptosporidiose seja responsável por 30 a 50% das mortes em crianças menores de cinco anos e é considerada a segunda maior causa de diarreia e morte em crianças após o rotavírus (RYAN; HIJAWI, 2015).
Um estudo epidemiológico, que avaliou mais de 22.000 bebês e crianças na África e na Ásia, descobriu que Cryptosporidium foi um dos quatro patógenos responsáveis pelas diarreias severas em crianças. Nesse estudo, o risco de morte (Hazard Ratio) das crianças de 12 a 23 meses foi dois a três vezes maior do que as sem a infecção (KOTLOFF e colaboradores, 2013).
Em países desenvolvidos, grande parte dos casos da infecção está relacionado com poluição hídrica.  O Cryptosporidium spp. é encontrado em aproximadamente 80 a 97% das águas superficiais. Nas águas tratadas, o percentual varia de 26 a 54%, o que é preocupante para os sistemas de saúde.
O maior surto registrado e relatado da doença ocorreu em Milwaukee, nos Estados Unidos, envolvendo 403.000 pessoas, em abril de 1993. Esse surto teve relação com contaminação em uma estação de tratamento de água (PEREIRA e colaboradores, 2009).
CURIOSIDADE
Apesar da criptosporidiose ser muitas vezes negligenciada, ela tem um importante papel mundial como doença epidêmica. O Cryptosporidium spp. é responsável por até 6% de todas as doenças diarreicas em pessoas imunocompetentes. Nas pessoas com AIDS, o parasito é responsável por 24% dos casos de diarreia. Nos Estados Unidos, a taxa de hospitalização pelo Cryptosporidium é de 25% e a de mortalidade, de 0,3%. (FAO/WHO, 2014).
Com base no que estudamos nesse tópico, reflita sobre as seguintes questões: apesar da criptosporidiose ter uma ampla distribuição global, qual a razão de os países em desenvolvimento apresentarem maior morbimortalidade? Por que é difícil controlar um surto dessa doença?
Métodos de diagnóstico
A criptosporidiose é uma doença entérica autolimitada em indivíduos imunocompetentes. Seus sintomas não são patognomônicos, portanto é preciso realizar análise laboratorial para confirmar o diagnóstico. Nesta seção iremos abordar os métodos de diagnóstico clínicos, histológicos e laboratoriais da criptosporidiose (RAMIREZ e colaboradores, 2004).
DIAGNÓSTICO CLÍNICO
O diagnóstico clínico é difícil, visto que os sinais e sintomas da criptosporidiose não são patognomônicos, facultando inúmeros diagnósticos diferenciais.
Na suspeita de criptosporidiose, deve-se também analisar a possibilidade de infecção pelos seguintes agentes: Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Salmonella, Shigella, Campylobacter jejuni, Yersinia spp., Cyclospora cayetanensis e microsporídeos (BRASIL, 2010).
A doença geralmente é caracterizada pela presença de diarreia aquosa e uma variedade de sintomas, como dor abdominal, perda de peso, náuseas, vômitos, febre e mal-estar. Alguns indivíduos não apresentam qualquer sintoma (BRASIL, 2010).
O Cryptosporidum spp. é um parasito oportunista, aproveitando-se da situação imunológica das pessoas para se proliferar. Dessa forma, é preciso atentar-se ao diagnóstico de criptosporidiose principalmente em indivíduos imunocomprometidos/imunossuprimidos, que podem desenvolver formas mais graves. Esse grupo consiste em pessoas com (CDC, 2019b):
· HIV/AIDS;
· Doenças hereditárias que afetam o sistema imunológico, como a agamaglobulinemia congênita, deficiência de IgA congênita;
· Câncer, com uso de medicamentos imunossupressores;
· Transplantados, com uso de medicamentos imunossupressores;
· Desnutrição, especialmente crianças menores de cinco anos.
Diagnóstico histológico
Inicialmente, o diagnóstico da criptosporidiose era realizado por meio da observação histológica das formas de desenvolvimento intracelular, em material de autópsia ou em biópsias de tecido intestinal (O'DONOGHUE, 1995).
Em cortes de tecido, o diagnóstico é feito pela demonstração de Cryptosporidium spp. na borda em escova da mucosa intestinal. Os parasitas aparecem como estruturas pequenas, basofílicas e esféricas, medindo de 3 a 5 μm (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
Não são necessárias colorações especiais de análise histológica, mas essas podem facilitar a triagem. As técnicas de PCR e imuno-histoquímica também podem ser realizadas em seções de tecido embebidas em parafina (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
Atualmente, o diagnóstico histológico não é usado com frequência em função de inúmeras desvantagens. O procedimento de coleta do material é muito invasivo, exige um processamento cuidadoso da amostra e está sujeito à alta probabilidade de erro amostral, pois apenas algumas regiões do intestino são infectadas. Além disso, a técnica é cara e demorada, inadequada para o diagnóstico rotineiro (CHEN e colaboradores, 2002; KHURANA; CHAUDHARY, 2018; O'DONOGHUE, 1995).
Diagnóstico laboratorial
Existem inúmeros métodos diagnósticos para Cryptosporidium spp. A seleção de teste depende de vários atributos e dos recursos disponíveis, incluindo conhecimento técnico, tempo de resposta, desempenho em modo de lote, tempo prático, custo de insumos por teste ou lote e equipamento especializado.
Antes da análise do material, geralmente é necessário realizar a preparação da amostra. No infográfico visualizado no Quadro 4, você pode observar algumas medidas que devem ser realizadas no processamento da amostra com suspeita de Cryptosporidium spp. (BOUZID e colaboradores, 2013).
Quadro 4. Infográfico do processamento das fezes de Cryptosporidium spp.
// Microscopia óptica
O diagnóstico do Cryptosporidium spp. no exame parasitológico de fezes analisa a morfologia do oocisto. Contudo, essa não é definitiva para a identificação da espécie, pois os oocistos são muito pequenos e podem apresentar variações morfológicas imperceptíveis. Os oocistos também podem ser morfologicamente idênticos entre as diferentes espécies.
A especificidade da microscopia depende prioritariamente da habilidade do microscopista em diferenciar oocistos de outros corpos em esfregaços corados com tintorial inespecíficos ou reagentes fluorescentes (BOUZID e colaboradores, 2013).
// Exame de montagem úmida
O Cryptosporidium spp. pode ser identificado tanto nas amostras de fezes preservadas quanto nas não preservadas. Embora os oocistos possam ser detectados por microscopia de luz ou microscopia de contraste de fase, na maioria das vezes eles são perdidos sem coloração. Na microscopia de luz, eles são vistos como corpos lisos, incolores e esféricos ou ligeiramente ovoides, com tamanho que varia de 3 a 8μm, dependendo da espécie (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
Para aumentar a sensibilidade da microscopia, deve-se reduzir os detritos pela concentração de oocistos nas fezes. Para isso, são recomendados os métodos de centrifugação, flotação de sacarose de Sheather, flotação de sal saturado e o método de formol-éter de Allen e Ridley (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
// Métodos de coloração
Existem muitos procedimentos de coloração descritos para facilitar a detecção dos oocistos. Os corantes de Romanowsky, como o de Giemsa e Jenner, foram os primeiros a ser usados para a identificação dos oocistos. Com essa coloração, visualiza-se o oocisto semitranslúcido, com um halo estreito e claro ao seu redor. Às vezes, as formas "fantasmas" podem ser encontradas com uma aparência de vidro fosco sem grânulos. Essa técnica é fácil e não invasiva, contudo, apresentabaixa sensibilidade e especificidade (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
A coloração acid-fast modificada (AF) é amplamente utilizada pelo seu baixo custo e por se tratar de uma metodologia simples. Sua sensibilidade é relativamente baixa em fezes, sendo possível melhorá-la entre 10 a 100 vezes se as lâminas forem preparadas sob luz ultravioleta com filtro de rodamina (BOUZID e colaboradores, 2013; RAMIREZ e colaboradores, 2004).
A coloração ácido-resistente de Ziehl-Neelsen (mZN), também é usada para identificar o oocisto que aparece como esférulas vermelhas contra o fundo verde pálido do slide. O grau de coloração obtido pelo oocisto individual varia e pode ser confundido com várias estruturas, como detritos fecais, células de levedura e esporos bacterianos. Nessa técnica, apenas as estruturas internas dele, como esporozoítos e corpo residual, são vermelhas, enquanto os vazios permanecem sem coloração, reduzindo sua sensibilidade (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
A coloração auramina-fenol é uma alternativa à coloração mZN. Trata-se de um procedimento rápido e mais sensível que o método mZN, e pode ser usado como uma técnica de triagem simples e rápida (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
// Microscopia eletrônica
A microscopia eletrônica normalmente não é usada em função do custo do equipamento, do custo de instalação, do processamento complexo e da impossibilidade de analisar grande número de amostras. Contudo, em alguns casos pode ser valiosa, como na identificação a nível populacional do parasito em meio a surtos (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
// Técnicas imunológicas
Os testes imunológicos têm sido utilizados em substituição à análise microscópica em fezes para pesquisa de oocistos ou de antígenos solúveis. Esses testes apresentam melhor sensibilidade e especificidade, têm tempo reduzido de análise, mas possuem custo mais elevado quando comparados às técnicas tradicionais de coloração (BOUZID e colaboradores, 2013).
Os métodos imunológicos podem ser baseados na detecção de antígeno ou de anticorpos e têm boa sensibilidade e especificidade na faixa de 93% a 100%. Os testes de detecção de antígenos são úteis para o diagnóstico de infecção aguda. Já os testes de detecção de anticorpos são melhores em inquéritos soroepidemiológicos (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
A maioria dos anticorpos monoclonais disponíveis comercialmente são produzidos contra C. parvum. Portanto, as amostras negativas devem sempre ser confirmadas por métodos convencionais ou métodos de reação em cadeia da polimerase (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
Os kits para detecção de antígenos baseados nos anticorpos marcados com enzima estão disponíveis comercialmente para os formatos de imunoensaio enzimático e de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou imunocromatográfico (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
Os kits de imunoabsorção enzimática (ELISA) apresentam sensibilidade variada, porém com boa especificidade, oscilando de 98% a 100%. Ainda, é possível processar um grande número de amostras em um curto período de tempo. A sensibilidade e especificidade dos ensaios imunocromatográficos são muito semelhantes aos da ELISA (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
Dessa forma, para facilitar o diagnóstico diferencial, são disponibilizados comercialmente kits de imunoensaio enzimáticos e imunocromatográficos que identificam, além do Cryptosporidium spp., a Giardia sp. e a Entamoeba histolytica. Esses testes são podem ser realizados em amostras frescas, congeladas ou conservadas em formalina. Eles oferecem a vantagem de curto tempo de teste e resultados múltiplos em um dispositivo de reação (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
É importante lembrar, especialmente quando utilizar os testes rápidos, que as reações positivas devem ser confirmadas usando um teste confirmatório adequado. Também é preciso estar ciente dos potenciais problemas com falsos positivos e interpretar os resultados com cautela (BOUZID e colaboradores, 2013).
// Métodos moleculares
Os métodos moleculares são os únicos capazes de diferenciar espécies e genótipos de Cryptosporidium. Normalmente, são usados em investigações epidemiológicas e tipagem genética. A vantagem dessas tecnologias é que oferecem a sensibilidade e especificidade altas, sem a necessidade de profissionais altamente treinados. Além disso, as infecções podem ser detectadas mesmo na ausência de suspeita clínica (BOUZID e colaboradores, 2013; CDC, 2019b).
A PCR é uma técnica que revolucionou os diagnósticos dessa enteropatia: é sensível, com a faixa de detecção de um a 106 oocistos, é relativamente rápida e permite a especiação, que é muito importante do ponto de vista epidemiológico. Como alternativa, é possível realizar a PCR em tempo real, o que proporciona resultados ainda mais rápidos, tendo menor chance de contaminação com amplicons pelo formato de sistema fechado de ensaio, dispensando a análise dos fragmentos amplificados por eletroforese em gel de agarose, permitindo a visualização dos resultados preliminares antes do término da reação. Ademais, permite a estimação do grau de contaminação do ambiente (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
O painel de patógenos gastrointestinais é um kit capaz de rastrear simultaneamente patógenos causadores de diarreia, compreendendo nove bactérias, quatro vírus e três parasitas (incluindo o Cryptosporidium spp.), diretamente de amostras fecais (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
Em casos de surtos decorrentes de contaminação da água, é possível realizar a detecção do patógeno em uma amostragem de grande volume (10 a 1.000 litros), com concentração por filtração e uso de esferas magnéticas revestidas com quitina ou anticorpos específicos. A detecção é feita geralmente por microscopia fluorescente indireta ou por técnicas moleculares como PCR (KHURANA; CHAUDHARY, 2018).
// Segurança de laboratório
O oocisto do Cryptosporidium spp. é resistente e infeccioso quando produzido. Assim, há um risco de infecção para os profissionais que trabalham no laboratório por ingestão acidental ou aerossolização. Observe no infográfico disponível no Quadro 5 algumas precauções recomendadas pelos profissionais que trabalham com amostras possivelmente contaminadas com esse parasito.
Quadro 5. Precauções ao trabalhar como Cryptosporidium spp. Fonte: CDC, 2019b (Adaptado). Acesso em: 05/10/2020.
SINTETIZANDO
O Cryptosporidium spp. é um parasita oportunista, unicelular e eucarionte. Sua classificação está em processo de mudança e isso tem grande significado não apenas para sua taxonomia, mas também para avanços no diagnóstico, compreensão da patogenia, tratamento e prevenção. As classificações antigas, baseadas apenas em características fenotípicas, eram insuficientes, pois muitas vezes não estarem relacionadas com uma origem evolutiva comum, o que pode influenciar na resposta a um fármaco por um microrganismo, por exemplo, a sua forma de fixação, à presença de proteínas de membrana etc. Por isso, o estudo da biologia de um patógeno depende muito do avanço no campo da biologia molecular.
A doença relacionada com o gênero Cryptosporidium spp., a criptosporidiose, é endêmica em muitos países e tem grande potencial de ocasionar surtos epidêmicos. Países em desenvolvimento normalmente apresentam piores índices da doença. A manifestação clínica mais comum é a diarreia, mas pode incluir desde febre a sintomas respiratórios.
Normalmente, a doença é autolimitada em indivíduos imunocompetentes. Pessoas imunossuprimidas/imunodeprimidas podem desenvolver formas crônicas e em alguns casos fulminantes, podendo inclusive ir a óbito. Essa enteropatia é uma doença comum em crianças, especialmente as menores de cinco anos e desnutridas. Os sintomas estão relacionados ao trato gastrointestinal, como diarreia, vômitos e desidratação. Em alguns casos, é possível a ocorrência de infecção grave pulmonar ou hepática.
Na maioria das vezes, não é necessário tratamento medicamentoso. Em crianças menores de cinco anos ou pessoas imunossuprimidas/imunodeprimidas, podem ocorrer manifestações graves. Nesses grupos, muitas vezes é preciso realizar alguma intervenção, como a hidratação oralou venosa. Alguns medicamentos têm sido usados nos últimos anos para tratamento da parasitose, mas a maioria não apresenta resultados de eficácia comprovados. Para crianças, o medicamento que se apresentou eficaz até o momento é a nitazoxanida.
A principal forma de prevenção dessa parasitose é a higiene adequada das mãos com água e sabão. No entanto, pelas inúmeras formas indiretas de contaminação, é difícil manter métodos adequados de profilaxia. Além disso, o oocisto do Cryptosporidium spp. é resistente a cloro, álcool e a inúmeros desinfetantes comerciais. 
O diagnóstico da doença pode ser realizado por diversas técnicas, incluindo histologia, microscopia óptica e técnicas imunológicas e moleculares. A escolha do melhor método depende de inúmeros fatores, como disponibilidade de material, custo e treinamento profissional.
UNIDADE 2.
Exame de fezes e resíduos alimentares
Patrícia Emanuella Ramos Marzola
OBJETIVOS DA UNIDADE
· Conhecer as funções e procedimentos do exame de fezes;
· Correlacionar os métodos diagnósticos recomendados para cada parasitose abordada;
· Reconhecer anormalidades ou patologias no exame de fezes com relação com o trato gastrointestinal;
· Entender a importância da coleta, preparação e análise adequadas dos materiais fecais para um diagnóstico preciso.
TÓPICOS DE ESTUDO
Coleta e processamento das fezes–
// Coleta da amostra fecal
// Armazenamento e transporte da amostra fecal
// Conservantes
Exame das fezes–
// Estudo coprológico
// Análise de resíduos alimentares
// Sangue oculto nas fezes
// Coprocultura
Métodos laboratoriais aplicados à parasitologia–
// Exame direto
// Tamisação
// Técnicas de concentração
Coleta e processamento das fezes
Este material foi elaborado com a finalidade de auxiliá-lo(a) na compreensão do exame de fezes, um procedimento rotineiro que permite a sondagem de inúmeras alterações no trato gastrointestinal. Por meio desse exame é possível identificar a presença de resíduos alimentares, sangue oculto, gordura e também a detecção de parasitos intestinais. Algumas dessas alterações podem ser observadas a olho nu, e algumas exigem observação microscópica.
A infecção por parasitos intestinais pode ocasionar inúmeras manifestações clínicas, como diarreia, dor abdominal, perda de sangue nas fezes e emagrecimento. A diarreia é uma importante causa de morbimortalidade no mundo, principalmente em países em desenvolvimento. Nos países desenvolvidos, raramente é fatal, mas ocasiona custos socioeconômicos (AZEVEDO et al., 2017; MOTTA; SILVA, 2002).
Os principais organismos relacionados com as diarreias são protozoários, helmintos, vírus e bactérias, como pode ser observado no Quadro 1. O exame parasitológico de fezes é capaz de identificar a presença de protozoários e helmintos; a coprocultura identifica a presença de bactérias patogênicas; e as viroses intestinais são identificadas por meio de métodos imunológicos ou moleculares (MOTTA; SILVA, 2002).
Quadro 1. Agentes etiológicos mais relacionados às diarreias infecciosas. Fonte: SILVA, 2008, p. 58; MOTTA; SILVA, 2002, p. 118. (Adaptado).
Considerando que o diagnóstico clínico das enteroparasitoses é impreciso – baseia-se em manifestações clínicas muito amplas –, o diagnóstico laboratorial é fundamental para o identificar as parasitoses, conduzir a terapêutica adequada e determinar a cura (AZEVEDO et al., 2017).
Em algumas situações, podem ser realizados testes para sondagem inicial dos parasitos, com alta sensibilidade e especificidade. Os testes de imunoensaio, ou testes rápidos, podem utilizar anticorpos monoclonais para detectar antígenos parasitários nas amostras fecais. Os métodos mais comuns são o ensaio imunoenzimático, fluorescência direta e técnicas de imunocromatografia. Os kits rápidos estão disponíveis para detecção de protozoários intestinais, como por exemplo, a Entamoeba histolytica, Giardia sp., Cryptosporidium spp. Contudo, em função do alto custo, esses testes normalmente não são utilizados no Brasil (ZEIBIG, 2014).
O exame mais tradicional para detecção de parasitos intestinais, na prática laboratorial em nosso país, é o exame de fezes. Mas, apesar da importância das doenças parasitárias em todo o mundo, muitas vezes o exame não é valorizado em função dos inúmeros erros diagnósticos e pelas dificuldades na coleta. Esses erros podem estar relacionados ao procedimento, interpretação ou coleta e armazenamento da amostra, conforme apresentado na Figura 1.
Figura 1. Fatores que aumentam a chance de erro no exame de fezes. Fonte: NEVES, 2010. (Adaptado).
Ressalta-se que as parasitoses intestinais são doenças muito frequentes, com destaque para regiões pobres e com falta de estrutura sanitária adequada, e tendo em vista que o diagnóstico dessas parasitoses é difícil em função de questões técnicas e da própria biologia dos parasitos, muitos profissionais de saúde utilizam o tratamento de modo empírico, sem a comprovação laboratorial.
Considerando todas essas dificuldades apresentadas, é fundamental que o profissional atuante na área esteja devidamente capacitado, que conheça as diferentes técnicas, assim como as vantagens e desvantagens de cada uma.
COLETA DA AMOSTRA FECAL
O exame parasitológico inicia com a coleta do material. É muito importante que o paciente receba todas as instruções para coleta com antecedência e por escrito.
A coleta e armazenamento adequados são fundamentais para garantir a qualidade e assegurar um diagnóstico preciso (CARLI, 2001; NEVES, 2010).
Deve-se atentar a inúmeros fatores, como o tipo de recipiente coletor, o volume de fezes coletados, o tempo entre a coleta e a análise, o uso de medicamentos e a temperatura de armazenamento (CARLI, 2001).
//Recipiente
As amostras de fezes devem ser coletadas em recipientes apropriados, limpos e preferencialmente estéreis. O recipiente coletor, como o modelo da Figura 2, deve ter boca larga e a capacidade aproximada de 250 mL. Deve ter vedação hermética para manter a umidade do material coletado (CARLI, 2001; NEVES, 2010).
Sempre que possível, as fezes devem ser colhidas diretamente no frasco específico para coleta. Caso necessário, pode-se utilizar um jornal ou papel limpo e, em seguida, utilizar uma pá estéril ou um palito de madeira descartável para realizar a transferência para o recipiente coletor. O recipiente de armazenamento deve ser próprio para esse fim e pode apresentar conservantes de acordo com a orientação do laboratório (ADLER, 1986; CARLI, 2001; NEVES, 2010; PROCOP, 2018).
// Contaminações
Durante a coleta, deve-se evitar contaminação com urina e água, pois podem fazer as formas vegetativas dos parasitos perderem a mobilidade ou sofrerem lise. Não é possível analisar espécimes coletados do solo, pois podem existir larvas de vida livre ou outros contaminantes que confundem o diagnóstico.As fezes obtidas do vaso sanitário também não podem ser aproveitadas em função do risco de contaminação e pela presença de água e urina, que destroem os trofozoítos (CARLI, 2001).
//Número de coletas
Para melhor diagnóstico de alterações, deve-se coletar três amostras de fezes em dias distintos. A justificativa para as múltiplas coletas se baseia nos seguintes fatores:
- Intermitência na liberação do parasito nas fezes do hospedeiro, que variam de acordo com a espécie;
- Distribuição não uniforme dos ovos dos helmintos na amostra;
- Diversos estágios de vida dos protozoários, com liberação irregular;
- Limitações das técnicas diagnósticas.
A sensibilidade dos exames aumenta se as coletas múltiplas mantiverem um intervalo de 48 horas entre cada uma. Para detecção da Giardia sp., por exemplo, em uma única amostra, a chance da positividade é de 50 a 70%. Com três amostras, a chance é de 90% (FERNANDES et al., 2012; KARSIGA, 2019).
// Medicamentos
Alguns medicamentos devem ser evitados antes de realizar o exame parasitológico de fezes, visto que podem interferir na análise do exame pelo escurecimento dos parasitos ou alteração de suas formas. Caso o paciente faça uso de algum desses medicamentos, recomenda-se queseja aguardado o período mínimo de uma semana, idealmente de duas a três semanas, para realização do exame de fezes (CARLI, 2001; NEVES, 2010).
Segundo Neves (2010), pode-se citar os seguintes medicamentos que devem ser evitados antes do exame parasitológico de fezes:
- Antiácidos;
- Antibióticos;
- Antidiarreicos;
- Antimaláricos;
- Bário ou bismuto;
- Ferro;
- Laxativos;
- Óleo mineral;
- Sulfato de bário;
- Vaselina.
Em algumas situações específicas, é preciso que o paciente faça uso de laxantes para obter intencionalmente fezes líquidas. Isso pode ser necessário para confirmar o diagnóstico de algumas parasitoses, como a amebíase, giardíase e estrongiloidíase. Nesses casos, é possível a indução com laxantes, de acordo com a recomendação do profissional de saúde. Deve-se preferir o uso de laxantes salinos, como os com fosfato de sódio e sulfato de sódio tamponado. Esses fármacos causam menos danos morfológicos aos parasitos, facilitando sua visualização. As fezes induzidas por laxantes devem ser coletadas e levadas imediatamente ao laboratório (CARLI, 2001).
// Diarreia
A fase líquida da diarreia deve ser aproveitada, tendo em vista que nela é que são identificados mais trofozoítos. Nesses casos, recomenda-se informar o laboratório sobre a presença da diarreia, para preparação de diferentes técnicas de coloração ou concentração de acordo com hipótese diagnóstica (FERNANDES et al., 2012).
// Coleta de crianças pequenas
Deve-se ter cuidado ao coletar material de crianças pequenas. Não se recomenda a retirada de fezes de fraldas, por cotonete retal ou do vaso sanitário. Em crianças que usam fraldas, a coleta pode ser realizada em saco coletor de urina. O material pode inclusive ser enviado para análise no saco coletor (ADLER, 1986; NEVES, 2010; PROCOP, 2018).
ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE DA AMOSTRA FECAL
Após a coleta das fezes, o material deve ser levado imediatamente para o laboratório. Caso isso não seja possível, deve-se mantê-lo lacrado (para manter a umidade e evitar o ressecamento) e armazenado em geladeira por no máximo 12 horas, com temperatura média de 3 °C a 5 ºC. Apesar disso, é importante lembrar que a refrigeração em baixa temperatura pode prejudicar o diagnóstico de algumas bactérias patogênicas, como a Shigella sp. e a Salmonella sp. e de larvas de nematódeos, como Strongyloides stercoralis e de ancilostomídeos (ADLER, 1986; CARLI, 2001; NEVES, 2010; PROCOP, 2018).
O transporte da amostra depende do clima e do tipo de organismo procurado. Em ambientes muito quentes, o resultado geralmente é insatisfatório. Isso porque ocorre competição entre bactérias patogênicas e não patogênicas, de modo que o isolamento dos patógenos é dificultado. Caso o tempo da coleta e da análise seja prolongado, o laboratório pode fornecer um frasco de coleta, como o Cary Blair ou salina glicerinada tamponada (ADLER, 1986).
CONSERVANTES
Para armazenamento no laboratório, as amostras fecais nunca devem ser congeladas ou colocadas em estufas, pois ocorre a deterioração dos parasitos. A temperatura ideal para armazenamento é de 3 °C a 5º C. Para conservação adequada em locais com clima tropical, o ideal é o congelamento rápido com nitrogênio (ADLER, 1986; FERNANDES et al., 2012; NEVES, 2010).
Para preservação permanente, recomenda-se o uso de conservantes, que podem ser adicionados às fezes para permitir maior intervalo entre a coleta e a análise da amostra. Recomenda-se manter a proporção de uma parte de fezes para três de conservantes. Antes de armazenar, deve-se homogeneizar o espécime (CARLI, 2001; NEVES, 2010). Para melhor compreensão, vale a pena abordarmos alguns dos principais fixadores utilizados para análise do exame de fezes.
Formaldeídos e preparações
Para preservação dos estágios de vida dos protozoários e helmintos, normalmente são utilizadas preparações de formaldeído em diversas diluições ou preparações:
Formalina 5%–
É ideal para preservação de cistos, mas não recomendada para fixação de trofozoítos;
Formalina 10%–
Não preserva trofozoítos, mas é eficaz para preservar oocistos, esporos, ovos e larvas. Entretanto os ovos, larvas e cistos podem ficar levemente distorcidos, especialmente os de H. nana, H. diminuta e S. stercoralis;
Formaldeído a quente (60ºC)–
Ideal para espécimes que contenham ovos. A fixação a frio não impede o desenvolvimento embrionário de muitos ovos, o que os torna infectantes e viáveis por longos períodos, tornando-se um risco em potencial para o examinador;
Formaldeído neutro–
A formulação neutra é eficaz para fixação de cistos, garantindo a manutenção das suas características morfológicas. Recomenda-se o uso da solução de formaldeído tamponada com fosfato de sódio (CARLI, 2001).
As principais vantagens no uso de fixadores à base de formaldeído é que eles mantêm a morfologia dos parasitos por longos períodos e têm longa validade. Todavia, não é possível preparar esfregaços permanentes corados preservados com formaldeídos. Ademais, podem interferir nas análises da reação em cadeia da polimerase (PCR) (CARLI, 2001)
Solução fixadora álcool polivínico
A solução fixadora de álcool polivínico (APV) consiste em uma resina solúvel em água. A solução atua como uma fita adesiva para o material fecal, preparando a lâmina para coloração. Normalmente, é incorporada ao fixador de Schaudinn para conservar e transportar amostras fecais líquidas. A APV é excelente para preservar trofozoítos cistos por anos, contudo a solução deve ser evitada na preservação de oocistos. A APV é incompatível com os métodos de coloração derivados de Ziehl-Neelsen e com as técnicas de concentração, que são muito frequentes na análise parasitológica (CARLI, 2001).
Fixador de Schaudinn
É um fixador frequentemente usado para preservar protozoários em fezes líquidas. É preciso tomar cuidado ao manusear esse fixador, pois ele contém cloreto de mercúrio II, sendo tóxico aos humanos e ao ambiente (CARLI, 2001).
Essa solução deve ser preparada imediatamente antes do uso. As principais vantagens da preparação é que ela preserva trofozoítos e cistos de protozoários para a coloração de esfregaços permanente e tem longa validade. A fixação dos organismos na lâmina é rápida, em aproximadamente uma a duas horas. As principais desvantagens são a toxicidade, difícil preparação e distorção da morfologia de ovos e larvas (CARLI, 2001).
Fixador mertiolato-iodo-formaldeído
O fixador mertiolato-iodo-formaldeído (MIF) é uma mistura que envolve corantes e fixadores com mertiolato ou mercurocromo, iodo e formaldeído. É eficaz para corar a maioria dos estágios de protozoários e helmintos. Na preparação do exame direto a fresco, é capaz de preservar e corar simultaneamente os organismos. Tem fácil preparação e longa validade. Quando utilizada em conjunto com técnicas de concentração, pode apresentar resultados insatisfatórios (CARLI, 2001).
Fixador acetato de sódio ácido acético formaldeído
O fixador acetato de sódio ácido acético formaldeído (SAF) consiste em uma mistura de formaldeído, acetato de sódio e ácido acético glacial. É uma solução estável e atóxica, sendo uma boa opção para fixação de parasitos. É útil para o diagnóstico de trofozoítos, cistos, oocistos e ovos por esfregaços permanentes e preparações concentradas a fresco (CARLI, 2001).
Exame das fezes
Segundo Carli (2001), o exame de fezes consiste nas seguintes avaliações:
- Identificação de parasitos intestinais, macro e microscopicamente;
- Análise de resíduos alimentares e gorduras nas fezes;
- Verificação de presença de sangue oculto em fezes, especialmente em casos que há suspeita de tumores no colon e reto;
- Coprocultura.
A pesquisa nas fezes deve se iniciar com uma análise macroscópica e, em seguida, a microscópica. Para correta identificação dos parasitos intestinais, é preciso distingui-los de tecido morto, fragmentos alimentares, leucócitos ou outros artefatos. Ainda, o profissional deve reconhecer as diversas formas dos parasitos intestinais, como ovos, larvas, trofozoítos, cistos, oocistos ou esporos (CARLI, 2001; LIMA et al., 2019; NEVES,2010).
O exame de fezes também permite a identificação de alterações no trato gastrointestinal, como a presença anormal de resíduos alimentares, em função da dieta ou de patologias, a presença patológica de sangue e a presença de bactérias patogênicas, que não fazem parte da flora intestinal normal (CARLI, 2001).
ESTUDO COPROLÓGICO
O estudo coprológico, também conhecido como coprológico funcional, tem como objetivo avaliar as funções do trato gastrointestinal, incluindo a avaliação macro e microscópica. O exame macroscópico funciona como uma triagem e análise geral das características do espécime fecal, portanto, sempre deve anteceder o exame microscópico. Antes de iniciar a análise do material, é importante lembrar que todo material fecal é considerado como infectante, por isso é necessário o uso de luvas para proteção e descarte adequado (CARLI, 2001; REY, 2017).
Para a preparação, deve-se transferir a amostra para recipientes de boca larga, como placas de Petri ou latas limpas. As porções superficiais da amostra fecal e das bordas devem ser rejeitadas, pois geralmente são mais secas. Deve-se examinar a superfície do espécime e, em seguida, com auxílio de um palito, buscar a presença de helmintos adultos ou proglotes de vermes. O exame macroscópico pode ser realizado pela observação simples ou pela tamisação (CARLI, 2001; REY, 2017).
O Diagrama 1 apresenta os principais aspectos que devem ser analisados no exame macroscópico das fezes.
Diagrama 1. Sondagem inicial do exame de fezes.
Também é importante avaliar a idade do paciente, pois, em bebês, as fezes têm cor e consistência diferenciadas. Essas informações auxiliam na detecção geral de alterações gastrointestinais e também na elaboração de hipóteses diagnósticas, que são essenciais para determinar o método adequado para prosseguir com a análise (KARSIGA, 2019).
Destacam-se algumas expressões que são formas ou estágios evolutivos dos parasitas intestinais estudados:
Trofozoítos–
São formas vegetativas de protozoários, móveis. São encontrados em fezes líquidas, pastosas, muco-sanguíneas. Se degeneram mais rapidamente, portanto deve-se realizar o exame o mais rápido possível;
Cistos ou oocistos–
Formas latentes de um organismo, com parede espessa, resistentes à dessecação, podendo ser de bactérias ou protozoários. São observados em fezes formadas ou semiformadas;
Os ovos e as larvas–
Formas de helmintos. Podem estar presentes em todos os tipos de amostras fecais, mas dificilmente são encontrados em amostras líquidas;
Proglotes ou proglótides–
Divisão ou segmento das tênias, vermes parasitas intestinais.
No laboratório, deve-se priorizar a análise e preparação do material fecal de acordo com a sua consistência. Inicialmente, deve-se analisar as fezes líquidas ou pastosas, em seguida, as semiformadas e as formadas. Além disso, deve-se registrar as características gerais, como a consistência, presença de sangue e muco, e o uso de medicamentos ou alimentos que possam alterar o resultado da análise (CARLI, 2001).
// Consistência das fezes
O material fecal varia quanto à consistência em função da quantidade de água presente. Em geral, as fezes normais apresentam cerca de 75% de líquidos. Em doenças, como a cólera, o teor de água pode se aproximar de 100%. O Quadro 2 apresenta as classificações tradicionais sobre a consistência das fezes (NEVES, 2010).
Quadro 2. Consistência do material fecal. Fonte: NEVES, 2010, p. 125. (Adaptado).
// Formato das fezes
O formato das fezes varia de acordo com sua consistência. Também é moldado pelo esfíncter anal. Na escala de Bristol, criada pelo médico inglês Ken Heaton, é possível observar as possíveis formas das fezes humanas. Em casos onde há estreitamento ou espasmos retais, o calibre das fezes é reduzido. Nos casos de diarreia, a massa é amorfa (tipo 7). Em casos de constipação, as fezes podem se apresentar como cíbalos (tipo 1). O formato de fezes em fita (segmento fino e longo) pode indicar a presença de colite espasmódica (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010).
Figura 3. Escala de Bristol. Fonte: SPILLER; THOMPSON, 2012, p. 44. (Adaptado).
// Coloração das fezes
Em geral, a cor normal das fezes é marrom (castanha) em função da bilirrubina e bile, contudo sua cor varia muito em função da dieta. Fezes ricas em vegetais apresentam coloração esverdeada. Quando há um grande consumo de alimentos lácteos, as fezes são amareladas (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010).
Em algumas situações, a coloração alterada das fezes pode ser indicativa de patologia ou uso de medicamentos/suplementos. Desse modo, é muito importante questionar sobre o uso de algum medicamento. A cor de argila ou massa de vidraceiro é observada em casos de obstruções biliares. Fezes pretas podem indicar sangue perdido no trato gastrointestinal superior (> 100 mL de sangue). Fezes avermelhadas são observadas no caso de sangramento do trato gastrointestinal inferior. A cor preta também pode ser em decorrência do tratamento com ferro ou bismuto. O uso de sais de ferro torna as fezes preto-esverdeadas (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010).
// Quantidade de fezes
A quantidade de fezes diárias eliminada varia de acordo com a qualidade e quantidade de alimentos ingeridos. Uma pessoa saudável, com dieta balanceada, elimina em média 100 a 150 g por dia. Em casos de diarreia ou enterite, essa quantidade pode atingir 800 g ou mais. Em casos de síndrome de má absorção ou de insuficiência pancreática, o volume de fezes produzido é maior. Em pessoas com constipação, a quantidade do bolo fecal é reduzida (NEVES, 2010).
// Presença de muco
É normal a evidenciação de um pouco de muco nas fezes, entretanto a presença de muco abundante e com sangue é anormal e pode ser indicativo de irritação ou inflamação. Em casos de colite, o muco está presente na forma de pequenas estrias, isoladas. Já nos casos de colite muco-membranosa, observa-se a presença de filamentos maiores, como coágulos ou placas, que podem ser facilmente removidos com auxílio de uma pinça (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010).
// Particularidades em bebês
Em recém-nascidos e bebês, as fezes apresentam consistência pastosa ou aquosa. Para identificação da cor de fezes em bebês, recomenda-se a avaliação usando o cartão de cores. Essa escala auxilia na detecção de possível atresia das vias biliares (KARSIGA, 2019).
Figura 4. Tabela de cores de fezes de bebês. Fonte: Ministério da Saúde, 2013, p. 29. (Adaptado).
// Odor das fezes
O odor característico das fezes é decorrente da presença de gás sulfídrico, metano e ácidos resultantes do metabolismo intestinal. Contudo, o odor pode ser influenciado pelo tipo de alimento ingerido, assim como medicamentos e pela alteração da flora intestinal. Em casos de pessoas com carcinomas, pode ocorrer odor pútrido. O odor também é alterado em pessoas com grande ingestão láctea ou com fezes alcoólicas (NEVES, 2010).
// Potencial hidrogeniônico das fezes
O potencial hidrogeniônico (pH) das fezes é determinado pela diluição no papel tornassol ou similar, empregando-se papel azul e vermelho. Normalmente, a reação é ligeiramente alcalina ou neutra, no entanto o regime alimentar pode alterar esse equilíbrio. Na presença de reação ácida, o papel azul se torna vermelho, e o vermelho permanece igual; se for neutra, os papéis não se alteram; em reações alcalinas, o papel vermelho se torna azul e o azul permanece igual. Também existem papéis indicadores, que mudam de cor em conformidade com os íons de H+ presentes nas fezes (NEVES, 2010).
Segundo Neves (2010), o pH das fezes está relacionado com diferentes fatores, tais como:
· 1
1- Alterações alimentares (quantidade excessiva de açúcares ou hidratos de carbono e o teor de gordura);
· 2
2- A presença de fermentação bacteriana;
· 3
3- Má absorção de hidratos de carbono ou de gorduras;
· 4
4- Diarreia secretória;
· 5
5- Colite;
· 6
6- Adenoma viloso;
· 7
7- Uso de antibióticos.
Algumas dessas alterações são fisiológicas e transitórias, mas, em alguns casos, pode evidenciar a presença de patologia. O Diagrama 2 resume o potencial hidrogeniônicodas fezes e suas possíveis alterações.
Diagrama 2. Potencial hidrogeniônico das fezes e suas possíveis alterações. Fonte: NEVES, 2010, p. 11. (Adaptado).
Após a triagem macroscópica inicial, deve-se selecionar amostras de diferentes partes da massa fecal para análise microscópica. O exame microscópico é uma ferramenta capaz de diagnosticar os patógenos intestinais. Além disso, deve-se buscar a presença de fibras musculares parcialmente diferidas, presença de gorduras e cristais de ácidos graxos, presença de amido, celulose não digestível e leucócitos (KARSIGA, 2019; NEVES, 2010).
DICA
O relatório da análise macro e microscópica sempre deve conter:
· O nome científico de todo parasito encontrado no relatório, com gênero e, se possível, espécie;
· A forma observada: ovo, larva, cisto, oocisto, trofozoíto ou verme adulto;
· Método(s) utilizado(s);
· Medicamentos utilizados pelo paciente;
· Consistência das fezes.
Para garantia da qualidade das amostras, é importante que o paciente receba todas as orientações instrutivas por escrito.
A menor quantidade de fezes necessária para o exame é de 2 g a 5 g. Pode-se examinar as fezes imediatamente para identificar organismos em movimento. Caso não seja possível a análise imediata, deve-se manter a amostra no conservante mais adequado para os organismos analisados (KARSIGA, 2019).
Para seleção da amostra fecal, deve-se buscar diferentes partes da massa fecal, principalmente de porções com maior suspeita. As fezes devem ser diluídas em uma parte de fezes para dez partes de água. Para tanto, se deve triturar uma pequena porção de fezes e acrescentar progressivamente água para obtenção da diluição final. Essa mistura deve ser colocada em uma placa de Petri para análise de detritos, com auxílio de um bastão de vidro e fundo escuro para sobreposição da placa microscópica (NEVES, 2010).
ANÁLISE DE RESÍDUOS ALIMENTARES
Tanto na análise macro como microscópica, é possível observar resíduos alimentares. A presença de restos de carne, gordura ou detritos vegetais podem indicar anormalidades, como alteração do trânsito intestinal ou síndrome de má absorção. Apresentamos, conforme Neves (2010), os principais resíduos alimentares observados em exames de fezes:
Fibras musculares
Têm cor amarela ou alaranjada, em função da bile. Normalmente, apresentam-se nas formas:
Cilíndricas alongadas, com estrias longitudinais ou transversais (fibras mal digeridas);
Retangulares com poucas estrias (fibras digeridas);
Ovais, amarelas, sem estrias, sendo conhecidas como corpos de Nothnagel, que são as fibras em estado avançado de digestão.
A presença de fibras mal digeridas é um indicativo de possível insuficiência pancreática;
Tecido conjuntivo
Na observação microscópica das fezes, o tecido conjuntivo se apresenta em forma de feixes alongados ou fibras isoladas refringentes. São transparentes quando tratadas pelo ácido acético e se coram em vermelho com o reativo de Hecht;
Gorduras
São muito refringentes e apresentam-se na forma de glóbulos ou gotículas e são levemente coradas pela bile. Quando há grandes quantidades de gordura, formam pequenos lagos. São coradas em vermelho pelo Sudan III e reativo de Hecht. Os ácidos graxos se apresentam na forma de agulhas finas e longas e seu excesso denota insuficiência biliar.
Em humanos saudáveis, a excreção diária de gordura nas fezes é inferior a 6 g. A excreção excessiva pode ocorrer em casos de ausência ou má absorção de gordura, especialmente em pacientes com diarreia. Em estudos com pessoas com diarreia, foram relatados até 14 g diários em voluntários com diarreia induzida por laxantes e em pacientes com peso fecal superior a 1.000 g por dia (KARSIGA, 2019);
Amido
Tem melhor observação em preparações com lugol. Pode ser observado intracelularmente, em pequenas porções, separadas por septos de celulose ou amorfas, em tom róseo se tingido com lugol. O amido cru é colorido em tom escuro;
Celulose
Dividem-se em digestíveis e não digestíveis. As digestíveis são arredondadas, ovais ou elípticas, com contornos nítidos. Está presente em quantidades insignificantes. Maiores quantidades indicam aceleração do trânsito intestinal. A celulose não digestível, derivada da cutícula de cerais e vegetais, não tem valor semiológico;
Cristais
Normalmente são de ácidos graxos, fosfato amoníaco-magnesiano, oxalato de cálcio. O ácido clorídrico normalmente dissolve esses cristais, logo, o excesso pode sugerir insuficiência gástrica;
Flora iodófila
Constitui-se na flora intestinal natural, formada por levedos ou bactérias. Apesar de não ser um resíduo, sua presença excessiva normalmente está relacionada com alterações alimentares, decorrentes da fermentação intestinal exagerada ou trânsito acelerado. Contém amido e se coram em violeta pelo iodo.
SANGUE OCULTO NAS FEZES
O exame de fezes é útil para avaliar a presença de sangue nas fezes. Para isso, não é necessário manter uma dieta restritiva.
As preparações de ferro por via oral não alteram o resultado. A ingestão de grandes quantidades de vitamina C deve ser limitada, não podendo ser superior a 250 mg por dia, por três dias antes da coleta. A aspirina e os anti-inflamatórios não esteroides podem causar falsa positividade, pois provocam pequenos sangramentos na mucosa do trato gastrointestinal (KARSIGA, 2019).
Em testes baseados em peroxidase, a atividade semelhante à peroxidase da hematina e/ou hemoglobina transforma o catalisador em azul. Antes do exame, não se recomenda que as amostras de fezes sejam diluídas novamente. Apesar de a diluição aumentar a sensibilidade do teste, causa um aumento nos resultados falso positivos (KARSIGA, 2019).
Uma perda de cerca de 2 a 5 mL de sangue por dia é normal nos intestinos. Caso seja observado volume maior do que esse, deve-se confirmar pela realização do teste de sangue imuno-histoquímico, que possui alta sensibilidade e especificidade (KARSIGA, 2019).
CITANDO
São proibidas carnes e derivados, bem como alimentos coloridos e que contenham alta atividade de peroxidase: em especial beterraba, espinafre, rabanete, nabo, brócolis, maçã, banana, couve-flor e melão. Não utilizar medicamentos que possam irritar a mucosa gástrica, em especial anti-inflamatórios hormonais, aspirina, ferro e vitamina C. Evitar sangramento gengival durante a higiene oral e evitar a coleta na presença de epistaxe (sangramento nasal) ou sangramento devido a hemorroidas. Não colher amostras até 3 dias após a menstruação.
COPROCULTURA
A coprocultura visa identificar agentes infecciosos causadores de doenças ou alterações gastrointestinais. Em geral, é recomendada para diagnosticar infecções bacterianas, como as provocadas pela Salmonella spp., Campylobacter spp., Escherichia coli ou Shigella spp. (FISCHBACK; FISCHBACK, 2016).
Normalmente, o exame parasitológico de fezes e a coprocultura ou cultura de fezes são solicitadas simultaneamente. Caso o paciente esteja com diarreia com suspeita infecciosa, deve-se realizar duas culturas de fezes: para busca de patógenos entéricos, com realização de cultura e antibiograma e a segunda, para cultura de C. difficile e pesquisa de toxinas (FISCHBACK; FISCHBACK, 2016).
A preparação deve ser montada utilizando sempre as porções mais suspeitas, como com a presença de muco ou sangue, preferencialmente com fezes frescas. O exame deve ser realizado antes da introdução do antibioticoterapia (FISCHBACK; FISCHBACK, 2016; MAROJA; LOWERY, 1956).
Primeiramente, deve-se utilizar um caldo de enriquecimento seletivo, visando diminuir a quantidade de bactérias da microbiota normal, que não é patogênica. Em seguida, é utilizado um meio de cultura, de acordo com o organismo desejado, com posterior visualização microscópica (SILVA, 2008)
Métodos laboratoriais aplicados à parasitologia
De acordo com o painel do Our World in Data, de 2017, a diarreia se constituiu como a sétima principal causa de morte no mundo, com 1,6 milhão de óbitos. Os principais patógenos relacionados a essa diarreia são protozoários e vermes que possuem ampla distribuição em locais com faltade saneamento, higiene e alimentação adequada. O diagnóstico dessas parasitoses auxilia na redução da morbimortalidade (Our world in data 2017).
Considerando que as parasitoses intestinais são doenças preveníveis, é importante refletir porque ainda há, na atualidade, tantos óbitos por diarreia, mesmo com todo avanço tecnológico que temos.
O exame de fezes aplicado à parasitologia consiste em métodos qualitativos ou quantitativos que podem ser examinados de forma fresca ou preservada. 
- Os métodos quantitativos avaliam a intensidade do parasitismo pela contagem das formas parasitárias. O método mais conhecido é o de Stoll e o mais utilizado rotineiramente é o de Kato-Katz. Esses métodos, entretanto, são pouco usados para fundamentar a conduta clínica, sendo mais usados para avaliações epidemiológicas (NEVES, 2010).
- Os métodos qualitativos são os mais utilizados para evidenciar a presença de parasitos. Como, em geral, o número de parasitos ou de suas formas é muito pequeno, é preciso associar a métodos de enriquecimento e colorações para concentração e melhor visualização dos parasitos. Não existe um método que consiga avaliar isoladamente todos os possíveis parasitos intestinais. Desse modo, frequentemente é preciso realizar uma combinação de métodos (NEVES, 2010; NEVES, 2016).
EXAME DIRETO
O exame direto a fresco, também conhecido como esfregaço de fezes, é preparado diretamente do material fecal coletado.
Trata-se de um procedimento simples e eficiente para o estudo das fezes, que permite a observação de trofozoítos vivos dos protozoários, contudo exige um microscopista experiente para identificar as formas parasitárias (CARLI, 2001; FERREIRA, MORAES, 2017).
Os esfregaços com fezes frescas e não fixadas são preparados com solução salina a 0,85% e de iodo. Os esfregaços devem ser examinados sistematicamente pela avaliação microscópica de pequeno aumento e com pequena intensidade de luz. A confirmação dos parasitos deve ser realizada com a objetiva de grande aumento (CARLI, 2001).
Quando forem usadas fezes preservadas, a formalina atua como diluente, não sendo necessário adicionar a solução salina a 0,85% às preparações de esfregaços sem coloração (CARLI, 2001).
O exame direto é recomendado para busca de trofozoítos em fezes frescas, preferencialmente com menos de 30 minutos entre a coleta e a análise, visto que os trofozoítos têm vida curta no meio externo. É ideal para o diagnóstico de infecções por E. histolytica. Para a identificação de cistos e larvas, é preciso preparar com lugol e a coloração que daí resulta, reforça e tinge os cistos (NEVES, 2010; FERREIRA, MORAES, 2017).
Outras colorações temporárias ou permanentes podem ser utilizadas com as preparações a fresco para auxiliar na localização e identificação de protozoários, sendo desnecessários esses corantes para a pesquisa de ovos e larvas de helmintos (CARLI, 2001). O corante de hematoxilina férrica pode ser usado para corar o núcleo dos parasitos; o azul de metileno é útil para evidenciar as estruturas citoplasmáticas e nucleares das formas vegetativas (FERREIRA; MORAES, 2017).
Procedimentos da técnica do exame direto:
- Colocar duas ou três gotas de salina a 0,85% em uma lâmina de vidro;
- Transferir para a lâmina pequenas porções de fezes, com o auxílio de um palito de madeira;
- Adicionar uma gota de solução de lugol forte (iodo: 2 g; iodeto de potássio: 4 g; água destilada: 100 mL);
- O uso da lamínula é opcional;
- Observar inicialmente em menor aumento e, posteriormente, com aumento de 100 a 200 vezes (NEVES, 2010).
TAMISAÇÃO
É uma técnica de emulsão das fezes em água. Em seguida, a emulsão é coada com auxílio de uma peneira metálica em água corrente. Com essa técnica, é possível observar a presença de vermes adultos de Ascaris lumbricoides e Enterobius vermicularis, assim como as proglotes de tênias (NEVES, 2010).
Para identificar as proglotes de tênias, podem ser utilizadas as seguintes técnicas:
Método do ácido acético glacial
Em uma placa de Petri contendo a solução do ácido acético durante 15 a 20 minutos. Após o período, comprimir a proglote em uma lâmina e examinar sob luz intensa;
Método dos campos
Dissolver três comprimidos de metoquina em 5 mL de água destilada deionizada. A proglote deve ser imersa nessa solução por 15 minutos e, posteriormente, deve ser colocada em uma lâmina e ser examinada sob luz intensa (NEVES, 2010).
TÉCNICAS DE CONCENTRAÇÃO
As técnicas de concentração ou enriquecimento são procedimentos de rotina, parte de um exame completo das fezes, para a pesquisa de parasitos e o diagnóstico de um pequeno número de organismos que foram omitidos quando foi usado somente o exame direto a fresco. Segundo Carli (2001), os principais objetivos dessas técnicas são:
· Aumentar o número de cistos, ovos ou larvas da preparação;
· Eliminar a maioria dos detritos fecais;
· Apresentar os organismos inalterados, facilitando a identificação.
Essas técnicas são indicadas para separar os cistos, oocistos de protozoários e ovos de helmintos do excesso de detritos fecais considerando as diferenças específicas de densidade. Os principais métodos de enriquecimento utilizados na rotina laboratorial são a sedimentação espontânea, sedimentação por centrifugação, flutuação espontânea, centrífugo-flutuação, fita gomada e concentração de larvas de helmintos por migração ativa (CARLI, 2001). O Quadro 3 apresenta os principais métodos de enriquecimento das amostras de fezes.
Quadro 3. Principais métodos de enriquecimento das amostras de fezes. Fonte: NEVES, 2010, p. 13. (Adaptado).
// Método de Lutz ou Hoffman, Pons e Janer ou sedimentação espontânea
Essa técnica foi criada inicialmente por Adolpho Lutz, em 1919, e tem como princípio a sedimentação espontânea. É uma técnica qualitativa, com baixa sensibilidade, tendo sido descrita inicialmente para diagnóstico de ovos de Schistosoma mansoni. Atualmente a técnica é utilizada para identificar a presença de ovos de helmintos. Com coloração de lugol, é possível observar cistos de protozoários e larvas de helmintos (CARLI, 2001; NEVES, 2010).
Lutz (1919) descreve o método da sedimentação espontânea do seguinte modo:
O exame torna-se mais fácil pela lavagem repetida das fezes, seguida de sedimentação simples ou centrifugação. Com estas, combina-se o uso do tecido de arame e de gaze de moleiro para reter todos os corpos mais grossos. Assim obtém-se um sedimento que contém quase exclusivamente corpúsculos amiláceos e ovos de parasito, sendo fácil examinar (LUTZ, 2019, n.p.).
Em 1934, a técnica foi padronizada por Hoffman, Pons e Janer. O método tem como objetivo diagnosticar parasitos intestinais pela concentração das formas parasitárias. Apesar de ter mais de cem anos, o método continua sendo a principal forma de diagnóstico de parasitos intestinais. Isso porque apresenta um amplo espectro e possibilita melhor visualização dos parasitos ou suas formas. Além disso, apresenta baixo custo e é de fácil execução (AZEVEDO et al., 2017; LIMA et al., 2019).
Nesse método de Lutz ou Hoffman, Pons e Janer, as fezes suspensas em água são homogeneizadas e filtradas para retenção dos resíduos fecais maiores. Em seguida, a amostra é deixada para sedimentar espontaneamente por aproximadamente duas horas. A Figura 8 resume os principais procedimentos técnicos para realização do método de Hoffman, Pons e Janer ou Lutz (AZEVEDO et al., 2017; LIMA et al., 2019; RABELLO et al., 2008).
Figura 8. Procedimento técnico do método de Lutz ou Hoffman, Pons, Janer. Fonte: LIMA, 2019; NEVES, 2010. (Adaptado).
É importante destacar que existem inúmeros métodos de diagnóstico para parasitoses intestinais e que o método deve ser escolhido com base nas hipóteses diagnósticas. Para tanto, é relevante conhecer as diversas técnicas e buscar variações que possam facilitar a prática diária garantindo o melhor diagnóstico. Na prática, observa-se a utilização de uma combinação de técnicas visando aumentar a acurácia diagnóstica.
ASSISTA
O método de sedimentação espontânea é um dos principais métodos utilizados