Materno_fetal

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A gravidez saudável requer tolerância aos aloantígenos fetais, bem como aos antígenos embrionários e placentários singênicos.
Este fenótipo é imunomediado, pois IUGR foi resgatado em camundongos deficientes em Rag1 e envolveu uma resposta 
de memória, demonstrada pela recorrência de IUGR grave em segundas gestações. O sequenciamento de RNA de célula 
única demonstrou que a depleção de células Aire+ na gravidez resulta na expansão de células T ativadas, particularmente células auxiliares foliculares T.
Inesperadamente, a ablação seletiva de células epiteliais tímicas medulares expressando Aire ou células expressando Aire 
extratímicas (eTACs) mapeou o fenótipo IUGR exclusivamente para eTACs. Assim, relatamos um mecanismo não descrito 
anteriormente para a manutenção da homeostase imune materno-fetal e demonstramos que os eTACs
Dada a importância do gene regulador autoimune (Aire) na autotolerância, investigamos o papel das células que expressam 
Aire na tolerância materno-fetal. Relatamos que a ablação materna de células que expressam Aire (Aire+ ) durante o início da 
gravidez em camundongos causou restrição de crescimento intra-uterino (IUGR) em gestações alogênicas e singênicas.
IMUNOLOGIA MATERNO-FETAL
proteger o concepto de RCIU imunomediada.
Universidade da Califórnia, San Francisco, CA, EUA. 
da Califórnia, San Francisco, CA, EUA.
Departamento de Cirurgia, Universidade da Califórnia, San Francisco, CA, EUA.
Departamento de Medicina, Universidade
Departamento de
CAUSA.
Centro de Medicina de Precisão Materno-Fetal,
partir
Gillis-Buck et al., Sei. imunol. 6, eabf1968 (2021) 16 de julho de 2021 1 de 11
Psiquiatria e Ciências Comportamentais, Weill Institute for Neurosciences, University of 7 
California, San Francisco, CA, EUA.
Bakar Computational Health Sciences Institute, University of California, San Francisco, Diabetes 
Center University of California, San Francisco, CA, EUA.
*Autor correspondente. E-mail: tippi.mackenzie@ucsf.edu (TCM); james.gardner@ ucsf.edu 
(JMG) †Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho.
mento da Pediatrics University of California, San Francisco, CA, EUA.
Departamento 
de Epidemiologia e Bioestatística Universidade da Califórnia, San Francisco, CA, EUA.
direitos reservados; 
licenciado exclusivo
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para o original dos EUA
Associação Americana 
para o Avanço da Ciência. 
Nenhuma reclamação
Obras Governamentais
Os Autores, alguns
Para estudar o papel das células Aire+ na tolerância materno-fetal, usamos 
camundongos transgênicos do receptor da toxina diftérica Aire (AireDTR), nos 
quais as populações de células que expressam Aire podem ser deletadas por 
injeção de toxina diftérica (DT) (15); este modelo nos permitiu evitar os 
potenciais fatores de confusão da autoimunidade crônica do órgão endócrino 
observada em camundongos com deficiência constitutiva de Aire que podem 
afetar o ciclo hormonal e a qualidade do oócito antes da gravidez (11, 16, 17). 
Assim, esgotamos as células Aire+ seletivamente durante o início da gravidez, 
porque a tolerância imunológica adaptativa materna do feto demonstrou ser 
essencial nesse período, tanto em configurações singênicas quanto alogênicas (18, 19).
O gene regulador autoimune (Aire) desempenha um papel essencial na 
prevenção da autoimunidade, facilitando a expressão de autoantígenos restritos 
ao tecido em células epiteliais tímicas medulares (mTECs), levando à deleção 
clonal (3) ou conversão regulatória (4) de auto-reatividade células T. Células 
extratímicas que expressam Aire (eTACs), células apresentadoras de antígenos 
mieloides nos órgãos linfoides secundários, também podem desempenhar um 
papel na manutenção da tolerância imunológica e prevenir ainda mais a 
autoimunidade (5, 6). Os antígenos restritos a tecidos regulados por Aire 
incluem antígenos placentários em mTECs de camundongos e humanos (7), e 
a expressão tímica de Aire é sexualmente dimórfica em camundongos e 
humanos em idade reprodutiva (8, 9). Papéis para Aire na decidualização e 
implantação de embriões também foram propostos (10–12). Embora pacientes com
INTRODUÇÃO A 
gravidez saudável requer tolerância materna aos antígenos expressos pelo 
concepto. Além dos antígenos paternos, que são alogênicos à mãe, também 
existem múltiplos antígenos placentários e embrionários codificados no genoma 
materno, produzidos quando a própria mãe era um feto. Esses antígenos 
associados à gravidez (PAAs) são, portanto, tecnicamente “próprios” antígenos 
para a mãe, mas, na vida pós-natal, são encontrados apenas no contexto da 
gravidez. Se a autotolerância materna aos PAAs protege a gravidez é uma 
questão biológica importante. A perda precoce da gravidez e a restrição do 
crescimento intrauterino (IUGR) são problemas de saúde substanciais em todo 
o mundo e, embora haja uma associação clínica entre autoimunidade e essas 
complicações da gravidez (1, 2), os mecanismos imunológicos dessa 
associação não foram descritos.
Detectamos um aumento significativo na taxa de reabsorção (desperdício 
fetal) após a depleção de células Aire+ em gestações alogênicas em 
comparação com gestações alogênicas não depletadas (Fig. 1, E e F). Além 
disso, detectamos restrição de crescimento fetal mesmo em gestações sem 
reabsorção: o peso médio dos locais de implantação foi significativamente 
menor nas gestações alogênicas AireDTR + DT (grupo #1) do que nos controles 
alogênicos de tipo selvagem (WT) + DT (grupo # 2) (Fig. 1, E e G). Mais da 
metade das gestações com AireDTR + DT tiveram um peso médio no local de 
implantação inferior ao 10º percentil
RESULTADOS Depleção de células que expressam Aire 
em gestações alogênicas e singênicas Para ablação de 
células Aire+ maternas em gestações alogênicas e singênicas e controle de 
efeitos fora do alvo de DT e do transgene AireDTR, usamos uma combinação 
de abordagens de reprodução (Fig. 1A). Confirmamos a depleção de mTEC e 
eTAC usando citometria de fluxo e hibridização in situ (Fig. 1B). As taxas de 
implantação (Fig. 1C) e o tamanho da ninhada não diferiram significativamente 
entre os grupos experimentais (Fig. 1D), indicando um fenótipo pós-implantação.
As mutações AIRE na terapia de reposição hormonal adequada podem levar à 
gravidez, mas são complicadas por insuficiência fetoplacentária, IUGR e 
placentas com infiltração linfocítica difusa da placa decidual, sugestiva de 
autoimunidade placentária ( 13, 14). No entanto, não foi investigado se as 
células que expressam Aire estão funcionalmente envolvidas na tolerância 
materno-fetal.
As células extratímicas que expressam Aire 
suportam a tolerância materno-fetal
,
,Eva Gillis-Buck1 , Haleigh 
Miller2,3,4 Mark S. Anderson4,8
,, Marina Sirota3,5 , Stephan J. Sanders6,7 
James M. Gardner1,4 *† , Tippi C. MacKenzie1,5,7 *†
Vasilis Ntranos2,3,4
CIÊNCIA IMUNOLOGIA | ARTIGO DE PESQUISA
1
4
6
2
5
8
3
Machine Translated by Google
mailto:james.gardner@ucsf.edu
Embriões 
vivos WT + útero DT, E9.5
Reabsorção 
AireDTR + útero DT,E9.5
Embriões 
vivos AireDTR + útero DT, E9.5
G
BA
C
E F
D
10º pct.
Timo Timo NL de drenagem uterina
* *
** *
Taxa de reabsorção em E9.5
Tamanho da ninhada em E9.5taxa de implantação
Expressão de mRNA de Aire em E9.5
#1 #2 #3 #4 #5 #6
80%
60%
40%
#1 #2 #3 #4 #5 #6
0%
5
20%
40%
30%
20%
15
0%
10%
10
0
Grupo (ver A) Grupo (ver A)
60
100
20
80
40
0
P = 0,10
N = 20N = 37 N = 29N = 42
N = 48 N = 47 N = 26 N = 35 N = 44 N = 37
N = 28N = 27
CIÊNCIA IMUNOLOGIA | ARTIGO DE PESQUISA
ns
ns
* * * *
*
* * *
* * * *
Linha pontilhada, percentil 10 (pct.) do peso de 
implantação no grupo alogênico (Allo) WT + DT. Sin, 
singênico. Os círculos vermelhos indicam conceptos 
abaixo do percentil 10. ns, não estatisticamente significativo.
(A) Desenho experimental: Fêmeas B6.AireDTR ou 
B6.WT foram criadas conforme indicado e tratadas com 
DT ou PBS em dias alternados desde o dia do plugue 
(E0.5) até a colheita (E9.5). (B) Citometria de fluxo do 
timo materno com CD11cÿ CD45ÿ EpCAM+ mTECs 
(esquerda) e hibridação in situ para transcrição de Aire 
(vermelho) no timo materno (meio) e linfonodos de 
drenagem uterina (direita) de fêmeas WT e AireDTR 
tratados com DT. (C) Taxa de implantação (percentagem 
de fêmeas obstruídas com locais de implantação visíveis 
em E9.5). n, número de fêmeas plugadas. (D) Tamanho da ninhada em E9.5.
Gillis-Buck et al., Sei. imunol. 6, eabf1968 (2021) 16 de julho de 2021 2 de 11
*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001 pelo 
teste exato de Fisher para (C) e (F). Teste de comparações 
múltiplas de Tukey para (D) e (G).
(E) Patologia macroscópica e coloração H&E dos 
resultados da gravidez em E9.5: (superior) útero AireDTR 
+ DT com embriões em reabsorção, (meio) útero AireDTR 
+ DT com embriões vivos e (inferior) útero WT + DT com 
embriões vivos . (F) Taxa de reabsorção em E9.5. n, 
número de gestações implantadas. (G) Peso médio do 
local de implantação (peso do útero por número de embriões).
Fig. 1. A ablação de células Aire+ maternas durante a 
gravidez aumenta o risco de reabsorção e RCIU.
AireDTR + DT WT + DT
Número de locais de implantação
MHC II
% de fêmeas plugadas
% de gestações
Peso (mg)
Peso médio do 
local de implantação em E9,5
Ar
Syn
WT + DT
Grupo #2
Syn
AirDTRName
AireDTR + DT 
×
WT
Grupo 1
Grupo #6
Syn
Ar DTR + DT
WT
No
Grupo 1
WT + DT 
×
Syn
WT + DT
No
AirDTR + PBS
×
WT
WT
Grupo #5
No
Ar DTR + DT
×
AireDTR + DT 
×
No
No
Grupo #4
Syn
AirDTRName
Grupo #6
×
WT
WT
WT
No
AireDTR + PBS 
×
Grupo #5
× ×
WT WT
Grupo #3
Grupo #4
Syn
Grupo #3
×
WT + DT
WT + DT 
×
Grupo #2
WT + DT 
×
WT
2.41
20.8
Ar
Ar
por DT) seria restrita ao embrião (grupo #6). O tamanho da ninhada (Fig. 
1D), a taxa de reabsorção (Fig. 1F) e o peso médio do local de implantação 
(Fig. 1G) foram todos semelhantes às gestações WT sem Aire +
Para determinar se esses efeitos foram
do grupo WT + DT e preencheram os critérios 
para IUGR (20). Este não foi um efeito 
intrínseco do transgene, porque as gestações 
alogênicas AireDTR + solução salina 
tamponada com fosfato (PBS) (grupo #3) 
tiveram resultados de gravidez e pesos do 
local de implantação comparáveis aos das 
mães WT + DT (Fig. 1, F e G).
devido à expressão de aloantígenos paternos 
pelo embrião/placenta, também esgotamos 
células Aire+ em gestações singênicas 
(grupos #4 e #5). As taxas de reabsorção em 
gestações com depleção de Aire tendem a 
ser maiores do que nos controles (Fig. 1F), e 
o fenótipo IUGR persistiu com depleção de 
células Aire+ em acasalamentos singênicos 
(Fig. 1G), indicando que as células Aire+ 
suportam a tolerância ao concepto, mesmo 
quando o feto não expressa aloantígenos 
paternos. Esses resultados sugeriram ainda 
que o fenótipo IUGR pode ser um marcador 
mais robusto do que a reabsorção para o 
papel de Aire nas complicações da gravidez.
Em seguida, investigamos se a depleção de células Aire+ embrionárias 
poderia explicar esses fenótipos, cruzando machos AireDTR com fêmeas 
WT, de modo que a expressão de AireDTR (e potencial depleção
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3 de 11Gillis-Buck et al., Sei. imunol. 6, eabf1968 (2021) 16 de julho de 2021
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depleção celular, indicando que os fenótipos de reabsorção e restrição de 
crescimento são secundários à depleção de células maternas, não 
embrionárias, Aire+ .
As mães AireDTR+ RAG1ÿ/ÿ e AireDTRÿ RAG1ÿ/ÿ não diferiram 
significativamente na taxa de implantação, tamanho da ninhada, taxa de 
reabsorção ou peso médio do local de implantação no dia embrionário 9,5 
(E9,5) (Fig. 2, B e C , e fig. S1, A e B). As mães RAG1-/- eram menos 
propensas a engravidar após o acasalamento e tinham taxas mais altas de 
reabsorção basal, independentemente da ablação de células Aire+ (fig. 
S1A), que observamos em experimentos anteriores com esta cepa. Esses 
achados indicam um papel da imunidade adaptativa materna nas 
complicações da gravidez observadas em gestações com AireDTR + DT.
Diferenciando o papel de mTECs versus eTACs na 
tolerância materno-fetal Apesar do significado bem 
estabelecido de Aire no timo, a curta duração da ablação de células Aire+ 
e a expansão específica de populações de TFH no experimento anterior 
sugeriram um papel potencial para eTACs neste processo; As células TFH 
dependem da sinalização do coestimulador induzível (ICOS/ICOS)-ligante 
(ICOS-L) e mediam a comunicação cruzada entre células T e células B 
( 24), e sabe-se que os eTACs se agrupam nas regiões limítrofes da TB e 
expressam altos níveis de ICOS -L (5). Além disso, foi previamente sugerido 
que a perda de Aire extratímico leva à expansão das populações de TFH 
(25). Portanto, investigamos as contribuições relativas do tímico e do 
eTACS para esse fenótipo de gravidez. Primeiro, investigamos alterações 
transcricionais em células Aire+ em mTECs e eTACs usando o Igrp (gene 
relacionado à glicose 6-fosfatase específico de ilhotas) – proteína 
fluorescente verde (GFP) (Adig) ( 5). Nós classificamos mTECs e eTACs 
de fêmeas Adig virgens e mães Adig grávidas E9.5 para RNA-seq em 
massa (fig. S5A).
Para entender melhor os mecanismos imunológicos subjacentes a esse 
fenótipo, realizamos o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-
seq) em leucócitos obtidos dos órgãos linfóides secundários (gânglios 
linfáticos de drenagem uterina e não uterina) de mães grávidas WT e 
AireDTR durante a gravidez alogênica. Todas as amostras mesclaram bem (fig. S3),
No entanto, esses resultados nos levaram a perguntar formalmente se 
o fenótipo IUGR poderia ser mapeado para a ablação de mTECs ou eTACs. 
Assim, realizamos experimentos de “troca” tímica recíproca em que 
timectomizamos fêmeas WT e AireDTR e transplantamos simultaneamente 
timo de doador WT ou AireDTR sob a cápsula renal. Esta abordagem nos 
permitiu ablacionar mTECs, eTACs, ambos ou nenhum em mães durante a 
gravidez(Fig. 4, D e E). Novamente não encontramos diferenças 
significativas nas taxas de implantação, tamanho da ninhada ou reabsorção 
entre os grupos (fig. S6, A e B). Inesperadamente, o fenótipo IUGR profundo 
persistiu, mas apenas em mães com ablação por eTAC e não por mTEC 
(Fig. 4F). Ablação de ambos os tipos de células
Resposta imune materna após depleção de células que 
expressam Aire A microscopia de imunofluorescência do 
útero nesses experimentos demonstrou infiltração marcada de células 
CD3+ no miométrio (Fig. 2A), sugerindo um mecanismo imunológico. Para 
testar formalmente se o sistema imunológico adaptativo era necessário 
para complicações na gravidez em camundongos com ablação de Aire, 
cruzamos o transgene AireDTR em camundongos RAG1-/-, que não 
possuem células T e B funcionais.
S2, D e E). Assim, as complicações da gravidez neste modelo não parecem 
ser devidas a autoimunidade sistêmica ou deficiência de progesterona.
Entre as células T CD4+ maduras, houve uma mudança significativa das 
células T reguladoras (Tregs) para as células T efetoras maduras (Fig. 3, F 
para H), principalmente as células T foliculares auxiliares (TFH) e T 
auxiliares 17 (TH17) (Fig. 3I). Juntos, esses resultados são consistentes 
com a ideia de que a ablação de células Aire+ leva à perda da homeostase 
imune normal, com ativação aumentada de efetores CD4+ e CD8+ T e uma 
mudança concomitante de populações de linfócitos reguladores para 
efetores nos linfonodos maternos.
Embora essas alterações transcricionais possam representar a expressão 
intrínseca do eTAC de PAAs, a gravidez também causa aumento da 
hematopoese materna (26) e passagem de hemácias nucleadas fetais para 
a circulação materna (27), e a relevância imunológica desse fenômeno não 
requer estudos adicionais.
Como pacientes com mutações Aire e camundongos knockout para 
Aire desenvolvem autoimunidade sistêmica, especialmente em órgãos 
endócrinos (21), pensamos que esse fenótipo de gravidez pode ser um 
resultado secundário de autoimunidade direcionada contra outros órgãos 
endócrinos. No entanto, não encontramos evidências de infiltração linfocítica 
ou outra patologia nas glândulas adrenais maternas AireDTR + DT e WT + 
DT, ilhotas pancreáticas, glândulas pituitárias ou ovários durante o curto 
curso desses experimentos (fig. S2A). Também não encontramos diferenças 
significativas no número de corpos lúteos, que produzem a progesterona 
necessária para manter a gravidez (fig. S2B). Para investigar se a deficiência 
materna de progesterona tornava as gestações AireDTR + DT vulneráveis 
à reabsorção, medimos a progesterona sérica materna em E6.5 e estudamos 
a correlação com os resultados de futuras gestações (vivos versus embriões 
reabsorvidos) em E9.5. Não houve diferenças significativas entre AireDTR 
+ DT e WT + DT progesterona sérica materna em E6.5, independentemente 
do resultado da gravidez E9.5 (fig. S2C). Para descartar um papel para a 
deficiência de progesterona neste fenótipo (22), em seguida, administramos 
progesterona exógena às mães nos dias E4.5 a E8.5 (peri-implantação), o 
que não impediu a reabsorção ou RCIU em mães AireDTR + DT (Figo.
e fomos capazes de identificar populações linfóides e mielóides distintas 
(Fig. 3A). O mapeamento de características e as projeções de similaridade 
por célula contra populações de referência do banco de dados do 
Immunological Genome Project (ImmGen) (23) nos permitiram validar 
claramente a identidade de subpopulações de células linfóides e mieloides 
virgens, maduras e reguladoras (Fig. 3, B a D, e fig. S4, A e B). A análise 
das distribuições populacionais diferenciais em camundongos WT e 
AireDTR demonstrou uma mudança significativa de células T CD4+ e CD8+ 
virgens para efetoras como resultado da perda de células que expressam Aire (Fig. 3, D e E).
Embora não tenhamos encontrado diferenças na frequência ou número 
absoluto de mTECs ou eTACs (fig. S5B), ou de expressão de Aire em 
mTECs ou eTACs (fig. S5C) durante a gravidez, encontramos um número 
significativo de diferencialmente expressos (DE) transcritos durante a 
gravidez em eTACs esplênicos e quase nenhuma alteração em mTECs 
(Fig. 4, A a C e fig. S5, D a F). A análise do caminho dos genes DE 
esplênicos revelou enriquecimento para o desenvolvimento de eritrócitos 
(fig. S5G) e incluiu vários PAAs putativos, como a hemoglobina teta embrionária.
Para confirmar ainda mais se esse fenótipo era de origem imunológica, 
perguntamos a seguir se havia um componente de memória, examinando 
os resultados de segundas gestações – ou seja, exposição repetida a PAAs 
– após ablação seletiva de células Aire+ apenas durante a primeira 
gravidez . Fêmeas AireDTR e WT foram tratadas com DT durante sua 
primeira gestação, reproduzidas uma segunda vez sem exposição a DT e 
colhidas em E9.5 (Fig. 2D). O tempo entre o primeiro tampão e o segundo 
tampão, taxa de implantação, tamanho da ninhada e taxa de reabsorção 
não diferiram significativamente (Fig. 2, E e F, e fig. S1, C e D), mas um 
fenótipo IUGR severo ocorreu seletivamente em mães AireDTR + , 
indicando uma resposta de memória aos PAAs (Fig. 2, G e H). Estas 
experiências suportam ainda mais a natureza imunológica do fenótipo IUGR.
Machine Translated by Google
embrião 
reabsorvido
Miométrio
Decídua
Decídua
embrião 
reabsorvido
Miométrio
Decídua
Decídua
Miométrio
Miométrio
4 de 11
Fig. 2. O sistema imunológico adaptativo materno media as complicações da gravidez associadas à ablação de células Aire+ . (A) Imagens de imunofluorescência mostrando 
infiltração de células T CD3 no útero após depleção de Aire. Barras de escala, 100 ÿm. (B) Taxa de reabsorção e (C) peso médio do local de implantação em E9,5 em gestações alogênicas 
AireDTR+ RAG1ÿ/ÿ e AireDTRÿ RAG1ÿ/ÿ tratadas com DT. (D) Esquema do projeto experimental: gestações alogênicas AireDTR e WT foram tratadas com DT até E9.5, e a gravidez 
continuou até o termo. As mães foram reproduzidas uma segunda vez sem tratamento DT, e os resultados da segunda gravidez foram observados em E9.5. (E) Dias entre o plug da primeira 
gravidez e o plug da segunda gravidez. (F) Taxa de reabsorção da segunda gravidez. (G) Patologia grosseira representativa do útero em E9.5 da segunda gravidez. (H) Peso médio do local 
de implantação em E9,5 da segunda gravidez. A linha pontilhada indica o percentil 10 do peso do local de implantação no grupo WT + DT.
Gillis-Buck et al., Sei. imunol. 6, eabf1968 (2021) 16 de julho de 2021
Os círculos vermelhos indicam conceptos abaixo do percentil 10. ns, não significativo; P > 0,05 e **P < 0,01 pelo teste exato de Fisher em (B) e (F) e teste t não pareado em (C), (E) e (H).
80
20
0
60
40
×
resultou em IUGR, enquanto a ablação de mTECs sozinha foi 
equivalente à ablação de nenhum tipo de célula, sugerindo que a 
perda de eTACs era necessária e suficiente para este fenótipo. Houve 
um aumento na proporçãode células ÿÿTCR+ CD3+ CD4/8ÿ , uma
população rara anteriormente descrita com função efetora (28, 29), 
no útero de mães com eTACs ablacionados (Fig. 4, G e H). Assim, o 
fenótipo de IUGR está funcionalmente ligado à perda de eTACs e 
associado ao enriquecimento de células imunes adaptativas no útero.
Útero CD3/DAPI
N = 22N = 23
AireDTR+ ou WT B6
WT BALB/CWT BALB/C
AireDTR + DT WT + DT
×
A
% de gestações
Dias
Peso (mg)
% de gestações
Peso (mg)
* *
40%
60%
0%
20%
B
FE 
G H
C
D
ns
ns
ns
AireDTR + DT WT + DT
N = 18 N = 29
WT + DT útero 
E9.5 da segunda gravidez
Taxa de reabsorção da 
segunda gestação em E9,5
Tempo entre
AireDTR + útero DT E9.5 
da segunda gravidez
DT DT DT DT DT
20%
80%
60%
0%
40%
10º pct.
ns
RAG1–/– taxa de 
reabsorção
Peso médio do local 
de implantação em E9,5
100 ÿm
100 ÿm100 ÿm
100 ÿm
CIÊNCIA IMUNOLOGIA | ARTIGO DE PESQUISA
(E9.5)
Segundo 
plugue 
E0.5
Resultado da segunda gravidez 
em E9.5
Primeiro 
plugue E0.5
Resultado da primeira 
gravidez (por exemplo, nascimento)
WT
RAG1–/–
AirDTR+
RAG1–/–
RAG1–/–
AirDTR+
WT
RAG1–/–
20
100
60
0
80
40
20
0
100
80
60
40
AireDTR + DT WT + DT
Machine Translated by Google
CIÊNCIA IMUNOLOGIA | ARTIGO DE PESQUISA
CD4+ CD8+CD8+ CD4+
Treg
Treg
TFH
deve incluir aloantígenos 
singênicos e paternos expressos 
pelo concepto. Assim, esses 
experimentos fornecem uma 
visão mecanicista da associação 
conhecida de IUGR com doença autoimune (1, 2).DISCUSSÃO 
Estes resultados sugerem um papel anteriormente não reconhecido para 
as células que expressam Aire na homeostase imunológica materno-fetal. 
Mostramos que a depleção de células Aire+ durante a gravidez resulta em
IUGR imunomediada, que esse 
fenômeno requer imunidade 
adaptativa e tem memória 
imunológica, e que um fenótipo 
de ativação imune significativa 
é observado nos órgãos 
linfoides secundários 
caracterizados pela ativação 
de células T efetoras, 
particularmente células TFH . 
Esses resultados levam à 
conclusão de que o repertório 
de antígenos é importante para a tolerância materno-fetal
Nossos achados também suportam um papel previamente não descrito 
para eTACs na manutenção da tolerância materna ao feto. Os eTACs já 
demonstraram mediar a inativação ou exclusão funcional
EUH
A
E 
G
D
C
F
B
Agir. Treg
40
20
10
Ato precoce. th17
30
% de células T virgens % de células T maduras
TFHTreg
porcentagem de células por grupo
Tipos de células
célula B
(% de todas as células)
Frequência do tipo de célula
Treg
Nve. CD4+
etc
Juntamente com. CD8+Comida. CD4+ Não. CD8+
células
mieloide
% maduro (entre CD4+ ou CD8+)
gdT
% Naïve (entre CD4+ ou CD8+)
eu
Gillis-Buck et al., Sei. imunol. 6, eabf1968 (2021) 16 de julho de 2021
Fig. 3. A ablação de células Aire+ leva 
ao aumento da ativação de células T e 
à expansão relativa das populações 
efetoras TFH e TH17. (A) Agrupamento 
Leiden de amostras reunidas de scRNA-
seq de linfonodos braquiais e uterinos de 
camundongos WT tratados com DT e 
AireDTR, populações identificadas 
conforme indicado. (B) Gráficos de recursos 
para os genes indicados. (C) Projeção por 
célula de pontuações de similaridade de 
cosseno para tipos de células de referência 
ImmGen indicados. Nve., ingênuo. Mat., 
maduro. (D) Frequência do tipo de célula 
(entre todas as células) em camundongos 
WT (verde, n = 3) e AireDTR (azul, n = 4). 
(E) Proporção relativa de populações 
virgens versus maduras entre células T 
CD4+ e CD8+ ; camundongos individuais são mostrados como pontos vermelhos.
5 de 11
(F) Agrupamento de Leiden de populações 
maduras de CD4+ e Treg de (A), acima, 
com populações identificadas conforme 
indicado. Agir, ativado. (G) Gráficos de 
recursos para os genes indicados. (H) 
Gráfico de densidade diferencial mostrando 
a distribuição de populações crescentes 
(vermelho) ou decrescentes (azul) em 
AireDTR em relação a WT. (I) Box plots 
mostrando frequência por tipo de célula 
entre populações maduras e regulatórias 
mostradas em (F). Camundongos 
individuais mostrados como pontos 
vermelhos. *P < 0,05, **P < 0,01 e ****P < 
0,0001 pelo teste t não pareado .
Gzmm
Juntamente com. CD8+
mieloide
CD8+ maduro
Agir. Treg
CD8+ ingênuo
célula B
maf
Comida. CD4+
Ato precoce.
Não. CD8+
CD4+ ingênuo
CD4
gdT
célula B Nve. CD4+
etc
Foxp3
th17
Cd8
CD4+ maduro
Cd19
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CIÊNCIA IMUNOLOGIA | ARTIGO DE PESQUISA
DT DT DT DT DT
P_S_8761_spl V_S_8763_spl P_S_8762_spl
10
P_S_58343_spl P_S_58348_spl
% de CD3+ CD4– CD8–
TCRÿÿ
P_S_58350_spl
TCRÿÿ
10
V_S_8714_spl
–Log P
P_S_8706_spl V_S_8758_spl
Peso (mg)
V_S_58351_spl
% de CD3+ CD4– CD8–
V_S_58355_spl
–Log P
V_S_58349_spl
Timo de doador WT em
Destinatário WT + DTDestinatário AireDTR + DT
Timo de doador AireDTR em
93,2%
0% 0%
1,2%
0%0%
ou
ou
Destinatário
Doador
Rim WT
1 mm
WT timo
1 mm
Destinatário
Doador
AireDTR + rim
AireDTR + timo
nsns
* *
NK1.1+ TCRÿÿ+ TCRÿÿ+ NK1.1+ TCRÿÿ+ TCRÿÿ+
10 10
15
5
0
10
20
100
60
0
80
40
Tmod1
Ermap
Grávida
Snc
1700025B11Rik
ÿ2
Apol11b
Aqp1
Hbb-b1
gpsm2
Trem3
Ninja2
direito
Status
0
Slc43a1
Abcg4
tubos
Hba-a1
Sox6
Hbq1b
Nxpe2
Lrfn4
ÿ1
Trim10
infelizmente2
F13a1
2
No
carro2
Status
Redrum
Hbb-bt
1300017J02 Rico
Samd11
Epor
Slc38a5
2 de outubro
Lpl
wdr78
Apol8
Cldn13
Hba-a2
Tuba3b
Btnl10
Pde4c
Tspo2
Virgem
1
Klf1
Sem ablação
Grupo #2 
mTECs 
ablacionados
Grupo nº 4 
mTECs + eTACs 
ablacionados
Grupo nº 1 
eTACs 
ablacionados
Grupo #3
Log FCLog FC
WT BALB/C
3
5 1010
10
0
–
5
3
10
10
10
4
–10
10
4
33
mTECs (timo)
AirDTRName
WT
eTACs (baço)
22
4
0
2
6
ÿ4 4
10º pct.
G
0 0
0
×
100%
50%
0%
6 de 11
Adig fêmeas. (D) Desenho experimental: Fêmeas 
AireDTR e WT foram submetidas a timectomia e 
receberam um transplante de timo de doador WT ou 
AireDTR e então foram cruzadas com machos 
alogênicos e tratadas com DT em dias alternados até 
E9.5. txp, transplante. (E) Hibridação in situ para Aire 
mRNA em timo WT transplantado (esquerda) e AireDTR 
+ timo (direita) após o tratamento DT. (F) Peso médio 
do local de implantação em E9.5. Linha pontilhada, 10º 
percentil de peso de implantação do grupo nº 2 com 
ablação de mTEC. Os círculos vermelhos indicam 
conceptos abaixo do percentil 10. (F) Gráficos 
representativos de citometria de fluxo e (G) porcentagens 
de subconjuntos de CD3 no útero de mães submetidas 
à ablação com eTAC ou mTEC. ns, não significativo (P 
> 0,05); *P < 0,05, **P < 0,01 e ****P < 0,0001 pelo 
teste de comparação múltipla de Tukey.
Fig. 4. eTACs expressam PAAs durante a gravidez 
normal e previnem a restrição do crescimento.
Gillis-Buck et al., Sei. imunol. 6, eabf1968 (2021) 16 de julho de 2021
(A e B) Gráficos de vulcão e (C) mapa de calor de 
genes DE [ P adjacente <0,05, abs(log2FC) > 1], por 
sequência de RNA em massa de células CD3ÿ CD19ÿ 
NK1.1ÿ MHCIIhi GFP+ classificadas do timo ( mTECs) 
ou baços (eTACs) de E9.5 grávida (P; n = 5) e virgem (V; n = 6)
Log2 FC
ns
P e Log2 FC P
Pe Log2 FC
ns
Log2 FC
Hibridização in situ de mRNA de Aire
Plugue 
E0.5
Saco E9,5
50%
100%
0%
A B
D
E F
C
H
2 semanas de recuperação
WT ou DTR
Txp tímico neonatal
Criação de Allo
WT ou DTR
Timectomia AirDTR
WT timectomia
Txp tímico neonatal
**
**
****
10
3 4
10
10
3
10
3
–10
– 10
4
5
3
10
5
0
0
10
TCRÿÿ TCRÿÿ
GrávidaNão grávidaGrávida Não grávida
A IUGR tem sido associada à tolerância materna 
prejudicada no início da gravidez, possivelmente 
como resultado da indução prejudicada de Treg 
(30).
genoma nal, mas expresso apenas por tecidos 
específicos masculinos e, portanto, encontrado 
apenas durante a gravidez com um feto masculino.
Na ausência de eTACs, as células T efetoras 
maternas escapam dessa regulação e se infiltram 
no útero, contribuindo para resultados adversos 
da gravidez (Fig. 5).
Um aspecto crítico da tolerância materno-
fetal é a tolerância a antígenos masculinos 
específicos (31). Alguns deles podem ser 
considerados PAAs: codificados na matéria
Por exemplo, antígenos autossômicos específicos 
da próstata podem ser expressos no feto 
masculino, mas são antígenos potencialmente 
inéditos para o sistema imunológico materno. No 
entanto, Tregs dependentes de Aire específicos 
para o antígeno específico da próstata são 
encontrados em camundongos machos e fêmeas, 
apesar da falta de tecido prostático em fêmeas 
(32). Por outro lado, antígenos menores codificados pelo cromossomo Y, como HY, 
também estão presentes em gestações alogênicas e singênicas, mas não são PAAs 
porque o genoma materno não inclui um cromossomo Y. Em nosso modelo AireDTR, 
observamos
IUGR ou reabsorção de todos os locais de implantação, em oposição a 50% dos 
locais de implantação se os embriões masculinos fossem afetados seletivamente, 
como vimos em um modelo anterior de reabsorção aloespecífica (33). No entanto, 
devido à expansão das células T efetoras específicas do antígeno contra um subconjunto de
de células T cognatas e expansão de populações 
Treg (5, 6). No contexto da gravidez, eles podem 
promover a tolerância ao feto por meio da 
expressão de PAAs induzida por Aire ou por uma 
variedade de meios, incluindo a supressão da 
ativação de células T e a indução de populações 
reguladoras.
Útero
Grupo #2 
mTECs ablacionados
Grupo nº 1 
eTACs ablacionados
Grupo #2 
mTECs ablacionados
Útero
Grupo nº 1 
eTACs ablacionados
Útero Útero
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CIÊNCIA IMUNOLOGIA | ARTIGO DE PESQUISA
- Manter a tolerância ao antígeno syn e allo
- Resposta alo/singênica contra a gravidez - 
Contribuição para IUGR/reabsorção - Papel das células 
B?
- Eliminar ou redirecionar as células 
imunológicas adaptativas syn e allo
Funções regulatórias/tolerogênicas
Treg
Órgão 
linfoide 
secundário
a ninhada pode ter um impacto adverso em toda a gravidez em outros 
ambientes (34, 35), a contribuição potencial da reatividade imunológica 
materna contra antígenos masculinos quando as células que expressam Aire 
estão esgotadas merece uma investigação mais aprofundada.
pelo menos 20 fêmeas plugadas em cada 
grupo experimental para alimentar o estudo 
dada a taxa de perda de gravidez em controles 
não manipulados. Para investigar a resposta 
imune materna da depleção de células Aire+ , 
usamos microscopia de imunofluorescência, 
citometria de fluxo e scRNA-seq para analisar 
células T do timo, linfonodos, baço e útero de 
camundongos AireDTR + DT e WT + DT 
prenhes. Para comparar transcrições de 
mTEC e eTAC com camundongos grávidos e 
não grávidos, usamos camundongos 
transgênicos Adig e citometria de fluxo para 
isolar os mTECs e eTACs e RNA-seq em 
massa para comparar as populações. Por 
último, para diferenciar o efeito da perda de 
mTEC versus perda de eTAC, realizamos 
timectomias e transplantes de timo em 
camundongos AireDTR e WT antes da gravidez.
Mais trabalho é necessário para entender o papel intrínseco da célula do 
próprio Aire na indução de tolerância periférica.
A genotipagem AireDTR também foi realizada pela Transnetyx usando PCR 
em tempo real. Camundongos C57BL/6 foram obtidos de Charles River
Laboratórios (Wilmington, MA). Camundongos BALB/c e RAG1ÿ/ÿ (B6.129S7- 
Rag1tm1Mom/J) foram adquiridos do laboratório Jackson (estoque JAX 
#002216). Camundongos RAG1ÿ/ÿ foram cruzados com camundongos 
transgênicos AireDTR para obter fêmeas experimentais RAG1ÿ/ÿAireDTR+/
ÿ , com fêmeas RAG1ÿ/ÿAireDTRÿ/ÿ como controles. A genotipagem RAG1 
foi realizada pela Transnetyx usando PCR em tempo real. Os machos foram 
acasalados com fêmeas individuais uma vez por semana. Fêmeas 
experimentais foram cruzadas com machos BALB/c em cruzamentos 
alogênicos ou machos C57BL/6J em cruzamentos singênicos, salvo indicação 
em contrário. O dia do plugue da cópula foi designado em E0.5. Todos os 
camundongos foram mantidos em gaiolas microisoladoras e tratados de acordo com os Institutos Nacionais
Camundongos transgênicos C57BL/6 Adig também foram adquiridos de M. 
Anderson e mantidos em heterozigose. A prole foi rastreada quanto à 
presença do transgene IGRP (proteína relacionada à glicose-6-fosfatase 
específica de ilhota)-GFP usando os iniciadores de genotipagem 5'-AAGTT 
CATCTGCACCACC-3' e 5'-TCCTTGAAGAAGATGGTGCG-3'.
GCTCCTCCTTGCT-3'. A genotipagem AireDTR também foi realizada pela 
Transnetyx usando reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.
Camundongos e 
genotipagem Todos os primers de DNA foram sintetizados pela Integrated 
DNA Technologies (Coralville, IA). Camundongos transgênicos C57BL/6 
AireDTR foram adquiridos de M. Anderson, e o transgene foi mantido em 
heterozigosidade para todos os experimentos. A prole foi rastreada quanto à 
presença do transgene AireDTR usando os iniciadores de genotipagem 5'-
GGACCTTTTGAGAGTCACTTTATCCT-3' e 5'-CCCGT
Desenho do 
estudo O objetivo deste estudo foi determinar o papel das células maternas 
que expressam Aire durante a gravidez. Usamos o transgênico AireDTR
No entanto, o conceito de que as células que expressam Aire, 
tradicionalmente reconhecidas por seu papel na autotolerância imune em 
mTECs, também desempenham um papel fora do timo na aptidão reprodutiva 
sugere um mecanismo previamente não descrito para manter a tolerância materno-fetal.
injeções de camundongo e DT para remover 
células que expressam Aire durante a primeira 
metade da gravidez e confirmaram a depleção 
de mTEC e eTAC usando citometria de fluxo 
e hibridização in situ. Para testar se o fenótipo 
da gravidez era devido à deficiência de 
progesterona, administramos progesterona 
suplementar a camundongos AireDTR e WT 
grávidos. Para testar se o sistema imunológico 
adaptativo era responsável pelo fenótipo 
observado, criamos camundongos 
AireDTR.RAGKO. Nós estudamos em
O papel preciso de Aire nesse processo também permanece obscuro.
Mais amplamente, isso demonstra que a perda de populações expressando 
Aire extratímica leva a uma quebra na homeostase imunológica normal. Se a 
expressão de PAAs induzida por Aire em eTACsinduz a tolerância materna 
ao embrião e à placenta, então esse importante mecanismo evolucionário 
pode ser sequestrado por cânceres que expressam PAAs e pode explicar por 
que esses cânceres são tão agressivos (36) . Uma melhor compreensão 
desses sistemas pode levar a terapias direcionadas a populações que 
expressam Aire para proteger a gravidez e, mais amplamente, para uma 
ampla gama de aplicações clínicas na tolerância imunológica.
Embora Aire possa promover a expressão de PAAs, também é possível que 
os eTACs suportem a gravidez independentemente da ação do próprio gene 
Aire ou que Aire desempenhe um papel diferente nessa população.
Icos/IcosL 
Ar
gravidez saudável
IUGR
Resopção
Gillis-Buck et al., Sei. imunol. 6, eabf1968 (2021) 16 de julho de 2021 7 de 11
Fig. 5. Mecanismo proposto do papel dos eTACs 
na tolerância materno-fetal. O eTAC pode ajudar a 
manter a tolerância materno-fetal por meio de vários 
mecanismos. Sua perda leva à expansão das 
populações de células T efetoras, particularmente 
células TFH e TH17, e resulta em RCIU imunomediada e reabsorção. Os eTACs podem interagir com células T virgens por meio 
de uma variedade de receptores de superfície celular e são conhecidos por expressar altos níveis de ICOS-L e outros genes 
imunomoduladores. O papel preciso de Aire nessa população ainda precisa ser determinado e pode incluir a expressão de 
antígenos específicos do tecido e associados à gravidez, indução de um fenótipo imunorregulador ou outros meios desconhecidos. 
Tanto a reabsorção quanto o IUGR podem resultar da quebra desse mecanismo de homeostase imune. Esta ilustração foi gerada usando biorender.com.
este orc ptors
Outro
imunomodulador
eTAC
MATERIAIS E MÉTODOS
Papel do Aire nos 
eTACs: - Expressão intrínseca de TSA/PAA celular? Aquisição primária de antígeno tecidual?
- Promoção de programa transcricional tolerogênico? Outro?
Célula T virgem
TFH/TH2
deletado
TH17/TH1
Exausta/
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8 de 11Gillis-Buck et al., Sei. imunol. 6, eabf1968 (2021) 16 de julho de 2021
CIÊNCIA IMUNOLOGIA | ARTIGO DE PESQUISA
DT (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) foi administrado intraperitonealmente em 
uma dose de 15 a 25 ng/g em PBS estéril, em dias alternados, de E0,5 a E8,5.
As células foram ressuspensas no clone de anticorpo bloqueador do receptor anti-Fc 
2.4G2 por 10 min e depois incubadas no gelo por 30 min com anti
Pontuações de similaridade de anotação de tipo de célula/ImmGen
coquetéis corporais. As amostras foram fixadas, permeabilizadas e incubadas com 
anticorpo FoxP3 1:100 usando um kit de coloração intranuclear (Thermo Fisher 
Scientific, Waltham, MA). As amostras coradas foram adquiridas em um LSR II (BD 
Biosciences, San Jose, CA) e os dados de citometria de fluxo foram analisados usando 
FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR) e software Prism (GraphPad Software, San Diego, 
CA).
Análise de sequenciamento de célula 
única Pré-processamento e desmultiplexação 
As matrizes de expressão gênica foram geradas pelo pré-processamento das leituras 
brutas de cada lote com o kallisto | pipeline bustools (37–39). As matrizes de contagem 
de tags foram geradas a partir das leituras brutas do experimento de código de barras 
com kITE (kallisto Index Tag Extractor) (40) e kallisto | bustools. Para atribuir identidade 
de tag a uma célula, calculamos a proporção de contagens de cada tag na célula. Um 
intervalo de confiança multinomial foi calculado para cada proporção usando o método 
de aproximação de Goodman implementado com o pacote Python statsmodels.stats. 
proporções. Uma tag foi atribuída a uma célula se o valor do intervalo de confiança 
mais baixo da tag mais abundante fosse duas vezes o valor do intervalo de confiança 
mais alto da próxima tag mais abundante. Essa medida estrita de identidade celular 
nos permite filtrar os duplos. Além disso, códigos de barras celulares (i) com mais de 
5% de leituras mitocondriais, (ii) com um número total de contagens ou número de 
genes acima do percentil 99,5 ou (iii) com menos de 10 contagens observadas foram 
removidos de cada lote. As amostras de útero foram excluídas do conjunto de dados 
devido a um baixo número de casos detectados.
com um coquetel de anticorpos. Células CD45+ CD3+ vivas foram classificadas em 
PBS com 2% de BSA seguindo o protocolo 10x Genomics para multiplexação e 
sequenciamento de célula única. As bibliotecas foram construídas usando o Single Cell 
3' Library Kit V3 (10x Genomics). Uma vez preparadas, as bibliotecas de cDNA 
indexadas foram sequenciadas com leituras pareadas em um Illumina NovaSeq 6000 
(Illumina).
Para o bulk RNA-seq, as células do estroma foram preparadas para separação de 
células picando timo, linfonodos e baço com lâminas de barbear e, em seguida, 
digerindo por 30 min a 37°C em DNase I (Roche) e Liberase TM (Roche) (100 ÿg/ml) 
antes de filtrar através de um filtro de célula de 70-ÿm. A centrifugação por gradiente 
de densidade foi usada para enriquecer as células estromais, usando um gradiente 
Percoll PLUS de três camadas (Sigma-Aldrich) com densidades de 1,115, 1,065 e 1,0. 
As células isoladas entre a camada 1.065 e 1.0 foram ressuspensas no clone 2.4G2 
do anticorpo bloqueador do receptor anti-Fc por 10 min e depois incubadas no gelo por 
30 min com um coquetel de anticorpos. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foi adicionado 
para excluir células mortas antes da classificação em um FACSAria II (BD Biosciences, 
San Jose, CA). As células CD3ÿ CD19ÿ NK1.1ÿ MHCII+ GFP+ foram classificadas 
diretamente em RPMI frio com 2% de soro fetal bovino, lavadas com PBS duas vezes 
e, em seguida, ressuspensas em tampão de lise e congeladas para isolamento e 
sequenciamento de RNA.
Para atribuir identidades às subpopulações/clusters de células resultantes de maneira 
imparcial, desenvolvemos uma abordagem para consultar a similaridade dos perfis 
scRNA-seq em relação a todas as 224 referências publicamente disponíveis
of Health (NIH) e da Associação Americana de Cuidados com Animais de Laboratório 
e consistente com os cuidados com animais e regulamentos de uso da Universidade 
da Califórnia, San Francisco.
Para scRNA-seq, os linfócitos foram preparados por esmagamento de linfonodos, 
que foram então filtrados através de um filtro de células de 70 ÿm. O útero materno foi 
picado com lâminas de barbear e digerido por 15 min a 37°C com 5% de CO2 em 
colagenase D (2 mg/ml) (Roche, Basel, Suíça) e DNase I recombinante (10 ÿg/ml) 
(Roche , Basel, Suíça) conforme descrito anteriormente (33). As células digeridas 
foram ressuspensas em tampão FACS frio (DPBS contendo 0,5% de BSA e 0,2 mM 
de EDTA) e filtradas através de um filtro de células de 70 µm . Centrifugação em 
gradiente de densidade foi usada para enriquecer células de linfócitos, usando um 
gradiente Percoll PLUS de três camadas (Sigma-Aldrich) com densidades de 1,115, 
1,065 e 1,0. As células isoladas entreas camadas 1.065 e 1.115 foram ressuspensas 
no clone de anticorpo bloqueador do receptor anti-Fc 2.4G2 por 10 min e depois 
incubadas em gelo por 30 min
Preparação de linfócitos para citometria de fluxo e RNA-seq Os linfócitos 
foram preparados para citometria de fluxo esmagando timo, linfonodos e baços, que 
foram então filtrados através de um filtro de células de 70 µm . Os glóbulos vermelhos 
foram lisados por incubação de amostras de sangue periférico e baço em tampão de 
lise de cloreto de amônio-potássio (Lonza BioWhittaker, Basel, Suíça) por 10 min. Se 
grávida, os embriões foram removidos do útero materno, que foi então picado com 
lâminas de barbear e digerido por 15 min a 37°C com 5% de CO2 em colagenase D (2 
mg/ml) (Roche, Basel, Suíça) e desoxirribonuclease I (DNase I) recombinante (10 ÿg/
ml) (Roche, Basel, Suíça) conforme descrito anteriormente (33). As células digeridas 
foram ressuspensas em tampão de seleção de células ativadas por fluorescência fria 
(FACS) [Dulbecco's PBS (DPBS) contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 
0,2 mM de EDTA] e filtradas através de um filtro de células de 70 ÿm.
células (apenas 20 células foram desmultiplexadas com confiança e atribuídas a 
amostras uterinas em vários lotes, em comparação com 6.919 e 4.442 células atribuídas 
a brLN (linfonodos braquiais) e udLN (linfonodos de drenagem uterina), respectivamente). 
As matrizes de contagem pré-processadas e demultiplexadas resultantes de cada 
experimento foram concatenadas para análise posterior e processamento a jusante 
com scanpy (41).
tratamento DT
Normalização, agrupamento e visualização Os dados 
desmultiplexados foram normalizados para ter 10.000 contagens por célula e foram 
log1 P transformados. Genes altamente variáveis foram calculados usando a função 
scanpy high_variable_genes usando o sabor Seurat (42) com os parâmetros padrão 
(min_mean = 0,0125, max_ mean = 3 e min_disp = 0,5). Somente genes altamente 
variáveis foram usados para análise posterior. O número total de contagens por célula 
foi regredido e a matriz de expressão gênica foi dimensionada usando a escala de 
função scanpy com max_value = 10. A redução de dimensionalidade foi realizada 
usando análise de componentes principais com 50 componentes principais. Lote 
balanceado kNN (k-vizinhos mais próximos) (43), implementado com a função bbknn 
do scanpy, foi usado para calcular os vizinhos superiores de cada célula e normalizar 
os efeitos do lote. As células corrigidas em lote foram agrupadas usando o algoritmo 
de Leiden (44) e projetadas em duas dimensões com aproximação e projeção de 
distribuição uniforme (UMAP) (45) para visualização. A identidade inicial do cluster foi 
determinada encontrando genes marcadores com análise de expressão diferencial pré-
formada usando um teste t em contagens brutas transformadas em log1 P com a 
função scanpy rank_genes_groups. Clusters associados com (i) marcadores de 
eritrócitos, (ii) co-expressão de marcadores de células B e T e clusters de identidade 
ambígua representando menos de 0,1% do número total de células foram filtrados.
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9 de 11Gillis-Buck et al., Sei. imunol. 6, eabf1968 (2021) 16 de julho de 2021
CIÊNCIA IMUNOLOGIA | ARTIGO DE PESQUISA
Função KDEMultivariate() do pacote Python statsmodels.
perfis de microarray no banco de dados ImmGen; todos os dados primários do 
ImmGen foram baixados do Haemosphere (www.haemosphere. org/datasets/
show). A medida de similaridade que utilizamos é baseada na distância do 
cosseno entre microarranjos/perfis de expressão gênica adequadamente 
normalizados, considerando apenas genes que foram identificados como 
altamente variáveis em scRNA-seq. Para cada subpopulação de referência, o 
perfil de microarray ImmGen correspondente foi normalizado para a soma da 
unidade. Os perfis de expressão gênica de célula única foram primeiro 
dimensionados para 1 × 104 contagens totais e logaritmizados antes de serem 
normalizados para a soma da unidade. Para cada perfil de célula única, as 
similaridades de cosseno resultantes para todos os perfis de ImmGen foram 
ainda mais padronizadas (removendo a média e escalando para a variância da 
unidade) para obter as pontuações finais de similaridade de ImmGen mostradas 
na Fig. 3 (B a D) e na fig. S4 (A e B). A anotação final do tipo de célula foi 
realizada de forma semi-supervisionada, validando de forma cruzada as 
pontuações ImmGen resultantes com a expressão gênica específica da subpopulação de marcadores conhecidos (Fig. 3, F e G, e fig. S4C).
Para cada ponto no espaço UMAP, calculamos e visualizamos o logaritmo da 
razão de densidades estimada e log(AireDTR_density/WT_density) como um 
proxy para a probabilidade de uma região UMAP estar associada a um aumento 
(razão de densidade de log positivo) ou diminuição ( razão de densidade de log 
negativo) proporções de células AireDTR.
O sequenciamento fornecido foi de 2,53 bilhões de leituras totais com uma média 
de 83,6% dessas leituras alinhando-se exclusivamente ao genoma humano 
(Ensembl human GRCh38.78). STAR (Spliced Transcripts Alignment to a 
Reference) (46) versão 2.5.2b foi usado para alinhar as leituras ao genoma do 
camundongo, versão GRCm38.78, e nenhum recorte ou filtragem do adaptador 
foi realizado antes do alinhamento. Reads mapeados exclusivamente para 
mRNAs conhecidos foram usados para avaliar as mudanças de expressão entre 
os genes. Comparações pareadas foram feitas entre camundongos prenhes e virgens no
os intervalos de confiança para cada proporção de cluster foram calculados pelo 
método de Goodman.
Estimativa de densidade diferencial UMAP 
Para visualizar as diferenças de densidade entre as subpopulações de células 
entre as amostras AireDTR e WT, usamos uma abordagem baseada na 
estimativa de densidade Kernel. As densidades AireDTR e WT foram calculadas 
independentemente usando as coordenadas UMAP das células correspondentes 
como entrada e foram extrapoladas para todo o espaço bidimensional, usando 
o kernel_density não paramétrico.
Timectomia e transplante tímico Os timos 
doadores foram coletados de recém-nascidos eutanasiados e então cultivados 
com 1,35 mM 2'-desoxiguanosina monohidratada (Sigma-Aldrich) por 5 a 7 dias 
para depletar os linfócitos endógenos. Camundongos receptores de quatro a 
seis semanas de idade foram anestesiados e uma pequena incisão foi feita ao 
longo da linha média das três primeiras costelas para entrar no tórax e expor a 
área ao redor do timo. Uma pipeta estéril foi inserida no tórax e o timo foi 
removido usando um vácuo. A incisão foi fechada com clipes cirúrgicos. Uma 
incisão no flanco esquerdo foi usada para expor o rim esquerdo, e o timo doador 
neonatal foi transplantado sob a cápsula renal. O peritônio foi fechado com 
suturas e a pele com clipes cirúrgicos, que foram removidos 14 dias após o 
procedimento, momento em que camundongos foram criados para experimentos.No momento da eutanásia, o tórax foi examinado para confirmar a excisão 
completa do timo e o rim foi examinado para a presença do timo transplantado; 
se o timo transplantado não estivesse presente, então aquele camundongo foi 
excluído da análise experimental.
Proporções de tipo de 
célula Modelamos o tratamento (AireDTR versus WT) como uma variável 
explicativa em um modelo linear generalizado binomial (GLM) no qual uma 
contagem do tipo de célula de interesse foi um resultado bem-sucedido em um 
experimento binomial. Ajustamos o GLM binomial com o pacote Python 
statsmodels.stats para contar os dados de cada réplica biológica.
As mudanças na composição do tipo celular foram consideradas significativas 
se o valor P do binomial GLM fosse menor que 0,05. multinomial
Bulk RNA-seq e análise Usamos 
protocolos padrão de mRNA-seq usados pelo núcleo de sequenciamento de 
Genômica Funcional da UCSF. Após a construção da biblioteca com SMART-
Seq/Nextera XT (Illumina, San Diego, CA), os fragmentos de cDNA foram 
submetidos ao sequenciamento single-end de 50 pares de bases em um Illumina HiSeq 4000.
Histologia 
Para a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), os tecidos foram fixados 
durante a noite a 4°C em formalina tamponada neutra a 10% (Thermo Fisher 
Scientific, Waltham, MA) e depois desidratados em etanol a 70% antes de serem 
enviados para HistoWiz (Brooklyn, NY ) para inclusão em parafina, seccionamento 
de 5 ÿm , coloração e avaliação de infiltração de linfócitos por um patologista 
empregado pela HistoWiz que desconhecia os grupos experimentais. Para a 
hibridização in situ, tecidos frescos congelados foram seccionados a 10 ÿm e 
então fixados durante a noite a 4°C em formalina tamponada neutra a 10% antes 
de prosseguir com um kit RNAscope RED 2.5 HD Chromogenic Assay (Advanced 
Cell Diagnostics, Newark, CA) para detecção de mRNA de Aire. Para 
imunofluorescência, tecidos frescos congelados foram seccionados a 10 ÿm e 
fixados em solução de metanol:acetona 1:1 por 20 min a -20°C, bloqueados com 
soro de cabra e, em seguida, incubados no Rabbit anti-CD3ÿ Clone SP7 
( Invitrogen) durante a noite. A coloração secundária foi concluída no dia seguinte 
usando o kit de cabra anti-coelho IgG Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost 
(Invitrogen) e montado com meio de montagem Fluoromount-G com DAPI 
(Invitrogen).
Suplementação de progesterona durante a gravidez A 
progesterona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi dissolvida em óleo de semente 
de gergelim (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e administrada por via subcutânea 
na dose de 2 mg/100 ÿl, diariamente, de E4.5 a E8.5, conforme descrito em (22).
Medições do nível de progesterona sérica O soro 
foi coletado por sangramentos submandibulares e armazenado a -80°C antes 
de ser enviado à Cayman Chemical Company para imunoensaio ligado a enzima 
(Ann Arbor, MI).
timo, baço, linfonodo de drenagem uterina e linfonodo de drenagem não uterina 
usando DESeq2 (47) em R. As transcrições foram combinadas por geneID e as 
transcrições com 0 contagens foram removidas, resultando em 21.478 
transcrições em 48 amostras. Aplicou-se a correção de hipótese múltipla da taxa 
de descoberta falsa (FDR), e os genes com valor de P ajustado < 0,05 e 
mudança de dobra de log de valor absoluto > 1 foram considerados significativos. 
Usamos seis camundongos por réplica biológica. A análise do caminho foi 
realizada com clusterProfiler (www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3339379/ ) 
usando o banco de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 
(www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5210567 /).
Níveis de significância do valor P para 
parcelas ****P ÿ 0,0001; ***0,0001< P ÿ 0,001; **0,001 < P ÿ 0,01; e *0,01 < P ÿ 
0,05.
Machine Translated by Google
http://www.haemosphere.org/datasets/show
As mudanças na composição do tipo celular foram consideradas significativas 
se o valor P do binomial GLM fosse menor que 0,05. multinomial
REFERÊNCIAS E NOTAS
Análise estatística A 
taxa de implantação (porcentagem de fêmeas obstruídas com locais de 
implantação visíveis em E9.5) e a taxa de reabsorção (porcentagem de 
gestações completamente reabsorvidas de todas as gestações com locais de 
implantação visíveis em E9.5) foram analisadas usando o teste exato de 
Fisher. Tamanho da ninhada, peso do local de implantação e porcentagens 
de subconjuntos de células de citometria de fluxo foram analisados usando o 
teste de comparação múltipla de Tukey (ao comparar três ou mais grupos 
experimentais) ou teste t não pareado ( ao comparar dois grupos experimentais). 
Para todos os testes, não significativo = P > 0,05 e significativo = *P < 0,05, 
**P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001. As barras de erro representam o 
intervalo de confiança de 95% com base normal. Para scRNA-seq, ajustamos 
o GLM binomial com o pacote Python statsmodels.stats para contar os dados de cada réplica biológica.
os intervalos de confiança para cada proporção de cluster foram calculados 
pelo método de Goodman. Para bulk RNA-seq, a correção de hipótese múltipla 
FDR foi aplicada, e os genes com P ajustado < 0,05 e valor absoluto de 
mudança de dobra de log > 1 foram considerados significativos. Usamos seis 
camundongos por réplica biológica.
Ver/solicitar um protocolo para este papel de Bio-protocolo.
CIÊNCIA IMUNOLOGIA | ARTIGO DE PESQUISA
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Agradecimentos: Agradecemos aos membros dos laboratórios MacKenzie, Gardner e Anderson e A. 
Erlebacher e S. Fisher pelas discussões úteis. Agradecemos a M. Clark, C. Eikani, J. Valencia e B. Wang pela 
assistência técnica. Financiamento: Este trabalho foi apoiado por NIH R01 A125452 e R01 AI145858 para TCM, uma 
bolsa do Programa Howard Hughes Medical Research Fellows para EG-B., e bolsas UCSF Sandler PSSP e ASTS 
Fellowship in Transplantation para JMG . MSA, JMG e TCM participaram do planejamento experimental e análise dos 
dados; MS, SJS, VN e HM realizaram análises de dados de RNA-seq; EG-B. e JMG realizaram experimentos; e EG-B., 
JMG e TCM escreveram o manuscrito com contribuições de todos os autores. Interesses conflitantes: Os autores 
declaram não ter interesses conflitantes. Disponibilidade de dados e materiais: Os dados de sequenciamento para 
este estudo foram depositados no banco de dados Gene Expression Omnibus e podem ser acessados usando os 
números de acesso GSE174521 (scRNA-seq) e GSE174730 (bulk RNA-seq). Todos os outros dados necessários para 
avaliar as conclusões do artigo estão presentes no artigo ou nos Materiais Suplementares.
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