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Rabalho, Alessandra Aparecida. 
Isolamento de linhagens microbianas termofílicas amilolíticas, 
produção, caracterização e aplicação das amilases na hidrólise do 
amido de mandioca / Alessandra Aparecida Rabalho. – São José 
do Rio Preto : [s.n.], 2002 
183 f. : il. ; 30 cm. 
Orientador: Eleni Gomes 
Co-orientador: Célia Maria Landi Franco 
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista. 
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 
1. Enzimas. 2. Enzimas microbianas. 3. Amilases. 4. 
Microrganismos termofílicos. 5. Bactérias. 6. Bactérias 
termofílicas. 7. Fungos. 8. Fungos termofílicos. 9. Fermentação. 
10. Xaropes. I. Gomes, Eleni. II. Franco, Célia Maria Landi. III. 
Universidade Estadual Paulista. Instituto de Biociências, Letras e 
Ciências Exatas. IV. Título. 
CDU – 577.15 
Meu Senhor e meu Deus, eu Te louvo e agradeço, porque me 
incluíste nos Teus planos; porque me destes um espírito livre e 
repleto de sonhos, com esperança e força suficientes para 
tentar concretizá-los. Por estar ao meu lado a cada dia, divido 
Contigo a glória desta conquista. 
Dedico este trabalho, 
Aos meus pais, João e Odete, 
às minhas irmãs Angela e Andréa, 
e aos meus sobrinhos Vinícius, Júnior e Guilherme, 
porque são o que há de mais maravilhoso em minha vida. 
Ao meu grande amor Fabrício, meu referencial para 
continuar vivendo intensamente. 
A minha gratidão a todos que me apoiaram e incentivaram e cuja 
convivência foi de extrema importância para o meu crescimento pessoal e 
profissional. 
Agradeço especialmente à Profa. Dra. Eleni Gomes, pela confiança, pelo 
constante apoio e por me proporcionar crescimento e amadurecimento 
científico. Seu exemplo de amor e dedicação ao ensino e à pesquisa me incitou 
a seguir seus passos. 
À Profa. Dra. Célia Maria Landi Franco, pela co-orientação e pelas valiosas 
dicas que permitiram o aperfeiçoamento deste estudo. 
Aos Professores integrantes da banca examinadora, Prof. Dr. Gustavo O. 
Bonilla Rodriguez e Prof. Dr. Claudio Cabello, pela acurada análise da pró-
forma, pelas críticas e sugestões que contribuíram para a melhoria deste 
trabalho. 
Aos Professores da Pós-Graduação pelos ensinamentos transmitidos no 
decorrer do curso, em especial ao Prof. Dr. Crispin H. Garcia-Cruz, pelo 
constante incentivo e aos Profs. Drs. Fernando Leite Hoffmann e Vanildo Del 
Bianchi, pelas correções e sugestões realizadas no Exame Geral de 
Qualificação. 
Ao Prof. Dr. Roberto da Silva pela amizade e prestatividade com que me 
auxiliou nos pequenos problemas e dúvidas do dia-a-dia. 
Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação, especialmente a Rosemar, 
Nadia, Oscar, Rosana e Nancy, pela simpatia no atendimento e contribuição 
para finalização deste trabalho. 
Aos funcionários da biblioteca, especialmente a Elza Satto, pela presteza no 
serviço de comutação bibliográfica. 
Aos funcionários e técnicos dos Departamentos de Química e Biologia, 
especialmente ao Claudinei Nobile e Paulo Maziero, pela convivência 
agradável e pela dedicação com que desempenharam suas funções, 
contribuindo para o bom andamento da rotina do laboratório. 
Ao Banco do Brasil, em nome do Sr. Hélio Schultz, pela pesquisa e 
disponibilização dos dados de comércio de enzimas no Brasil. 
À FAPESP, processo 99/12840-4, pelo auxílio financeiro. 
A todos os colegas do curso de Pós-Graduação pelo incentivo constante e 
amizade, especialmente à Erika, Riana, João Cláudio, Marô, Graziela, Ana 
Lúcia, Giane, Luísa, Juan, Sílvia e Silvia (Mulher). 
Aos estagiários e pós-graduandos do Laboratório de Bioquímica de Proteínas, 
especialmente ao Hamilton Cabral pela prontidão com que sempre esclareceu 
pequenas dúvidas que surgiram ao longo deste estudo. 
Aos queridos amigos do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada: 
Caio, Carla, Daniela, Dênis, Eduardo, Fabiana, Gisele, Heloiza, Márcia Maria, 
Márcia Rizzatto, Maricy, Mirlene, Natalia, Simone, Tatiana, Tony, Kivia e Ana 
Paula pela convivência agradável, pelos constantes ensinamentos e auxílio na 
resolução dos problemas diários. Vocês foram a família que me acompanhou 
de perto. 
À Valquíria Barco Damiano, pela serenidade com que instruiu e acompanhou 
meus primeiros passos na Microbiologia e, principalmente, pelo exemplo de 
profissionalismo e conduta. 
À Solange Xavier dos Santos e Denise Prado do Amaral Voltarelli, pela 
amizade sincera, pelo apoio nos momentos difíceis e pelas discussões sobre 
trabalho, profissão e vida, que tanto contribuíram para meu crescimento 
pessoal e profissional. 
Às amigas Elaine Priscilla e Luísa Jorge porque, apesar da distância, nunca 
estiveram ausentes nos momentos em que mais precisei. 
À Silvia R. Viodres, pelo ternura com que me ajudou a compreender e superar 
os momentos de aflição. 
Aos amigos Morgana e Airton Rocca, que acreditaram, apoiaram e deram força 
para a concretização desta conquista. 
Aos queridos Sr. Loreto Tomasetto e Sra. Aparecida Tomasetto, por terem me 
acolhido como filha em suas vidas. 
Aos meus pais, João e Odete, às minhas irmãs, Andréa e Angela e aos meus 
sobrinhos, Vinícius, Júnior e Guilherme pelo amor imensurável, pelo constante 
estímulo e pela alegria que proporcionam à minha vida. Tenho a grata 
felicidade de fazer parte desta maravilhosa família, vocês foram a chave para 
a realização deste sonho. 
Ao meu querido Fabrício, por todo amor, carinho e dedicação. Sem sua 
presença e apoio constantes tudo teria sido mais difícil. 
À Deus que, na sua infinita misericórdia, me ofereceu juntamente com as 
dificuldades a força para superá-las. 
“Vida devotada a atividade criadora em ciência é vida 
feliz. Nenhum outro modo de vida é igual ou superior em 
felicidade. ... Eu creio que o trabalho científico, juntamente 
com outras formas de trabalho criador, é o principal 
propulsor da evolução do espírito humano. A evolução do 
espírito humano dá significado à evolução humana e à 
evolução universal.” 
Theodosius Dobzhansky, 1970 
Página 
α
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α
α
Bacillus 
Bacillus 
Mucor
Bacillus 
Whatman
Bacillus Mucor
Bacillus 
Mucor
Bacillus Mucor
Bacillus 
Mucor
Página 
Bacillus Mucor
Mucor
Mucor
α
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Bacillus 
Mucor
α
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Bacillus Mucor
α
Introdução
α
α
–
–
Introdução
,
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Introdução
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Introdução
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α
αααα
α
α α β
α
Introdução
α
α
α
Introdução
Introdução
Thermotoga Aquifex
Introdução
Streptomyces 
Introdução
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α
Introdução
/
Introdução
/
Introdução
Introdução
Introdução
α α
/
Introdução
α α
α
α β
α
Introdução
α
Bacillus licheniformis B. stearothermophilus
Aspergillus
A. niger A. awamorii
Introdução
α
Introdução
/ / /
/
Material e Métodos
/ / /
/
Material e Métodos
≥
<
Material e Métodos
Material e Métodos
≥
<
Material e Métodos
Material e Métodos
−−−−
−
−
−
−
/
−
−
−
−
−
−
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−
−
−
−
−
−
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/ −
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
Material e Métodos
Material e Métodos
MEIO LÍQUIDO
(amido1% + sais)
0,1 mL
55ºC/24h
ISOLAMENTO
(Estrias de Esgotamento)
CULTURA ISOLADA
MEIO SELETIVO
1 g/2 mL
Amostra
55ºC/24h
Material e Métodos
×
Material e Métodos
CULTURA
(24-48h)
PRÉ-INÓCULO
M.Líquido (10 mL)
55ºC/24h
200 rpm
55ºC/48h
200 rpm
Células: descarte
10.000 rpm/20 min
Sobrenadante
“SOLUÇÃO ENZIMÁTICA BRUTA”
REAÇÃOREAÇÃOREAÇÃOREAÇÃO
ENZIMÁTICAENZIMÁTICAENZIMÁTICAENZIMÁTICA
 2 mL
125 mL
CENTRIFUGAÇÃO
50 mL
INÓCULO
M. Líquido (25 mL)
Material e Métodos
×
250 mL
250 mL
SUSPENSÃO CÉLULAS
(Sol. Sais - 10 mL)
RESÍDUO SÓLIDO
 (5g)
55ºC/72-96h
30 mL
 H2O
FILTRAÇÃO
A VÁCUO
Filtrado
CENTRIFUGAÇÃO
10.000 rpm/20 min.
Células.: Descarte
REAÇÃOREAÇÃOREAÇÃOREAÇÃOREAÇÃOREAÇÃOREAÇÃOREAÇÃO
ENZIMÁTICAENZIMÁTICAENZIMÁTICAENZIMÁTICAENZIMÁTICAENZIMÁTICAENZIMÁTICAENZIMÁTICA
Agitação/
15 min.
Sobrenadante
“SOL. ENZIMÁTICA BRUTA”
CULTURA
(24-48h)
Material e Métodos
Material e Métodos
αααα
α
/
/
Material e Métodos
//// − ÷ × ÷ × ÷
/
/
/
Material e Métodos
µ
/
Glicose Enz-
Color Biodiagnóstica
µ
Material e Métodos
µ
µ
Material e Métodos
Reagen
/
Material e Métodos
±
Bacillus 
/
Bacillus Mucor
Material e Métodos
/
Sol. Enz. Bruta
(10U/g Amido)
AUTOCLAVAGEM
120 ºC/15 min
85ºC/ 1 h
Agitação
➲ Teor de açúcar redutor
➲ Reação com iodo
➲ Cromatografia de papel
(açúcares presentes no hidrolisado)
ANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISE
SOL. AMIDO
(25% p/p)
RESFRIAMENTO
80ºC
Sol. Enz. Bruta
(10U/g Amido)
85ºC/ 1 h
Agitação
HIDROLISADO
50 mL
50 mL50 mL
Material e Métodos
/
/
/
Sol. Enz. Bruta
(20, 30 e 40 U/g Amido)
85ºC/ 1, 2 e 3h
Agitação
➲ Teor de açúcar redutor
➲ Reação com iodo
➲ Cromatografia de papel
(açúcares presentes no
hidrolisado)
ANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISEANÁLISE
 SOL. AMIDO
(25% p/p) HIDROLISADO
50 mL 50 mL
Material e Métodos
Watman
Sigma
/
/
µ
Whatman 
Material e Métodos
Newport Scientific /
/
/
/
Resultados e Discussão
screening
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Klebsiella oxytoca Clostridium 
Bacteroides 
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
81,5%
52%
33%
α
Resultados e Discussão
93,2% 92%
66,3%
α
α
α
/
/ / / /
/ /
/ / / /
/
/ / /
/ / /
/ /
/ / / /
Resultados e Discussão
α β
Gibberella fujikuroi /
/ /
/
Fervidobacterium 
/ Bacillus 
/
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
/
/
/
/ /
/
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
β
α
/
/
α
/ /
/ /
/ /
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
/ / /
/
/
/
/
/
/ /
/ /
/
/
/ / / /
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
/
/
/
/
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
/ / /
/
/ /
/ /
/ /
/ /
/ /
α
β
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
/
/
/
α
/ /
/ /
/
/
/
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
/
/
/
/
/
/ /
/ /
/
/
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
/
/
/
α
/ /
/ / / /
/
/
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
/
/
/
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
/
/
/ /
/ /
/
/
/
/
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
/ /
/ / / /
/ /
α
/
/
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
/
/ /
α
/ /
/ / /
/ / /
Resultados e Discussão
α
Resultados e Discussão
α
α
Bacillus subtilis
α
Thermus
α Thermomyces laguginosus
α
Rhizopus
Resultados e Discussão
α
β
Synth
α
Resultados e Discussão
α Gibberella fugikuroi
Resultados e Discussão
/ α /
/
/
/ /
/
Bacillus clausii
/ /
Gibberalla fugikuroi
α /
/
Resultados e Discussão
screening 
Bacillus licheniformis
Bacillus Streptomyces
Bacillus
Thermomyces lanuginosus
B licheniformes
Humicula H. insolens H. lanuginosa, H. 
stellata), Thermomyces, Malbrachea pulchella sulfurea, Mucor pusillus e 
Talaromyces thermophilus
Resultados e Discussão
Bacillus 
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Kurthia 
Bacillus
Bacillus
Mucor
Bacillus Bacillus Mucor
α
Resultados e Discussão
Bacillus 
Mucor α
Nocardiopsis 
Bacillus
Thermosipho 
Thermoactinomyces
Bacillus
Bacillus clausii
Pirrococcus Thermococcus Thermogota 
Fervidobacterium 
Fervidobacterium 
 Pirrococcus woesei
Aspergillus terreus
A. terreus
Aspergillus A. tamarii
α
Resultados e Discussão
α
α Bacillus
Mucor α
α
Bacillus 
Thermosipho
Aspergillus terreus A.
terreus
A. tamarii
α Streptomyces 
Resultados e Discussão
α
Bacillus
Bacillus
Mucor
Bacillus clausii 
Thermosipho 
Bacillus α
Thermoactinomyces 
Aspergillus terreus
Aspergillus tamarii
α
Bacillus
α Bacillus
α
Mucor
Bacillus
Resultados e Discussão
Thermosipho 
Aspergillus terreus
Aspergillus tamarii
Bacillus Mucor
Mucor
Resultados e Discussão
Bacillus 
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Bacillus 
Resultados e Discussão
Mucor 
Resultados e Discussão
Bacillus 
Bacillus 
Bacillus 
α
Bacillus
α B. subtilis
α B. licheniformis
Resultados e Discussão
B. subtilis 
α Bacillus 
licheniformis
α
B. subtilis B. licheniformis
Pyrococcus furiosus
Thermococcus litoralis
α
B.
subtilis e B. stearothermophilus 
B. amyloliquefaciens,
 orizae B.
subtilis amylisacchariticus
α
α− Bacillus 
Clostridium thermosulfurogenes
α Thermus α
B. licheniformis
Resultados e Discussão
α
Bacillus 
α Mucor pusillus
α
α Bacillus circulans
α
Bacillus licheniformis
Resultados e Discussão
Bacillus Mucor
Bacillus Mucor 
////
Bacillus −
Mucor −
Resultados e Discussão
/
α /
α α
α
α
α
α
Resultados e Discussão
α
α
α
α
α
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Mucor
Resultados e Discussão
/
/
Mucor
////
−
−
−
Mucor
Resultados e Discussão
α β
α
/
Mucor 
//// ////
−
−
−
/
/
Resultados e Discussão
/
/
α α
α
Resultados e Discussão
Whatman 
Bacillus Mucor 
Resultados e Discussão
Mucor
α
Bacillus 
Bacillus 
Resultados e Discussão
Mucor
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Whatman 
Bacillus
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
Whatman 
Mucor
Resultados e Discussão
Bacillus Mucor 
/
Resultados e Discussão
α
Bacillus 
Mucor 
Resultados e Discussão
Bacillus Mucor
Bacillus
Mucor
Bacillus Bacillus
Mucor
α
Bacillus Mucor
α
Bacillus
Referências Bibliográficas
Bacillus Mucor
Bacillus
Bacillus
Mucor
Bacillus 
Mucor
-
-
-
-
>
>
>
>
α
Bacillus 
Apêncice
Aspergillus 
terreus
αααα
Scytalidium thermophilum
α Thermomyces lanuginosus 
α
Bacillus
Apêncice
Pirococcus 
furiosus. 
α α
Pyrococcus furiosus Thermococcus litoralis
Fervidobacterium
Thermococcus profundus 
Apêncice
>
α
Pyrococcus furiosus
α Rhizopus
Humicola sp
Bacillus licheniformis α
Apêncice
Bacillus clausii 
Aspergillus 
awamori
Thermococcus hydrothermalis
Curvalaria inaequalis
Aspergillus terreus
Apêncice
Aspergillus fumigatus
Baccilus 
megaterium
Aspergillus terreus
Apêncice
Thermogota maritima 
α
Aspergillus oryzae
Aspergillus awamori
α
Pyrococcus woesei
α
Pyrococcus furiosus.
Apêncice
α
Bacillus
α
Streptomyces
Bacillus 
Apêncice
Bacillus
Aspergillus tamarii
α
Apêncice
Bacillus
Thermomyces 
lanuginosos 
Apêncice
Thermogota maritima
α Thermus 
Bacillus sp
Bacillus 
α
Nocardiopsis 
Apêncice
α
α Bacillus 
subtilis
α
Apêncice
Apêncice
Apêncice
Apêncice
Apêncice
////
Apêncice
////
Apêncice
////
Apêncice
////
Apêncice
////
Apêncice
////
Apêncice
////
Apêncice
////
Apêncice
////
ApênciceApêncice
Apêncice
Apêncice
Apêncice
Whatman 
	Capa
	Folha de rosto
	Ficha catalográfica
	Comissão julgadora
	Dados curriculares
	Dedicatória
	Agradecimentos
	Epígrafe
	Sumário
	Lista de figuras
	Lista de tabelas
	Resumo
	Abstract
	Introdução
	Objetivos
	Material e Métodos
	Resultados e Discussão
	Conclusões
	Referências Bibliográficas
	APÊNDICES