Avaliacaoperfilimunomolecular-Soares-2022

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
 
 
 
 
 
VICTOR DE LIMA SOARES 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOMOLECULAR DE PACIENTES 
DIAGNOSTICADOS COM LEUCEMIA LINFOIDE AGUDA PHILADELPHIA 
POSITIVA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL/RN 
2022 
1 
VICTOR DE LIMA SOARES 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DO PERFIL IMUNOMOLECULAR DE PACIENTES 
DIAGNOSTICADOS COM LEUCEMIA LINFOIDE AGUDA PHILADELPHIA 
POSITIVA 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao 
Programa de Pós-graduação em Ciências 
Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio 
Grande do Norte como requisito para obtenção do 
título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. 
 
 
 
 
 
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior 
Coorientador: Prof. Dr. Aldair de Souza Paiva 
 
 
 
 
 
NATAL/RN 
2022 
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Dedico este trabalho a Deus e à minha 
família, que tem acreditado em mim e me 
concedido suporte para que eu consiga 
alcançar minhas metas. 
5 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço primeiramente aos pacientes que foram ou não incluídos neste 
trabalho e que tem suas vidas transformadas no momento que descobrem serem 
acometidas de uma patologia tão severa. Desejo do fundo do coração o melhor a 
todos. 
Ao meu orientador Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior pela oportunidade, 
ensinamentos, apoio, compreensão e generosidade em todos os momentos. 
Certamente o senhor faz muita diferença na minha vida e de todos os alunos que 
passaram pela sua mentoria. 
Ao meu coorientador Dr. Aldair de Souza Paiva que me auxiliou a dar meus 
primeiros passos no caminho da hematologia e que sempre me presenteia com bons 
conselhos e muita sabedoria. 
Ao Hemocentro Dalton Cunha Barbosa (HEMONORTE/RN), aos gestores e 
todos os colaboradores, mas principalmente a equipe do Laboratório de 
Hematologia/Laboratório de Citometria de Fluxo e que auxiliaram durante todo o 
processo e a equipe de médicos hematologistas que se destaca por sua 
competência e responsabilidade. 
A CAPES que concedeu a tão almejada bolsa de mestrado colaborando para 
que essa dissertação se tornasse viável. 
Agradeço à minha mãe Cilene, à minha filha Valentina, à minha amiga 
Rosana Leão, à minha equipe do DNA Center por todo o suporte que me deram, a 
Dra. Andrea Fernandes, Dra. Gioconda Leão, Dr. Roberto Chaves e a Rene Castro, 
diretores do DNA Center que possibilitaram a realização deste trabalho, ao PPGCF 
em especial a coordenação nas pessoas de Marcelo Silva e Vivian Silbiger, a 
secretaria do PPGCF Fabia e a tantas outras pessoas especiais que me cercam e 
têm sempre ajudado e acreditado no meu potencial. 
6 
EPÍGRAFE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“I would rather have questions that can't 
be answered than answers that can't be 
questioned.” ― Richard P. Feynman. 
7 
RESUMO 
 
Introdução: Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é uma doença maligna do sistema 
linfo-hematopoiético caracterizada pelo acúmulo de precursores linfoides 
neoplásicos (linfoblastos) de origem B ou T na medula óssea (MO)e/ou sangue 
periférico (SP). O diagnóstico e classificação, dessas leucemias, ocorre pela 
classificação morfológica Franco-Americana-Britânica (L1, L2 ou L3) associada a 
características do perfil imunológico de malignidade de células T ou B, com base no 
perfil de expressão de anticorpos monoclonais (AcMo) dirigidos contra os antígenos 
de diferenciação celular por citometria de fluxo (CF). Vários estudos têm 
demonstrado que imunofenótipos de células blásticas nem sempre exibem 
característica de diferenciação linfoide normais, mas exibem imunofenótipos 
aberrantes. Assim, blastos de alguns casos de LLA B podem possuir antígenos T ou 
mielóides assim como de células T de LLA podem possuir antígenos B ou mielóides. 
Objetivos: Determinar o perfil imunofenotípico pela CF em 88 pacientes com LLA 
(linhagem B ou T) diagnosticados no Laboratório de Citometria de Fluxo do 
Hemocentro Dalton Cunha – HEMONORTE, do estado do Rio Grande do Norte, 
Basil. Metodologia: Todas as amostras de SP e/ou MO foram submetidas à 
imunofenotipagem por CF usando um painel de AcMo específico para o diagnóstico 
de leucemias agudas (LA) diretamente conjugados a fluorocromos. Resultados: A 
faixa etária dos pacientes variou de 1 mês a 84 anos, com mediana de 13 anos 
sendo 62,5% do sexo masculino. A cepa observada mais frequente foi a B e o 
subtipo mais evidente foi a LLA Pré-B Comum. Dentre os marcadores celulares 
avaliados, os mais expressos na linhagem B foram CD19, CD10 e cCD79a e os 
antígenos mais expressos na linhagem T foram CD3, CD7, CD5 e CD2. Uma 
pequena porcentagem (6,8%) eram células T duplamente positivas. Conclusão: 
Conclui-se que os indivíduos com LLA neste estudo apresentam características 
demográficas, clínicas e imunofenotípicas semelhantes às observadas em outros 
estudos, demonstrando que a CF é uma metodologia essencial no diagnóstico e 
seguimentos dessas leucemias. 
 
Palavras-Chave: Leucemia linfoide aguda. Imunofenotipagem. Citometria de fluxo. 
 
8 
ABSTRACT 
 
Introduction: Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is a malignant disease of the 
lympho-hematopoietic system characterized by the accumulation of neoplastic 
lymphoid precursors (lymphoblasts) of origin B or T in the bone marrow (BM) and/or 
peripheral blood (PB). The diagnosis and classification of these leukemias occurs by 
the French-American-British morphological classification (L1, L2 or L3) associated 
with characteristics of the immune profile of T or B cell malignancy, based on the 
expression profile of monoclonal antibodies (MoAb) directed against cell 
differentiation antigens by flow cytometry (FC). Several studies have found that blast 
cell immunophenotypes do not always have the characteristics of normal lymphoid 
differentiation, but exhibit aberrant immunophenotypes. Thus, the blasts of some 
cases of ALLB may have T or myeloid antigens, as well as T cells of ALL may have B 
or myeloid antigens. Objectives: To determine the immunophenotypic profile by FC 
in 88 patients with ALL (lineage B or T) diagnosed at the Flow Cytometry Laboratory 
of the Hemocentro Dalton Cunha - HEMONORTE, in the state of Rio Grande do 
Norte, Brazil. Methodology: The samples, such as PB and/or BM, were subjected to 
FC immunophenotyping using a specific MoAb panel for the diagnosis of acute 
leukemia (AL) directly conjugated to fluorochromes. Results: The age of patients 
ranged from 1 month to 84 years, with a median of 13 years, with 62.5% being male. 
The most frequent strain observed was B and the most evident subtype was the 
Common Pre-B ALL. Among the cell markers emitted, the most expressed in lineage 
B were CD19, CD10, HLADR and cCD79a and the most expressed antigens in 
lineage T were CD3, CD7, CD5 and CD2. A small percentage (6.8%) was doubly 
positive T cells. Conclusion: It is concluded that the individuals with ALL in this study 
have demographic, clinical and immunophenotypic characteristics similar to those 
observed in other studies, demonstrating that FC is an essential methodology in the 
diagnosis and follow-up of these leukemias. 
 
Key-Words: Acute lymphoid leukemia. Immunophenotyping. Flow citometry. 
9 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 12 
2. OBJETIVOS........................................................................................................................... 15 
2.1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................................ 15 
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................15 
3. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................. 16 
3.1. LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA.............................................................................................. 16 
3.2. CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS LINFOIDES AGUDAS ................................................ 16 
3.2.1. Classificação morfológica .................................................................................................. 16 
3.2.2. Classificação Imunofenotípica ........................................................................................... 19 
3.2.2.1. Leucemia Linfóide Aguda de Linhagem B ............................................................................. 22 
3.2.2.2. Leucemia Linfoide Aguda de Linhagem T ............................................................................. 22 
3.3. ESTRATIFICAÇÃO DE RISCO .............................................................................................. 24 
3.4. LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA PHILADELPHIA POSITIVA ................................................. 25 
4. METODOLOGIA .................................................................................................................... 31 
4.1. SELEÇÃO DOS PACIENTES ................................................................................................ 31 
4.2. IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO ...................................................... 31 
4.2.1. Marcação de Antígenos de Superfície ............................................................................... 32 
4.2.2. Marcação de Antígenos Intracitoplasmáticos .................................................................. 33 
4.2.3. Aquisição e Análise no Software Cell Quest .................................................................... 33 
4.3. HEMOGRAMA E CITOMORFOLOGIA DE ASPIRADO MEDULAR ...................................... 35 
4.3.1. Coleta e Extensão e Coloração .......................................................................................... 35 
4.3.2. Avaliação Morfológica e Contagem Relativa .................................................................... 36 
4.3.3. Hemograma .......................................................................................................................... 36 
4.4. CITOGENÉTICA CONVENCIONAL ...................................................................................... 36 
4.5. PESQUISA DE BCR/ABL POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE ........................... 39 
4.6. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ................................................................................................... 40 
5. RESULTADOS ...................................................................................................................... 41 
5.1. CASUÍSTICA.......................................................................................................................... 41 
5.2. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E HEMATOLÓGICAS ........................................................ 42 
5.3. IMUNOFENOTIPAGEM ......................................................................................................... 46 
5.4. PERFIL MOLECULAR E CARIOTÍPICO ................................................................................ 47 
6. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 51 
7. CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 59 
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................................... 60 
APÊNDICE A: Artigo a ser Submetido .............................................................................................. 73 
APÊNDICE B: Artigos Publicados ..................................................................................................... 95 
10 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
 
FIGURAS 
Figura 1. Esquema da diferenciação dos linfócitos B e seus correspondentes 
malignos .................................................................................................................... 23 
Figura 2. Esquema da diferenciação dos linfócitos T e seus correspondentes 
malignos .................................................................................................................... 24 
Figura 3. Representação de um caso de LLA de células B IgM+ .............................. 34 
Figura 4. Representação esquemática de uma LLA T por citrometria de fluxo com 
representação tipo dotplot. ........................................................................................ 35 
Figura 5. Cariótipo. .................................................................................................... 38 
Figura 6. BCR ABL. ................................................................................................... 40 
 
QUADROS 
Quadro 1. Classificação morfológica (FAB) da leucemia linfoblástica aguda. ........... 18 
Quadro 2. Principais antígenos de diferenciação utilizados para identificar diferentes 
tipos celulares durante a hematopoiese normal e leucêmica. ................................... 21 
Quadro 3. Painel de Anticorpos Monoclonais utilizados no estudo de caracterização 
imunofenotípica das leucemias agudas. ................................................................... 32 
 
 
11 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1. Distribuição dos pacientes com leucemia linfóide aguda em relação à faixa 
etária e sexo .............................................................................................................. 41 
Tabela 2. Distribuição do perfil imunofenotípico das leucemias linfoides aguda 
investigadas. ............................................................................................................. 42 
Tabela 3. Frequências dos dados clínicos dos pacientes com lla da linhagem b ..... 44 
Tabela 4. Dados laboratoriais dos pacientes de lla de linhagem b analisados ......... 45 
Tabela 5. Dados laboratoriais dos pacientes de lla de linhagem t analisados .......... 46 
Tabela 6. Frequência de reatividade dos acmo nas llas de linhagem b .................... 48 
Tabela 7. Frequência de reatividade dos acmo nas llas de linhagem t ..................... 49 
Tabela 8. Perfil molecular e citogenético dos pacientes investigados ....................... 50 
 
12 
1. INTRODUÇÃO 
 
As leucemias agudas (LA) compreendem um grupo de neoplasias 
caracterizadas pela proliferação clonal e acúmulo na medula óssea (MO) e/ou 
sangue periférico (SP) de células hematopoéticas imaturas anormais denominadas 
blastos, que proliferam e se infiltram no ambiente medular inibindo o crescimento e 
maturação normal dos precursores eritróides, mielóides e megacariocitários 
(GOASGUEN, 1996; GREAVES, 2002; OLIVEIRA et al., 2004; PUI et al., L., 2011). 
Elas diferem entre si com respeito à célula de origem, apresentação clínica, curso e 
resposta terapêutica. À medida que se acumulam na MO, as células leucêmicas 
suprimem a expansão das células progenitoras hematopoéticas normais, refletindo 
as manifestações clínicas comumente observadas nas LA no momento do 
diagnóstico, tais como anemia, infecções e hemorragias, que são resultantes da 
escassez de hemácias, leucócitos maduros funcionais e plaquetas, respectivamente 
(GOASGUEN, 1996; GREAVES, 2002; OLIVEIRA et al., 2004; PUI et al., L., 2011). 
Nas LA dois estágios de desenvolvimento hematopoético são prováveis alvos 
para a transformação maligna em as células precursoras mielóides e linfóides (B ou 
T), originando respectivamente a leucemia mielóide aguda (LMA) e a leucemia 
linfóide aguda (LLA). 
As LA são diagnosticadas e classificadas com base na célula de origem 
presumida, sendo possível na maioria dos casos, identificar o estágio dediferenciação celular. A determinação do estágio e/ou linhagem celular onde esta 
transformação ocorreu pode ser determinada por técnicas de imunofenotipagem por 
citometria de fluxo tendo importantes implicações clínicas, terapêuticas e 
prognósticas onde a resposta clínica inicial e a chance de cura variam de acordo 
com o estágio onde as células são afetadas (FIALKOW, 1987; GOASGUEN et al., 
1996; OLIVEIRA et al.,., 2004; PAMNANI, 2009). 
Dentre estas, destacam-se a: i) citomorfologia de acordo com os critérios 
propostos pelo grupo French-American-British (FAB), podendo ser complementada 
pela citoquímica; ii) técnicas de imunofenotipagem por citometria de fluxo; iii) 
citogenética e iv) biologia molecular (BENNET et al., 1976; GREAVES, 1993; 
CAVALCANTI JR et al, 1995; OLIVEIRA et al., 2004; Lai, Kondo, 2008; Pui et al., 
2008). Nas pesquisas sobre câncer e no delineamento do perfil imunofenotípico de 
tumores, atualmente a imunofenotipagem por citometria de fluxo (CF) é considerada 
13 
um instrumento importante no diagnóstico de doenças onco-hematológicas, 
particularmente nas LA (OLIVEIRA et al., 2004; VARDIMAN et al., 2009; BÉNÉ et al., 
2011). 
A CF mede as propriedades de células em suspensão, orientadas em um 
fluxo laminar e interceptadas, uma a uma, por um feixe de laser. As modificações 
ocasionadas nesse feixe de luz devidas à presença de células serão então 
detectadas e mensuradas por sensores (detectores). A luz dispersa é coletada por 
um sistema óptico que permite identificar as células pelo seu tamanho e 
granularidade interna. Hemácias, plaquetas, linfócitos, monócitos e granulócitos 
podem ser então identificados e quantificados. Os diferentes fluorocromos que 
marcam cada antígeno absorvem a luz e emitem-na num comprimento de onda 
maior e específico. Cada fluorocromo possui um padrão espectral distinto de 
absorção e emissão, de tal maneira que até três cores de luz podem ser 
opticamente separadas com os filtros seletivos encontrados nos citômetros comuns ( 
SALES VASCONCELOS et al, 2013). 
A técnica de ICF, usando pelo menos três, e preferencialmente quatro ou 
mais cores, possibilitou a identificação e quantificação dessas células, mesmo 
quando presentes em pequeno número, permitindo a detecção de pequenas 
quantidades de células leucêmicas, viabilizando o acompanhamento clínico dessas 
leucemias durante e após o seu tratamento como ocorre no teste de doença residual 
mínima (DRM) (IKOMA et al., 2015). 
Nas LLAs, a CF é mandatória para a definição da origem celular T ou B, além 
de identificar os subtipos imunofenotípicos, que são de relevância no prognóstico e 
no tratamento dos pacientes. A CF permite estabelecer uma classificação 
imunológica de acordo com o grau de diferenciação B ou T das células leucêmicas, 
pois, as suas expressões antigênicas refletem de certa forma, a ontogenia linfoide 
normal (ALVES G et al, 2013). 
As LLA de linhagem B podem ser diagnosticadas pela expressão dos Clusters 
of Differentiation (CD), como o antígeno Pam-B CD19 na grande maioria dos casos, 
além de CD79a e o CD22 citoplasmático e ou de superfície, podendo o CD20 estar 
expresso. Para LLA de linhagem T são marcadores: o antígeno pam-T CD3 
citoplasmático ou de superfície, o CD7, CD2 e CD5 (SALES; VASCONCELOS et al, 
2013). 
14 
A ICF também é indispensável no diagnóstico dos subtipos de LMA: 
indiferenciada, minimamente diferenciada, megacariotítica/megacarioblástica, alguns 
casos de monoblástica e eritroide pura, nas quais a morfologia muito imatura não 
permite identificar a linhagem celular. Além disso, ela também é essencial para o 
diagnóstico das LA de linhagem ambígua. Os marcadores mais frequentemente 
expressos e importantes para esse diagnóstico são: a mileoperoxidase (MPO), mais 
sensível que adetecção pela citoquímica, pois o AcMo identifica também formas pró-
enzimáticas, CD13, CD33, CD65, CD117; CD41, CD42 e CD61 nas células da 
linhagem megacariocítica; CD36, CD64 e CD14 na linhagem monocítica; glicoforina-
A (CD235a), receptor para transferrina (CD71) e CD36 na linhagem linhagem 
eritroide; e os marcadores de imaturidade CD34, CD38, HLADR. Os antígenos 
associados à linhagem linfoide B (CD19,CD20 e CD22), T (CD3, CD7, CD2 e CD5) e 
NK(CD56) são incluídos no painel para a determinação das LA ambíguas (SALES; 
VASCONCELOS et al 2013). 
Ainda no que diz respeito à LLA, seu manejo clínico está diretamente 
relacionado à resposta ao tratamento. Atualmente, a forma estabelecida para avaliar 
esta resposta é a pesquisa da DRM que se baseia na observação da cinética de 
descrição da massa tumoral em resposta ao tratamento e avaliação de sua 
implicação prognóstica (CAMPANA, 2010). 
A literatura já aponta benefícios do diagnóstico preciso e do acompanhamento 
do curso da doença para o desfecho clínico demonstrando dessa forma a 
importância de estudos de caracterização de leucemias e do aprimoramento da 
detecção de DRM e ressalta a importância da ICF nesse contexto (THEUNISSEN et 
al., 2017). 
A pesquisa que serviu de base para a dissertação de mestrado pelo programa 
de Pós graduação em Ciências Farmacêuticas (PPGCF) da Universidade Federal do 
Rio Grande do Norte) aqui apresentada, teve como objeto de estudo o estudo do 
imunofenotipos de casos LLA Philadelphia positiva e sua associação com dados 
clínicos e tendo sido desenvolvida no Laboratório de Hematologia do Hemocentro 
Dalton Cunha – HEMONORTE e no e Laboratório DNA-Center onde foram 
diagnosticados 59 pacientes diagnosticados com LLA/Ph1+ através citomorfologia, 
imunofenotipagem por citometria de fluxo, pesquisa da translocação BCR/ABL e 
análise de cariótipo convencional. 
 
15 
2. OBJETIVOS 
 
2.1. OBJETIVO GERAL 
 Investigar e caracterizar o perfil imunofenotípico e molecular das 
Leucemias Linfóide Aguda Philadelphia Positiva (LLA/Ph1+). 
 
 
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 Determinar a distribuição das LLA/Ph1+ por gênero e faixa etária; 
 Avaliar as características clínicas e hematológicas dos pacientes 
afetados; 
 Correlacionar as LLA/Ph+ com os subtipos imunofenotípicos 
determinados pela citometria de fluxo e classificação citomorfologica 
pela classificação FAB; 
 Investigar a incidência de fenótipo aberrante determinada pela 
citometria de fluxo nas LLA/Ph1+; 
 Correlacionar dados citogenéticos e diferentes padrões moleculares 
dos transcritos BCR/ABL das LLA investigadas. 
 
 
16 
3. REVISÃO DE LITERATURA 
 
3.1. LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA 
 
A leucemia linfoide aguda (LLA) é uma LA derivada de células blásticas 
linfoides (linfoblastos) que se infiltram na MO, timo e gânglios linfáticos em diferentes 
etapas de maturação, mantendo a capacidade de multiplicação, porém com parada 
de diferenciação antes das células afetadas atingirem as formas maduras e 
funcionais (HOFFBRAND; PETIT; MOSS, 2001). 
Embora a LLA possa ocorrer em qualquer faixa etária, sua incidência é maior 
entre crianças de 2 a 5 anos, numa porcentagem em torno de 70% dos casos, 
diminuindo na adolescência, voltando a crescer após 60 anos de idade (ALVES; 
FERNANDES, 2012). Dentre as crianças, a doença é mais comum naquelas de cor 
branca e do sexo masculino (ALVES G, 2013). 
A LLA pode se apresentar com linfadenopatia, hepatomegalia e 
esplenomegalia. Também podem se manifestar sintomas prodromais como febre, 
suor noturno e perda de peso ou ser assintomática, embora em um número reduzido 
de casos. Menos comumente dores ósseas e/ou articulares podem surgir no curso 
da LLA (ROSE-INMAN; KUEHL, 2017). 
 
 
3.2. CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS LINFOIDES AGUDAS 
 
3.2.1. Classificação morfológica 
 
A LLA representa quase 25% dos cânceres pediátricos e pode afetar tanto 
adultos quanto crianças, embora esta seja o tipo de leucemia mais comum da 
infância (80% dos casos), apresentando um pico de incidência entre os 2 e 5 anos 
de idade, decrescendo para um índice de cerca de 20% em adultos,voltando a 
aumentar a incidência nesses pacientes após os 60 anos (ARMSTRONG; LOOK, 
2005). A estimativa nos EUA (Estados Unidos da América) é de 3.000 casos novos 
ao ano e 2/3 deles são crianças (3,4 casos/100.000 crianças menores de 15 anos 
(MEENAGHAN; DOWLING; KELLY, 2012) 
17 
As LLA são leucemias caracterizadas pelo acúmulo de precursores linfóides 
neoplásicos (linfoblastos) na MO e/ou no SP. Segundo os critérios da classificação 
FAB podem ser diagnosticadas pela presença de mais de 30% de células blásticas 
na MO (LILLEYMAN et al., 1986). A WHO-World Health Organization ou 
Organização Mundial de Saúde (OMS) considera uma contagem maior que 20% o 
suficiente para o diagnóstico dessa doença (ONCIU, 2009; WANDT et al., 2010). 
As LLA são classificadas pelo aspecto morfológico associado às 
características do perfil imunológico das células malignas. A FAB classificou as LLA 
em três subtipos distintos, L1, L2 e L3, baseados somente em critérios morfológicos 
de MO e de SP corados pelo May-Grünwald-Giemsa (BENNETT et al., 1976, 1981; 
SACHDEVA et al., 2006; WANDT et al., 2010). 
A classificação do sistema FAB é baseada em sistemas de escores e analisa 
a relação tamanha do núcleo/citoplasma, presença de nucléolos, regularidade da 
membrana nuclear e tamanho da célula como critérios para a distinção entre os 
subgrupos morfológicos L1, L2 e L3 (Quadro 1) (BENNETT et al., 1976, 1981; 
SACHDEVA et al., 2006; WANDT et al., 2010). 
O subtipo L1 caracteriza-se por apresentar em seus esfregaços de MO ou de 
SP blastos pequenos homogêneos com núcleo redondo de contorno regular. A 
cromatina é levemente condensada e os nucléolos não são visíveis em, pelo menos, 
75% dos blastos. O citoplasma é escasso resultando em uma alta relação 
núcleo/citoplasma (BENNETT et al., 1981; LEWIS; BAIN; BATES, 2006; WANDT et 
al., 2010). 
O subtipo L2 é constituído por células de tamanhos variados. O citoplasma 
geralmente é mais abundante que o observado na L1, os núcleos mostram um 
contorno irregular em mais que 30% dos blastos, apresentando clivagem ou fendas. 
A cromatina nuclear é frouxa e os nucléolos são sempre visíveis citoplasma 
(BENNETT et al., 1981; LEWIS; BAIN; BATES, 2006; WANDT et al., 2010). 
O subtipo L3 (Tipo Burkitt) é constituído por células grandes de aspecto 
homogêneo, o citoplasma é caracteristicamente hiper basofílico com presença de 
vacúolos; a cromatina nuclear é frouxa, exibindo 1 a 2 nucléolos proeminentes. A 
presença de células em mitose é outra constante neste subtipo de LLA (BENNETT 
et al., 1981; LEWIS; BAIN; BATES, 2006; WANDT et al., 2010). 
O subtipo L1 é mais frequente em crianças (76 a 89%) do que em adultos (31 
a 43%), o subtipo L2 é mais frequente em adultos (49 a 60%) que em crianças (14 a 
18 
22%) e o subtipo L3, raramente encontrado, é mais frequente em crianças do que 
em adultos (ALVES G et al, 2012; PLASSCHAERT et al., 2004; PUI; RELLING; 
DOWNING, 2004). 
O tipo L3 é um tipo de LLA de células B maduras com características 
distintas, associado ao vírus Epstein Barr, colocando-o como uma entidade única de 
genótipo e imunofenótipo (ALVES; FERNANDES, 2012; PEGORARO et al., 1984; 
RAWLINSON; BAKER; KAHWASH, 2011). A precisão do diagnóstico de LLA tipo 3 
tem uma importância crítica para a sobrevida dos pacientes, pois este tipo de 
leucemia não responde satisfatoriamente aos tratamentos que são normalmente 
bem-sucedidos em outros tipos de LLA (KONDO; O’BRIEN; LAI, 2009; 
RAWLINSON; BAKER; KAHWASH, 2011). 
 
Quadro1. Classificação morfológica (FAB) da leucemia linfoblástica aguda. 
CRITÉRIOS 
MORFOLÓGICOS 
L1 L2 L3 
Diâmetro Celular 
Células pequenas e 
homogêneas 
Células Grandes e 
heterogêneas 
Células 
Grandes, 
homogêneas 
Cromatina Nuclear Fina ou aglomerada Fina Fina 
Forma do núcleo Regular 
Irregular, podendo 
apresentar fendas 
ou indentação 
Regular, 
redondo ou 
oval 
Nucléolos 
Indistintos ou não-
visíveis 
Um ou mais por 
célula, grandes e 
proeminentes 
Um ou mais por 
célula, grandes, 
proeminentes 
Citoplasma Escasso 
Moderadamente 
abundante 
Moderadament
e abundante 
Basofilia 
citoplasmática 
Ligeira Ligeira Intensa 
Vacúolos 
citoplasmáticos 
Ausentes Ausentes Evidente 
 Fonte: Bennet JM, 1976 
 
 
 
 
19 
3.2.2. Classificação Imunofenotípica 
 
Nas LLA a ICF é mandatória para a definição da origem celular T ou B, além 
de identificar os subtipos imunofenotípicos, que são de relevância no prognóstico e 
no tratamento dos pacientes (ALVES; FERNANDES, 2012). Os blastos leucêmicos 
expressam o antígeno leucocitário comum CD45 em fraca ou moderada intensidade. 
A expressão do CD45 afasta a maioria das outras neoplasias não hematológicas, 
como neuroblastoma, carcinoma ou sarcoma (CD45 negativo) e doenças 
linfoproliferativas crônicas ou linfomas não Hodgkin (LNH) que se caracterizam pela 
forte expressão desse antígeno (SALES et al., 2017). 
Em 1995, European Group of Imunological Characterization of Leukaemias ou 
EGIL, propôs que a classificação imunológica para as LA fosse uniformizada, 
apresentando como base o perfil de expressão dos marcadores celulares 
determinado por painéis de AcMo direcionados contra os antígenos de diferenciação 
celular, exemplificado no Quadro 2 (BENE MC, CASTOLDI G, KNAPP W, 1995; 
MARTINS; FALCAO, 2000). 
Baseando-se no princípio de que no processo de diferenciação e maturação 
os linfócitos apresentam antígenos de superfície e de membranas citoplasmáticas, e 
que algumas destas moléculas são perdidas ou adquiridas, podem-se estabelecer 
perfis de diferenciação maturativa. Considerando também que as leucemias 
representam a expansão clonal de uma célula em determinado estágio maturativo, o 
emprego de painéis de AcMo permitiu classificar as LLA conforme suas expressões 
antigênicas em LLA de linhagem B e T. Aproximadamente 20% dos casos são de 
origem de células T, 75% de precursores de células B e 5% de células B maduras 
(BENE MC, CASTOLDI G, KNAPP W, 1995; DAVIDSON et al., 2012; GORCZYCA, 
2011). 
Essas expressões passam a predizer, a partir dos fenótipos B ou T, que as 
alterações biológicas associadas à resposta terapêutica, monitorização da doença 
residual mínima e estratificação de grupos em maior ou menor risco, hoje em dia são 
sabidamente bem mais importantes que os critérios estritamente morfológicos 
(BENE MC, CASTOLDI G, KNAPP W, 1995; GORCZYCA, 2011). 
A LLA de linhagem B é demonstrada pela expressão do antígeno pan-B CD19 
na grande maioria dos casos, CD79a e o CD22 citoplasmáticos, podendo o CD20 
estar expresso. O CD79a foi considerado um marcador citoplasmático para essas 
20 
leucemias, porém pode estar expresso em raros casos de LLA-T ou mesmo LMA.. 
Para a as LLA linhagem T são marcadores: CD3 citoplasmático ou de superfície, 
CD7 com forte intensidade, CD2 e CD5. A CF nas LLA permite estabelecer uma 
classificação imunológica de acordo com o grau de diferenciação B ou T das células 
leucêmicas, pois as suas expressões antigênicas refletem de certa forma, a 
ontogenia linfoide normal (ALVES G, 2012). 
 
 
21 
Quadro 2. Principais antígenos de diferenciação utilizados para identificar diferentes tipos celulares 
durante a hematopoiese normal e leucêmica. 
ANTICORPO LOCALIZAÇÃO FUNÇÃO 
CD1a 
Células T tímicas, subgrupo de células B, 
células de Langerhans 
Glicoproteína 48kD que se liga a β2-
microglobulina 
CD2 Todas as céls T, maioria das NK ligante de LFA-3 
CD3 Céls T tímicas e maduras Estrutura do TCR, transdução de sinal 
CD4 Céls T auxiliadoras, monócitos, macrófagos 
Co-receptor de MHC classe II, receptor do 
HIV 
CD5 
Céls T maduras e tímicas, subgrupo de 
céls B (Células B1) 
Ativação de céls T, ligante de CD72 
CD7 Todas as céls T, céls NK Ativação de céls T e NK 
CD8 
Subgrupo de céls T tímicas, T 
supressora/citotóxica, subgrupo de NK. 
Co-receptor do MHC de classe I 
CD10 
Precursor B e Céls B do centro 
germinativo, PMN 
Endopeptidaseneutra 
CD13 Céls Mielóides Aminopeptidase N 
CD14 Monócitos maduros e precursores 
CD15 Célsmielocíticas e monocíticas 
Antígeno Lewis-X, adesão celular e 
fagocitose 
CD16 Céls Natural Killer, Granulócitos 
Receptor para cadeia pesada das 
Imunoglobulinas 
CD19 Céls B precursoras e maduras Ativação de céls B 
CD20 Céls B precursores tardios e maduros Canal de Ca++. Ativação de céls B 
CD22 Céls B precursoras e maduras Molécula de adesão celular 
CD33 Céls mielóides e monocíticas Molécula de adesão do ácido siálico 
CD34 Céls Progenitoras 
CD38 
Célslinfóides progenitoras, Céls. 
Plasmáticas, Céls T ativadas 
Ativação leucocitária 
CD41 Megacariócitos e plaquetas gpIIb/IIIa, 
CD45 Pan-hematopoético Transdução de sinal: tirosina-fosfatase 
CD56 Céls NK e céls T citotóxicas Molécula de adesão celular 
CD61 Megacariócitos e plaquetas 
GPIIb/IIIa, molécula de adesão celular 
com CD41, receptor de fibrinogênio 
CD79a Céls B precursoras 
transdução de sinal da Ig de superfície 
para o citoplasma 
CD117 Céls mielóides precursoras receptor de c-kit 
HLA-DR 
Céls B, monócitos, progenitores mielóides 
e céls T ativadas 
Antígeno de apresentação, MHC classe II 
IgM * Céls pré-B, Linf B naive 
Reconhecimento da cadeia pesada da 
imunoglobulina M 
TdT Céls linfóides imaturas Rearranjo de Igs e TCR 
Fonte: Martins SLR et al., 2000. 
Nota: *Cadeia pesada de imunoglobulina; TCR (Receptores de células T); TdT (Deoxinucleotidil 
transferase Terminal). 
22 
3.2.2.1. Leucemia Linfóide Aguda de Linhagem B 
 
Aproximadamente 85% das LLA são de linhagem B (CHAN, 2002).O grupo 
EGIL propôs a subclassificação da LLA de origem B em 4 subtipos: o primeiro grupo 
expressa apenas antígenos relacionados à resposta imune HLADR, além do CD19, 
CD34 e o TdT, sendo denominada LLA do tipo Pró-B. O segundo tipo corresponde 
as LLA Pré-B do tipo Comum ou CALLA Positivo, cujo fenótipo apresenta HLADr+, 
CD19+ e o antígeno comum da LLA (CALLA) ou CD10+, expressando também o 
CD22 intracitoplasmático (cCD22). As características do terceiro grupo desta 
linhagem de LLA é a presença intracitoplasmática da cadeia pesada “mü” das 
imunoglobulinas (c), além do HLADR, CD10, CD19, CD22 de superfície (sCD22) e 
o CD20. Finalmente, no quarto e último estágio, encontram-se as leucemias que 
morfologicamente correspondem ao tipo Burkitt com padrão L3 da classificação 
FAB, além de estar associado à translocação 8q24, caracterizando-se 
imunologicamente pela expressão completa de Imunoglobulina de superfície M 
(sIgM) e negatividade do CD34 e do TdT (CHAN et al., 2003). 
 
 
3.2.2.2. Leucemia Linfoide Aguda de Linhagem T 
 
Aproximadamente 15% das LLAs infantis e cerca 25% das que acometem os 
adultos apresentam blastos leucêmicos de linhagem T, sendo a expressão do 
antígeno CD3 intracitoplasmático (cCD3) ou de superfície (sCD3), o melhor critério 
para a identificação de células dessa origem. O antígeno CD7 encontra-se expresso 
na maioria dos casos (ROSE-INMAN; KUEHL, 2017). 
Os casos de LLA-T podem ser subdivididos de acordo com os estágios de 
diferenciação, em LLA pré-T, LLA-Tintermediária e LLA-T medular. A LLA Pré-T é 
encontrada em aproximadamente 6% dos adultos e em 1% das crianças e os seus 
blastos expressam cCD3 e CD7 além de expressar antígenos de imaturidade como 
HLADR, TdT e CD34 sendo negativos para os demais marcadores. Na LLA T 
Intermediária, o CD3 pode ser encontrado no citoplasma (cCD3) ou na superfície 
(sCD3), associado a expressão de CD2, CD1a, CD5, CD4 e CD8 
concomitantemente. Finalmente em um estágio maturativo mais avançado encontra-
se a LLA T Medular ou madura em que os blastos expressam as moléculas CD2, 
23 
CD5, CD7, sCD3 e está presente CD4 ou CD8. Estas leucemias geralmente 
acometem indivíduos do sexo masculino, apresentando elevada leucometria, 
infiltração no SNC e massa mediastinal sendo consideradas de mau prognóstico 
(ROSE-INMAN; KUEHL, 2017). 
 
 
 
 
Figura 1 - Esquema da diferenciação dos linfócitos B e seus correspondentes malignos 
 
Fonte: Cavalcanti Júnior GB, 1995, baseado em Uckun FM, 1990. LLC (Leucemia Linfocítica 
Crônica), LNH (Linfoma Não-Hodgkin), LCP (Leucemia de Células Plasmáticas), MM (Mieloma 
Múltiplo). 
 
24 
Figura 2 - Esquema da diferenciação dos linfócitos T e seus correspondentes malignos 
 
Fonte: Cavalcanti Júnior GB, 1995, baseado em Uckun FM, 1990. 
Nota: LPL-T (Leucemia Prólinfocítica de célula T), SS (Síndrome de Sjögren), LNH-T (Linfoma não-
Hodgkin de Células T), ATLL (Leucemia/linfoma de Células T do Adulto). 
 
 
3.3. ESTRATIFICAÇÃO DE RISCO 
 
O manejo da LLA, tanto em crianças quanto em adultos, está vinculado a 
várias decisões clínicas e na resposta ao tratamento uma vez que o rastreamento de 
células neoplásicas residuais ao fim da primeira fase de quimioterapia possui 
25 
elevado valor prognóstico. Atualmente, a estratégia do tratamento após a realização 
do diagnóstico, se baseia na avaliação do risco de recidiva, já que a intensidade do 
tratamento será modulada essencialmente de acordo com a probabilidade do risco 
de recidiva (THEUNISSEN et al., 2017). 
A recaída inicial é definida pelo grupo Berlin-Frankfurt-Munster (BFM) como a 
recaída que ocorre dentro de 6 meses da terapia primária completa. Vários exames 
auxiliam a estratificação de risco no diagnóstico inicial, entretanto poucos são 
aplicados durante a recaída. Entre os que são aplicados encontra-se o Tempo de 
Recaída (TR), o Sítio de Recaída (SR) e o Imunofenótipo (BHOJWANI; PUI, 2013). 
No Grupo Brasileiro para Tratamento de Leucemias da Infância (GBTLI) além 
dos critérios clássicos como, remissão morfológica no 8° dia e/ou 28° dia de 
indução, a quantificação de DRM em LLA será de fundamental importância para 
avaliação da resposta terapêutica. Portanto, a detecção de novos fatores 
(prognóstico) capazes de estabelecer previsão de cura nas fases iniciais do 
tratamento é fundamental na definição das diretrizes do tratamento da LA e 
determinação de doença residual mínima (DRM) (IKOMA et al., 2015) 
 
 
3.4. LEUCEMIA LINFÓIDE AGUDA PHILADELPHIA POSITIVA 
 
A Leucemia linfóide aguda (LLA) é uma neoplasia do sistema 
linfohematopoético caracterizada pelo acúmulo de células imaturas da linhagem 
linfoide na medula óssea, sangue periférico e órgãos linfóides, sendo seu pico de 
incidência por volta dos 5 anos de idade. O prognóstico da LLA é determinado pela 
idade; perfil imunofenotípico; características cito-morfológicas (L1, L2 e L3), além de 
alterações genéticas. 
A translocação entre os loci 12p13 e 21q22 (t(12;21) (p13:q21)), envolvendo 
os genes TEL e AML1 é predominante nas crianças, estando associada a uma 
sobrevida livre de doença de 85% a 90% dos casos (SCHAFFEL R,. SIMÕES BP 
2008) 
A LLA com translocação t(9;22) (q34;q11) ou cromossomo Philadelphia 
positiva (LLA Ph+) constitui um subtipos de LLA de alto risco e mau prognóstico. A 
t(9;22) (q34:q11.2) ou cromossomo Philadelphia (Ph1 ou Ph) é a anormalidade 
citogenética mais comum associada à LLA em adultos, ocorrendo em 20% a 40% 
26 
dos casos, sendo também detectada em 2% a 5% das crianças com LLA (5) e em 
aproximadamente 1% dos pacientes com LMA (SCHAFFEL R,. SIMÕES BP 2008) 
O cromossomo Ph1 é o resultado de uma translocação recíproca de material 
genético entre os cromossomos 9 e 22. Essa translocação, descrita como t (9; 22), 
funde parte do gene ABL1, do cromossomo 9, com parte do gene BCR, do 
cromossomo 22, criando um gene de fusão anormal chamado BCR-ABL. A t (9; 22) 
é adquirida durante a vida de uma pessoa estando presente apenas em células 
sanguíneas anormais, tratando-se, portanto, de uma mutação somática (SCHAFFEL 
R. SIMÕES BP 2008). 
Estas proteínas BCR-ABL apresentam constitutivamente atividade de tirosina 
quinase ativa que é consideravelmente maior do que o produto do gene ABL normal 
de 145 kDa. (SCHAFFEL R. SIMÕES BP 2008). 
A proteína BCR-ABL, resultante datranslocação, está constantemente ativa, 
levando a uma atividade desregulada nas células afetadas, induzindo-as a se 
dividirem constantemente independentemente da influência de fatores de 
crescimento. Impedindo tambem sua apoptose (morte celular programada), levando 
à superprodução das células anormais e diminuição das células sanguíneas 
normais, sendo responsável pelo fenótipo maligno da LMC (SCHAFFEL R,. SIMÕES 
BP). 
O rearranjo entre os cromossomos 9 e 22 resulta em duas isoformas: BCR-
ABL p190 e BCR-ABL p210. A isoforma p210 é característico da LMC, enquanto a 
p190 ocorre na maioria das LLA das células B. Cerca de 1% dos pacientes com 
LMC apresentam também a isoforma p190. 
Diferenças nas interações de proteínas e vias de sinalização ativada que 
podem estar associadas com as diferentes doenças dirigidas por p210 e p190 são 
desconhecidas. 
A presença da t(9;22) (q34:q11.2), envolvendo os genes BCR e ABL em 
adultos está associada a uma sobrevida livre de doença de apenas 10% - 20% dos 
casos a despeito de tratamentos quimioterápicos muito intensos, apresentando 
sobrevida a longo prazo inferior a 10% do total dos casos (SCHAFFEL R,. SIMÕES 
BP). 
Recentemente, surgiram vários inibidores da proteína bcr-abl, como o 
mesilato de imatinibe (Glivec®) que se mostraram extremamente eficazes no 
tratamento da LMC/BCR-ABL+. Estas drogas já foram incorporadas ao tratamento 
27 
da LLA Ph1+ com resultados promissores, o que se justifica uma investigação desta 
anomalia genética em todos pacientes (adultos e pediátricos) no momento do 
diagnóstico da LLA bem como na investigação de resposta ao tratamento ou doença 
residual mínima (DRM) SCHAFFEL R,. SIMÕES BP. 
A t (9;22) ocorre em cerca de 25% dos casos de LLA do adulto, sendo a 
alteração citogenética mais comum da LLA nesta faixa etária. A idade mediana ao 
diagnóstico da LLA Ph1+ recém diagnosticada é de 45 anos. Nos pacientes 
pediátricos a prevalência é em torno de 3% em LLA de crianças com menos de 15 
anos, aumentando para cerca de 30% a partir dos 30 anos, ocorrendo em mais de 
50% dos casos das LLA diagnosticados após os 65 anos de idade (SCHAFFEL R,. 
SIMÕES BP 2008). 
A LLA Ph1+ pode ocorrer ao diagnóstico ou como uma fase de crise blástica 
linfóide da LMC. Esta forma secundária à crise blástica apresenta uma maior 
heterogeneidade clínica decorrente da presença das alterações próprias da LMC. 
Do ponto de vista clínico, a LLA Ph1+ acomete pacientes com idade média de 
45 anos, apresenta menor frequência de anemia e maior leucocitose ao diagnóstico 
que as LLA do adulto Ph1 negativas (SCHAFFEL R,. SIMÕES BP 2008). Em termos 
morfológicos ela é semelhante aos outros tipos de LLA, ou seja, pode ser do tipo L1 
ou L2 (SCHAFFEL R,. SIMÕES BP 2008) 
A LLA Ph1 positiva ocorre em mais da metade dos casos de LLA do idoso, 
grupo etário com maior número de comorbidades e sem possibilidade de realização 
de transplante de medula óssea (TMO). Estes fatores tornam a LLA Ph1+ nesta 
faixa etária de prognóstico mais desfavorável (SCHAFFEL R,. SIMÕES BP 2008) 
Devido à raridade cos casos, a LLA Ph1+ em crianças tem sido pouco 
investigada (SCHAFFEL R,. SIMÕES BP 2008). 
O diagnóstico de LLA de linhagem B por citometria de fluxo é confirmado pela 
positividade ao CD79a intracitoplasmático (cCD79a), CD19, CD22 de superfície 
(sCD22) e / ou intracitoplasmático (cCD22) e HLA-Dr, associado à negatividade para 
os antígenos de linhagem T. Segundo os critérios do grupo EGIL, a LLA de linhagem 
B é classificada em pró-B (CD10 negativo, IgM citoplasmática negativa); Comum 
(CD10 positivo, IgM citoplasmática negativa); pré-B c+ (IgM citoplasmática positiva 
com ou sem CD10 positivo) e B madura (cadeias leves das imunoglobulinas kappa 
ou lambda citoplasmática ou de superfície além de IgM de superfície positiva) 
(VASCONCELOS G, 2012) 
28 
A LLA Ph1+ pertence ao grupo comum ou pré-B na quase totalidade dos 
casos. O antígeno CD34 é positivo em mais de 90% dos casos de LLA Ph1+, 
ocorrendo com frequência expressão aberrante de antígenos mielóides: CD33 e / ou 
CD13, além do receptor para IL-2 (CD25) na maioria dos casos (SCHAFFEL R,. 
SIMÕES BP 2008). Nestes casos, quando diagnosticado uma LLA de linhagem B 
com co-expressão de antígenos mielóides ou CD25 é recomendável investigar a 
presença do cromossomo Ph1, sendo também necessário o emprego de um painel 
de anticorpos monoclonais ampliado para diferenciar a LLA Ph+ da leucemia aguda 
bifenotípica (SCHAFFEL R,. SIMÕES BP 2008). 
Os testes de diagnóstico que permitem detectar, especificamente, a 
anormalidade do cromossoma Ph1 e do gene de fusão BCR-ABL, e baseiam-se em 
testes “standard” de citogenética convencional, hibridização in situ por fluorescência 
(FISH), e a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR). 
A detecção do RNA BCR-ABL por PCR é atualmente o método mais utilizado 
para o diagnóstico da LLA Ph1+. Este teste apresenta uma elevada sensibilidade, 
sendo capaz de detectar uma célula positiva em 10.000 células, o que o torna 
particularmente útil para o acompanhamento da doença residual mínima. 
Na LLA, o material biológico para exame é preferencialmente a medula óssea, 
onde existe até dez vezes mais positividade para o BCR/ABL do que no sangue 
periférico. O exame de PCR no sangue periférico é recomendado apenas nos casos 
em que o aspirado de medula óssea é seco. 
A citogenética é a parte da genética que estuda os cromossomos, sua 
estrutura e sua herança. Os cromossomos que se encontram dentro dos núcleos 
das células são estruturas complexas constituídos por agregados de genes. Nos 
organismos superiores, os cromossomos são formados por DNA e diversos tipos de 
proteínas, podendo ser visualizados em microscópio na fase da divisão celular 
conhecida como metáfase. Embora os cromossomos sejam visíveis como estruturas 
distintas apenas nas células em divisão, eles conservam sua integridade, inclusive 
entre as divisões celulares 
Cada espécie tem um conjunto cromossômico típico em termos de número e 
morfologia, denominado cariótipo. Os 46 cromossomos das células somáticas 
humanas constituem 23 pares, nos quais 22 pares são semelhantes em ambos os 
sexos, denominados autossomos, e o par restante representa os cromossomos 
sexuais, que são: XX no sexo feminino e XY no sexo masculino. Os membros de um 
29 
par autossomo possuem informações genéticas equivalentes, ou seja, possuem os 
mesmos locus gênicos na mesma sequência em cromossomos homólogos 
denominados alelos. Um membro de cada par dos cromossomos é herdado do pai e 
o outro da mãe (71). 
A citogenética convencional constitui um dos ensaios mais importantes na 
detecção do cromossoma Ph1 e na monitorização da DRM de pacientes com 
leucemias agudas e LMC. As preparações cromossômicas podem ser feitas de 
todos os tecidos e de todas as suspensões que contenham mitose. Nos humanos 
podem ser usadas as preparações de curto prazo de medula óssea, sangue 
periférico, sangue de cordão, material fetal e vilosidade coriônica, ou de longo prazo, 
de líquido amniótico, fibroblastos ou outras células cultivadas. O material que 
permitiu o grande desenvolvimento da citogenética humana foi o sangue periférico, 
pois há um grande número de linfócitos no sangue circulante e são eles que, quando 
estimulados, entram em divisão (GIL E, 2011). 
As desvantagens deste método é a baixa sensibilidade, o que limitada a uma 
ausência de positividade a um intervalo de 1-5% dos casos; o material obtido no 
aspirado de medular da LLA pode ser escasso com consequente possibilidade da 
não obtenção do número de metáfases suficiente para análise. Além de ser um 
método que pode demorar de 15 dias, o que, com a introdução dos inibidores de 
tirosino quinase na terapêutica destas doenças, retardaria o início do tratamento 
específico. A citogenética convencional deve ser sempre realizada para investigação 
de outras alteraçõescitogenéticas que podem ocorrer paralelamente tais como 
cariótipo complexo ou presença de duplo cromossomo Ph1, quando os dois alelos 
estão envolvidos na t(9;22), o que caracteriza evolução desfavorável da doença, 
além disso, a citogenética convencional têm a vantagem de não necessitar qualquer 
tipo de sonda molecular, sendo um exame de menor custo (GIL E, 2011).. 
Relativamente ao cariótipo Ph-negativo na LMC e na LLA, os rearranjos BCR-
ABL podem ser encontrados tanto em casos com um cariótipo negativo (normal), 
como em casos com cariótipo complexo em que a t (9;22) não é detectada por 
análises citogenéticas convencionais. A localização, mais comum, do gene de fusão 
BCR-ABL no cariótipo é na primeira banda, da região 1, do braço longo do 
cromossoma 22, (22q11), e, em menos casos, está localizado na quarta banda, da 
região 1 do braço longo do cromossoma 9 (9q34) (GIL E, 2011). 
30 
A hibridização in situ por fluorescência (FISH) é um método em que são 
utilizadas sondas fluorescentes (sequências de DNA) complementares à região alvo 
no cromossomo a ser pesquisado. Esta técnica é indicada para detecção da 
translocação BCR/ABL principalmente quando não há células em metáfase para a 
análise do citogenética convencional ou nos casos em que o cariótipo é normal, mas 
o quadro clínico do paciente sugere a presença do rearranjo. Trata-se de uma 
técnica mais rápida que o cariótipo, pois não depende de cultura celular para sua 
realização pois as análises podem ser realizadas em células na fase de interfase. 
Na pesquisa da translocação BCR/ABL por FISH, utiliza-se sondas de dupla 
fusão específicas para os genes ABL1 (9q34) e BCR (22q11.2) marcadas com 
fluorescência vermelha e verde, respectivamente. A presença do rearranjo é 
detectada ao microscópio através da visualização de fusões e/ou sobreposições de 
dois sinais, um verde e um vermelho, além da presença de um sinal vermelho e um 
verde isolados, correspondentes aos cromossomos 9 e 22 normais (GIL E, 2011). 
Com o uso de sondas de dupla fusão algumas situações anormais e variantes 
também podem ser detectadas, como por exemplo, a presença de um cromossomo 
derivado adicional, deleção no cromossomo der (9q) e elucidação de rearranjos 
complexos envolvendo os genes BCR e ABL. 
 
31 
4. METODOLOGIA 
 
4.1. SELEÇÃO DOS PACIENTES 
 
Os pacientes foram recrutados para o presente estudo no Laboratório de 
Hematologia do Hemocentro Dalton Cunha – HEMONORTE e no Laboratório DNA-
Center na cidade do Natal, Rio Grande do Norte. Ao total, foram analisados 59 
pacientes diagnosticados com LLA pela imunofenotipagem por citometria de fluxo 
(CF). O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres 
Humanos, protocolo CAAE: 51300215.6.0000.5292 (2015). 
O diagnóstico inicial das LLA foi realizado por critérios clínicos e laboratoriais, 
sendo a avaliação clínica realizada por médicos especialistas. Dados laboratoriais 
relevantes e complementares ao diagnóstico clínico foram realizados, constando de 
hemograma, mielograma, colorações citoquímicas de negro de Sudan Black ou 
Mieloperoxidase para exclusão dos casos de LMA. 
Dados clínicos relacionados à doença foram realizados pelos médicos 
hematologistas e registrado no prontuário dos pacientes, constando de astenia, 
febre, linfadenopatia, hepatomegalia, esplenomegalia e sinais hemorrágicos, dentre 
outras. Exames complementares também foram realizados quando necessário tal 
como biópsia de MO, tomografias exames de imagem. 
Realização de exame de cariótipo e análises moleculares da pesquisa de 
BCR/ABL foram realizados objetivando a confirmação dos casos de LLA philadelphia 
positivo. 
Dados dos pacientes foram obtidos dos prontuários arquivados dos pacientes. 
Entre os dados obtidos constando de: gênero (sexo), idade, leucometria, níveis de 
hemoglobina, hematócrito, contagem de plaquetas, dosagem de LDH e porcentagem 
de blastos no SP ao diagnóstico e mielograma. 
 
 
4.2. IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO 
 
Para a realização das análises de citometria de fluxo foram realizadas coletas 
de SP e MO. As amostras de SP foram colhidas em tubo contendo EDTA (BD-
Vacutainer, EDTA-K2 5.4 mg Plus Plastic) e as amostras de MO foram colhidas por 
32 
punção da crista ilíaca ou externo em seringa contendo heparina (Liquemine, Roche, 
USA). 
A imunofenotipagem por CF após marcação com os AcMo seguiu duas 
etapas, conforme mostra o Quadro 3. 
 
Quadro 3. Painel de Anticorpos Monoclonais utilizados no estudo de caracterização imunofenotípica 
das leucemias agudas. 
 ANTÍGENOS B ANTÍGENOS T 
ANTIGENOS 
MIELOIDES 
ANTÍGENOS 
NÃO 
ESPECÍFICOS 
PAINEL 
PRIMARIO 
(TRIAGEM) 
cytCD79a; CD19, 
sCD22 
sCD3; cytCD3 
CD7 
CD13, CD33, anti-MPO CD45 
PAINEL 
SECUNDARIO 
(COMPLEMENTAR) 
cytIgM;sIgM 
CD1a; CD2; 
CD4; CD5; 
CD8 
CD15; CD11b; CD14; 
CD41; CD61; CD117; 
CD235a 
CD34; CD123; 
HLA-Dr; TdT; 
CD10, CD25 
Nota: sIg: Imunoglobulina de superfície, cyIg: Imunoglobulina citoplasmática, sCD3: CD3 de 
superfície, cyCD3: CD3 citoplasmático, MPO: mieloperoxidase, CD235: Glicoforina alfa, TdT: 
Terminal deoxinucleotidil Transferase, *CD13 (em alguns casos, cytCD13 foi utilizado). Todos os 
anticorpos monoclonais são da Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA. 
 
 
4.2.1. Marcação de Antígenos de Superfície 
 
Para realizar a marcação de antígenos na membrana celular foram 
distribuídos 50μL da amostra previamente homogeneizada em cada tubo. A amostra 
em seguida foi incubada por 30 minutos (min.) a temperatura ambiente (TA) ao 
abrigo da luz juntamente com 10μL do AcMo. Em seguida, foram adicionados 4 mL 
da solução hemolisante FACS lysingsolution (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 
previamente diluída 1/10 (v/v) em água destilada. As amostras foram novamente 
incubadas no escuro por 10 min. com a finalidade de romper as hemácias. Depois 
de passados os 10 min. as amostras foram centrifugadas a 1.500 rotações por 
minuto (rpm) por 5 min. e posteriormente foi retirado o sobrenadante. Por fim, foram 
adicionados à amostra 4 mL de tampão salina fosfato (PBS Tablets, PH 7.2, Sigma-
33 
Aldrich Ltda, Brazil) e em seguida centrifugadas a 1.500 rpm por 5 min. e retirado o 
sobrenadante (ALVES, 2013). 
 
 
4.2.2. Marcação de Antígenos Intracitoplasmáticos 
 
Por se tratar de antígenos cujos epítopos celulares encontram-se no 
citoplasma foi necessária a permeabilização prévia possibilitando, dessa forma, o 
direcionamento e reatividade do AcMo. Para este procedimento foi utilizado o 
protocolo de permeabilização da membrana citoplasmática celular empregando 
solução permeabilizante (BectonDickinson´s FACS lysingsolution, San José CA, 
USA) (BRADSTOCK et al., 1994; IKOMA et al., 2015a; TONG et al., 2009). 
Cerca de 50µL de amostra de SP e/ou MO por tubo foi incubada com solução 
hemolisante (Facs-Lysing, Becton Dickinson, San José CA, USA) previamente 
diluída a 10% em água destilada por 10 minutos a TA, seguido de uma centrifugação 
a 1.500 RPM por 5 minutos, em seguida realizou-se o descarte do sobrenadante e 
homogeneização do sedimento. 
Após a homogeneização foram adicionados 5µL dos AcMo seguido de uma 
incubação por 30 minutos à TA e ao abrigo da luz. O sedimento foi homogeneizado 
em 3 mL de solução de PBS seguida de centrifugação a 1.500 RPM por 5 minutos. 
Desprezado o sobrenadante o sedimento foi ressuspenso e submetido a mais uma 
lavagem com PBS. Após o descarte do sobrenadante foi adicionado 1 mL de PBS 
ao sedimento final e estocado na geladeira ao abrigo da luz até o momento da 
leitura no citômetro de fluxo (ALVES, 2013) 
Para cada amostra foi utilizado um tubo controle de marcação inespecífica 
(Gama 1FICT/gama 2PE/gama 3PerCP;- Becton Dickinson, San José CA, USA). 
 
 
4.2.3. Aquisição e Análise no Software Cell Quest 
 
A aquisição e a análise das amostras foram realizadas em Citometro de Fluxo 
de 4 cores(FACS Calibur - Beckton Dickinson, CA, USA) em plataforma machintosh 
(Apple), onde foi utilizado o programa Cell Quest (Cell Quest software Beckton 
Dickinson, CA, USA) com aquisição (leitura) de um total de 50.000 células por tubo, 
34 
levando-se em conta os parâmetros Forward Scatter (FSC) em escala linear que 
avalia o tamanho celular e Side Scatter (SSC) também em escala linear, o qual 
avalia a complexidade e granulosidade celular, FL1, FL2, FL3 e FL4 em escala 
logarítimica que detectam as fluorescências verde, laranja, vermelha e rosa ou seja, 
a reação antígeno-anticorpo conjugado ao isotiocianato de fluoresceína (FICT), 
ficoeritria (PE), complexo protéico piridina clorofila (PercP) e aloficocianina (APC) 
respectivamente. Para cada amostra analisada foram empregados controles 
isotípicos de marcação inespecífica, os quais serviram de referencial para calibração 
do citômetro de fluxo. 
As imunofenotipagens foram consideradas positivas quando mais que 20% 
das células foram positivas para os AcMo, exceto para os AcMo CD34 e TdT que 
foram considerados positivos quando mais de 10% das células fossem positivas 
para esses anticorpos. 
Os resultados foram expressos em porcentagem de células positivas. O limiar 
de positividade foi baseado no controle negativo do tubo controle das amostras 
(Figuras 3 e 4). 
 
Figura 3. Representação de um caso de LLA de células B IgM+ 
 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE. Nota: A) Paramentos morfológicos FSCxSSC; B) Expressão do antígeno CD45; C) 
Expressão do CD19; D) Expressão da sIgM; E e F) positividade para cadeia leve lambda e 
negatividade para cadeia leve kappa. 
35 
Figura 4. Representação esquemática de uma LLA T por citrometria de fluxo com representação tipo 
dotplot. 
 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE. Nota: A) Paramentos morfológicos FSCxSSC; B) Positividade para o CD3 e 
negatividade ao CD19; C) Negatividade aos antígenos mielóides CD13 e ao Antígeno Comum das 
leucemias linfóides agudas (CD10); D)Positividade para enzima nuclear Terminal deoxinucleotidil 
Transferase; E) Positividade ao antígeno CD4 e negatividade ao antígeno CD8 e F)Dupla positividade 
aos antígenos T Cd7 e CD2. 
 
 
4.3. HEMOGRAMA E CITOMORFOLOGIA DE ASPIRADO MEDULAR 
 
4.3.1. Coleta e Extensão e Coloração 
 
Foram obtidas amostras de SP e/ou MO ao momento do diagnóstico para 
realização do hemograma e citomorfologia. O SP foi coletado por punção venosa na 
fossa antecubital do braço após assepsia com álcool 70% e transferido para tubos 
contendo anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (BD-Vacutainer, 
EDTA-K2 5.4 mg Plus Plastic). No instante da coleta foram realizados esfregaços 
sanguíneos em lâmina de vidro utilizando-se extensoras adequadas e os esfregaços 
foram corados por corantes May GrumwaldGiemsa (MGG, Laborclin, Brazil). 
 
 
36 
4.3.2. Avaliação Morfológica e Contagem Relativa 
 
Os esfregaços de SP e/ou MO depois de corados foram observados em 
microscópio óptico (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) em objetiva de 10X, 20X, 
40X e em objetiva de 100X com a finalidade de avaliar o aspecto morfológico das 
células e a presença de blastos linfóides associados a alterações eritrocitárias e 
plaquetárias e realizar a contagem diferencial dos leucócitos. 
Análise de aspirado medular (mielograma) foram avaliados em objetiva de 
40X e 100X, procedendo a contagem convencional e a classificação FAB em L1, L2 
e L3. 
 
 
4.3.3. Hemograma 
 
Os hemogramas foram realizados utilizando amostras de SP por automação 
no analisador hematológico (Cell-Dyn 3.000, UnipathCorp., Mountain View, CA, 
USA) para obtenção das contagens de leucócitos, plaquetas e níveis de 
hemoglobina. 
 
 
4.4. CITOGENÉTICA CONVENCIONAL 
 
A análise citogenética dos pacientes foi realizada no setor de citogenética do 
laboratório DNA Center. Para a obtenção dos cromossomos metafásicos em 
amostras de medula óssea e/ou sangue periférico (quando a contagem de células 
blasticas for > 20%), utilizando foi utilizado o método descrito na literatura, com 
modificações (temperatura, água utilizada, tempo de incubação). Amostra de medula 
óssea (MO) coletada por punção aspirativa medular pelo médico e /ou o sangue 
periférico (SP) será obtido por punção venosa. O material foi enviado ao laboratório 
em isopor com gelo, no prazo máximo de 24 a 48 horas para se iniciar os processos 
de cultura, em seguida a pós-cultura e finalizando com o bandeamento G (GIL 
2011). 
A. Cultura de Células para obtenção de células metafasicas. Para a cultura 
de medula óssea foi necessário que seja colhido no mínimo 2mL de material em 
37 
seringa heparinizada. São suficientes de 0,1 a 1mL de amostra (dependendo do 
número de células contadas) para cada tubo cônico estéril (média de 4 tubos por 
cultura) contendo meio RPMI 1640, suplementado com glutamina e soro bovino fetal 
(5 ou 10mL). O tubo será levado à estufa à 37ºC por 24 e/ou 48 horas, visto que é 
ao redor desse período que a taxa de mitoses se eleva exponencialmente. 
Transcorrido este período acrescenta-se até 0,1 mL de colchicina ao meio de 
cultura, homogeneíza-se e incuba-se novamente a 37ºC, por mais uma hora. Ao 
término, o conteúdo do tubo é centrifugado por aproximadamente 10 minutos, a 
1.500 rpm (GIL 2011)). Depois, desprezou-se o sobrenadante e procedeu-se a 
hipotonia (choque hipotômico) acrescentando uma solução de KCl 0,075M pré-
aquecida a 37ºC, colocando-se em estufa a 37ºC por 20 minutos. Após o 
procedimento da hipotonia é seguida da fase de fixação das células. Para isto, faz-
se a centrifugação dos tubos por 10 minutos, a 1500 rpm, seguido do descarte do 
sobrenadante. Acrescenta-se à cultura aproximadamente 7 mL de fixador (álcool 
metílico e ácido acético (3:1), homogeneizando lentamente. O tubo é submetido a 
uma nova centrifugação por 10 minutos a 1500 rpm, e repete-se o mesmo ciclo de 
operações com o fixador por duas ou mais vezes, se necessário, até que o 
sedimento de células fique transparente (GIL 2011). Depois da última centrifugação 
não se deve esgotar o fixador, mas deixar, aproximadamente, 0,5 mL dele sobre o 
sedimento de suspensão celular, considerando a quantidade de material obtido. É 
importante ressaltar que a primeira etapa da fixação não precisa ser seguida 
imediatamente pelas outras, pois as células podem permanecer no primeiro banho 
de fixador por muitas horas, de acordo com a conveniência do laboratório. As células 
fixadas estão prontas para serem distribuídas em lâminas. Devem ser utilizadas, 
sempre, lâminas novas e devidamente limpas, mantidas em geladeira com fixador. 
No centro das lâminas distribuem-se duas ou três gotas da suspensão celular e a 
secagem é feita em placa aquecedora. A primeira lâmina servirá de guia para a 
quantidade necessária de lâminas a serem pingadas. Ela deverá ser corada com a 
coloração clássica, que consiste em banhar a lâmina durante 10 minutos com 
corante Giemsa a 4%, (diluir 4 mL de Giemsa em 96 mL de tampão fosfato), lavar 
em água corrente, secar a temperatura ambiente e observar ao microscópio óptico. 
Deve-se pingar a quantidade necessária de lâminas, para cada paciente, e deixar 
envelhecer em temperatura ambiente, para o bandeamento (GIL 2011). 
38 
Para o bandeamento cromossômico baseou-se no desenvolvimento das 
técnicas de bandeamento por Caspersson e colaboradores (1970) trouxe um avanço 
significativo para a citogenética, porque, a partir delas, foi possível a identificação de 
cada par cromossômico pelo padrão característico das bandas que eles apresentam, 
após tratamento adequado. Este tratamento é feito depois da distribuição do material 
nas lâminas. Para o bandeamento G, os cromossomos são submetidos à digestão 
pela tripsina, que desnatura as proteínas cromossômicas, sendo coradoscom 
Wright ou Giemsa (origem do nome banda W e banda G) ou com várias técnicas 
adicionais (GIL 2011). O Bandeamento G com Tampão Fosfato / Wrigtht As lâminas 
envelhecidas por no mínimo um dia foram colocadas em uma solução tampão 
Sorensen (KH2PO4-Merck diluídos em água destilada e Na2HPO4- Merck diluídos 
em água destilada) a 37°C por aproximadamente 30 min. Após o tampão, a lâmina 
será corada pelo Wright/fosfato por aproximadamente dois minutos, depois foi 
lavada em água corrente para logo após ser analisada no microscópio óptico (Nikon-
E200) com objetiva de 20x e 100x. Serão analisadas pelo menos 20 metáfases. A 
nomenclatura para descrição de aberrações cromossômicas é atualizada 
regularmente pelo Comitê do Sistema Internacional de Nomenclatura em 
Citogenética Humana (ISCN). A última atualização foi realizada em 2008 e publicada 
em 2009 (GIL 2011). 
 
Figura 5. Cariótipo. 
 
Fonte: Setor de citogenética do Laboratório DNA Center 
 
 
39 
4.5. PESQUISA DE BCR/ABL POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
 
Amostras de aspirado de medula óssea ou sangue periférico (contagem de 
blastos > 25%) foram processadas segundo recomendação de Artigas et al (ARIGAS 
2002) e do grupo Fleury (28). Amostras foram coletados com EDTA, centrifugadas a 
3000 rpm e pelet de leucócitos tratados imediatamente com Trizol, e posteriormente 
fixados com soluções alcoólica (isopropano e etanol v:v). Após esta fase as 
amostras de concentrado de leucócitos serão armazenadas a -70° C até à extração 
do ARN, que será realizada de acordo com o método de trizol. As análises serão 
realizadas pelo método do RT-PCR, técnica que amplifica sequências de DNA do 
RNA mensageiro. Através do uso da enzima transcriptase reversa, M-MLV (Gibco), 
obtêm-se uma cópia do DNA. Uma PCR simples foi utilizada como controle interno, 
utilizando um par de primers direcionados ao gene DRB134. Subsequentemente 
PCR foi realizada em cerca de 30 e 35 ciclos e 64 ° C Temperatura de recozimento 
6 usando iniciadores, as quais amplificam os segmentos de genes de fusão que 
codificam os transcritos da proteína p210 BCR/ABL (456 ou 385 pb) e p190 
BCR/ABL (444pb) 15,28. Os segmentos amplificados serão analisados por um 
equipamento de real time PCR. Como controle positivo, serão utilizadas células de 
LMC e LLA/Ph1 + previamente armazenadas em nosso laboratório, correspondendo 
aos transcritos p210 BCR-ABL e p190 BCR/ABL. Amostras negativas usados como 
controle negativo para o gene de fusão BCR/ABL. Ambos os controles foram 
processados simultaneamente com as amostras testadas. 
 
 
40 
Figura 6. BCR ABL. 
 
Fonte: Setor de biologia molecular do Laboratório DNA Center. 
 
 
4.6. ANÁLISES ESTATÍSTICAS 
 
Os dados obtidos nos serão armazenados em um computador em forma de 
planilha eletrônica do tipo Exell e analisados por diferentes testes estatísticos, 
comparando os diversos grupos de LLAPh+, faixa etária, dados clínicos, resultados 
do hemograma mielograma e fatores prognósticos para leucemias agudas 
estabelecidos na literatura. Serão realizados testes do Qui-quadrado e Wilcoxon e 
Man Wtney através do software estatístico Statistic Pack for Social Sciences (SPSS 
for Windows versão 9.0; Copyright ® SPSS, INC) e considerados estatisticamente 
significativos quando p < 0,05. Poderão ainda ser utilizados outros testes para 
análise, como o teste não paramétrico de Wilcoxon ou coeficientes de correlação de 
Spearman 
 
41 
5. RESULTADOS 
 
5.1. CASUÍSTICA 
 
Neste trabalho foram selecionados 59 pacientes recém diagnosticados com 
LLA, entre 5 meses de vida até 69 anos de idade, com a seguite distribuição: 04 
casos na faixa etária de lactente (≤ 2 anos de idade); 30 casos na faixa etária de > 2 
até 10 anos de idade; 16 casos na faixa de 11 até 20 anos de idade e 09 casos com 
idade acima de 20 anos. No tocante ao sexo, 36 eram do sexo masculino e 23 do 
sexo feminino (Tabela 1). 
 
Tabela 1. Distribuição dos pacientes com leucemia linfóide aguda em relação à faixa etária e sexo 
 
FAIXA ETÁRIA 
SEXO 
Total n(%) 
 M n(%) F n(%) 
Crianças/ 
adolescentes 
≤ 1 ano 03 (75,0) 01 (25,0) 04 (100) 
> 2 a 10 anos 19 (63,3) 11 (36,7) 30 (100) 
> 10 a 20 anos 13 (81,3) 03 (18,7) 16 (100) 
 
Adultos 
> 20 anos 08 (88,9) 01 (11,1) 09 (100) 
 TOTAL 43 (72,9) 16 (27,1) 59 (100) 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE e Laboratório DNA Center. 
 
Dentre as LLA de linhagem B, obtiveram-se as frequências de 01/59 LLA pró-
B, 40/59 LLA Calla+ e 01/59 caso de LLA-B sIgM+. Podendo ser observada a 
predominância das LLA calla+ dentro do subgrupo B e mesmo dentro do total de 
LLAs. Nas LLAs de linhagem T obtiveram-se as frequências de 17/59 (Tabela 2). 
 
 
42 
Tabela 2. Distribuição do perfil imunofenotípico das leucemias linfoides aguda investigadas. 
DIAGNÓSTICO 
SEXO 
Total n (%) 
Masc / n (%) Fem / n (%) 
LLA pró-B 01 (100) 00 ( - ) 01 (100) 
LLA calla+ 23 (57,5) 17 (42,5) 40 (100) 
LLA pré-B cμ+ 00 ( - ) 00 ( - ) 00 ( - ) 
LLA-B sIgM+ 01 (100) 00 ( - ) 01 (100) 
Total LLA - B 25 (59,5) 17 (40,5) 42 (100) 
Total LLA - T 13 (76,5) 04 (23,5) 17 (100) 
TOTAL 55 (62,5) 33 (37,5) 59 (100) 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE e Laboratório DNA-Center. 
 
 
5.2. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E HEMATOLÓGICAS 
 
Na tabela 3 estão registrados os principais sintomas e sinais clínicos 
referentes aos diferentes perfis das LLA investigadas tais com linfadenopatia, 
esplenomegalia, hepatomegalia, presença de massas tumorais (mediastinal e 
abdominal), febre e presença de infiltração extra-medular (pele, glândula supra-renal 
e sistema nervoso central), devendo ser ressaltado que um único paciente 
apresentou mais de um sintoma clínico. Também foi observado que cada grupo de 
LLA apresentou alguns sinais específicos de acordo com o perfil imunofenotípico. 
A linfadenopatia foi o sinal clínico mais observado nesses pacientes. Na LLA 
de linhagem B ela foi observada em 40/48 casos (83,3%). Nas LLA-T, a 
linfadenopatia foi observada em todos os casos avaliados. 
A esplenomegalia, apesar de ser o segundo sintoma clínico mais relatado, 
ocorreu em um número inferior de casos quando comparado a linfadenopatia, 
ocorrendo também em sua maioria nas LLA de linhagem, sendo menos observadas 
nas LLA-T de linhagem T. 
A hepatomegalia também foi constatada nesses pacientes, porém com uma 
distribuição de casos mais homogênea entre dois grupos de LLA. 
A presença de massa mediastinal ocorreu majoritariamente em todos os 
pacientes com LLA-T. Outros sintomas ou sinais clínicos foram pouco observados 
43 
no momento da coleta, que incluíam: infiltração da pele em 02 pacientes com LLA de 
linhagem B; presença de massa abdominal em 01 paciente com LLA-B; infiltração da 
glândula supra-renal em 01 paciente com LLA-T e infiltração no sistema nervoso 
central (SNC) em 02 pacientes com LLA-T. A febre, apesar de ser um sintoma 
inespecífico, é classicamente associada aos primeiros sintomas de pacientes 
diagnosticados com LA e foi referida em apenas 7 pacientes, sendo 4 em LLA da 
linhagem B e 3 em LLA-T. 
Parâmetros laboratoriais/hematológicos encontram-se resumidos nas tabelas 
4 e 5, constando de leucometria, níveis de hemoglobina, contagem de plaquetas e 
de células blásticas em SP, além do resultado do mielograma (Classificação FAB). A 
leucometria mostrou-se elevada na maioria dos casos estudada sendo esta uma 
característica das LLAs Ph1+. Os níveis da dosagem de hemoglobina variaram de 
2,7 a 19,6 g/dL, com mediana de 8,8 g/dL. A maioria dos subtipos de LLA 
estudadas, apresentaram níveis de hemoglobina menor ou igual a 10,0 g/dL. A 
contagem de plaquetas no SP variou de 10.000 a 383.000/mm3 com mediana de 
53.000/mm3, A contagem relativa (percentual) de células blásticas no SP variou de 
21 a 100%,com mediana de 91%. Dos 88 pacientes investigados um caso (01,1%) 
apresentou contagem menor ou igual a 20%, 20 (22,7%) apresentaram mais que 20 
a 70%, e a maioria dos casos, 67/88 (76,1%), apresentou contagem de blastos no 
SP acima de 70%. 
 
 
44 
Tabela 3. Frequências dos dados clínicos dos pacientes com LLA da linhagem B 
Dados Clínicos NT / N+ % 
LLA de linhagem B 
Linfadenopatia 40 / 42 95,2 
Esplenomegalia 10 / 42 23,8 
Hepatomegalia 30 / 42 71,4 
Massa Mediastinal 00 / 42 ( - ) 
Massa tumoral 01 /42 02,4 
LLA de linhagem T 
Linfadenopatia 17 /17 100 
Esplenomegalia 10 /17 58,8 
Hepatomegalia 10 /17 58,8 
Massa Mediastinal 17 /17 100 
Massa tumoral 01 /17 05,9 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE; Laboratório DNA-Center. Nota: NT – Número de pacientes testados; N+ - Número de 
pacientes positivos. 
 
 
45 
Tabela 4. Dados laboratoriais dos pacientes de LLA de linhagem B analisados 
Leucometria (cel/mm3) Frequência (%) 
≤5.000 00/42 ( - ) 
>5.000 a 10.000 01/42 02,4 
>10.000 a 20.000 01/42 02,4 
>20.000 a 50.000 01/42 02,4 
>50.000 39/42 92,8 
Total 42 100 
Hemoglobina (g/dL) Frequência (%) 
≤10 40/42 95,2 
>10 02/42 04,8 
Total 42 100 
Plaquetas Frequência (%) 
≤ 20.000 05/42 11,9 
> 20.000 a 50.000 05/42 11,9 
> 50.000 a 100.000 30/42 71,4 
> 100.000 a 150.000 00/42 ( - ) 
> 150.000 00/42 ( - ) 
Total 42 100 
Blastos (SP) Frequência (%) 
≤20% 00 ( - ) 
>20% a 70% 00 ( - ) 
>70% 42 100 
Total 42 100 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE, laboratório DNA-Center. 
 
 
46 
Tabela 5. Dados laboratoriais dos pacientes de LLA de linhagem T analisados 
Leucometria (cel/mm3) Frequência (%) 
≤5.000 00 ( - ) 
>5.000 a 10.000 00 ( - ) 
>10.000 a 20.000 00 ( - ) 
>20.000 a 50.000 04 42,2 
>50.000 13 76,8 
Total 17 100 
Hemoglobina (g/dL) Frequência (%) 
≤ 10 17 100 
> 10 00 ( - ) 
Total 17 100 
Plaquetas Frequência (%) 
≤ 20.000 13 76,6 
> 20.000 a 50.000 02 11,7 
> 50.000 a 100.000 02 11,7 
> 100.000 a 150.000 00 ( - ) 
> 150.000 00 ( - ) 
Total 17 100 
Blastos (SP) Frequência (%) 
≤ 20% 00 ( - ) 
> 20% a 70% 00 ( - ) 
> 70% 17 100 
Total 17 100 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE, laboratório DNA-Center. 
 
 
5.3. IMUNOFENOTIPAGEM 
 
Os dados referentes à ICF das LLA de linhagem B e T encontram-se 
organizados nas tabelas 6 e 7 respectivamente. Ao definir os critérios de reatividade 
de cada AcMo adotou-se o valor 10% de positividade para os AcMo CD34 e TdT, 
pois são muito sensíveis e específicos, já os demais AcMo foram considerados 
positivos a partir de 20% de expressão dentro dos eventos avaliados. 
Avaliando-se a frequência de expressão dos antígenos relacionados aos 
linfócitos B, aqueles que apresentaram destaque na frequência foram o CD19 e o 
47 
cCD79a em 100% dos casos, seguidos do CD10 (84,8%). O CD22 apresentou 
42,8% de positividade em apenas 3,4% dos pacientes com LLA B testados 
apresentaram algum nível de positividade para o CD20. Quanto aos antígenos não 
específicos e de maturidade o HLADr e CD38 destaca-se com 100% de positividade, 
seguido do TdT em 83,9% e CD34 em 82,3% dos casos. O antígeno leucocitário 
comum (CD45) também esteve presente em todos os casos investigados. Expressão 
de antígenos relacionados à LLA ph+, destacou-se a positividade ao CD25, CD34 e 
expressão aberrante para antígenos mielóides com o CD33, CD13 e CD65 (Tabela 
6). 
Na Tabela 7 está distribuída a frequência de positividade dos antígenos nos 
pacientes com LLA de linhagem T. Entre os antígenos pan-T pode ser observada 
elevada positividade do CD7 e CD3 citoplasmático em 100,0% dos casos, do CD5 e 
do CD2. Nenhum paciente com LLA T expressou positivamente algum antígeno de 
linhagem B. Entre os antígenos de maturidade e não específicos o CD45 obteve 
uma frequência de expressão em todos os casos assim como o CD38. O CD34 foi 
expresso em 58,9% dos pacientes e o HLADR e o CD13/CD33 foram expressos em 
41,2% dos pacientes testados. O CD25 mostrou-se positivo na maioria dos casos 
investigados. 
 
 
5.4. PERFIL MOLECULAR E CARIOTÍPICO 
 
Na Tabela 8, observou-se presença da t (9;22) na maioria dos casos. Em 
alguns casos, observou-se outras alterações citogenéticas. O perfil genético do 
transcrito do BCR/ABL, observou-se p190 na maioria dos casos, destacando nos 
casos da LLA comum em todos os casos. 
 
48 
Tabela 6. Frequência de reatividade dos AcMo nas LLAs de linhagem B 
LLA da Linhagem B 
Anticorpo N Testados N Positivos % 
Antígenos Relacionados às Células Mieloides 
CD14/CD64 42 00 ( - ) 
sCD13 42 40 95,2 
CD33 42 40 95,2 
MPO 42 00 ( - ) 
CD65 42 30 95,2 
CD42b 42 00 ( - ) 
CD117c-kit 42 00 ( - ) 
Antígenos pan-T 
sCD3 42 00 ( - ) 
CD4 42 00 ( - ) 
CD8 42 00 ( - ) 
CD7 42 00 ( - ) 
CD2 42 00 ( - ) 
CD5 42 00 ( - ) 
Antígenos pan-B 
CD10 42 40 95,2 
CD19 42 42 100 
CD20 42 01 23,8 
sCD22/cCD22 42 42 100 
cCD79a 42 42 100 
cIgM 42 01 23,8 
sIgM 42 01 23,8 
Outros Antígenos Celulares 
CD34 42 40 95,2 
HLA-DR 42 42 100 
CD38 42 42 100 
TdT 42 42 100 
CD45 42 42 100 
CD25 42 42 100 
CD16-56 42 00 ( - ) 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE; Laboratório DNA-Center. 
 
 
49 
Tabela 7. Frequência de reatividade dos AcMo nas LLAs de linhagem T 
LLA da Linhagem T 
Anticorpo N Testados N Positivos % 
Antígenos Relacionados às Células Mieloides 
CD14 17 00 ( - ) 
sCD13 17 10 58,9 
CD33 17 07 41,2 
MPO 17 00 ( - ) 
CD65 17 07 41,2 
CD42b 17 00 ( - ) 
CD117c-kit 17 00 ( - ) 
Antígenos pan-T 
sCD3 17 07 41,2 
cCD3 17 17 100 
CD4 17 ( - ) 26,3 
CD8 17 ( - ) 15,8 
CD7 17 17 100 
CD2 17 14 82,4 
CD5 17 16 94,1 
Antígenos pan-B 
CD10 17 00 ( - ) 
CD19 17 00 ( - ) 
CD20 17 00 ( - ) 
sCD22 17 00 ( - ) 
cCD79a 17 00 ( - ) 
cIgM 17 00 ( - ) 
Outros Antígenos Celulares 
CD34 17 10 58,9 
HLA-DR 17 07 41,2 
CD38 17 17 100 
TdT 17 17 100 
CD45 17 17 100 
CD25 17 17 100 
CD16-56 17 01 05,9 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE e Laboratório DNA-Center. 
 
 
50 
Tabela 8. Perfil molecular e citogenético dos pacientes investigados 
 
BCR/ABL 
Cariótipo 
T (9;22) P190 
N (%) 
P210 
N (%) 
LLA Pro-B (n= 01) 00 ( - ) 01 (100) 01 (100) 
LLA Pré-B Calla+ (n = 40) 38 (95,0) 02 (05,0) 38 (95,0) 
LLA-B (IgM+) (n = 01) 00 ( - ) 01 (100) 01 (100) 
LLA-T (n = 17) 00 ( - ) 17 (100) 06 (35,0) 
Fonte: Serviço de Citometria de Fluxo / Laboratório de Hematologia. Hemocentro Dalton Cunha / 
HEMONORTE; Laboratório DNA-Center. 
 
51 
6. DISCUSSÃO 
 
As leucemias agudas (LA) compreendem um grupo heterogêneo de 
neoplasias que afetam a MO, subdividindo-se em subtipos biologicamente 
diferentes, primariamente de acordo com a linhagem celular em mielóides (Leucemia 
Mielóide Aguda ou LMA) e linfóides (Leucemia Linfóide Aguda ou LLA). A leucemia 
linfóide aguda e caracterizada pela proliferação de células B ou T precursores. E a 
doença maligna mais comum na infância, principalmente na faixa etária entre três a 
10 anos de idade com pico entre um a quatro anos, sendo menos frequentes nos 
adultos. Há predominância do sexo masculino (CORNET et al., 2014; MIRANDA-
FILHO et al., 2018), (HAMMERSCHLAK, 2010; HENTRICH; BARTA, 2016). 
O diagnóstico é confirmado pelo aspirado medular que indica mais que 20% 
de células blásticas leucêmicas. Nessas amostras também devem ser realizadas 
análises citomorfológicas, colorações citoquímicas, imunofenotipagem por citometria 
de fluxo além de citogenética e análises molecular. 
A caracterização imunofenotípica tem sido o método preferencial para a 
determinação da linhagem celular e análise da maturação das células nas